CN116178577B - 一种高纯度微藻多糖及其提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高纯度微藻多糖的提取方法，所述提取方法包括如下步骤：复合酶酶解破壁处理；制备并筛选新型深层共晶溶剂，提取拟微球藻多糖；制备新型蛋白处理剂，高效除蛋白；制备新型脱色除杂处理剂，有效脱除色素与其他杂质；膜过滤；减压浓缩；喷雾干燥，得到成品；该方法操作简单、提取时间短、提取效率高、蛋白色素脱除效果好，可进行工业化生产，可获得高纯度，杂质少的微藻多糖产品。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高纯度微藻多糖及其提取方法。
背景技术
微藻多糖一般为酸性杂多糖，其单糖组成较为复杂且多带硫酸化修饰，连接方式上既有α糖苷键又含有β糖苷键，多带有分支；相对分子质量一般较大，多大于10KDa。根据微藻种类的不同，单糖组成成分也大不相同其中葡萄糖是最主要的单糖，占总含量的21％～87％；其次是半乳糖和甘露糖，分别占1％～20％和2％～46％，其他为阿拉伯糖、岩藻糖、鼠李糖、核糖和木糖，占0％～17％。微藻多糖的生物活性功能主要有抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、增强机体免疫活性、抗辐射、抗突变及调血脂等。微藻多糖大多应用于在生物医药、饲料添加剂、化妆品行业，之后可以进一步拓展向机械和船舶工程(如缓冲剂、生物润滑剂等)、生物农药和食品工程等领域。
目前，国内外提取藻类多糖主要采用稀碱、稀酸与热水抽提的方法。其优点是工艺简单、操作方便、成本低，缺点是提取率较低、活性损失大、过滤纯化困难，这大大限制了多糖的大规模工业化生产。近年来，如微波辅助提取、超声波辅助提取、酶解辅助提取等提取技术在传统浸提法的基础上发展起来，但藻类多糖的纯化方法多糖损失率高、纯度低，尤其是在脱色方面的能力有限，不能有效的对藻类多糖进行脱色。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明提供了一种高纯度微藻多糖的提取方法，其生产工艺简单、便捷，可规模化生产，在酶解与深层共晶溶剂条件下即可有效提取微藻多糖，进一步纯化处理，可获得提取率高、高纯度的微藻多糖。
为实现以上技术目的，本发明的技术方案是：
一种高纯度微藻多糖的提取方法，所述提取方法包括如下步骤：
S1、复合酶酶解破壁处理：配制微球藻溶液，料液比范围为1:5～1:25g/mL，加入0.2％～1.0％复合酶，酶解温度为40～60℃，酶解pH为4.0～7.5，酶解时间为2～7h；
S2、微藻多糖提取：将破壁后的微藻酶解液与深层共晶溶液按照质量比为1:10～1:40的比例充分混合均匀，提取温度为40～60℃，提取时间为2～7h，得到微藻多糖粗提液；
S3、微藻多糖脱蛋白：将蛋白处理剂按2％～8％的比例加入到微藻多糖粗提液中，充分混合均匀，静置，离心后得到上清液，即为微藻多糖纯化液；
S4、微藻多糖脱色除杂：将脱色除杂处理剂按2％～8％的比例加入到微藻多糖纯化液中，充分混合均匀，静置，离心后得到上清液，即为微藻多糖精制液；
S5、制成成品：将微藻多糖精制液进行陶瓷膜过滤，得到陶瓷膜清液，即得到微藻多糖溶液；将微藻多糖溶液进行减压浓缩，喷雾干燥，得到微藻多糖产品。
本发明S1中所述复合酶为酸性纤维素酶、果胶酶与木瓜蛋白酶；所述酸性纤维素酶、果胶酶与木瓜蛋白酶的质量比为1:2:1。
