CN115927512A - 壳聚糖酶联合甲壳素酶在降解壳聚糖中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了壳聚糖酶OUC‑CsnCA联合甲壳素酶SaChiA4在降解中度乙酰化壳聚糖中的应用，壳聚糖酶OUC‑CsnCA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；甲壳素酶SaChiA4的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述中度乙酰化壳聚糖是指脱乙酰度为40%～75%的壳聚糖。本发明还公开了一种降解中度乙酰化壳聚糖的方法。本发明利用壳聚糖酶OUC‑CsnCA和甲壳素酶SaChiA4联合降解中度乙酰化壳聚糖，水解更彻底，水解产物中全脱乙酰壳寡糖含量更多，且以完全脱乙酰的壳二糖与甲壳单糖为主。本发明对于降解中度乙酰化壳聚糖、酶法制备乙酰化低聚糖的研究具有重要的工业应用价值以及经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及壳聚糖酶联合甲壳素酶在降解壳聚糖中的应用，属于壳聚糖的降解技术领域。
背景技术
壳聚糖是一种线性的高分子量多糖物质，以N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）和氨基葡糖糖（GlcN）为基本单元，由β-1，4糖苷键连接而成。商业化壳聚糖通常由甲壳素脱乙酰制备，一般脱乙酰度＞55%的产物即可称为壳聚糖。壳聚糖降解后的低分子寡糖具有高水溶性、安全性和优质的生理活性，例如抗氧化性、降血糖、保湿性、调节肠道菌群、预防肿瘤等多种生物活性，在食品、医药、化妆品等行业被广泛利用。
甲壳类低聚糖的生物活性受不同的聚合度和乙酰化程度（DD）的影响，越来越多的研究表明部分乙酰化壳寡糖（paCOS）相比全脱乙酰壳寡糖具有更加优良的生物活性，制备特定的paCOS已经成为研究趋势之一。
降解壳聚糖的酶主要有甲壳素酶、壳聚糖酶两大类，各类包括非常多的结构、性质、偏好等各不相同的酶。基于甲壳类水解酶对不同乙酰化度的壳聚糖具有不同的偏好性等性质，探究甲壳类水解酶的水解产物规律，建立协同反应体系，对于制备具有不同功能活性的甲壳类低聚糖具有重要意义。
发明内容
针对上述现有技术，本发明利用壳聚糖酶OUC-CsnCA和甲壳素酶SaChiA4，联合降解中度乙酰化壳聚糖，得到的部分乙酰化壳寡糖，以完全脱乙酰的壳二糖与甲壳单糖为主。
本发明是通过以下技术方案实现的：
壳聚糖酶OUC-CsnCA联合甲壳素酶SaChiA4在降解中度乙酰化壳聚糖中的应用。所述壳聚糖酶OUC-CsnCA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述甲壳素酶SaChiA4，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.1：
MMLSGLGLLAGACNAQGSAAGSSARHAARAEACSAGPHCTVAAARTAANPDDNFSPATLKFLKANTGLDGEQWNNIMKLINKPEQDSLDWTKFYGYCEDIGDKRGYTIGIFGATTGGPNDEGPDGPTLFKEFDAASGAANPSIEGGLSRIGAHGKMQGSILKISDSSKVFCGKIGGLQANAAWRQAMWNTFYKVYIQYSVSQARQRGFNSALTIGSFVDTALNQGAAGDSGTLQGLLSRSGNSADEKTFMTTFYAQRSKIVDTNDYNQPPNGKNRVKQWSTLLNMGETDLKNADAAVAKVTDWEMK。
SEQ ID NO.2：
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进一步地，所述中度乙酰化壳聚糖是指脱乙酰度为40%～75%的壳聚糖，优选脱乙酰度为50.8%的壳聚糖。所述中度乙酰化壳聚糖可通过以下方法制备得到：将脱乙酰度95%的壳聚糖溶解于乙酸溶液中，加入乙酸酐的1,2-丙二醇溶液，搅拌反应；加入NaOH溶液直至析出白色沉淀并且不再增加；沉淀用乙醇溶液洗涤至中性，干燥，即得。
