CN111718972B - 一种特定聚合度的壳寡糖的制备方法 - Google Patents

一种特定聚合度的壳寡糖的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特定聚合度的壳寡糖的制备方法，属于壳寡糖制备技术领域，所述制备方法包括以下步骤：S1、壳聚糖提纯；S2、制备壳聚糖溶液；S3、阶段一水解：向壳聚糖溶液中加入非特异性酶，超声反应0.5‑1.5h，之后升温灭活，中和，经离心过滤得聚合度为65‑115的低分子量壳聚糖溶液；S4、阶段二水解：向低分子量壳聚糖溶液中加入葡聚糖酶，反应1‑2h，之后升温灭活，中和，经离心过滤得聚合度为5‑7的壳寡糖混合物溶液，经分离、纯化、干燥处理后得聚合度5‑7的壳寡糖粉末。本发明先后采用对大分子亲和力高的非特异性酶和对小分子亲和力高的特异性酶‑葡聚糖酶作用壳聚糖，使反应速度大大提高，酶解反应在3.5h内即可完成，极大提升生产效率。

Description

一种特定聚合度的壳寡糖的制备方法
技术领域
本发明属于壳寡糖制备技术领域，具体涉及一种特定聚合度的壳寡糖的制备方法。
背景技术
壳寡糖又名壳聚寡糖、低聚壳聚糖，是壳聚糖经过特殊的生物技术处理得到的一种产品，分子量在3000Da以下，其化学结构与植物纤维及其相似，因此也被称为可食性动物纤维素，且壳寡糖于2014年被国家卫计委批准为新食品原料，在食品领域有较大的发展前景。据研究报道，壳寡糖具有免疫调节功能，能防癌、抗癌、抑制癌细胞转移，可以调节血糖、血压、血脂，强化肝脏功能，增强胃肠功能，具有抗衰老和抗疲劳、清除自由基，排除重金属离子等功能与活性，其中尤以壳五糖和壳六糖的抗肿瘤效果最优。
壳寡糖的结构与功能密切相关，聚合度范围越宽，其功能就越不明确。如聚合度为6的壳寡糖对肿瘤细胞的生长和癌细胞的转移有明显的抑制效果，壳四糖是Ⅱ型糖尿病的天然克星。目前，壳寡糖的制备方式主要是：化学法、物理法、酶解法以及电化学方法。其中，化学法所添加的试剂主要为盐酸、硫酸、双氧水等，不利于环保，而且化学试剂易残留在产品中，造成产品的不安全性；同时，该法制备条件相对剧烈，使产物杂质多、单糖含量高，使得寡糖产率低下，产品生物活性较低。物理法主要是用微波、超声波、γ射线等方法降解壳聚糖，该方法条件相对简单但需要特定设备，工艺条件不易控制，而且存在容易发生交联反应和产物质量差等缺点，不利于工业化生产。酶解法，主要是通过特异性酶和非特异性酶作用于壳聚糖生产壳寡糖，反应条件温和，易于环保，生产过程和产物分子量易于控制。酶解法所使用的酶包括非专一性酶如纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶等，价格低廉但酶解效率低，专一性酶如壳聚糖酶，价格高但效率高。
现有技术中，采用酶解法制备低聚合度的壳寡糖已有诸多报道。如专利CN201110405284.9一种应用复合酶制备壳寡糖的方法，采用纤维素酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、葡萄糖酶、木瓜蛋白酶复合酶在50-60℃摇床震荡降解壳聚糖2-3h，通过5000D分子筛和300D分子筛获得聚合度在2-30(分子量为300-5000D)的壳寡糖，壳寡糖分子量分布范围较为宽泛，针对性不强，酶解产物中高活性范围的含量低的问题仍没有解决。CN200710067143.4公布一种制备聚合度为4-7的壳寡糖的方法，以脱乙酰度为75-95％壳聚糖为原料，经壳聚糖酶水解后，当水解液中性溶液折光率为70％-85％终止反应，100℃灭酶后，离心取上清用85％-95％的丙酮或乙醇选择性沉淀制备聚合度4-7的壳寡糖，得率为85％-90％，未提及所制备壳寡糖聚合度和分子量分布。