CN103060404A - 一种低分子量肝素的制备方法 - Google Patents
一种低分子量肝素的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种利用非哺乳类鱼类资源制备低分子量肝素的方法，其具体步骤为：从鱼类组织中粗提获得未分级肝素组分，用肝素酶降解未分级肝素，得到低分子量肝素冻干纯品，采用咔唑比色法计算含量，使用高效液相质谱联用仪和聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析分子量和纯度，并通过羊血浆法测定抗Ⅱa效价和生色底物法测定抗Ⅹa效价对其活性进行评价。本发明利用非哺乳类鱼类资源，克服了由于哺乳动物不同种属之间存在的属间交叉病毒和朊病毒感染所带来的不利影响，并改进酶提取方法最终获得高凝血酶活性低分子量肝素。
Description
技术领域
本发明涉及一种低分子量肝素的制备方法，尤其是利用非哺乳类鱼类资源，采用改进酶法提取高凝血酶活性低分子量肝素的方法。
背景技术
凝血是参与维持哺乳动物正常止血的生理途径，在血管受伤的情况下，凝血途径受到激发而形成血凝块，阻止血液损失，血管受伤发生后，血小板立即开始在受伤部位凝集形成物理堵塞物以阻止血液流失。此外，受伤血管也通过血管收缩来减少流经此区域的血流，而血纤维蛋白则开始凝集形成覆盖破裂区域的不溶性网络或凝块。
当凝血途径倾向于过量凝结的不平衡状态时，其结果是血栓趋势的形成，通常表现为心脏病发作、中风、深静脉血栓和急性冠状动脉综合征，例如心肌梗死和不稳定型心绞痛。此外，血栓可以引发栓塞，并造成肺栓塞或包括中风或短暂缺血性发作在内的脑血管栓塞。目前与凝血途径中的不平衡相关的病变的治疗方法存在很多风险，必须进行谨慎的控制。
肝素是一类具有抗凝性质的硫酸化的葡糖胺聚糖的名称。肝素在医学上广泛用作医用介入设备(invasive medical equipment)的涂层剂例如导管和植入体的涂层剂，以及治疗剂和预防剂。此外，已经将肝素与体外循环血液透析一起使用，作为化疗药物和抗炎药物的助剂，作为生长因子的调节剂，并且用于治疗血液动力学紊乱(haemodynamoic disorder)、先兆子痫(pre-eclampsia)、肠炎疾病(inflammator bowel disease)、癌症(cancer)、静脉血栓疾病(venous thromboembolic)、不稳定的冠脉局部缺血疾病(unstablecoronary ischemic disease)和急性脑血管局部缺血(acute cerebravascularischemia)。 肝素是天然的抗凝药物，广泛分布在哺乳动物的肝、肺、心、脾、肾、胸腺、肠黏膜、肌肉和血液中，多与蛋白质结合成复合物存在，这种复合物无抗凝活性，随着蛋白质去除而活性增加。各种组织中肝素的含量与肥大细胞的数目有关，肥大细胞内的颗粒含有肝素或肝素前体，当物理或化学的刺激使肥大细胞脱颗粒时，肝素被释放出来，在体内被肝素酶灭或而通过尿液排泄出去。 肝素具有聚合结构，因而肝素组合物通常包含分子量通常为5kDa至40kDa的肝素(例如参见Mulloy et al.，Thromb.Haemost.84：1052-1056(2000))。分子量范围如此广的肝素通常是指未分级肝素(unfractionated heparin，UFH)。
低分子肝素(low molecular weight heparin,LMWH)是由未分级肝素经化学或酶解聚的方法得到的低相对分子量(Mr)的肝素片段或经分级得到的低Mr肝素组分，Mr范围一般为3000-8000，平均Mr为5000左右。低分子肝素的抗凝血酶FIIa活性远低于其抗Xa因子的活性。LMWH具有抗凝血、抗血栓、调血脂、抗肿瘤等作用，与UFH相比具有以下几个优点：它更好地被吸收，并且可以进行皮下给药；在血流中保留更长的时间；具有更可预测的临床响应；可能引起更少的与UFH有关的不利副作用例如出血过多、血小板数量偏低、骨质疏松和刺激注射部位。
