CN111019985B - 一种酶解制备低分子量或寡聚透明质酸或其盐的方法 - Google Patents

一种酶解制备低分子量或寡聚透明质酸或其盐的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酶解制备低分子量或寡聚透明质酸或其盐的方法，该方法在透明质酸酶解过程中加入吸附树脂，起到边降解边纯化的效果，通过离子交换树脂有效回收透明质酸酶。本发明方法工艺流程操作简单，条件温和，绿色环保，吸附树脂和离子交换树脂的使用降低了纯化的难度，防止了产品褐变，提高了产品的品质，提高了生产效率，降低了能耗，适合大规模工业化生产。

Description

一种酶解制备低分子量或寡聚透明质酸或其盐的方法
技术领域
本发明涉及一种低分子量透明质酸或其盐或寡聚透明质酸或其盐的大规模制备方法，具体涉及一种酶解制备低分子量或寡聚透明质酸或其盐的大规模制备方法，属于透明质酸制备技术领域。
背景技术
透明质酸(hyaluronic acid，HA)是一种广泛存在于人及哺乳动物体内的酸性黏多糖，是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡萄糖醛酸双糖重复单位通过β-(1→4)糖苷键和β-(1→3)糖苷键构成的、无分支的单链高分子糖胺聚糖。不同分子量的透明质酸有着不同的用途，高分子量透明质酸因其保水性、润滑性、粘弹性在骨科、眼科、美容科等领域都得到了广泛的应用；而低分子量的透明质酸（分子量10 kDa -1000 kDa）与寡聚透明质酸（分子量＜10kDa）表现出抗氧化性、透皮吸收、创伤修复的活性等不同的性能。
酶降解法是目前低分子量及寡聚透明质酸制备的常用方法，随着分子量的降低，尤其是当透明质酸分子量降低到10 kDa以后，透明质酸的抗氧化性逐渐增强，在此作用下，原料中引入的金属离子、小分子色素等杂质的存在容易引起产品的褐变。此外，酶解结束后一般采用高温或高pH对酶进行灭活，这也会导致产品的严重褐变。为了得到纯度高、颜色合格的产品，后期需要加入大量的活性炭进行脱色处理，活性炭用量大，成本高。
CN108220364A公开了一种固液双相酶解与超滤联用制备超低分子量低分子及寡聚透明质酸及其盐的方法，该方法在酶解结束时加入大量的粉剂活性炭进行吸附除杂，同时配备精密的除活性炭过滤器进行过滤，对设备要求较高。
王鑫等发表了阴离子交换树脂法纯化透明质酸工艺的研究的文章，采用阴离子交换树脂对透明质酸粗液进行纯化，该方法中透明质酸粗提物与树脂的体积比为4:1，树脂用量大，当透明质酸产生褐变后，需要更高的树脂用量才能达到脱色、防止褐变的作用。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种酶解制备低分子量或寡聚透明质酸或其盐的方法，该方法在酶解的过程中加入吸附树脂，起到边降解边纯化的效果，消除了酶解液中的杂质对产品的影响，同时通过树脂吸附的方式除去透明质酸酶，避免了高温或pH灭活引起的产品褐变，简化了后处理过程。
本发明在酶解过程中加入对透明质酸酶酶解速率没有明显干扰的吸附树脂用于吸附杂质，该吸附树脂对色素、重金属等杂质具备良好的吸附效果，而对透明质酸或其盐、透明质酸酶没有吸附性，加入该吸附树脂后，透明质酸或其盐进行边酶解边纯化，当接近酶解终点后，过滤回收该吸附树脂，再加入离子交换树脂回收透明质酸酶，过滤获得的酶解液采用有机溶剂沉淀析出低分子量或寡聚透明质酸或其盐。本发明在酶解过程中进行纯化，通过离子交换树脂除去透明质酸酶，避免了杂质和灭活导致的低分子量及寡聚透明质酸或其盐的褐变，简化了透明质酸纯化过程，降低了成本和能耗，提高了产品纯度和品质。
本发明具体技术方案如下：
一种酶解制备低分子量或寡聚透明质酸或其盐的方法，该方法包括以下步骤：