利用微波-酶法耦合降解壳聚糖，如专利CN201410337271.6公开了一种微波-酶法耦合降解壳聚糖的方法，首先，将高分子量的壳聚糖溶解在pH值为4-6的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，充分搅拌制成壳聚糖溶液；其次，向制得的壳聚糖溶液中加入质量为壳聚糖质量的0.5-3％的酶，搅拌均匀后将壳聚糖溶液倒入反应瓶中，再将反应瓶放入微波反应器中，并在反应瓶中通入氮气，控制温度在65℃以下、微波功率100-1000W条件下进行降解反应10-180min；降解反应结束后将微波升温至100℃使酶灭活，灭活反应时间为10-15min；最后，用碱性溶液将反应后的溶液pH值调节至7-8，再经过滤除去沉淀，将所得滤液用透析法除去盐离子后冷冻干燥，制得低分子量壳聚糖，但未提及所制备壳寡糖聚合度和分子量分布。综上，现有技术中，目标聚合度壳寡糖制备方法存在反应周期较长，所制备壳寡糖分子量分布较宽，得率低，针对性不强，而较窄的分子量分布需要投入膜处理设备，有机溶剂选择性沉淀会增加安全隐患等缺点。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种特定聚合度的壳寡糖的制备方法，先采用对大分子亲和力高的非特异性酶随机切割壳聚糖的高分子部分，将壳聚糖大分子水解为低分子量壳聚糖，然后采用对小分子亲和力高的特异性酶-葡聚糖酶作用低分子壳聚糖，使反应速度大大提高，酶解反应在3.5h内即可完成，极大提升生产效率。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种特定聚合度的壳寡糖的制备方法，包括以下步骤：
S1、壳聚糖提纯：用酸溶解壳聚糖后干燥处理，得到纯化壳聚糖；
S2、壳聚糖溶解：将步骤S1纯化后的壳聚糖加入酸溶液中，超声溶解，制备壳聚糖溶液；
S3、阶段一水解：按10-30U/g壳聚糖的添加量向壳聚糖溶液中加入非特异性酶，调节pH为4.0-5.0，在20-40℃条件下超声反应0.5-1.5h，降解完成后即升温灭活，中和，经离心过滤得聚合度为65-115的低分子量壳聚糖溶液；
S4、阶段二水解：按30-60U/g壳聚糖的添加量向低分子量壳聚糖溶液中加入葡聚糖酶，调节pH为4.5-6.5，45-55℃条件下反应1-2h，降解完成后即升温灭活，中和，经离心过滤得聚合度为5-7的壳寡糖混合物溶液，经分离、纯化、干燥处理后得聚合度5-7的壳寡糖粉末。
采用上述的技术方案：先通过超声的机械效应和热效应促进壳聚糖分子链断裂及初步降解，使克服自身分子间氢键作用及破坏结晶结构而逐渐崩解，溶液粘度急剧增大，然后加入非特异性酶，在超声条件下，高效将壳聚糖大分子水解为分子量较小的分子链段，迅速使溶液粘度大大降低，所得降解产物的分子量范围较宽；在超声条件下耦合酶反应，可在壳聚糖的溶解过程和非特异性酶水解过程相互配合，使壳聚糖边溶解边水解以降低溶液粘度，并具有适应浓度的反应底物，有利于提高反应速度，缩短降解时间。之后加入特异性酶，以维持高效的酶解效率，并专一性将低分子量壳聚糖降解为聚合度5-7(DP 5-7)的壳寡糖，所得壳聚糖降解产物分子量低，分布范围窄，产品得率高。
进一步的，步骤S2和S3中，所述超声条件为：超声功率80-150W、频率20-40HZ。
进一步的，步骤S2和S3中，所述超声条件为：超声功率100W、频率30HZ。
进一步的，步骤S3中，所述非特异性酶为溶菌酶、果胶酶、木瓜蛋白酶中的一种或多种。
