CN101544999A - 高纯度低分子量肝素钠的生产纯化方法 - Google Patents
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Abstract
高纯度低分子量肝素钠的生产纯化方法，包括通过酶解、预处理后树脂吸附和洗脱制得未分级肝素钠溶液，然后通过肝素酶酶切、胰脏酶解离结合多次超滤截留，有选择性截获不同分子量范围的肝素钠，从而分离出不同分子量、适合不同领域使用的肝素钠产品；本工艺方法生产周期短，产品收率高，分布均匀，可实现低分子肝素生产的连续化，不会破坏肝素的有效基因成分，保留了生物活性，通过多次除杂，提高了产品纯度和生物利用度，可减少药物临床使用时出现过敏、不适等症状的风险。
Description
(一)技术领域：
本发明涉及一种生物药用原料的分离纯化方法，具体是高纯度低分子量肝素钠的生产纯化方法。
(二)现有技术：
肝素钠自1916年Molean发现其良好的抗凝作用以来，历经半个多世纪，作为一种重要的生化药物而被广泛地应用在医药临床上。肝素钠不仅具有抗凝、抗血栓、抗炎、抗过敏、抗病毒和降血脂等多种生物功能，同时也是一种防治深部静脉血栓、肺血栓或其他血栓的有效药物。
近几年来，肝素钠广泛应用于美容、保健等其它领域中，有改善局部血液循环，及消炎、消除青春痘、润肤、软化疤痕等作用。目前我国抗血栓药物中肝素类占有最大的市场份额(39％)，在肝素类中低分子肝素又占整个抗血栓类药物27％的市场份额。肝素在临床应用时常伴有出血、血小板减少，骨质疏松等副作用。但到目前为止，尚无一种能够完全替代它的产品，尽管存在以上副作用，但在临床上它仍然是预防手术后血栓形成和治疗急性静脉血栓的首选药物。为了减轻肝素的副作用，人们采取了各种方法，但效果均不能和低分子肝素相当。
1976年Johnson等发现当皮下注射从肝素钠分离出来的分子量较小的片段(即低分子肝素，简称LMWH)时，在人体内其抗活性X因子(FXa)的作用远高于普通肝素(SH)，而出现副作用却明显降低，其报道立即引起人们广泛的兴趣与密切关注。80年代后低分子肝素以其抗血栓作用强、出血副作用小，半衰期长、生物利用率高等优异的药用物性，成为了当今肝素研究的热点。
肝素钠的纯化过程主要是对粗品肝素钠进行除杂和脱色，目前，国内肝素钠的纯化主要是在不同pH条件下采用高锰酸钾和过氧化氢两步氧化法或过氧化氢分次加入的二次氧化法，再以有机溶剂进行分级沉淀；但第一种工艺的缺点是产品的活性损失大、色泽差、生产的二氧化锰较难滤除，且二氧化锰对肝素钠有部分吸附作用，同时得到肝素外用级或类肝素等副产品，使产品回收率较低；第二种方法所得产品色泽较好，目前应用比较广泛，但可能是二次氧化对肝素钠结构造成破坏，难以得到较高纯度的低分子量肝素钠。
(三)发明内容：
本发明的目的就在于针对现有技术的不足，提供一种生产周期短、产品收率高、质量稳定的高纯度低分子量肝素钠的生产纯化方法。
本发明包括下述步骤：
第一步：未分级肝素钠溶液的制备
①提取
将肠粘膜加2-3倍水于反应罐中以蛋白酶酶解，蛋白酶的用量为肠粘膜重量的5-8％，酶解温度50-55℃，pH8.0—9.5，酶解时间3—5小时，酶解完毕，过滤，得酶解液；再在酶解液中加入酶解液重量3-4倍的碱性阴离子交换树脂搅拌吸附，第一次吸附6-10小时，滤出树脂后，再加入树脂搅拌吸附5—8小时，过滤，合并两次树脂，弃去滤液；
②除杂