（1）将透明质酸酶加入pH4~9的水中，配成酶解缓冲液；
（2）向酶解缓冲液中加入吸附树脂，然后在搅拌下加入透明质酸或其盐，透明质酸或其盐与酶解缓冲液的质量体积比为1-5 g:10 ml，酶解至终点；
（3）达到酶解终点后，过滤回收吸附树脂，所得滤液中加入离子交换树脂，以吸附滤液中的透明质酸酶及蛋白；
（4）过滤回收离子交换树脂，所得滤液用有机溶剂沉淀，所得沉淀干燥，得低分子量透明质酸或其盐或寡聚透明质酸或其盐。
本发明所述的低分子量透明质酸或其盐指的是分子量大于10 kDa小于等于1000kDa的透明质酸或其盐，所述的寡聚透明质酸或其盐指的是分子量为10 kDa以下的透明质酸或其盐。低分子量或寡聚透明质酸或其盐通过采用比其自身分子量高的透明质酸或其盐进行酶解的方式得到。
酶解所用的透明质酸酶为细菌产透明质酸酶，优选为芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO.5744发酵生产的透明质酸酶，该透明质酸酶在专利CN201210317032.5中有详细的记载，其酶活高、热稳定性高、pH稳定性高，对透明质酸有很好的降解性，通过控制酶解条件可以得到所需分子量的透明质酸或其盐。当用其制备低分子量或寡聚透明质酸或其盐时，由于低分子量或寡聚透明质酸或其盐溶液的黏度低，添加离子交换树脂易于将透明质酸酶回收，因此不需要高温或高pH灭活透明质酸酶，解决了酶灭活存在的产品容易褐变的问题。
进一步的，所述透明质酸盐可以为透明质酸的钠盐、钙盐、钾盐、镁盐等，常用的为钠盐。
进一步的，步骤（1）中，酶解缓冲液的pH为4-9，优选为5.5-7.5。
进一步的，步骤（2）中，所述透明质酸或其盐的分子量大于等于200 kDa，优选为200 kDa~3000 kDa，纯度优选≥95%。根据最终所需要的透明质酸或其盐的分子量，可以在此范围内选择原料透明质酸或其盐的分子量。例如最终要制备寡聚透明质酸或其盐时，那所用的原料透明质酸或其盐可以是低分子量的透明质酸或其盐。
进一步的，步骤（2）中，每1 kg透明质酸或其盐加入1×107~5×109IU的透明质酸酶。
进一步的，步骤（2）中，在酶解缓冲液中添加吸附树脂后再加入透明质酸或其盐，使透明质酸边酶解边纯化，加入的吸附树脂对色素、重金属等杂质具备良好的吸附效果，而对透明质酸或其盐、透明质酸酶没有吸附效果，对透明质酸酶的酶解速率没有明显干扰，吸附树脂的纯化作用为透明质酸或其盐提供了抗氧化保护，降低了产品褐变的几率，与酶解结束再进行纯化相比，大大降低了树脂、活性炭等纯化材料的用量。本发明所用吸附树脂为大孔吸附树脂，用量为透明质酸或其盐质量的1%~10%。
经过试验验证，当选择LX-60、LX-68和LX-500的混合物为吸附树脂时，不仅用量少，还不会干扰酶解，防止酶解液褐变，起到较优的纯化效果。优选的，LX-60、LX-68和LX-500的质量比为6-9:3-5:1。
进一步的，步骤（2）中，在10~50 rpm的搅拌速度下边搅拌边加入透明质酸或其盐。为了降低透明质酸或其盐的溶解难度，提高其在酶解缓冲液中的分散均匀度，透明质酸或其盐以连续的方式加入或以间歇的方式加入，以保证透明质酸或其盐在酶解缓冲液中的浓度不要太高，酶解体系的粘度不要太大。可以根据高分子透明质酸或其盐的分子量和加入的总量调整每次加入的量、加入的次数、加入的时间、每次间隔的时间、连续加入的速度等。例如，可以采用间歇的方式加入透明质酸或其盐，每次根据溶液的粘度添加透明质酸或其盐，当酶解一段时间溶液粘度较稀时再加入一部分透明质酸或其盐，反复操作直至加入完毕。采用这样的加入方式，既可以保证透明质酸的分散均匀，又可以保证透明质酸浓度较高。
进一步的，步骤（2）中，酶解温度为20~48℃。