进一步的，步骤S3中，所述非特异性酶为溶菌酶、果胶酶、木瓜蛋白酶按比活力7：6：7配制而成的复合酶。含有多种非特异性酶，其中，溶菌酶能够降解脱乙酰度不完全的壳聚糖，即切割乙酰氨基葡糖糖聚合物，而果胶酶属于内切酶，能够随机切割壳聚糖的糖苷键，将其降解成低分子量；木瓜蛋白酶则能够高效降解高聚合度的壳聚糖。将上述三种酶安特定比例混合在一起，使得降解效率提高，对不同聚合物度的壳聚糖、脱乙酰和未脱乙酰的壳聚糖等都能有效水解，避免了单一酶降解的缺陷，而且通过不同非特异性酶的集合，使得降解得到的产物中不同聚合度的低分子量壳聚糖均匀存在，制备目标DP5-7壳寡糖的产率高。
进一步的，步骤S3和S4中，所述中和过程为：调节pH至7.5-8.5。在该pH条件下，微量未降解的壳聚糖会形成沉淀，通过离心即可去除。
进一步的，步骤S3和S4中，中和过程采用的pH调节剂为三乙醇胺溶液或氨甲基丙醇溶液中一种。
进一步的，步骤S2中，所述酸溶液为0.8-5％乳酸，所述壳聚糖与乳酸质量比为5：4-3.5。
进一步的，步骤S1中，所述壳聚糖为脱乙酰度≥96％、分子量0.6-1×107Da的壳聚糖。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明先采用对大分子亲和力高的非特异性酶随机切割壳聚糖的高分子部分，将壳聚糖大分子水解为低分子量壳聚糖，然后采用对小分子亲和力高的特异性酶-葡聚糖酶作用低分子壳聚糖，使反应速度大大提高，酶解反应在3.5h内即可完成，极大提升生产效率。
2、采用非特异性酶结合特异性酶的复合酶解法，利于获得特定分子量壳寡糖(DP5-7)，所得壳寡糖的聚合度明确，分布范围窄，而且低分子量壳寡糖的产率及单体壳寡糖纯度也有较大提升。
3、本发明主要设备为超声波发生器、水浴锅等，工艺方法简单易操作，反应条件温和、易于控制，且涉及原料安全环保，更利于工业生产。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
一种特定聚合度的壳寡糖的制备方法，包括以下步骤：
S1、壳聚糖提纯：将脱乙酰度≥96％、分子量0.6-1×107Da的壳聚糖经0.8-5.0％乳酸水溶液溶解，在90-110℃下干燥得到纯化壳聚糖；
S2、壳聚糖溶解：将步骤S1纯化后的壳聚糖加入酸溶液中，置于超声波发生器，在超声功率80-150W、频率20-40HZ温度20-40℃的条件下超声至溶解，配制成3-5％壳聚糖溶液；
S3、阶段一水解：按10-30U/g壳聚糖的添加量向壳聚糖溶液中加入非特异性酶，调节pH为4.0-5.0，配制成壳聚糖反应液，再将壳聚糖反应液置于超声波发生器中，在20-40℃、超声功率80-150W、频率20-40HZ条件下反应0.5-1.5h，降解完成后即升温至100℃并保持8-13min使酶灭活，调节pH至7.5-8.5进行中和，经离心过滤得聚合度为65-115的低分子量壳聚糖溶液；
S4、阶段二水解：按30-60U/g壳聚糖的添加量向低分子量壳聚糖溶液中加入葡聚糖酶，调节pH为4.5-6.5，45-55℃条件下反应1-2h，降解完成后即升温至100℃并保持8-13min，使酶灭活，调节pH至7.5-8.5进行中和，经离心过滤得聚合度为5-7的壳寡糖混合物溶液，经特定分子筛分离纯化和真空冷冻干燥处理后得聚合度5-7壳寡糖粉末。
上述中和过程采用的pH调节剂为三乙醇胺溶液或氨甲基丙醇溶液中一种。
上述离心过滤的具体步骤为：将酶解液在4℃、8000r/min条件下高速冷冻离心10min，取上清液，向离心后的上清液中缓慢加入2-3倍体积的95％乙醇，静置5min后，在4℃、8000-10000r/min条件下冷冻离心20-30min，弃去上清，沉淀用纯水溶解，即得相应的聚合度为65-115的低分子量壳聚糖溶液或者聚合度为5-7的壳寡糖混合物溶液。先通过调节pH，加碱沉降未反应完的壳聚糖，然后离心去除酶和残余壳聚糖，之后醇沉去除少量单糖、二糖，取沉淀复溶得到聚合度为5-7的壳寡糖。