进一步地，具体应用时，向中度乙酰化壳聚糖溶液中加入壳聚糖酶OUC-CsnCA和甲壳素酶SaChiA4，在40～55℃、pH 5.0～8.0条件下降解12～18小时，制备得到部分乙酰化壳寡糖，以完全脱乙酰的壳二糖与甲壳单糖为主。
进一步地，所述中度乙酰化壳聚糖溶液的浓度为1%～5%，优选2%。
进一步地，所述壳聚糖酶OUC-CsnCA的加入量为10～15 U/g，优选11.96 U/g。
进一步地，所述甲壳素酶SaChiA4的加入量为7～9 U/g，优选7.72 U/g。
进一步地，降解条件为：在45℃条件、pH 5.0条件下降解16小时。
一种降解中度乙酰化壳聚糖的方法：向中度乙酰化壳聚糖溶液中加入壳聚糖酶OUC-CsnCA和甲壳素酶SaChiA4，在40～55℃、pH 5.0～8.0条件下降解12～18小时，制备得到部分乙酰化壳寡糖，以完全脱乙酰的壳二糖与甲壳单糖为主；所述中度乙酰化壳聚糖是指脱乙酰度为40%～75%的壳聚糖，优选脱乙酰度为50.8%的壳聚糖。
进一步地，所述中度乙酰化壳聚糖溶液的浓度为1%～5%，优选2%。
进一步地，所述壳聚糖酶OUC-CsnCA的加入量为，优选11.96 U/g。
进一步地，所述甲壳素酶SaChiA4的加入量为，优选7.72 U/g。
进一步地，降解条件为：在45℃条件、pH 5.0条件下降解16小时。
本发明利用壳聚糖酶OUC-CsnCA和甲壳素酶SaChiA4联合降解中度乙酰化壳聚糖，解决了现有技术对高乙酰度壳聚糖降解能力不足的技术难题。本发明经研究发现，壳聚糖酶OUC-CsnCA作用中度乙酰化壳聚糖底物（DD=50.8%）的水解产物以二糖为主，水解较为彻底，且底物乙酰化程度的增大不利于壳聚糖酶OUC-CsnCA对底物的彻底水解。甲壳素酶SaChiA4对中度乙酰化壳聚糖底物（DD=50.8%）水解不彻底，形成的产物多为较大聚合度的乙酰化甲壳寡糖，且甲壳素酶SaChiA4偏好于水解乙酰基含量高的底物。而壳聚糖酶OUC-CsnCA 和甲壳素酶SaChiA4协同作用于中度乙酰化（DD=50.8%）壳聚糖底物时，效率增大，转化率更高，水解更为彻底，且水解产物中全脱乙酰壳寡糖含量增多；相较单独使用甲壳素酶SaChiA4，甲壳二糖含量增多，大聚合度甲壳类低聚糖含量明显减少。本发明对于降解中度乙酰化壳聚糖、酶法制备乙酰化低聚糖的研究具有重要的工业应用价值以及经济价值。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1：乙酰化壳聚糖的红外光谱图，其中，0.120g、0.247g、0.494g、0.741g、1.235g分别对应样品1、样品2、样品3、样品4、样品5。
图2：壳聚糖酶OUC-CsnCA作用于不同乙酰化壳聚糖后的吸光度示意图。
图3：甲壳素酶SaChiA4作用于不同乙酰化壳聚糖后的吸光度示意图。
图4：壳聚糖酶OUC-CsnCA水解壳聚糖产物生成时间分析示意图。
图5：甲壳素酶SaChiA4酶水解壳聚糖产物生成时间分析示意图。
图6：壳聚糖酶OUC-CsnCA水解中度乙酰化壳聚糖的产物质谱ESI-MS检测结果示意图。
图7：甲壳素酶SaChiA4水解中度乙酰化壳聚糖的产物质谱ESI-MS检测结果示意图。
图8：壳聚糖酶OUC-CsnCA和甲壳素酶SaChiA4协同水解中度乙酰化壳聚糖的产物质谱ESI-MS检测结果示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
实施例1 不同乙酰度壳聚糖的制备
本发明对脱乙酰度为95%的壳聚糖进行N-乙酰化反应制备不同乙酰度的壳聚糖，制备方法具体如下：