进一步的，步骤（3）中，可以采用钛棒过滤器对酶解液进行过滤，钛棒过滤器的滤芯孔径优选为0.45 µm ~10 µm。过滤得到吸附树脂和滤液，吸附树脂经过活化后可以循环利用。吸附树脂的活化方式为：将吸附树脂依次采用0.5~2 mol/L的氢氧化钠溶液、水、体积浓度20~40%的乙醇溶液进行冲洗。
进一步的，步骤（3）中，去除吸附树脂后的滤液加入离子交换树脂，以去除酶解液中的透明质酸酶及蛋白。所述离子交换树脂为阴离子交换树脂，例如日本三菱化学的DIAION PA308、美国通用电气公司(GE)的DEAE Sepharose Fast Flow树脂等，从成本考虑，优选为DIAION PA308。离子交换树脂的用量按照每1.0×1010IU的透明质酸酶加入0.5~3 L树脂的用量添加。
进一步的，步骤（4）中，过滤回收离子交换树脂，过滤可以采用钛棒过滤器，钛棒过滤器的滤芯孔径为0.45 µm ~10 µm。过滤得到的离子交换树脂中吸附有透明质酸酶，将回收的离子交换树脂加入0.4~0.6 mol/L的氯化钠溶液中搅拌0.5~ 1 h，可以实现透明质酸酶的高效洗脱与回收。回收透明质酸酶后的离子交换树脂依次采用1~2 mol/L的氯化钠溶液、0.5~2 mol/L的氢氧化钠溶液、水、体积浓度20~40%的乙醇溶液进行冲洗，可以实现活化，活化后的离子交换树脂可以循环利用。
进一步的，步骤（4）中，过滤得到的酶解液直接加入有机溶剂进行沉淀，即可以得到低分子量或寡聚透明质酸或其盐产品，该产品为白色粉末，杂质少，纯度95%~100%，具有较强的抗氧化、抗炎、促创伤修复的活性，可以应用于医药、化妆品等领域。本发明纯化简单，所述有机溶剂可以为乙醇、丙醇、异丙醇或乙二醇，优选为乙醇。有机溶剂与步骤（4）所得的滤液的体积比为5~20：1，优选10-20:1。
本发明通过酶解过程中的吸附树脂和离子交换树脂对酶解液进行纯化，所得酶解液用高体积倍数的有机溶剂进行沉淀即可得到纯度高的产品。该方法解决了酶解及酶灭活过程中低分子量及寡聚透明质酸或其盐容易褐变、需要大量活性炭进行后期纯化的难题，产品品质高，吸附树脂和离子交换树脂可以活化后重复利用，透明质酸酶可以回收后反复利用，不需要高效的活性炭过滤设备，不需要常规树脂所需的色谱柱等相关设备，经济环保，能耗低，实现了低分子量及寡聚透明质酸或其盐的高效大规模制备。与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明在透明质酸或其盐酶解过程中加入吸附树脂，起到边降解边纯化的效果，可以防止酶解过程中产品褐变，降低酶解后纯化难度，吸附树脂经过活化后还可以重复利用，经济环保。
2、采用离子交换树脂对酶解液中的透明质酸酶进行回收利用，避免高温灭活产品褐变，有效的对低分子量及寡聚透明质酸或其盐进行了保护，酶解后不必添加活性炭进行纯化，产品品质更好，对纯化设备的要求更低，重复回收利用的树脂更加经济环保。
3、该方法工艺流程操作简单，条件温和，绿色环保，所用透明质酸酶能够反复利用，生产效率高，能耗相对较低，适合大规模工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例和实验例，进一步详细说明本发明。如无特别说明，下述实施例中乙醇的浓度均为体积浓度。
下述实施例中，低分子量透明质酸或其盐、寡聚透明质酸或其盐的分子量测定采用Laurent法，含量测定采用专利CN109298112A中实施例1记载的HPLC法，白度测定采用欧洲药典白度测定法。
下述实施例中，LX-60、LX-68、LX-500和LX-10G购自西安蓝晓科技股份有限公司。DIAION PA308购自日本三菱化学。DEAE Sepharose Fast Flow树脂购自美国通用公司（GE）。
实施例1