将所得树脂置于1.5倍量0.5mol/L的NaCl溶液中搅拌40-45分钟，滤出树脂；
③洗脱
将树脂置于洗脱罐中，以树脂体积2-3倍量的浓NaCl溶液进行梯度洗脱，第一次以4.0-4.5mol/L的NaCl溶液洗脱，洗脱时间6小时，第二次第三次分别用3.0-3.5mol/L的NaCl溶液洗涤3小时，合并三次洗脱液；
④过滤
调整洗脱液pH值至11—12，过滤，滤液再调pH至7.0-7.5，即可得未分级的肝素钠溶液；
第二步：未分级肝素钠溶液的分离纯化
①肝素酶酶切降解
在所制得的未分级肝素钠溶液中按肝素酶：肝素钠溶液＝1:12.5(g/L)的比例加入固相化的肝素酶，缓慢搅拌40-50分钟，高速离心分离除固相化肝素酶，得酶切降解后的肝素钠溶液；
②第1次超滤
将所得肝素钠溶液用截留分子量15K的超滤膜超滤，得超滤液I；
③胰酶酶解
将超滤液I升温至50℃，加超滤液重量0.1-0.5％的胰酶，调pH值至6.5—8.5，恒温酶解3小时，然后升温至90℃，冷却后过滤，得滤液；
④第2次超滤
将所得滤液，用截留分子量10K的超滤膜超滤，得超滤液II；
⑤第3次超滤
将超滤液II用截留分子量4K的超滤膜超滤，以超滤液1-2倍的纯水冲洗2次，分别收集截留液和超滤液III，将截留液冷冻干燥，即得低分子肝素钠；⑥第4次超滤
将超滤液III用截留分子量3K的超滤膜超滤，以超滤液2-3倍量的纯水冲洗3次，收集截留液并冷冻干燥，即可得分子量为3000—4000的肝素钠。
所用的蛋白酶是碱性2709蛋白酶。
所用的碱性阴离子交换树脂是PUROLITE Z-3树脂。
所用的碱性阴离子交换树脂前处理方法如下：a.将树脂放在容器内用40—50℃热水浸泡4-5小时，再用热水冲洗3-5次；b.用含10-12％(重量百分比)NaCl的80—90°乙醇浸泡18-20小时，抽干，再用40—50℃的热水反复冲洗3-5次；c.将树脂投入到洗脱罐中，按照1∶1的比例加入7—9％氢氧化钠溶液浸泡并搅拌3小时左右，然后用清水冲洗至中性；d.将树脂投入到洗脱罐中，按照1∶1(g/g)的比例加入5mol/L盐酸浸泡并搅拌3-4小时；e.放出盐酸液，再加入用2倍于树脂量的25％NaCl溶液搅拌2-3小时，放出NaCl溶液，用清水冲洗3-5次，即可。
所述第一次、第二次超滤压力均为0.18MP，第三次超滤压力为0.14MP，第四次超滤压力为0.12MP，四次超滤温度均为22—26℃，超滤膜均采用聚砜膜。
所用的胰酶是由新鲜猪胰脏搅碎后，于90％的乙醇中常温激活13-15小时制得。
本发明与传统工艺相比，具有以下的优点：
(1)在提取阶段，通过优化工艺参数及使用树脂多次吸附，获得合适分子量分布范围的未分级肝素钠；再通过肝素酶酶切、胰脏酶解离结合多次“超滤截留技术”有选择性截获不同分子量范围的肝素钠(6000以上，4000—6000，3000—4000)。平均分子量在4200左右道尔顿的肝素钠符合注射级要求和能作为小分子肝素钠原料的低分子肝素钠；3000—4000分子量的肝素钠用于美容领域，变废为宝；6000分子量以上的肝素钠用于医用外用级或重新降解。本工艺生产周期短，产品收率高、分布更加均匀，可实现低分子肝素生产的连续化，不会破坏肝素的有效基因成分，保留了生物活性，通过多次除杂，提高了产品纯度和生物利用度，可减少药物临床使用时出现过敏、不适等症状的风险。
(2)针对树脂在肝素钠生产中出现的一些问题，对树脂进行前期处理，使其吸附能力增强，各项性能指标均得到改善。