本发明S2中深层共晶溶液的配制方法如下：将氢键受体与氢键供体按照摩尔比为1:1～5的比例的添加到广口瓶中，在50～70℃下，边搅拌边加入去离子水，直至溶液呈现澄清透明的状态，得到深层共晶溶液。
本发明所述氢键受体为蛋氨酸、氯化胆碱、甜菜碱的一种或两种组合；所述氢键供体为草酸、咖啡酸、乳酸、低聚木糖、低聚果糖、山梨醇、木糖醇、甘油中的两种或三种组合。
本发明S3中蛋白处理剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将壳聚糖溶于1％醋酸溶液，常温下溶胀8～10h，溶胀完成后加入氢氧化钠使其析出，过滤得到溶胀的壳聚糖；
(2)将溶胀后的壳聚糖水洗至中性，加入到四口烧瓶中，先后向四口烧瓶中加入烯类单体溶液和反应介质，并采用微波、紫外或脉冲电场的反应引发方式引发聚合；
(3)先后用异丙醇和丙酮对步骤(2)的产物进行分离提纯，置于70℃条件下烘干处理，得到蛋白处理剂。
本发明步骤(2)中的烯类单体为丁烯酸、甲基丙烯酸-2-羟基丙酯或二烯丙基二乙基氯化铵中的至少一种。
本发明步骤(2)中的所述烯类单体溶液的质量浓度为20～40％。
本发明S4中脱色除杂处理剂的制备方法，包括如下步骤：
A、将活化后的玉米芯溶于1％柠檬酸溶液，常温下溶胀8～10h，溶胀完成后加入氢氧化钠使其析出，过滤得到溶胀的玉米芯；
B、将溶胀后的玉米芯水洗至中性，加入到四口烧瓶中，然后加入[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵或丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵溶液和反应介质，并采用脉冲电场的反应引发方式引发聚合；
C、先后用异丙醇和丙酮对步骤(2)的产物进行分离提纯，置于70℃条件下烘干处理，得到脱色除杂处理剂。
本发明步骤B中的[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵或丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵溶液的质量浓度为25～45％。
本发明反应介质为水和异丙醇的混合液，其中所述水和异丙醇的体积比为3:1。
从以上描述可以看出，本发明具备以下优点：
(1)本发明采用酶解与深层共晶溶剂提取微藻多糖，使用纯化方法进行纯化，喷雾干燥获得微藻多糖。该方法操作简单、提取时间短、提取效率高、蛋白色素脱除效果好，可进行工业化生产，可获得高纯度，杂质少的微藻多糖产品。
(2)本发明开发的深层共晶溶液，可高效提取微藻多糖，提取率高达98.2％。
(3)本发明开发的蛋白处理剂，可有效去除蛋白，蛋白脱除率可达95％以上；
(4)本发明开发的脱色除杂处理剂，可有效去除色素与其他杂质，多糖纯度可达98％以上。
具体实施方式
下面通过实施例，进一步阐述本发明的特点，但不对本发明的权利要求做任何限定。
实施例1
1、配制拟微球藻溶液，其料液比为1:5g/mL，复合酶为酸性纤维素酶、果胶酶与木瓜蛋白酶，酸性纤维素酶、果胶酶与木瓜蛋白酶的质量比为1:2:1，复合酶的用量为0.7％，酶解温度为50℃，酶解pH为6.5，酶解时间为5h。
2、选用蛋氨酸、氯化胆碱、甜菜碱的一种或两种与草酸、咖啡酸、乳酸、低聚木糖、低聚果糖、山梨醇、木糖醇、甘油的两种或三种进行组合，得到共16种深层共晶溶液，将破壁后的微藻酶解液与16种深层共晶溶液按照质量比为1:15的比例充分混合均匀，提取条件为：提取温度为60℃，提取时间为4h，得到微藻多糖粗提液。