所述分离纯化的具体步骤为：采用凝胶色谱法对壳寡糖进行分离纯化，凝胶色谱填料BIO-GEL P2(填料排阻范围为100-1800Da)，固定床体积340mL(2.0×110cm)，最适上样量0.10g，流速0.20mL/min，分离过程使用的流动相为碳酸氢氨，可通过减压旋蒸除去。
由于现有技术中离心、醇沉、分离、纯化等相关操作研究的较多，本申请不单独进行讨论，以下实施例中，离心过滤和分离纯化皆采用上述步骤。其次，经过前期试验，酶解反应过程的温度和pH等对本发明聚合度为5-7的壳寡糖的得率和纯度影响不大，而且上述反应条件依据商品酶的差异略有不同，本申请也不再单独进行讨论。
实施例1
一种特定聚合度的壳寡糖的制备方法，包括以下步骤：
S1、壳聚糖提纯：将脱乙酰度≥96％、分子量0.6-1×107Da的壳聚糖经0.8-5.0％乳酸水溶液溶解，所述壳聚糖与乳酸质量比为5：4-3.5，在90-110℃下干燥得到纯化壳聚糖；
S2、壳聚糖溶解：将步骤S1纯化后的壳聚糖加入0.8-5.0％乳酸水溶液中，所述壳聚糖与乳酸质量比为5：4-3.5，置于超声波发生器，在超声功率80W、频率20HZ的条件下超声至溶解，配制成5％壳聚糖溶液；
S3、阶段一水解：按10U/g壳聚糖的添加量向壳聚糖溶液中加入复合酶，所述复合酶包括5U/g溶菌酶和5U/g果胶酶，调节pH为4.0-5.0，配制成壳聚糖反应液，再将壳聚糖反应液置于超声波发生器中，在30℃、超声功率100W、频率30HZ条件下反应0.5h，降解完成后即升温至100℃并保持8-13min使酶灭活，调节pH至7.5-8.5进行中和，经离心过滤得聚合度为86-115的低分子量壳聚糖溶液；
S4、阶段二水解：按30U/g壳聚糖的添加量向低分子量壳聚糖溶液中加入葡聚糖酶，调节pH为4.5-6.5，50℃条件下反应1h，降解完成后即升温至100℃并保持8-13min，使酶灭活，调节pH至7.5-8.5进行中和，经离心过滤得聚合度为5-7的壳寡糖混合物溶液，经特定分子筛分离纯化和真空冷冻干燥处理后得聚合度5-7壳寡糖粉末。
将得到的聚合度5-7壳寡糖粉末采用HPLC法检测其纯度：检测条件为：采用TSK2Gel Amide280柱、视差检测器检测，流动相为乙腈：水＝37：63，pH＝4.0，柱温25℃，上样量1μL。
壳聚糖转化率、壳寡糖纯度等检测结果见表1。
表1
Figure BDA0002603025660000061
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于：
S3、阶段一水解：按20U/g壳聚糖的添加量向壳聚糖溶液中加入果胶酶，调节pH为4.0-5.0，配制成壳聚糖反应液，再将壳聚糖反应液置于超声波发生器中，在30℃、超声功率100W、频率30HZ条件下反应1h，降解完成后即升温至100℃并保持8-13min使酶灭活，调节pH至7.5-8.5进行中和，经离心过滤得聚合度为75-110的低分子量壳聚糖溶液；
S4、阶段二水解：按45U/g壳聚糖的添加量向低分子量壳聚糖溶液中加入葡聚糖酶，调节pH为4.5-6.5，50℃条件下反应1.5h，降解完成后即升温至100℃并保持8-13min，使酶灭活，调节pH至7.5-8.5进行中和，经离心过滤得聚合度为5-7的壳寡糖混合物溶液，经特定分子筛分离纯化和真空冷冻干燥处理后得聚合度5-7壳寡糖粉末。
壳聚糖转化率、壳寡糖纯度等检测结果见表2。
表2