1. 向1.5 m3不锈钢溶解罐中加入1 m3纯化水，升温至40℃，调节pH为6.0，设置搅拌速度20 rpm，边搅拌边向该溶解罐中加入1.0×1010 IU的芽孢杆菌透明质酸酶。
2. 搅拌1 min 后，向酶解缓冲液中加入15 kg吸附树脂（LX-60，LX-68和LX-500分别为9 kg，4.5 kg和1.5 kg）。
3. 缓慢加入分子量为1500 kDa的透明质酸钠350 kg，加入时间为2 h，继续酶解直至接近终点。采用1.0 μm的钛棒过滤器过滤，分别回收吸附树脂和酶解过滤液I。
4. 向酶解过滤液I中加入离子交换树脂DIAION PA308 2 L, 搅拌40 min。采用1.0 μm的钛棒过滤器过滤，分别回收离子交换树脂及酶解液过滤液II。
5. 向酶解液过滤液II中加入15吨乙醇沉淀，脱水，干燥，得到寡聚透明质酸钠，分子量为2400 Da，产品纯度98.4%，白度95。
6. 将回收的吸附树脂依次采用60 L 的1.0 mol/L的氢氧化钠溶液、60 L纯化水、60 L的20%的乙醇溶液洗涤，并储存于20%的乙醇溶液中备用。
7. 向回收的离子交换树脂中加入6 L的0.5 mol/L的氯化钠溶液，搅拌后过滤分别回收洗脱液及离子交换树脂，测定洗脱液总酶活，计算透明质酸酶酶活回收率，酶活回收率为72%。
8. 将上述离子交换树脂依次采用6 L的 1.0 mol/L的氯化钠溶液、6 L 的1.0mol/L的氢氧化钠溶液、6 L纯化水、6 L的20%的乙醇溶液洗涤，并储存于20%的乙醇溶液中备用。
实施例2
1. 向1.5 m3不锈钢溶解罐中加入1 m3纯化水，升温至30℃，调节pH为5.8，设置搅拌速度50 rpm，边搅拌边向该溶解罐中加入1.5×1010 IU的芽孢杆菌透明质酸酶。
2. 搅拌1 min 后，向酶解缓冲液中加入15 kg吸附树脂（LX-60，LX-68和LX-500分别为9kg，5 kg和1kg）。
3. 缓慢加入分子量为1800 kDa的透明质酸钙400 kg，加入时间为2 h，继续酶解直至接近终点。采用0.45 μm的钛棒过滤器过滤，分别回收吸附树脂和酶解过滤液I。
4. 向酶解过滤液I中加入离子交换树脂DIAION PA308 4 L, 搅拌50 min。采用0.45 μm的钛棒过滤器过滤，分别回收离子交换树脂及酶解液过滤液II。
5. 向酶解液过滤液II中加入12吨乙醇沉淀，脱水，干燥，得到低分量透明质酸钙，分子量为280 kDa，产品纯度95.6%，白度93。
6. 将回收的吸附树脂依次采用100 L 的1.5 mol/L的氢氧化钠溶液、100 L纯化水、100 L的30%的乙醇溶液洗涤，并储存于30%的乙醇溶液中备用。
7. 向回收的离子交换树脂中加入8 L的0.4 mol/L的氯化钠溶液，搅拌后过滤分别回收洗脱液及离子交换树脂，测定洗脱液总酶活，计算透明质酸酶酶活回收率，酶活回收率为68%。
8.将上述离子交换树脂依次采用12 L的 1.2 mol/L的氯化钠溶液、6 L 的1.5mol/L的氢氧化钠溶液、12 L纯化水、12 L的30%的乙醇溶液洗涤，并储存于30%的乙醇溶液中备用。
实施例3
1. 向1.5 m3不锈钢溶解罐中加入1 m3纯化水，升温至45℃，调节pH为5.5，设置搅拌速度30 rpm，边搅拌边向该溶解罐中加入3.0×1010 IU的芽孢杆菌透明质酸酶。
2. 搅拌1 min 后，向酶解缓冲液中加入20 kg吸附树脂（LX-60，LX-68和LX-500分别为12 kg，6 kg和2 kg）。
3. 缓慢加入分子量为1500 kDa的透明质酸钾200 kg，加入时间为3.5 h，继续酶解直至接近终点。采用2.0 μm的钛棒过滤器过滤，分别回收吸附树脂和酶解过滤液I。