3、将壳聚糖溶于1％醋酸溶液，常温下充分溶胀，溶胀时间为8-10小时，溶胀完成后加入氢氧化钠使其析出，过滤得到溶胀的壳聚糖，水洗至中性后加入到250ml四口烧瓶中，然后加入一定体积的质量浓度为30％的二烯丙基二乙基氯化铵溶液，同时以水和异丙醇体积比为3:1的溶液作为反应介质，在电场强度为15kv/cm，脉冲数为12个的脉冲电场条件下充分反应，结束后分别用异丙醇和丙酮对产物进行分离提纯，最后于70℃条件下烘干备用。
将蛋白处理剂粉末按照5％的比例加入到微藻多糖粗提液中，充分混合均匀，静置，离心后得到上清液，即为微藻多糖纯化液。
4、将活化后的玉米芯溶于1％柠檬酸溶液，常温下充分溶胀，溶胀时间为8-10小时，溶胀完成后加入氢氧化钠使其析出，过滤得到溶胀的玉米芯，水洗至中性后加入到250ml四口烧瓶中，然后加入一定体积的质量浓度为35％的[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵溶液，同时以水和异丙醇体积比为3:1的溶液作为反应介质，在电场强度为15kv/cm，脉冲数为12个的脉冲电场条件下充分反应，结束后分别用异丙醇和丙酮对产物进行分离提纯，最后于70℃条件下烘干备用。
将脱色除杂处理剂粉按照4％的比例加入到微藻多糖纯化液中，充分混合均匀，静置，离心后得到上清液，即为微藻多糖精制液。
5、将微藻多糖精制液进行陶瓷膜过滤，得到陶瓷膜清液，即得到微藻多糖溶液。
6、将微藻多糖溶液进行减压浓缩，喷雾干燥，得到微藻多糖产品。
实施例2
1、配制拟微球藻溶液，其料液比为1:5g/mL，复合酶为酸性纤维素酶、果胶酶与木瓜蛋白酶，酸性纤维素酶、果胶酶与木瓜蛋白酶的质量比为1:2:1，复合酶的用量为0.7％，酶解温度为50℃，酶解pH为6.5，酶解时间为5小时。
2、以蛋氨酸、甜菜碱、低聚木糖与咖啡酸为深层共晶溶液的原料，其摩尔比为1：1：2：3，配制成水溶液，其原料与水的比例为1:1.5，60℃下充分搅拌直至溶液呈现澄清透明的状态。
将破壁后的微藻酶解液与配制好的深层共晶溶液按照1:15g/g的比例充分混合均匀，提取条件为：提取温度为60℃，提取时间为4小时，得到微藻多糖粗提液。
3、采用微波的反应引发方式，将壳聚糖与二烯丙基二乙基氯化铵共聚合成一种的蛋白处理剂。
将壳聚糖溶于1％醋酸溶液，常温下充分溶胀，溶胀时间为8-10小时，溶胀完成后加入氢氧化钠使其析出，过滤得到溶胀的壳聚糖，水洗至中性后加入到250ml四口烧瓶中，然后加入一定体积的质量浓度为30％的二烯丙基二乙基氯化铵溶液，同时以水和异丙醇体积比为3:1的溶液作为反应介质，在微波功率为300W，作用时间为60min的微波条件下充分反应，结束后分别用异丙醇和丙酮对产物进行分离提纯，最后于70℃条件下烘干备用。
将蛋白处理剂粉按照5％的比例加入到微藻多糖粗提液中，充分混合均匀，静置，离心后得到上清液，即为微藻多糖纯化液。
4、将活化后的玉米芯溶于1％柠檬酸溶液，常温下充分溶胀，溶胀时间为8-10小时，溶胀完成后加入氢氧化钠使其析出，过滤得到溶胀的玉米芯，水洗至中性后加入到250ml四口烧瓶中，然后加入一定体积的质量浓度为35％的[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵溶液，同时以水和异丙醇体积比为3:1的溶液作为反应介质，在电场强度为15kv/cm，脉冲数为12个的脉冲电场条件下充分反应，结束后分别用异丙醇和丙酮对产物进行分离提纯，最后于70℃条件下烘干备用。
将脱色除杂处理剂粉按照4％的比例加入到微藻多糖纯化液中，充分混合均匀，静置，离心后得到上清液，即为微藻多糖精制液。
5、将微藻多糖精制液进行陶瓷膜过滤，得到陶瓷膜清液，即得到微藻多糖溶液。