本发明中所使用的PUROLITE Z-3碱性阴离子交换树脂，其碱性稍强于其他同类树脂，更有利于生成R+He-(R代表树脂，He代表肝素，ROH+He-＝R+He-+OH-)；此树脂交联度低，孔隙率大，He-易于透入，交换平衡快，可获较高纯度和产率。树脂用量减少，与传统工艺相比，用量减少至约1/6左右。
(3)使用树脂两次吸附，可提高收率20％，树脂的量控制适当，保证了肝素钠最大程度吸附且不浪费树脂。
(4)在洗脱过程中，用不同高浓度NaCl溶液多次梯度洗脱，从而确保肝素钠最大量洗脱，可提高收率6％左右。
(5)在肝素酶霉切前，通过调pH值和过滤，进一步除去了肝素钠溶液中一些杂质，提高了肝素钠得率和质量。
(6)使用固相化肝素酶和胰脏酶降解肝素，产品和肝素易于分离，生产中十分方便，同时，酶可以反复使用，可极大的节约成本。
(7)直接用未分级肝素钠溶液分离纯化，乙醇用量大为减少(每公斤低分子肝素产品减少了乙醇消耗40升以上)，降低了制造成本，提高了生产工艺的防火防爆安全性，有利于减排和环境保护；减少了乙醇沉淀后离心分离的高劳动强度。
(8)多次利用超滤截留不同分子量范围的肝素钠并使其产业化，不会改变肝素钠分子结构，不仅生产成本低，质量稳定，而且所得的高纯度低分子肝素得率高，分子分布合理。
(9)自制的胰脏蛋白酶工艺简单，原料来源广，价格便宜，解离效率高。
本发明可以通过测量240nm处的吸收值来控制产品质量。
本发明工艺生产的低分子肝素有关数据如下：
| 本发明工艺产品4000-6000分子量肝素 | 本发明工艺产品3000-4000分子量肝素 | 国家标准 | |
| 性状 | 白色或类白色颗粒或粉末 | 黄白色颗粒或粉末 | 白色或类白色的颗粒或粉末 |
| 溶解性 | 易溶于水，微溶于酒精 | 能溶于水 | 易溶于水，微溶于酒精 |
| 抗Xa因子效价 | 95—150IU/mg | 30—70IU/mg | 不低于70IU/mg |
| Xa/IIa | 3.0-5.0 | ≥0.6 | ≥1.5 |
| 平均分子量 | 4387—5000D | 3230—3654D | <8000 |
| 分子量分布 | <8000的组分>80％ | <4000的组分>75％ | <8000的组分>60％ |
| pH值 | 4.5—7.5 | 6-8 | 5.5-8.0 |
(四)具体实施方式
实施例1
第一步：未分级肝素钠溶液的制备
①提取
取肠粘膜加2倍的水于反应罐中，以氢氧化钠溶液调节pH8.0，加入肠粘膜重量5％的碱性2709蛋白酶，在50℃下酶解3小时，酶解完毕，过滤，得酶解液；再在酶解液中加入酶解液重量3倍的PUROLITE Z-3碱性阴离子交换树脂搅拌吸附，第一次吸附6小时，滤出树脂后，再加入树脂搅拌吸附5小时，过滤，合并两次树脂，弃去滤液；
②除杂
将所得树脂置于1.5倍量0.5mol/L的NaCl溶液中搅拌40分钟，滤出树脂；
③洗脱
将树脂置于洗脱罐中，以树脂体积2倍量的浓NaCl溶液进行梯度洗脱，第一次以4.0mol/L的NaCl溶液洗脱，洗脱时间6小时，第二次第三次分别用3.0mol/L的NaCl溶液洗脱，洗脱时间3小时，合并三次洗脱液；
④过滤
以氢氧化钠溶液调整洗脱液pH值至11，过滤，滤液再以盐酸溶液调pH至7.0，即可得未分级的肝素钠溶液；
第二步：未分级肝素钠溶液的分离纯化
①肝素酶酶切降解