4. 向酶解过滤液I中加入离子交换树脂DIAION PA308 5 L, 搅拌45 min。采用2.0 μm的钛棒过滤器过滤，分别回收离子交换树脂及酶解液过滤液II。
5. 向酶解液过滤液II中加入10吨乙醇沉淀，脱水，干燥，得到低分量透明质酸钾，分子量为370 kDa，产品纯度94.5%，白度96。
6. 将回收的吸附树脂依次采用100 L 的2.0 mol/L的氢氧化钠溶液、100 L纯化水、100 L的35%的乙醇溶液洗涤，并储存于30%的乙醇溶液中备用。
7. 向回收的离子交换树脂中加入15 L的0.6 mol/L的氯化钠溶液，搅拌后过滤分别回收洗脱液及离子交换树脂，测定洗脱液总酶活，计算透明质酸酶酶活回收率，酶活回收率为77%。
8.将上述离子交换树脂依次采用20 L的 1.5 mol/L的氯化钠溶液、20 L 的1.5mol/L的氢氧化钠溶液、20 L纯化水、20 L的35%的乙醇溶液洗涤，并储存于35%的乙醇溶液中备用。
实施例4
1. 向1.5 m3不锈钢溶解罐中加入1 m3纯化水，升温至25℃，调节pH为7.5，设置搅拌速度40 rpm，边搅拌边向该溶解罐中加入5.0×1011 IU的芽孢杆菌透明质酸酶。
2. 搅拌1 min 后，向酶解缓冲液中加入8 kg吸附树脂（LX-60，LX-68和LX-500分别为4.8kg，2.4 kg和0.8 kg）。
3. 缓慢加入分子量为3000 kDa的透明质酸镁100 kg，加入时间为3.5 h，继续酶解直至接近终点。采用10.0 μm的钛棒过滤器过滤，分别回收吸附树脂和酶解过滤液I。
4. 向酶解过滤液I中加入离子交换树脂DIAION PA308 50 L， 搅拌60 min。采用10.0 μm的钛棒过滤器过滤，分别回收离子交换树脂及酶解液过滤液II。
5. 向酶解液过滤液II中加入18吨乙醇沉淀，脱水，干燥，得到低分子量透明质酸镁，分子量为29 kDa，产品纯度93.8%，白度91。
6. 将回收的吸附树脂依次采用200 L 的1.6 mol/L的氢氧化钠溶液、200 L纯化水、200 L的25%的乙醇溶液洗涤，并储存于30%的乙醇溶液中备用。
7. 向回收的离子交换树脂中加入20 L的0.55 mol/L的氯化钠溶液，搅拌后过滤分别回收洗脱液及离子交换树脂，测定洗脱液总酶活，计算透明质酸酶酶活回收率，酶活回收率为64%。
8. 将上述离子交换树脂依次采用30 L的1.6 mol/L的氯化钠溶液、30 L 的1.6mol/L的氢氧化钠溶液、30 L纯化水、30 L的25%的乙醇溶液洗涤，并储存于25%的乙醇溶液中备用。
实施例5
1. 向1.5 m3不锈钢溶解罐中加入1 m3纯化水，升温至40℃，调节pH为7.0，设置搅拌速度30 rpm，边搅拌边向该溶解罐中加入4.0×109 IU的芽孢杆菌透明质酸酶。
2. 搅拌1 min 后，向酶解缓冲液中加入5 kg吸附树脂（LX-60，LX-68和LX-500分别为3 kg，1.5 kg和0.5 kg）。
3. 缓慢加入分子量为400 kDa的透明质酸钠100 kg，加入时间为0.5 h，继续酶解直至接近终点。采用5.0 μm的钛棒过滤器过滤，分别回收吸附树脂和酶解过滤液I。
4. 向酶解过滤液I中加入离子交换树脂DIAION PA308 1.2 L，搅拌60 min。采用5.0 μm的钛棒过滤器过滤，分别回收离子交换树脂及酶解液过滤液II。
5. 向酶解液过滤液II中加入10吨乙醇沉淀，脱水，干燥，得到寡聚透明质酸钠，分子量为4700 Da，产品纯度96.8%，白度96。
6. 将回收的吸附树脂依次采用50 L 的1.0 mol/L的氢氧化钠溶液、50 L纯化水、50 L的40%的乙醇溶液洗涤，并储存于40%的乙醇溶液中备用。
7. 向回收的离子交换树脂中加入10 L的0.4 mol/L的氯化钠溶液，搅拌后过滤分别回收洗脱液及离子交换树脂，测定洗脱液总酶活，计算透明质酸酶酶活回收率，酶活回收率为65%。