Figure BDA0002603025660000071
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于：
S3、阶段一水解：按30U/g壳聚糖的添加量向壳聚糖溶液中加入木瓜蛋白酶，调节pH为4.0-5.0，配制成壳聚糖反应液，再将壳聚糖反应液置于超声波发生器中，在30℃、超声功率100W、频率30HZ条件下反应2h，降解完成后即升温至100℃并保持8-13min使酶灭活，调节pH至7.5-8.5进行中和，经离心过滤得聚合度为65-100的低分子量壳聚糖溶液；
S4、阶段二水解：按60U/g壳聚糖的添加量向低分子量壳聚糖溶液中加入葡聚糖酶，调节pH为4.5-6.5，50℃条件下反应2h，降解完成后即升温至100℃并保持8-13min，使酶灭活，调节pH至7.5-8.5进行中和，经离心过滤得聚合度为5-7的壳寡糖混合物溶液，经特定分子筛分离纯化和真空冷冻干燥处理后得聚合度5-7壳寡糖粉末。壳聚糖转化率、壳寡糖纯度等检测结果见表3。
表3
Figure BDA0002603025660000081
实施例4
实施例4与实施例2的区别在于：
步骤S3中，按20U/g壳聚糖的添加量向壳聚糖溶液中加入复合酶，所述复合酶包括8U/g溶菌酶、4U/g果胶酶和8U/g木瓜蛋白酶，调节pH为4.0-5.0，配制成壳聚糖反应液，再将壳聚糖反应液置于超声波发生器中，在30℃、超声功率100W、频率30HZ条件下反应1h，降解完成后即升温至100℃并保持8-13min使酶灭活，调节pH至7.5-8.5进行中和，经离心过滤得聚合度为75-105的低分子量壳聚糖溶液。
壳聚糖转化率、壳寡糖纯度等检测结果见表4。
表4
Figure BDA0002603025660000082
实施例5
实施例5与实施例2的区别在于：
步骤S3中，按20U/g壳聚糖的添加量向壳聚糖溶液中加入复合酶，所述复合酶包括7U/g溶菌酶、6U/g果胶酶和7U/g木瓜蛋白酶，调节pH为4.0-5.0，配制成壳聚糖反应液，再将壳聚糖反应液置于超声波发生器中，在30℃、超声功率100W、频率30HZ条件下反应1h，降解完成后即升温至100℃并保持8-13min使酶灭活，调节pH至7.5-8.5进行中和，经离心过滤得聚合度为75-105的低分子量壳聚糖溶液。
壳聚糖转化率、壳寡糖纯度等检测结果见表5。
表5
Figure BDA0002603025660000091
实施例6
实施例6与实施例2的区别在于：
步骤S3中，按20U/g壳聚糖的添加量向壳聚糖溶液中加入复合酶，所述复合酶包括6U/g溶菌酶、8U/g果胶酶和6U/g木瓜蛋白酶，调节pH为4.0-5.0，配制成壳聚糖反应液，再将壳聚糖反应液置于超声波发生器中，在30℃、超声功率100W、频率30HZ条件下反应1h，降解完成后即升温至100℃并保持8-13min使酶灭活，调节pH至7.5-8.5进行中和，经离心过滤得聚合度为75-105的低分子量壳聚糖溶液。
壳聚糖转化率、壳寡糖纯度等检测结果见表6。
表6
Figure BDA0002603025660000092
对比例1
对比例1与实施例2的区别在于：
S3、阶段一水解：按20U/g壳聚糖的添加量向壳聚糖溶液中加入果胶酶，调节pH为4.0-5.0，配制成壳聚糖反应液，再将壳聚糖反应液置于超声波发生器中，在30℃、超声功率100W、频率30HZ条件下反应1h，降解完成后即升温至100℃并保持8-13min使酶灭活，调节pH至7.5-8.5进行中和，经离心过滤得聚合度为75-110的低分子量壳聚糖溶液；