6、将微藻多糖溶液进行减压浓缩，喷雾干燥，得到微藻多糖产品。
通过微波作为反应引发方式，微藻多糖的蛋白脱除率为93.3％，多糖损失率为2.8％。
实施例3
1、配制拟微球藻溶液，其料液比为1:5g/mL，复合酶为酸性纤维素酶、果胶酶与木瓜蛋白酶，酸性纤维素酶、果胶酶与木瓜蛋白酶的质量比为1:2:1，复合酶的用量为0.7％，酶解温度为50℃，酶解pH为6.5，酶解时间为5小时。
2、以蛋氨酸、甜菜碱、低聚木糖与咖啡酸为深层共晶溶液的原料，其摩尔比为1：1：2：3，配制成水溶液，其原料与水的比例为1:1.5，60℃下充分搅拌直至溶液呈现澄清透明的状态。
将破壁后的微藻酶解液与配制号的深层共晶溶液按照1:15g/g的比例充分混合均匀，提取条件为：提取温度为60℃，提取时间为4小时，得到微藻多糖粗提液。
3、采用超声的反应引发方式，将壳聚糖与二烯丙基二乙基氯化铵共聚合成一种的蛋白处理剂。
将壳聚糖溶于1％醋酸溶液，常温下充分溶胀，溶胀时间为8-10小时，溶胀完成后加入氢氧化钠使其析出，过滤得到溶胀的壳聚糖，水洗至中性后加入到250ml四口烧瓶中，然后加入一定体积的质量浓度为30％的二烯丙基二乙基氯化铵溶液，同时以水和异丙醇体积比为3:1的溶液作为反应介质，在超声功率为400W，作用时间为70min的超声条件下充分反应，结束后分别用异丙醇和丙酮对产物进行分离提纯，最后于70℃条件下烘干备用。
将蛋白处理剂粉按照5％的比例加入到微藻多糖粗提液中，充分混合均匀，静置，离心后得到上清液，即为微藻多糖纯化液。
4、将活化后的玉米芯溶于1％柠檬酸溶液，常温下充分溶胀，溶胀时间为8-10小时，溶胀完成后加入氢氧化钠使其析出，过滤得到溶胀的玉米芯，水洗至中性后加入到250ml四口烧瓶中，然后加入一定体积的质量浓度为35％的[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵溶液，同时以水和异丙醇体积比为3:1的溶液作为反应介质，在电场强度为15kv/cm，脉冲数为12个的脉冲电场条件下充分反应，结束后分别用异丙醇和丙酮对产物进行分离提纯，最后于70℃条件下烘干备用。
将脱色除杂处理剂粉按照4％的比例加入到微藻多糖纯化液中，充分混合均匀，静置，离心后得到上清液，即为微藻多糖精制液。
5、将微藻多糖精制液进行陶瓷膜过滤，得到陶瓷膜清液，即得到微藻多糖溶液。
6、将微藻多糖溶液进行减压浓缩，喷雾干燥，得到微藻多糖产品。
通过微波作为反应引发方式，微藻多糖的蛋白脱除率为92.0％，多糖损失率为2.5％。
实施例4
1、配制拟微球藻溶液，其料液比为1:5g/mL，复合酶为酸性纤维素酶、果胶酶与木瓜蛋白酶，酸性纤维素酶、果胶酶与木瓜蛋白酶的质量比为1:2:1，复合酶的用量为0.7％，酶解温度为50℃，酶解pH为6.5，酶解时间为5小时。
2、以蛋氨酸、甜菜碱、低聚木糖与咖啡酸为深层共晶溶液的原料，其摩尔比为1：1：2：3，配制成水溶液，其原料与水的比例为1:1.5，60℃下充分搅拌直至溶液呈现澄清透明的状态。
将破壁后的微藻酶解液与配制号的深层共晶溶液按照1:15g/g的比例充分混合均匀，提取条件为：提取温度为60℃，提取时间为4小时，得到微藻多糖粗提液。
4、采用脉冲电场的反应引发方式，将壳聚糖与二烯丙基二乙基氯化铵或丁烯酸、甲基丙烯酸-2-羟基丙酯共聚合成一种的蛋白处理剂。