低分子肝素可从肝素直接分离，或把肝素降解后再纯化得到。分离方法包括：有机溶剂分级沉淀法、凝胶色谱法、亲和色谱法、离子交换色谱法和超滤法等。这些方法保持了未分级肝素原有的结构特征和生物学活性，但由于低分子量的成分再UFH中的含量低，不宜于大规模生产。降解方法有肝素酶解法、亚硝酸降解法、过氧化氢降解法、过碘酸降解法、β-消除法、γ-照射法等。不同方法制备得到的LMWH之间结构差异最大之处在于其末端结构，由亚硝酸降解得到的产物，其末端具有无水甘露醇残基，β-消除法的产物具有非硫酸化或2-O-硫酸化的不饱和糖醛酸非还原末端。由于化学降解法反应的剧烈，使得肝素分子中的某些功能基团再反应过程中或多或少被破坏，从而对其某些生物学功能带来一定影响。而酶法降解由于其反应条件温和、便于检测以及生物活性保持较好等特点，成为近年来LMWH提取研究的热点。
现在商品肝素主要来源于牛肺、猪肺、猪肠黏膜和羊肺等动物器官。但是，由于认识到哺乳动物不同种属之间存在的属间交叉病毒和朊病毒感染，对源自哺乳动物的LMWH的使用所带来的副作用倍受关注。针对上述问题，本发明提供了一种使用极为广泛的非哺乳类鱼类资源，改进酶法提取工艺，获取高凝血活性低分子量肝素的制备方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用非哺乳类鱼类资源，采用改进酶法提取高凝血酶活性低分子量肝素的方法，以避免哺乳动物种属之间存在的属间交叉病毒和朊病毒感染，同时改进酶提取方法，提高了低分子量肝素的凝血酶活性。
为解决上述技术问题，本发明提供一种制备低分子量肝素的方法，其具体步骤为：从鱼类组织中粗提获得未分级肝素组分，用肝素酶降解未分级肝素，得到低分子量肝素冻干纯品，并对其含量和活性进行测定。
本发明提供的制备低分子量肝素的方法，还包括使用高效液相质谱对所获得的低分子量肝素的纯度和分子量的分析。
其中，从鱼类组织中粗提获取未分级肝素组分的步骤为：在组织搅拌机中加入等量的鱼类组织和PBS缓冲液进行组织匀浆，将匀浆物中加入40％的NaOH调节pH到9.0，升温至80℃温育3小时，并以10000rpm离心，收集上清液备用；在上清液中加入50％硫酸铵进行盐析步骤，升温至80℃，搅拌1小时，8000 rpm离心，收集上清施加至强碱性阴离子交换树脂，并使用含有4M NaCl的PBS缓冲液对肝素进行洗脱；收集洗脱组分，使用截留分子量为1000Da的过滤器对洗脱液进行浓缩和脱盐，加入95％乙醇洗涤2-3次后进行真空冻干处理，即获得未分级肝素冻干品。
其中，所述的鱼类为鲑鱼，特别的，所述鱼类组织选自头、皮、鳃和内脏。
其中，所述强碱性阴离子交换树脂优选为美国Rohm Hass生产的Amberlite系列、德国拜尔公司生产的Lewatit系列。
其中，所述用肝素酶降解未分级肝素获得低分子量肝素的步骤包括：取UFH组分溶于pH7.4的PBS溶液中，充分溶解后离心去除杂质，在上清液中加入肝素酶III(EC 4.2.2.8)，37℃水浴反应10小时后，不加入相同量的肝素酶III，继续反应10小时，然后水浴升温加热至80℃，1小时候停止反应并10000rpm离心，收集上清液用0.22μm滤膜过滤，加入NaCl固体使其盐浓度未20％(wt)，然后加入90％乙醇，低温静置过夜，直至有沉淀析出，8000 rpm离心 20min后，弃去上清收集沉淀，重复上述盐析、脱水步骤，将获得的沉淀冻干处理后即得低分子量肝素纯品。
其中，所述低分子量肝素含量的测定的方法采用咔唑比色法。