在所制得的未分级肝素钠溶液中按肝素酶：肝素钠溶液为1:12.5(g/L)的比例加入固相化的肝素酶，缓慢搅拌40分钟，高速离心分离除固相化肝素酶，得酶切降解后的肝素钠溶液；
②第1次超滤
将所得肝素钠溶液用截留分子量15K的聚砜超滤膜超滤，超滤压力为0.18MP，超滤温度为22℃，得超滤液I，截留液为较高分子量(6000以上)的低抗Xa因子比活性肝素钠，可用于医用外用级或重新降解；
③胰酶酶解
将超滤液I升温至50℃，加超滤液重量0.1％的胰酶，调pH值至6.5，恒温酶解3小时，然后升温至90℃，冷却后过滤，得滤液；
④第2次超滤
将所得滤液，用截留分子量10K的聚砜超滤膜超滤，超滤压力为0.18MP，超滤温度为22℃，得超滤液II；
⑤第3次超滤
将超滤液II用截留分子量4K的聚砜超滤膜超滤，超滤压力为0.14MP，超滤温度为22℃，超滤后以超滤液1倍的纯水冲洗2次，分别收集截留液和超滤液III，将截留液冷冻干燥，即得分子量为4000-6000的低分子肝素钠；
⑥第4次超滤
将超滤液III用截留分子量3K的聚砜超滤膜超滤，超滤压力为0.12MP，超滤温度为22℃，超滤后以超滤液2倍量的纯水冲洗3次，收集截留液并冷冻干燥，即可得分子量为3000—4000的肝素钠。
实施例2
第一步：未分级肝素钠溶液的制备
①提取
取肠粘膜加3倍的水于反应罐中，以氢氧化钠溶液调pH至9.5，加入肠粘膜重量8％的碱性2709蛋白酶，在55℃下酶解5小时，酶解完毕，过滤，得酶解液；再在酶解液中加入酶解液重量4倍的PUROLITE Z-3碱性阴离子交换树脂搅拌吸附，第一次吸附10小时，滤出树脂后，再加入树脂搅拌吸附8小时，过滤，合并两次树脂，弃去滤液；
②除杂
将所得树脂置于1.5倍量0.5mol/L的NaCl溶液中搅拌45分钟，滤出树脂；
③洗脱
将树脂置于洗脱罐中，以树脂体积3倍量的浓NaCl溶液进行梯度洗脱，第一次以4.5mol/L的NaCl溶液洗脱，洗脱时间6小时，第二次第三次分别用3.5mol/L的NaCl溶液洗脱，洗脱时间3小时，合并三次洗脱液；
④过滤
以氢氧化钠溶液调整洗脱液pH值至12，过滤，滤液再以盐酸溶液调pH至7.5，即可得未分级的肝素钠溶液；
第二步：未分级肝素钠溶液的分离纯化
①肝素酶酶切降解
在所制得的未分级肝素钠溶液中按肝素酶：肝素钠溶液为1:12.5(g/L)的比例加入固相化的肝素酶，缓慢搅拌50分钟，高速离心分离除固相化肝素酶，得酶切降解后的肝素钠溶液；
②第1次超滤
将所得肝素钠溶液用截留分子量15K的聚砜超滤膜超滤，超滤压力为0.18MP，超滤温度为26℃，得超滤液I，截留液为较高分子量(6000以上)的低抗Xa因子比活性肝素钠，可用于医用外用级或重新降解；
③胰酶酶解
将超滤液I升温至50℃，加超滤液重量0.5％的胰酶，调pH值至8.5，恒温酶解3小时，然后升温至90℃，冷却后过滤，得滤液；
④第2次超滤
将所得滤液，用截留分子量10K的聚砜超滤膜超滤，超滤压力为0.18MP，超滤温度为26℃，得超滤液II；
⑤第3次超滤
将超滤液II用截留分子量4K的聚砜超滤膜超滤，超滤压力为0.14MP，超滤温度为26℃，超滤后以超滤液2倍的纯水冲洗2次，分别收集截留液和超滤液III，将截留液冷冻干燥，即得分子量为4000-6000的低分子肝素钠；
⑥第4次超滤
将超滤液III用截留分子量3K的聚砜超滤膜超滤，超滤压力为0.12MP，超滤温度为26℃，超滤后以超滤液3倍量的纯水冲洗3次，收集截留液并冷冻干燥，即可得分子量为3000—4000的肝素钠。