将壳聚糖溶于1％醋酸溶液，常温下充分溶胀，溶胀时间为8-10小时，溶胀完成后加入氢氧化钠使其析出，过滤得到溶胀的壳聚糖，水洗至中性后加入到250ml四口烧瓶中，然后加入一定体积的质量浓度为30％的二烯丙基二乙基氯化铵溶液或丁烯酸、甲基丙烯酸-2-羟基丙酯混合溶液，同时以水和异丙醇体积比为3:1的溶液作为反应介质，在电场强度为15kv/cm，脉冲数为12个的脉冲电场条件下充分反应，结束后分别用异丙醇和丙酮对产物进行分离提纯，最后于70℃条件下烘干备用。
将蛋白处理剂粉按照5％的比例加入到微藻多糖粗提液中，充分混合均匀，静置，离心后得到上清液，即为微藻多糖纯化液。
4、将活化后的玉米芯溶于1％柠檬酸溶液，常温下充分溶胀，溶胀时间为8-10小时，溶胀完成后加入氢氧化钠使其析出，过滤得到溶胀的玉米芯，水洗至中性后加入到250ml四口烧瓶中，然后分别加入一定体积的质量浓度为35％的[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵溶液，同时以水和异丙醇体积比为3:1的溶液作为反应介质，在电场强度为15kv/cm，脉冲数为12个的脉冲电场条件下充分反应，结束后分别用异丙醇和丙酮对产物进行分离提纯，最后于70℃条件下烘干备用。
将脱色除杂处理剂粉按照4％的比例加入到微藻多糖纯化液中，充分混合均匀，静置，离心后得到上清液，即为微藻多糖精制液。
5、将微藻多糖精制液进行陶瓷膜过滤，得到陶瓷膜清液，即得到微藻多糖溶液。
6、将微藻多糖溶液进行减压浓缩，喷雾干燥，得到微藻多糖产品。
蛋白处理剂的制备
实施例5
1、配制拟微球藻溶液，其料液比为1:5g/mL，复合酶为酸性纤维素酶、果胶酶与木瓜蛋白酶，酸性纤维素酶、果胶酶与木瓜蛋白酶的质量比为1:2:1，复合酶的用量为0.7％，酶解温度为50℃，酶解pH为6.5，酶解时间为5小时。
2、以蛋氨酸、甜菜碱、低聚木糖与咖啡酸为深层共晶溶液的原料，其摩尔比为1：1：2：3，配制成水溶液，其原料与水的比例为1:1.5，60℃下充分搅拌直至溶液呈现澄清透明的状态。
将破壁后的微藻酶解液与配制好的深层共晶溶液按照1:15g/g的比例充分混合均匀，提取条件为：提取温度为60℃，提取时间为4小时，得到微藻多糖粗提液。
3、将壳聚糖溶于1％醋酸溶液，常温下充分溶胀，溶胀时间为8-10小时，溶胀完成后加入氢氧化钠使其析出，过滤得到溶胀的壳聚糖，水洗至中性后加入到250ml四口烧瓶中，然后加入一定体积的质量浓度为30％的二烯丙基二乙基氯化铵溶液，同时以水和异丙醇体积比为3:1的溶液作为反应介质，在电场强度为15kv/cm，脉冲数为12个的脉冲电场条件下充分反应，结束后分别用异丙醇和丙酮对产物进行分离提纯，最后于70℃条件下烘干备用。
将蛋白处理剂粉按照5％的比例加入到微藻多糖粗提液中，充分混合均匀，静置，离心后得到上清液，即为微藻多糖纯化液。
4、将活化后的玉米芯溶于1％柠檬酸溶液，常温下充分溶胀，溶胀时间为8-10小时，溶胀完成后加入氢氧化钠使其析出，过滤得到溶胀的玉米芯，水洗至中性后加入到250ml四口烧瓶中，然后分别加入一定体积的质量浓度为35％的[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵溶液或丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵溶液，同时以水和异丙醇体积比为3:1的溶液作为反应介质，在电场强度为15kv/cm，脉冲数为12个的脉冲电场条件下充分反应，结束后分别用异丙醇和丙酮对产物进行分离提纯，最后于70℃条件下烘干备用。
将脱色除杂处理剂粉按照4％的比例加入到微藻多糖纯化液中，充分混合均匀，静置，离心后得到上清液，即为微藻多糖精制液。
5、将微藻多糖精制液进行陶瓷膜过滤，得到陶瓷膜清液，即得到微藻多糖溶液。