8. 将上述离子交换树脂依次采用30 L的1.0 mol/L的氯化钠溶液、30 L 的1.0mol/L的氢氧化钠溶液、30 L纯化水、30 L的40%的乙醇溶液洗涤，并储存于40%的乙醇溶液中备用。
实施例6
按照实施例1的方法制备寡聚透明质酸钠，不同的是：将离子交换树脂DIAIONPA308替换为等体积的DEAE Sepharose Fast Flow树脂。酶活回收率为68%，所得寡聚透明质酸钠分子量为4700 Da，产品纯度为96.8%，白度为96。
比较例1
按照实施例1的方法制备寡聚透明质酸钠，不同的是，将吸附树脂分别替换为：比较例1-A：9 kg LX-60、6 kg LX-68；比较例1-B：15 kg LX-68；比较例1-C：10 kg LX-68、5kg LX-500。
比较例2
按照实施例1的方法制备寡聚透明质酸钠，不同的是：将实施例1中的15 kg吸附树脂在酶解接近结束时加入，搅拌吸附1 h。
比较例3
按照实施例1的方法制备寡聚透明质酸钠，不同的是：将吸附树脂在酶解接近结束时加入，搅拌吸附1 h，其中LX-60 54 kg、LX-68 27 kg、LX-500 9 kg。
比较例4
按照实施例1的方法制备寡聚透明质酸钠，不同的是：所有的吸附树脂替换为15kg LX-10G吸附树脂。
比较例5
按照实施例1的方法制备寡聚透明质酸钠，不同的是：将15kg的吸附树脂替换为15kg 活性炭。加入活性炭后，酶解速率缓慢，与实施例1 酶解相同时间后酶解液中透明质酸钠分子量仅为134 kDa，活性炭的加入造成了严重的空间位阻，严重干扰了透明质酸酶的酶解活性，降低了酶解速率。
比较例6
1. 向1.5 m3不锈钢溶解罐中加入1 m3纯化水，升温至40℃，调节pH为6.0，设置搅拌速度20 rpm，边搅拌边向该溶解罐中加入1.0×1010 IU的芽孢杆菌透明质酸酶。
2. 缓慢加入分子量为1500 kDa的透明质酸钠350 kg，加入时间为2 h，继续酶解直至接近终点。
3. 向酶解液中加入离子交换树脂DIAION PA308 2 L, 搅拌40 min。采用1.0 μm的钛棒过滤器过滤，分别回收离子交换树脂及酶解过滤液。
5. 向酶解过滤液中加入15 kg活性炭，搅拌吸附1 h，采用0.45 μm的钛棒过滤器过滤，滤速缓慢，过滤时间为实施例1过滤除吸附树脂的8倍，过滤后滤液中依然存在很多活性炭颗粒，需进一步采用0.2 μm滤芯过滤，过滤时间为实施例1中过滤除吸附树脂的24倍。
6. 向滤液中加入15吨乙醇沉淀，脱水，干燥，得到寡聚透明质酸钠。
比较例7
按照实施例1的方法制备寡聚透明质酸钠，不同的是：将酶解液过滤液I加热至60℃，灭活 0.5 h，然后加入15吨乙醇沉淀，脱水，干燥，得到寡聚透明质酸钠。
将实施例1和比较例1-5去除离子交换树脂后的滤液、比较例6去除活性炭后的滤液以及比较例7灭活后的滤液采用紫外吸收检测器检测在435 nm处的透光率，当透光率≤97%时，肉眼可见微微变色，当透光率为60%左右时，肉眼见滤液为红棕色。实施例1和各比较例所得滤液的透光率以及最终得到的寡聚透明质酸钠的白度如下表1所示。
Figure 518516DEST_PATH_IMAGE001
从实施例1和比较例1、4的对比可以看出，本发明LX-60、LX-68、LSZ-500的混用表现出突出的防褐变效果。从实施例1和比较例2、3的对比可以看出，在酶解初期就加入吸附树脂能提高防褐变效果，降低树脂用量。从实施例1和比较例5、6的对比可以看出，活性炭的防褐变效果远低于本发明吸附树脂。从实施例1和比较例7的对比可以看出，高温灭酶会加重产品的褐变，影响产品品质，而采用离子交换树脂可以很好的防止产品褐变。