将4 g纯化后的壳聚糖（脱乙酰度95%）溶解于200 mL的0.6%（0.6 g/100 mL）的乙酸溶液中，分为5份，加入分别溶有乙酸酐0.120 g、0.247 g、0.494 g、0.741 g、1.235 g 的1,2-丙二醇溶液（25mL），依次标记为样品1～样品5，于30℃条件下不断搅拌反应6 h。反应完毕加入NaOH溶液，直至析出白色沉淀并且不再增加。沉淀用75%乙醇溶液（150mL）洗涤至中性后，放入80℃烘箱过夜（12 h），然后进行冷冻干燥、装瓶，测定其脱乙酰度。
壳聚糖样品的脱乙酰度采用红外光谱法测定：将壳聚糖样品在110℃下烘干后，与溴化钾混合研磨后压片，设定扫描范围为400～4000 cm-1，进行红外光谱检测并搜集整理数据。计算公式如下：
选择酰胺Ⅰ的谱带作为分析谱带（图1），以3450 cm-1作为参比谱带进行计算各个样品的脱乙酰度，计算结果如图1、表1所示。
表1 壳聚糖样品的脱乙酰度
由表1可知，样品1的脱乙酰度最高为76.4%，而样品5的脱乙酰度最低为50.8%，二者相差25.6%。并且随着乙酸酐浓度的增加，样品1～样品5的脱乙酰度依次降低。由此得到了中度脱乙酰度的壳聚糖样品。样品1～样品5分别溶于1%乙酸溶液中，得到浓度均为2.0%的样品1～样品5溶液（浓度单位g/ml），备用。
实施例2 壳聚糖酶OUC-CsnCA和甲壳素酶SaChiA4的制备
壳聚糖酶OUC-CsnCA，参照中国发明专利CN 111500555 A中记载的方法制备得到（得到的酶液，冷冻干燥，得到纯酶，其酶活为1786.2 U/mg）。纯酶溶于Tris-HCl缓冲液（pH7.4），得壳聚糖酶OUC-CsnCA溶液（浓度为1.25 mg/mL），备用。
甲壳素酶SaChiA4，参照中国发明专利CN 108342374 A中记载的方法制备得到（得到的酶液，冷冻干燥，得到纯酶，其酶活为66.2 U/mg）。纯酶溶于Tris-HCl缓冲液（pH 7.4），得甲壳素酶SaChiA4溶液（浓度为0.68 mg/mL），备用。
实施例3 降解不同乙酰度的壳聚糖
取样品1～样品5溶液各190μL，分别加入10μL的壳聚糖酶OUC-CsnCA溶液，再加入200μL的Tris-Hcl缓冲液，调节pH至6.0，在50℃条件下反应15 min。沸水浴10 min；加入300μL的3，5-二硝基水杨酸（DNS），沸水浴10 min后立即冷却。反应液加水1 mL进行稀释，12000g离心2 min，在540 nm处测定上清液吸光度。每个实验做三次平行。
取样品1～样品5溶液各80μL，分别加入20μL的甲壳素酶SaChiA4溶液，再加入100μL的Tris-Hcl缓冲液，调节pH至5.0，在55℃条件下反应30 min。沸水浴10 min；加入300μL的DNS，沸水浴10 min后立即冷却。反应液加水1 mL稀释，12000 g离心2 min，在540 nm处测定上清液吸光度。每个实验做三次平行。
通过生成还原糖的量分析壳聚糖酶OUC-CsnCA、甲壳素酶SaChiA4对不同脱乙酰度样品的降解能力，结果如图2、图3所示。
图2结果表明：壳聚糖酶OUC-CsnCA对于乙酰度较高的样品3、样品4、样品5活性较低，明显低于该酶作用与样品1、样品2时所表达的活性。可以看出该酶对底物的作用能力随样品的乙酰度的增高而降低，说明较高的乙酰化程度影响了壳聚糖酶OUC-CsnCA对壳聚糖的降解能力。
图3结果表明：甲壳素酶SaChiA4对样品3、样品4、样品5表现出高活性；对乙酰度较低的样品1、样品2表现出了低活性。并且随着乙酰度的增大，SaChiA4的活性增高。这表明乙酰基的存在促进了SaChiA4的酶解过程。
实施例4 壳聚糖酶OUC-CsnCA和甲壳素酶SaChiA4分别降解中度乙酰度壳聚糖的产物分析和水解特性分析
选择样品5为中度乙酰化壳聚糖。
取样品5溶液7份各190μL，分别加入10μL的壳聚糖酶OUC-CsnCA溶液，再加入200μLpH为8.0的Tris-Hcl缓冲液。在45℃（为使酶在较长时间中保持较高活性，选择在低于其最适温度的条件下进行反应）条件分别培养不同时间（5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、12 h、24 h）。沸水浴10 min；加入300μL的DNS，沸水浴10 min后立即冷却。反应液加水1 mL稀释，12000 g离心2 min，在540 nm处测定上清液吸光度。每个实验做三次平行。