实施例3
第一步：未分级肝素钠溶液的制备
①提取
取肠粘膜加2.5倍的水于反应罐中，以氢氧化钠溶液调节pH9.0，加入肠粘膜重量5-8％的碱性2709蛋白酶，在52℃下酶解4小时，酶解完毕，过滤，得酶解液；再在酶解液中加入酶解液重量3.5倍的PUROLITE Z-3碱性阴离子交换树脂搅拌吸附，第一次吸附8小时，滤出树脂后，再加入树脂搅拌吸附6.5小时，过滤，合并两次树脂，弃去滤液；
②除杂
将所得树脂置于1.5倍量0.5mol/L的NaCl溶液中搅拌40分钟，滤出树脂；
③洗脱
将树脂置于洗脱罐中，以树脂体积2.5倍量的浓NaCl溶液进行梯度洗脱，第一次以4.2mol/L的NaCl溶液洗脱，洗脱时间6小时，第二次第三次分别用3.2mol/L的NaCl溶液洗脱，洗脱时间3小时，合并三次洗脱液；
④过滤
以氢氧化钠溶液调整洗脱液pH值至11.5，过滤，滤液再以盐酸溶液调pH至7.2，即可得未分级的肝素钠溶液；
第二步：未分级肝素钠溶液的分离纯化
①肝素酶酶切降解
在所制得的未分级肝素钠溶液中按肝素酶：肝素钠溶液为1:12.5(g/L)的比例加入固相化的肝素酶，缓慢搅拌45分钟，高速离心分离除固相化肝素酶，得酶切降解后的肝素钠溶液；
②第1次超滤
将所得肝素钠溶液用截留分子量15K的聚砜超滤膜超滤，超滤压力为0.18MP，超滤温度为24℃，得超滤液I，截留液为较高分子量(6000以上)的低抗Xa因子比活性肝素钠，可用于医用外用级或重新降解；
③胰酶酶解
将超滤液I升温至50℃，加超滤液重量0.3％的胰酶，调pH值至7.0，恒温酶解3小时，然后升温至90℃，冷却后过滤，得滤液；
④第2次超滤
将所得滤液，用截留分子量10K的聚砜超滤膜超滤，超滤压力为0.18MP，超滤温度为24℃，得超滤液II；
⑤第3次超滤
将超滤液II用截留分子量4K的聚砜超滤膜超滤，超滤压力为0.14MP，超滤温度为24℃，超滤后以超滤液1倍的纯水冲洗2次，分别收集截留液和超滤液III，将截留液冷冻干燥，即得分子量为4000-6000的低分子肝素钠；
⑥第4次超滤
将超滤液III用截留分子量3K的聚砜超滤膜超滤，超滤压力为0.12MP，超滤温度为24℃，超滤后以超滤液2.5倍量的纯水冲洗3次，收集截留液并冷冻干燥，即可得分子量为3000—4000的肝素钠。
上述实施例中所用的PUROLITE Z-3碱性阴离子交换树脂均先以下述方法进行前处理：a.将树脂放在容器内用40—50℃热水浸泡4-5小时，再用热水冲洗3-5次；b.用含10-12％(质量百分比)NaCl的80—90°乙醇浸泡18-20小时，抽干，再用40—50℃的热水反复冲洗3-5次；c.将树脂投入到洗脱罐中，按照1∶1的比例加入7—9％(质量百分比)氢氧化钠溶液浸泡并搅拌3小时左右，然后用清水冲洗至中性；
d.将树脂投入到洗脱罐中，按照1∶1(g/g)的比例加入5mol/L盐酸浸泡并搅拌3-4小时；e.放出盐酸液，再加入用2倍于树脂量的25％(质量百分比)NaCl溶液搅拌2-3小时，放出NaCl溶液，用清水冲洗3-5次，即可。
所用的胰酶是由新鲜猪胰脏搅碎后，于90％的乙醇中常温激活13-15小时制得。
Claims (6)
1、高纯度低分子量肝素钠的生产纯化方法，其特征在于包括下述步骤：
第一步：未分级肝素钠溶液的制备
①提取