Claims (12)

1.一种酶解制备低分子量或寡聚透明质酸或其盐的方法，其特征是包括以下步骤：
（1）将透明质酸酶加入pH5.5~7.5的水中，配成酶解缓冲液；
（2）向酶解缓冲液中加入吸附树脂，然后在搅拌下加入透明质酸或其盐，透明质酸或其盐与酶解缓冲液的质量体积比为1-5g:10ml，酶解至终点；
（3）达到酶解终点后，过滤回收吸附树脂，所得滤液中加入离子交换树脂，以吸附滤液中的透明质酸酶及蛋白；
（4）过滤回收离子交换树脂，所得滤液用有机溶剂沉淀，所得沉淀干燥，得低分子量透明质酸或其盐或寡聚透明质酸或其盐；
步骤（1）中，所述透明质酸酶为芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO.5744发酵生产的透明质酸酶；
步骤（2）中，所述吸附树脂为LX-60、LX-68和LX-500的混合物，LX-60、LX-68和LX-500的质量比为6-9:3-5:1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤（2）中，所述吸附树脂的用量为透明质酸或其盐质量的1%~10%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤（2）中，所述透明质酸或其盐的分子量大于等于200 kDa；步骤（4）中，所述低分子量透明质酸或其盐的分子量大于10 kDa小于等于1000 kDa，所述寡聚透明质酸或其盐的分子量小于等于10 kDa。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是：步骤（2）中，所述透明质酸或其盐的分子量为200 kDa~3000 kDa。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤（2）中，每1 kg透明质酸或其盐加入1×107~5×109IU的透明质酸酶。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤（2）中，所述透明质酸或其盐以连续的方式加入或以间歇的方式加入。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤（2）中，搅拌速度为10~50 rpm，酶解温度为20~48℃。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征是：步骤（4）中，所述离子交换树脂为阴离子交换树脂，每1.0×1010IU的透明质酸酶加入0.5~3 L离子交换树脂。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征是：步骤（4）中，有机溶剂与滤液的体积比为5~20：1。
10.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征是：步骤（4）中，所述有机溶剂为乙醇、丙醇、异丙醇或乙二醇。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征是：步骤（4）中，所述有机溶剂为乙醇。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征是：回收的吸附树脂通过依次采用0.5~2 mol/L的氢氧化钠溶液、水、体积浓度20~40%的乙醇溶液进行冲洗的方式进行活化，活化后的吸附树脂循环利用；回收的离子交换树脂加入0.4~0.6 mol/L的氯化钠溶液中搅拌0.5~ 1 h，过滤回收透明质酸酶液，过滤得到的离子交换树脂通过依次采用1~2 mol/L的氯化钠溶液、0.5~2 mol/L的氢氧化钠溶液、水、体积浓度20~40%的乙醇溶液进行冲洗的方式进行活化，活化后的离子交换树脂循环利用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111778303B (zh) * 2020-06-15 2023-01-24 华熙生物科技股份有限公司 一种透明质酸或其盐酶降解的方法