取样品5溶液6份各80μL，分别加入20μL的甲壳素酶SaChiA4溶液，再加入100μL pH为5.0的Tris-Hcl缓冲液。在45℃（为使酶在较长时间中保持较高活性，选择在低于其最适温度的条件下进行反应）条件分别培养不同时间（1 h、3 h、8 h、12 h、24 h、48 h）。沸水浴10 min；加入300μL的DNS，沸水浴10 min后立即冷却。反应液加水1 mL稀释，12000 g离心2min，在540 nm处测定上清液吸光度。每个实验做三次平行。
通过不同时间下还原糖生成量的不同分析壳聚糖酶OUC-CsnCA和甲壳素酶SaChiA4的水解特性，结果如图4、图5所示。
通过图4可以看到，反应5～15 min，还原糖生成量迅速增多，中度乙酰化壳聚糖被快速水解生成甲壳类低聚糖。反应15～30 min，还原糖生成量增速变缓，而30 min以后还原糖生成量几乎保持不变，说明壳聚糖在30 min左右时已经完成酶解，通过测定残留壳聚糖重量得中度乙酰化壳聚糖经壳聚糖酶OUC-CsnCA酶解的转化率为32%。
通过图5可以看到，甲壳素酶SaChiA4水解中度乙酰化壳聚糖在1～8 h之间还原糖生成量缓慢增加，8～12 h之间还原糖生成量迅速增多，该时间段酶解反应速率较快，大量水解产物生成。到12 h之后，还原糖生成量几乎不发生改变，说明底物水解反应终止，中度乙酰化壳聚糖在12 h左右完成水解，通过测定残留壳聚糖重量得中度乙酰化壳聚糖经壳聚糖酶SaChiA4酶解的转化率为67%。
利用质谱仪分析验证壳聚糖酶OUC-CsnCA、甲壳素酶SaChiA4单独作用于中度乙酰化壳聚糖样品5水解产物的成分构成，结果图6、图7所示。
由图6可知，壳聚糖酶OUC-CsnCA水解壳聚糖样品5的水解产物以完全脱乙酰的壳二糖为主，此外，也存在少量的聚合度在1～4之间的甲壳低聚糖。即通过壳聚糖酶OUC-CsnCA水解中度乙酰化壳聚糖，可以得到完全脱乙酰的壳二糖。
由图7可知，甲壳素酶SaChiA4作用于壳聚糖样品5产物中甲壳单糖的占比较大，但总体来看，该酶的水解产物成分复杂，聚合度1～7的甲壳类低聚糖均存在，且占比较为均一，大量的大聚合度甲壳类低聚糖不能够被继续水解，说明SaChiA4作用中度乙酰化壳聚糖的水解不够彻底。
实施例5 壳聚糖酶OUC-CsnCA和甲壳素酶SaChiA4协同降解中度乙酰度壳聚糖的产物分析
实验分为三组：
第一组：取样品5溶液170μL，加入30μL的壳聚糖酶OUC-CsnCA溶液（调节pH至5.0），45℃条件下反应16 h，沸水浴10 min灭活。
第二组：取样品5溶液170μL，加入30μL的甲壳素酶SaChiA4溶液（调节pH至5.0），45℃条件下反应16 h，沸水浴10 min灭活。
第三组：取样品5溶液170μL，加入10μL的壳聚糖酶OUC-CsnCA溶液和20μL的甲壳素酶SaChiA4溶液（调节pH至5.0），45℃条件下反应16 h，沸水浴10 min灭活。
以上三组反应液，12000 g离心10 min，取上清液过膜，然后进行质谱检测，结果如图8所示。
当壳聚糖酶OUC-CsnCA与甲壳素酶SaChiA4联合水解壳聚糖样品5时，以全脱乙酰的壳二糖和甲壳单糖为主要水解产物，其它聚合度的甲壳类低聚糖含量很少。通过图6、图7、图8的对比不难发现，单独使用各酶时，壳聚糖酶OUC-CsnCA水解壳聚糖样品5较甲壳素酶SaChiA4产物水解更加彻底，且壳聚糖酶OUC-CsnCA水解产物多为壳寡糖，而甲壳素酶SaChiA4水解产物多为甲壳寡糖。当两酶联用时，产物组成相较两种酶单独使用发生了明显变化；相较单独使用甲壳素酶SaChiA4，甲壳二糖含量增多，大聚合度甲壳类低聚糖含量明显减少，说明两酶联用时，水解更为彻底，且主要产物为完全脱乙酰的壳二糖与甲壳单糖。