将肠粘膜加2-3倍水于反应罐中以蛋白酶酶解，蛋白酶的用量为肠粘膜重量的5-8％，酶解温度50-55℃，pH8.0—9.5，酶解时间2—5小时，酶解完毕，过滤，得酶解液；再在酶解液中加入酶解液重量3-4倍的碱性阴离子交换树脂搅拌吸附，第一次吸附6-10小时，滤出树脂后，再加入树脂搅拌吸附5-6小时，过滤，合并两次树脂，弃去滤液；
②除杂
将所得树脂置于1.5倍量0.5mol/L的NaCl溶液中搅拌40-45分钟，滤出树脂；
③洗脱
将树脂置于洗脱罐中，以树脂体积2-3倍量的浓NaCl溶液进行梯度洗脱，第一次以4.0-4.5mol/L的NaCl溶液洗脱，洗脱时间6小时，第二次第三次分别用3.0-3.5mol/L的NaCl溶液洗涤3小时，合并三次洗脱液；
④过滤
调整洗脱液pH值至11—12，过滤，滤液再调pH至7.0-7.5，即可得未分级的肝素钠溶液；
第二步：未分级肝素钠溶液的分离纯化
①肝素酶酶切降解
在所制得的未分级肝素钠溶液中按肝素酶：肝素钠溶液＝1:12.5(g/L)的比例加入固相化的肝素酶，缓慢搅拌40-50分钟，高速离心分离除固相化肝素酶，得酶切降解后的肝素钠溶液；
②第1次超滤
将所得肝素钠溶液用截留分子量15K的超滤膜超滤，得超滤液I；
③胰酶酶解
将超滤液I升温至50℃，加超滤液重量0.1-0.5％的胰酶，调pH值至6.5—8.5，恒温酶解3小时，然后升温至90℃，冷却后过滤，得滤液；
④第2次超滤
将所得滤液，用截留分子量10K的超滤膜超滤，收集超滤液II；
⑤第3次超滤
将超滤液II用截留分子量4K的超滤膜超滤，以超滤液1-2倍的纯水冲洗2次，分别收集截留液和超滤液III，将截留液冷冻干燥，即得低分子肝素钠；
⑥第4次超滤
将超滤液III用截留分子量3K的超滤膜超滤，以超滤液2-3倍量的纯水冲洗3次，收集截留液并冷冻干燥，即可得分子量为3000—4000的肝素钠。
2、根据权利要求1所述的高纯度低分子量肝素钠的生产纯化方法，其特征在于：所用的蛋白酶是碱性2709蛋白酶。
3、根据权利要求1或2所述的高纯度低分子量肝素钠的生产纯化方法，其特征在于：所用的碱性阴离子交换树脂是PUROLITE Z-3。
4、根据权利要求1或3所述的高纯度低分子量肝素钠的生产纯化方法，其特征在于：所用的碱性阴离子交换树脂的处理方法如下：a.将树脂放在容器内用40—50℃热水浸泡4-5小时，再用热水冲洗3-5次；
b.用含10-12％(重量百分比)NaCl的80—90°乙醇浸泡18-20小时，抽干，再用40—50℃的热水反复冲洗3-5次；
c.将树脂投入到洗脱罐中，按照1∶1的比例加入7—9％(质量百分比)的氢氧化钠溶液浸泡并搅拌3小时左右，然后用清水冲洗至中性；
d.将树脂投入到洗脱罐中，按照1∶1(g/g)的比例加入5mol/L盐酸浸泡并搅拌3-4小时；
e.放出盐酸液，再加入用2倍于树脂量的25％(质量百分比)NaCl溶液搅拌2-3小时，放出NaCl溶液，用清水冲洗3-5次，即可。
5、根据权利要求1所述的高纯度低分子量肝素钠的生产纯化方法，其特征在于：，所述第一次、第二次超滤压力均为0.18MP，第三次超滤压力为0.14MP，第四次超滤压力为0.12MP，四次超滤温度均为22—26℃，超滤膜均采用聚砜膜。
6、根据权利要求1所述的高纯度低分子量肝素钠的生产纯化方法，其特征在于：所用的胰酶是由新鲜猪胰脏搅碎后，于90％的乙醇中常温激活13-15小时制得。
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