6、将微藻多糖溶液进行减压浓缩，喷雾干燥，得到微藻多糖产品。
脱色除杂处理剂的制备
实施例6
1、配制拟微球藻溶液，其料液比为1:5g/mL，复合酶为酸性纤维素酶、果胶酶与木瓜蛋白酶，酸性纤维素酶、果胶酶与木瓜蛋白酶的质量比为1:2:1，复合酶的用量为0.7％，酶解温度为50℃，酶解pH为6.5，酶解时间为5小时。
2、将破壁后的微藻酶解液与深层共晶溶液按照1:15g/g的比例充分混合均匀，提取条件为：提取温度为60℃，提取时间为4小时，得到微藻多糖粗提液。
3、将壳聚糖溶于1％醋酸溶液，常温下充分溶胀，溶胀时间为8-10小时，溶胀完成后加入氢氧化钠使其析出，过滤得到溶胀的壳聚糖，水洗至中性后加入到250ml四口烧瓶中，然后加入一定体积的质量浓度为30％的二烯丙基二乙基氯化铵溶液，同时以水和异丙醇体积比为3:1的溶液作为反应介质，在电场强度为15kv/cm，脉冲数为12个的脉冲电场条件下充分反应，结束后分别用异丙醇和丙酮对产物进行分离提纯，最后于70℃条件下烘干备用。
将蛋白处理剂粉按照5％的比例加入到微藻多糖粗提液中，充分混合均匀，静置，离心后得到上清液，即为微藻多糖纯化液。
4、将活化后的玉米芯溶于1％柠檬酸溶液，常温下充分溶胀，溶胀时间为8-10小时，溶胀完成后加入氢氧化钠使其析出，过滤得到溶胀的壳聚糖，水洗至中性后加入到250ml四口烧瓶中，然后加入一定体积的质量浓度为35％的[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵溶液，同时以水和异丙醇体积比为3:1的溶液作为反应介质，在电场强度为15kv/cm，脉冲数为12个的脉冲电场条件下充分反应，结束后分别用异丙醇和丙酮对产物进行分离提纯，最后于70℃条件下烘干备用。
将脱色除杂处理剂粉按照4％的比例加入到微藻多糖纯化液中，充分混合均匀，静置，离心后得到上清液，即为微藻多糖精制液。
5、将微藻多糖精制液进行陶瓷膜过滤，得到陶瓷膜清液，即得到微藻多糖溶液。
6、将微藻多糖溶液进行减压浓缩，喷雾干燥，得到微藻多糖产品。
7、通过脉冲电场作为反应引发方式，微藻多糖的蛋白脱除率为96.8％，多糖损失率为1.4％。
通过本实施例提取方法制备得到的多糖纯度可达98.7％，提取率可达98.5％。
实施例7
1、配制拟微球藻溶液，其料液比为1:10g/mL，复合酶为酸性纤维素酶、果胶酶与木瓜蛋白酶，酸性纤维素酶、果胶酶与木瓜蛋白酶的质量比为1:2:1，复合酶的用量为0.2％，酶解温度为40℃，酶解pH为7.5，酶解时间为7小时。
2、将破壁后的微藻酶解液与深层共晶溶液按照1:15g/g的比例充分混合均匀，提取条件为：提取温度为60℃，提取时间为4小时，得到微藻多糖粗提液。
3、将壳聚糖溶于1％醋酸溶液，常温下充分溶胀，溶胀时间为8-10小时，溶胀完成后加入氢氧化钠使其析出，过滤得到溶胀的壳聚糖，水洗至中性后加入到250ml四口烧瓶中，然后加入一定体积的质量浓度为30％的二烯丙基二乙基氯化铵溶液，同时以水和异丙醇体积比为3:1的溶液作为反应介质，在电场强度为15kv/cm，脉冲数为12个的脉冲电场条件下充分反应，结束后分别用异丙醇和丙酮对产物进行分离提纯，最后于70℃条件下烘干备用。
将蛋白处理剂粉按照5％的比例加入到微藻多糖粗提液中，充分混合均匀，静置，离心后得到上清液，即为微藻多糖纯化液。