结论：首先，壳聚糖酶OUC-CsnCA和甲壳素酶SaChiA4单独作用中度乙酰化壳聚糖时，酶解效果较差，均不能彻底水解底物得到小聚合度的甲壳类低聚糖。而两酶联用，可使水解产物中大聚合物甲壳类低聚糖含量减少，达到了增大转换率、使中度乙酰化壳聚糖底物彻底水解的效果，转化率可达93%。其次，利用壳聚糖酶OUC-CsnCA和甲壳素酶SaChiA4联合作用中度乙酰化壳聚糖，可以得到以完全脱乙酰的壳二糖与甲壳单糖为主的水解产物。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
Claims (10)
1.壳聚糖酶OUC-CsnCA联合甲壳素酶SaChiA4在降解中度乙酰化壳聚糖中的应用，所述壳聚糖酶OUC-CsnCA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述甲壳素酶SaChiA4的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述中度乙酰化壳聚糖是指脱乙酰度为40%～75%的壳聚糖。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述中度乙酰化壳聚糖是指脱乙酰度为50.8%的壳聚糖。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述中度乙酰化壳聚糖是通过以下方法制备得到的：将脱乙酰度95%的壳聚糖溶解于乙酸溶液中，加入乙酸酐的1,2-丙二醇溶液，搅拌反应；加入NaOH溶液直至析出白色沉淀并且不再增加；沉淀用乙醇溶液洗涤至中性，干燥，即得。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：具体应用时，向中度乙酰化壳聚糖溶液中加入壳聚糖酶OUC-CsnCA和甲壳素酶SaChiA4，在40～55℃、pH 5.0～8.0条件下降解12～18小时，制备得到部分乙酰化壳寡糖。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述中度乙酰化壳聚糖溶液的浓度为1%～5%；所述壳聚糖酶OUC-CsnCA的加入量为10～15 U/g；所述甲壳素酶SaChiA4的加入量为7～9 U/g。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述中度乙酰化壳聚糖溶液的浓度为2%；所述壳聚糖酶OUC-CsnCA的加入量为11.96 U/g；所述甲壳素酶SaChiA4的加入量为7.72 U/g；降解条件为：在45℃条件、pH 5.0条件下降解16小时。
8.一种降解中度乙酰化壳聚糖的方法，其特征在于：向中度乙酰化壳聚糖溶液中加入壳聚糖酶OUC-CsnCA和甲壳素酶SaChiA4，在40～55℃、pH 5.0～8.0条件下降解12～18小时，制备得到部分乙酰化壳寡糖；所述中度乙酰化壳聚糖是指脱乙酰度为40%～75%的壳聚糖。
9.根据权利要求8所述的降解中度乙酰化壳聚糖的方法，其特征在于：所述中度乙酰化壳聚糖是指脱乙酰度为50.8%的壳聚糖；所述中度乙酰化壳聚糖溶液的浓度为1%～5%；所述壳聚糖酶OUC-CsnCA的加入量为10～15 U/g；所述甲壳素酶SaChiA4的加入量为7～9 U/g。
10.根据权利要求9所述的降解中度乙酰化壳聚糖的方法，其特征在于：所述中度乙酰化壳聚糖溶液的浓度为2%；所述壳聚糖酶OUC-CsnCA的加入量为11.96 U/g；所述甲壳素酶SaChiA4的加入量为7.72 U/g；降解条件为：在45℃条件、pH 5.0条件下降解16小时。
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| CN116790696B (zh) * | 2023-08-28 | 2023-11-03 | 中国海洋大学 | 利用裂解性多糖单加氧酶OsLPMO10A制备N-乙酰化壳二糖的方法 |
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