其中，所述低分子量肝素纯度和分子量分析采用高效液相质谱联用仪和聚丙烯酰胺凝胶电泳法。
其中，所述高效液相-质谱法的具体操作步骤为：将冻干纯品溶解于蒸馏水配制成1μg/μl的浓度，进样5μl。流动相A为水/乙腈(85:15 v/v)，B为水/乙腈(35:65 v/v)，两个流动相均含有12mM的三丁基氨TBA和38mM醋酸铵，pH用醋酸调节至6.5。梯度洗脱程序为0％B流动相洗脱10分钟，开始增加B的使用量，在60分钟内使得B在总流动相中的比例由0％匀速增加到100％。色谱柱为ZorbaxSB-C18(5μm，0.5×250mm)，洗脱速度为10μl/min。洗脱液直接接入电喷雾离子源质谱分析仪中，电喷雾接口设置为负电模式，进口电压为-40V，出口为-40V，离子源温度控制在325℃以使得最大程度的得到离子，全谱扫描宽度为150-1500Da，扫描速率为10次/秒，氮气分别被用作干燥气(5L/min)和中和气(20psi)，数据处理采用Data Analysis 2.0。
其中，聚丙烯酰胺凝胶电泳法的具体步骤为：将所获得的低分子量肝素纯品用双蒸水配成5 mg/ml,再与等体积40%蔗糖混匀配成上样液,溴酚蓝作指示剂。电泳胶浓度采用22%的分离胶加5%的浓缩胶,150V电泳1 h后,调电压为200V继续电泳1.5 h。上样量为10 ~ 20μl,染色用0.25%阿利辛蓝,染色半0.5 h,脱色用2%醋酸脱至背景无色。
其中，对低分子量肝素活性的测定包括羊血浆法测定抗Ⅱa效价和生色底物法测定抗Ⅹa效价。
其中，所述羊血浆法测定抗Ⅱa效价的步骤为：取16支干净带塞糖管编号1至16置于37℃水浴中,按逐管递增10μl规律依次加入100μl到250μl的标准肝素(8IU/ml)。再按顺序加入羊血浆1 ml和0.25%的氯化钙0.8 ml,带塞倒转3次使混匀并湿润管内壁,勿产生气泡。置于水浴中恒温1 h后将其全部取出,观察各管的凝固程度,找出标准肝素的1/2凝固体积(标准肝素V1/2)。精确称取层析分离后的肝素寡糖冻干粉适量,用水溶解成1 mg/ml,测定时按估计效价用0.9%氯化钠稀释适当倍数。用上述方法测定各供试品的1/2凝固体积(供试品V1/2)。按如下公式计算各供试品的抗凝血酶效价:供试品效价(IU/mg)=(标准肝素V1/2/供试品V1/2)×标准肝素效价×稀释倍数。
其中，所述生色底物法测定抗Ⅹa效价的步骤为：参照英国药典方法将对照品依诺肝素用Tris2NaCl缓冲液(pH7.4)配制成4个具一定浓度梯度(0.02、0.08、0.14、0.2 Anti F Xa IU/ml)的溶液。精密称取肝素寡糖冻干粉适量,用上述缓冲液溶解成1 mg/ml,测定时再用缓冲液稀释适当倍数。ATⅢ和Xa因子均用上述缓冲液溶解按说明稀释成适宜浓度。生色底物加水溶解成3 mmol/L溶液,临用前再用Tris2EDTA缓冲液(pH8.4)稀释成0.5 mmol/L溶液。取干净具塞试管置于37℃水浴中,加入对照品或供试品溶液80μl,空白管中加入PH7.4的缓冲液80μl。再依次加入抗凝血酶Ⅲ溶液80μl,Xa因子溶液160μl,生色底物CBS溶液400μl,每次加试剂后都迅速漩涡振荡混匀,勿产生气泡,分别精确保温1 min、2 min和4 min。最后加入37%的醋酸600μl终止反应,在波长405 nm处测定吸收度。以对照品效价为横坐标,空白管减去对照管吸收值为纵坐标做标准曲线,根据供试品的吸收值差值在标曲上查出相应的效价值。
附图说明
图1表示高效液相-质谱图。
图2 表示聚丙烯酰胺凝胶电泳图，图中泳道从左往右依次为：肝素dp10，部分降解的肝素样品，本发明所得LMWH，UFH，商品LMWH。
具体实施方式