S4、阶段二水解：按45U/g壳聚糖的添加量向低分子量壳聚糖溶液中加入果胶酶，调节pH为4.0-5.0，50℃条件下反应1.5h，降解完成后即升温至100℃并保持8-13min，使酶灭活，调节pH至7.5-8.5进行中和，经离心过滤得聚合度为5-7的壳寡糖混合物溶液，经特定分子筛分离纯化和真空冷冻干燥处理后得聚合度5-7壳寡糖粉末。
壳聚糖转化率、壳寡糖纯度等检测结果见表7。
表7
Figure BDA0002603025660000101
对比例2
对比例2与实施例2的区别在于：
S3、阶段一水解：按20U/g壳聚糖的添加量向壳聚糖溶液中加入葡聚糖酶，调节pH为4.5-6.5，配制成壳聚糖反应液，再将壳聚糖反应液置于超声波发生器中，在30℃、超声功率100W、频率30HZ条件下反应1h，降解完成后即升温至100℃并保持8-13min使酶灭活，调节pH至7.5-8.5进行中和，经离心过滤得聚合度为75-135的低分子量壳聚糖溶液；
S4、阶段二水解：按45U/g壳聚糖的添加量向低分子量壳聚糖溶液中加入葡聚糖酶，调节pH为4.5-6.5，50℃条件下反应1.5h，降解完成后即升温至100℃并保持8-13min，使酶灭活，调节pH至7.5-8.5进行中和，经离心过滤得聚合度为5-7的壳寡糖混合物溶液，经特定分子筛分离纯化和真空冷冻干燥处理后得聚合度5-7壳寡糖粉末。
壳聚糖转化率、壳寡糖纯度等检测结果见表8。
表8
Figure BDA0002603025660000111
对比例3
对比例3与实施例2的区别在于：无阶段二水解，在阶段一水解中同时加入果胶酶和葡聚糖酶。
S3、阶段一水解：按20U/g壳聚糖的添加量向壳聚糖溶液中加入果胶酶，并按45U/g壳聚糖的添加量向壳聚糖溶液中加入葡聚糖酶，调节pH为4.5-5.0，配制成壳聚糖反应液，再将壳聚糖反应液置于超声波发生器中，在30℃、超声功率100W、频率30HZ条件下反应2h，降解完成后即升温至100℃并保持8-13min使酶灭活，调节pH至7.5-8.5进行中和，经离心过滤得聚合度为5-7的壳寡糖混合物溶液，经特定分子筛分离纯化和真空冷冻干燥处理后得聚合度5-7壳寡糖粉末。
壳聚糖转化率、壳寡糖纯度等检测结果见表9。
表9
Figure BDA0002603025660000112
对比例4
对比例4与实施例2的区别在于：
S3、阶段一水解：按20U/g壳聚糖的添加量向壳聚糖溶液中加入葡聚糖酶，调节pH为4.5-6.5，配制成壳聚糖反应液，在30℃条件下水浴反应1h，降解完成后即升温至100℃并保持8-13min使酶灭活，调节pH至7.5-8.5进行中和，经离心过滤得聚合度为110-157的低分子量壳聚糖溶液。
壳聚糖转化率、壳寡糖纯度等检测结果见表10。
表10
Figure BDA0002603025660000121
对比例5
对比例5与实施例2的区别在于：
S3、阶段一水解：按20U/g壳聚糖的添加量向壳聚糖溶液中加入果胶酶，调节pH为4.0-5.0，配制成壳聚糖反应液，再将壳聚糖反应液置于超声波发生器中，在30℃、超声功率200W、频率50HZ条件下反应1h，降解完成后即升温至100℃并保持8-13min使酶灭活，调节pH至7.5-8.5进行中和，经离心过滤得聚合度为45-95的低分子量壳聚糖溶液。
壳聚糖转化率、壳寡糖纯度等检测结果见表11。
表11
Figure BDA0002603025660000122
Figure BDA0002603025660000131
分析实施例1～3的数据可知，随着非特异性酶和葡聚糖酶含量的增加以及反应时间的延长，DP 5-7壳寡糖的转化率和纯度呈现先增加后降低的趋势，这是因为随着酶浓度的增加，反应速度加快，且反应时间延长，有利于壳聚糖降解，因而提高了DP 5-7的壳寡糖的生成量，但是酶浓度过高或反应时间过长，会造成过度的酶解反应，导致已生成的聚合度为5-7的壳寡糖进一步降解为二糖、三糖、四糖等，引起DP 5-7壳寡糖的生成量降低。