4、将活化后的玉米芯溶于1％柠檬酸溶液，常温下充分溶胀，溶胀时间为8-10小时，溶胀完成后加入氢氧化钠使其析出，过滤得到溶胀的壳聚糖，水洗至中性后加入到250ml四口烧瓶中，然后加入一定体积的质量浓度为35％的[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵溶液，同时以水和异丙醇体积比为3:1的溶液作为反应介质，在电场强度为15kv/cm，脉冲数为12个的脉冲电场条件下充分反应，结束后分别用异丙醇和丙酮对产物进行分离提纯，最后于70℃条件下烘干备用。
将脱色除杂处理剂粉按照4％的比例加入到微藻多糖纯化液中，充分混合均匀，静置，离心后得到上清液，即为微藻多糖精制液。
5、将微藻多糖精制液进行陶瓷膜过滤，得到陶瓷膜清液，即得到微藻多糖溶液。
6、将微藻多糖溶液进行减压浓缩，喷雾干燥，得到微藻多糖产品。
通过本实施例提取方法制备得到的多糖纯度可达91.8％，提取率可达92.5％。
实施例8
1、配制拟微球藻溶液，其料液比为1:25g/mL，复合酶为酸性纤维素酶、果胶酶与木瓜蛋白酶，酸性纤维素酶、果胶酶与木瓜蛋白酶的质量比为1:2:1，复合酶的用量为1.0％，酶解温度为60℃，酶解pH为4.0，酶解时间为2小时。
2、将破壁后的微藻酶解液与深层共晶溶液按照1:15g/g的比例充分混合均匀，提取条件为：提取温度为60℃，提取时间为4小时，得到微藻多糖粗提液。
3、将壳聚糖溶于1％醋酸溶液，常温下充分溶胀，溶胀时间为8-10小时，溶胀完成后加入氢氧化钠使其析出，过滤得到溶胀的壳聚糖，水洗至中性后加入到250ml四口烧瓶中，然后加入一定体积的质量浓度为30％的二烯丙基二乙基氯化铵溶液，同时以水和异丙醇体积比为3:1的溶液作为反应介质，在电场强度为15kv/cm，脉冲数为12个的脉冲电场条件下充分反应，结束后分别用异丙醇和丙酮对产物进行分离提纯，最后于70℃条件下烘干备用。
将蛋白处理剂粉按照5％的比例加入到微藻多糖粗提液中，充分混合均匀，静置，离心后得到上清液，即为微藻多糖纯化液。
4、将活化后的玉米芯溶于1％柠檬酸溶液，常温下充分溶胀，溶胀时间为8-10小时，溶胀完成后加入氢氧化钠使其析出，过滤得到溶胀的壳聚糖，水洗至中性后加入到250ml四口烧瓶中，然后加入一定体积的质量浓度为35％的[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵溶液，同时以水和异丙醇体积比为3:1的溶液作为反应介质，在电场强度为15kv/cm，脉冲数为12个的脉冲电场条件下充分反应，结束后分别用异丙醇和丙酮对产物进行分离提纯，最后于70℃条件下烘干备用。
将脱色除杂处理剂粉按照4％的比例加入到微藻多糖纯化液中，充分混合均匀，静置，离心后得到上清液，即为微藻多糖精制液。
5、将微藻多糖精制液进行陶瓷膜过滤，得到陶瓷膜清液，即得到微藻多糖溶液。
6、将微藻多糖溶液进行减压浓缩，喷雾干燥，得到微藻多糖产品。
通过本实施例提取方法制备得到的多糖纯度可达93.4％，提取率可达91.9％。
可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案。本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种高纯度微藻多糖的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括如下步骤：
S1、复合酶酶解破壁处理：配制微球藻溶液，料液比范围为1:5～1:25 g/mL，加入0.2%～1.0%复合酶，酶解温度为40～60℃，酶解pH为4.0～7.5，酶解时间为2～7h；
S2、微藻多糖提取：将破壁后的微藻酶解液与深层共晶溶液按照质量比为1:10～1:40的比例充分混合均匀，提取温度为40～60℃，提取时间为2～7h，得到微藻多糖粗提液；