以下将结合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明提供一种制备低分子量肝素的方法，其具体步骤为：从鱼类组织中粗提获得未分级肝素组分，用肝素酶降解未分级肝素，得到低分子量肝素冻干纯品，并对其含量和活性进行测定。
本发明所提供的制备低分子量肝素的方法，还包括使用高效液相质谱对所获得的低分子量肝素的纯度和分子量的分析。
所述从鱼类组织中粗提获取未分级肝素组分的步骤为：选取鲑鱼头、皮、鳃和内脏等加工废弃物，在组织搅拌机中加入等量的鱼类组织和PBS缓冲液进行组织匀浆，将匀浆物中加入40％的NaOH调节pH到9.0，升温至80℃温育3小时，并以10000rpm离心，收集上清液备用；在上清液中加入50％硫酸铵进行盐析步骤，升温至80℃，搅拌1小时，8000 rpm离心，收集上清施加至强碱性阴离子交换树脂，并使用含有4M NaCl的PBS缓冲液对肝素进行洗脱；收集洗脱组分，使用截留分子量为1000Da的过滤器对洗脱液进行浓缩和脱盐，加入95％乙醇洗涤2-3次后进行真空冻干处理，即获得未分级肝素冻干品。
所述强碱性阴离子交换树脂优选为美国Rohm Hass生产的Amberlite系列、德国拜尔公司生产的Lewatit系列。
所述用肝素酶降解未分级肝素获得低分子量肝素的步骤包括：取UFH组分溶于pH7.4的PBS溶液中，充分溶解后离心去除杂质，在上清液中加入肝素酶III(EC 4.2.2.8)，37℃水浴反应10小时后，不加入相同量的肝素酶III，继续反应10小时，然后水浴升温加热至80℃，1小时候停止反应并10000rpm离心，收集上清液用0.22μm滤膜过滤，加入NaCl固体使其盐浓度未20％(wt)，然后加入90％乙醇，低温静置过夜，直至有沉淀析出，8000 rpm离心 20min后，弃去上清收集沉淀，重复上述盐析、脱水步骤，将获得的沉淀冻干处理后即得低分子量肝素纯品。
所述低分子量肝素含量的测定的方法采用咔唑比色法（Carbazole Assay），LMWH冻干后配制成 0.01 mg/ml,0.05 mg/ml 和 0.2 mg/ml 三个浓度。另外取同样量的肝素和商品低分子量肝素各适量，重复以上的纯化步骤，测定重量后冻干配制成相对应的浓度作为对照。
所述低分子量肝素纯度和分子量分析采用高效液相质谱联用仪和聚丙烯酰胺凝胶电泳法。
所述高效液相-质谱法的具体操作步骤为：将冻干纯品溶解于蒸馏水配制成1μg/μl的浓度，进样5μl。流动相A为水/乙腈(85:15 v/v)，B为水/乙腈(35:65 v/v)，两个流动相均含有12mM的三丁基氨TBA和38mM醋酸铵，pH用醋酸调节至6.5。梯度洗脱程序为0％B流动相洗脱10分钟，开始增加B的使用量，在60分钟内使得B在总流动相中的比例由0％匀速增加到100％。色谱柱为ZorbaxSB-C18(5μm，0.5×250mm)，洗脱速度为10μl/min。洗脱液直接接入电喷雾离子源质谱分析仪中，电喷雾接口设置为负电模式，进口电压为-40V，出口为-40V，离子源温度控制在325℃以使得最大程度的得到离子，全谱扫描宽度为150-1500Da，扫描速率为10次/秒，氮气分别被用作干燥气(5L/min)和中和气(20psi)，数据处理采用Data Analysis 2.0。图1中显示了上述高效液相色谱－质谱分析的结果。
所述聚丙烯酰胺凝胶电泳法的具体步骤为：将所获得的低分子量肝素纯品用双蒸水配成5 mg/ml,再与等体积40%蔗糖混匀配成上样液,溴酚蓝作指示剂。电泳胶浓度采用22%的分离胶加5%的浓缩胶,150V电泳1 h后,调电压为200V继续电泳1.5 h。上样量为10 ~ 20μl,染色用0.25%阿利辛蓝,染色半0.5 h,脱色用2%醋酸脱至背景无色。本发明所获得的低分子量肝素产物和肝素对照品一起进行聚丙烯酰胺凝胶，其获得的结果见图2，图中蛋白条带显示本发明纯化所得的蛋白质分子量约为5700Da，与已有的肝素样品分子量类似。