实施例4-6相比于实施例2，阶段一水解采用复合酶相比于单一酶具有更高的优势，所得产物中不同聚合度的低分子量壳聚糖均匀存在，制备目标DP 5-7壳寡糖的产率和纯度高。相应的，当对比例1-2在阶段一水解和阶段二水解过程中均分别采用单一酶，DP 5-7壳寡糖的得率和纯度均显著降低。此外，更改非特异性酶和特异性酶的加入时机，如对比例3采用混合加入，由于不同酶对底物的亲和力差异以及底物竞争关系，将导致反应速度降低，使得壳寡糖的生成量显著降低。因此，只有在本发明的加入顺序下，才能得到壳寡糖的聚合度明确，分布范围窄，而且低分子量壳寡糖的产率及单体壳寡糖纯度高的产品。
对比例4不采用超声波辅助酶解反应，一方面壳聚糖的溶解速度慢，另一方面溶液黏度大导致酶与底物的接触概率低，使得反应速度明显降低；对比例5采用大功率、高频率的超声波，热效应明显，局部温度过高，对酶活性影响较大，也会一定程度降低反应速度。因此，对比例4-5的壳寡糖产率及单体壳寡糖纯度低于实施例1-6。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种特定聚合度的壳寡糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、壳聚糖提纯：准备脱乙酰度≥96%、分子量为0.6-1x107Da 的壳聚糖，用酸溶解所述壳聚糖后干燥处理，得到纯化壳聚糖；
S2、壳聚糖溶解：将步骤S1纯化后的壳聚糖加入酸溶液中，超声溶解，制备壳聚糖溶液；
S3、阶段一水解：按10-30U/ g 壳聚糖的添加量向壳聚糖溶液中加入非特异性酶，调节pH为4.0-5.0，在20-40℃条件下超声反应0.5-1.5h，降解完成后即升温灭活，中和，经离心过滤得聚合度为65-115的低分子量壳聚糖溶液；
S4、阶段二水解：按30-60U/ g 壳聚糖的添加量向低分子量壳聚糖溶液中加入葡聚糖酶，调节pH为4.5-6.5，45-55℃条件下反应1-2h，降解完成后即升温灭活，中和，经离心过滤得聚合度为5-7的壳寡糖混合物溶液，经分离、纯化、干燥处理后得聚合度5-7的壳寡糖粉末；
所述步骤S2和S3中，所述超声条件为：超声功率80-150W、频率20-40HZ，所述步骤S3中，所述非特异性酶为果胶酶或木瓜蛋白酶，或溶菌酶、果胶酶、木瓜蛋白酶中的多种。
2.根据权利要求1所述的一种特定聚合度的壳寡糖的制备方法，其特征在于，步骤S2和S3中，所述超声条件为：超声功率100W、频率30HZ。
3.根据权利要求1所述的一种特定聚合度的壳寡糖的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述非特异性酶为溶菌酶、果胶酶、木瓜蛋白酶按比活力7:6:7配制而成的复合酶。
4.根据权利要求1所述的一种特定聚合度的壳寡糖的制备方法，其特征在于，步骤S3和S4中，所述中和过程为：调节pH至7.5-8.5。
5.根据权利要求1所述的一种特定聚合度的壳寡糖的制备方法，其特征在于，步骤S3和S4中，中和过程采用的pH调节剂为三乙醇胺溶液或氨甲基丙醇溶液中一种。
6.根据权利要求1所述的一种特定聚合度的壳寡糖的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述酸溶液为0.8-5%乳酸，所述壳聚糖与乳酸质量比为5:4-3.5。
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