S3、微藻多糖脱蛋白：将蛋白处理剂按2%～8%的比例加入到微藻多糖粗提液中，充分混合均匀，静置，离心后得到上清液，即为微藻多糖纯化液；
S4、微藻多糖脱色除杂：将脱色除杂处理剂按2%～8%的比例加入到微藻多糖纯化液中，充分混合均匀，静置，离心后得到上清液，即为微藻多糖精制液；
S5、制成成品：将微藻多糖精制液进行陶瓷膜过滤，得到陶瓷膜清液，即得到微藻多糖溶液；将微藻多糖溶液进行减压浓缩，喷雾干燥，得到微藻多糖产品；
S2中深层共晶溶液的配制方法如下：将氢键受体与氢键供体按照摩尔比为1:1～5的比例的添加到广口瓶中，在50～70℃下，边搅拌边加入去离子水，直至溶液呈现澄清透明的状态，得到深层共晶溶液；
所述氢键受体为蛋氨酸、氯化胆碱、甜菜碱的一种或两种组合；所述氢键供体为草酸、咖啡酸、乳酸、低聚木糖、低聚果糖、山梨醇、木糖醇、甘油中的两种或三种组合；
S3中蛋白处理剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）将壳聚糖溶于1%醋酸溶液，常温下溶胀8～10h，溶胀完成后加入氢氧化钠使其析出，过滤得到溶胀的壳聚糖；
（2）将溶胀后的壳聚糖水洗至中性，加入到四口烧瓶中，先后向四口烧瓶中加入烯类单体溶液和反应介质，并采用微波、紫外或脉冲电场的反应引发方式引发聚合；
（3）先后用异丙醇和丙酮对步骤（2）的产物进行分离提纯，置于70℃条件下烘干处理，得到蛋白处理剂；
步骤（2）中的烯类单体为丁烯酸、甲基丙烯酸-2-羟基丙酯或二烯丙基二乙基氯化铵中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，S1中所述复合酶为酸性纤维素酶、果胶酶与木瓜蛋白酶；所述酸性纤维素酶、果胶酶与木瓜蛋白酶的质量比为1:2:1。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（2）中的所述烯类单体溶液的质量浓度为20～40%。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，S4中脱色除杂处理剂的制备方法，包括如下步骤：
A、将活化后的玉米芯溶于1%柠檬酸溶液，常温下溶胀8～10h，溶胀完成后加入氢氧化钠使其析出，过滤得到溶胀的玉米芯；
B、将溶胀后的玉米芯水洗至中性，加入到四口烧瓶中，然后加入[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵或丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵溶液和反应介质，并采用脉冲电场的反应引发方式引发聚合；
C、先后用异丙醇和丙酮对步骤（2）的产物进行分离提纯，置于70℃条件下烘干处理，得到脱色除杂处理剂。
5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，步骤B中的[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵或丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵溶液的质量浓度为25～45%。
6.根据权利要求1或4所述的提取方法，其特征在于，反应介质为水和异丙醇的混合液，其中所述水和异丙醇的体积比为3:1。
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