对低分子量肝素活性的测定包括对Ⅱa效价和抗Ⅹa效价的检测，采用羊血浆法测定抗Ⅱa效价和生色底物法测定抗Ⅹa效价。所述羊血浆法测定抗Ⅱa效价的步骤为：取16支干净带塞糖管编号1至16置于37℃水浴中,按逐管递增10μl规律依次加入100μl到250μl的标准肝素(8IU/ml)。再按顺序加入羊血浆1 ml和0.25%的氯化钙0.8 ml,带塞倒转3次使混匀并湿润管内壁,勿产生气泡。置于水浴中恒温1 h后将其全部取出,观察各管的凝固程度,找出标准肝素的1/2凝固体积(标准肝素V1/2)。精确称取层析分离后的肝素寡糖冻干粉适量,用水溶解成1 mg/ml,测定时按估计效价用0.9%氯化钠稀释适当倍数。用上述方法测定各供试品的1/2凝固体积(供试品V1/2)。按如下公式计算各供试品的抗凝血酶效价:供试品效价(IU/mg)=(标准肝素V1/2/供试品V1/2)×标准肝素效价×稀释倍数。所述生色底物法测定抗Ⅹa效价的步骤为：参照英国药典方法将对照品依诺肝素用Tris2NaCl缓冲液(pH7.4)配制成4个具一定浓度梯度(0.02、0.08、0.14、0.2 Anti F Xa IU/ml)的溶液。精密称取肝素寡糖冻干粉适量,用上述缓冲液溶解成1 mg/ml,测定时再用缓冲液稀释适当倍数。ATⅢ和Xa因子均用上述缓冲液溶解按说明稀释成适宜浓度。生色底物加水溶解成3 mmol/L溶液,临用前再用Tris2EDTA缓冲液(pH8.4)稀释成0.5 mmol/L溶液。取干净具塞试管置于37℃水浴中,加入对照品或供试品溶液80μl,空白管中加入PH7.4的缓冲液80μl。再依次加入抗凝血酶Ⅲ溶液80μl,Xa因子溶液160μl,生色底物CBS溶液400μl,每次加试剂后都迅速漩涡振荡混匀,勿产生气泡,分别精确保温1 min、2 min和4 min。最后加入37%的醋酸600μl终止反应,在波长405 nm处测定吸收度。以对照品效价为横坐标,空白管减去对照管吸收值为纵坐标做标准曲线,根据供试品的吸收值差值在标曲上查出相应的效价值。
测定结果显示如表1
本发明LMWH与对照品依诺肝素对Ⅱa和Ⅹa半抑制率对比
从上表中可以看到，本发明所获得的LMWH的抗Ⅱa效价和抗Ⅹa效价均优于依诺肝素。
所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品属于保留的权利。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.一种制备低分子量肝素的方法，其具体步骤为：从鱼类组织中粗提获得未分级肝素组分，用肝素酶降解未分级肝素(UFH)，得到低分子量肝素冻干纯品，分析其分子量，并对其含量和活性进行测定。
2.如权利要求1所述的制备低分子量肝素的方法，其特征在于，从鱼类组织中粗提获取未分级肝素组分的步骤为：在组织搅拌机中加入等量的鱼类组织和PBS缓冲液进行组织匀浆，将匀浆物中加入40％的NaOH调节pH到9.0，升温至80℃温育3小时，并以10000rpm离心，收集上清液备用；在上清液中加入50％硫酸铵进行盐析步骤，升温至80℃，搅拌1小时，8000 rpm离心，收集上清施加至强碱性阴离子交换树脂，并使用含有4M NaCl的PBS缓冲液对肝素进行洗脱；收集洗脱组分，使用截留分子量为1000Da的过滤器对洗脱液进行浓缩和脱盐，加入95％乙醇洗涤2-3次后进行真空冻干处理，即获得未分级肝素冻干品。
3.如权利要求2所述的制备低分子量肝素的方法，其特征在于，所述的鱼类为海鱼，优选鲑鱼。
4.如权利要求2所述的制备低分子量肝素的方法，其特征在于，所述鱼类组织选自头、皮、鳃和内脏。