CN112662718A (zh) * 2021-01-13 2021-04-16 山东众山生物科技有限公司 一种寡聚透明质酸钠的制备方法
CN113528488B (zh) * 2021-08-17 2022-09-27 南昌大学 一种树脂搅拌吸附制备高质量玻璃酸酶粗品的方法
CN117535363A (zh) * 2023-12-27 2024-02-09 常州加源医药科技研发有限公司 一种功能性透明质酸的生产方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101544999A (zh) * 2009-04-10 2009-09-30 湖北五瑞生物工程有限公司 高纯度低分子量肝素钠的生产纯化方法
CN102876748A (zh) * 2012-04-13 2013-01-16 华熙福瑞达生物医药有限公司 酶切法制备寡聚透明质酸盐的方法及所得寡聚透明质酸盐和其应用
CN106350566A (zh) * 2016-08-25 2017-01-25 艾美科健（中国）生物医药有限公司 一种合成硫酸头孢喹肟的酶法工艺
EP2870243B1 (en) * 2012-07-06 2018-02-14 Inalco S.R.L. Enzymes immobilised on styrene-divinyl benzene polymer matrices and the use thereof in industrial productions

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101544999A (zh) * 2009-04-10 2009-09-30 湖北五瑞生物工程有限公司 高纯度低分子量肝素钠的生产纯化方法
CN102876748A (zh) * 2012-04-13 2013-01-16 华熙福瑞达生物医药有限公司 酶切法制备寡聚透明质酸盐的方法及所得寡聚透明质酸盐和其应用
EP2870243B1 (en) * 2012-07-06 2018-02-14 Inalco S.R.L. Enzymes immobilised on styrene-divinyl benzene polymer matrices and the use thereof in industrial productions
CN106350566A (zh) * 2016-08-25 2017-01-25 艾美科健（中国）生物医药有限公司 一种合成硫酸头孢喹肟的酶法工艺

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A new mass spectrometry based bioassay for the direct assessment of hyaluronidase activity and inhibition;Britton ER, Ibberson CB, Horswill AR, Cech NB.;《J Microbiol Methods》;20151028;全文 *
大孔吸附树脂脱色透明质酸的初步研究;甘聃;《现代农业科学》;20090110;第1卷;全文 *

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