5.如权利要求1－4任一所述的制备低分子量肝素的方法，其特征在于，用肝素酶降解未分级肝素获得低分子量肝素的步骤包括：取UFH组分溶于pH7.4的PBS溶液中，充分溶解后离心去除杂质，在上清液中加入肝素酶III(EC 4.2.2.8)，37℃水浴反应10小时后，不加入相同量的肝素酶III，继续反应10小时，然后水浴升温加热至80℃，1小时候停止反应并10000rpm离心，收集上清液用0.22μm滤膜过滤，加入NaCl固体使其盐浓度未20％(wt)，然后加入90％乙醇，低温静置过夜，直至有沉淀析出，8000 rpm离心 20min后，弃去上清收集沉淀，重复上述盐析、脱水步骤，将获得的沉淀冻干处理后即得低分子量肝素纯品。
6.如权利要求1－5任一所述的制备低分子量肝素的方法，其特征在于，所述低分子量肝素含量的测定的方法采用咔唑比色法。
7.如权利要求1－6任一所述的制备低分子量肝素的方法，其特征在于，所述低分子量肝素纯度和分子量分析采用高效液相质谱联用仪和聚丙烯酰胺凝胶电泳法，其中高效液相-质谱法的具体操作步骤为：将冻干纯品溶解于蒸馏水配制成1μg/μl的浓度，进样5μl，流动相A为水/乙腈(85:15 v/v)，B为水/乙腈(35:65 v/v)，两个流动相均含有12mM的三丁基氨TBA和38mM醋酸铵，pH用醋酸调节至6.5，梯度洗脱程序为0％B流动相洗脱10分钟，开始增加B的使用量，在60分钟内使得B在总流动相中的比例由0％匀速增加到100％，色谱柱为ZorbaxSB-C18(5μm，0.5×250mm)，洗脱速度为10μl/min，洗脱液直接接入电喷雾离子源质谱分析仪中，电喷雾接口设置为负电模式，进口电压为-40V，出口为-40V，离子源温度控制在325℃以使得最大程度的得到离子，全谱扫描宽度为150-1500Da，扫描速率为10次/秒，氮气分别被用作干燥气(5L/min)和中和气(20psi)，数据处理采用Data Analysis 2.0。
8.如权利要求1－7任一所述的制备低分子量肝素的方法，其特征在于，对低分子量肝素活性的测定包括羊血浆法测定抗Ⅱa效价和生色底物法测定抗Ⅹa效价。
9.如权利要求8所述的制备低分子量肝素的方法，其特征在于，所述羊血浆法测定抗Ⅱa效价的步骤为：取16支干净带塞糖管编号1至16置于37℃水浴中,按逐管递增10μl规律依次加入100μl到250μl的标准肝素(8IU/ml)，再按顺序加入羊血浆1 ml和0.25%的氯化钙0.8 ml,带塞倒转3次使混匀并湿润管内壁,勿产生气泡，置于水浴中恒温1 h后将其全部取出,观察各管的凝固程度,找出标准肝素的1/2凝固体积(标准肝素V1/2)，精确称取层析分离后的肝素寡糖冻干粉适量,用水溶解成1 mg/ml,测定时按估计效价用0.9%氯化钠稀释适当倍数，用上述方法测定各供试品的1/2凝固体积(供试品V1/2)，按如下公式计算各供试品的抗凝血酶效价:供试品效价(IU/mg)=(标准肝素V1/2/供试品V1/2)×标准肝素效价×稀释倍数。
10.如权利要求8所述的制备低分子量肝素的方法，其特征在于，所述生色底物法测定抗Ⅹa效价的步骤为：参照英国药典方法将对照品依诺肝素用Tris2NaCl缓冲液(pH7.4)配制成4个具一定浓度梯度(0.02、0.08、0.14、0.2 Anti F Xa IU/ml)的溶液，精密称取肝素寡糖冻干粉适量,用上述缓冲液溶解成1 mg/ml,测定时再用缓冲液稀释适当倍数，ATⅢ和Xa因子均用上述缓冲液溶解按说明稀释成适宜浓度，生色底物加水溶解成3 mmol/L溶液,临用前再用Tris2EDTA缓冲液(pH8.4)稀释成0.5 mmol/L溶液，取干净具塞试管置于37℃水浴中,加入对照品或供试品溶液80μl,空白管中加入PH7.4的缓冲液80μl，再依次加入抗凝血酶Ⅲ溶液80μl,Xa因子溶液160μl,生色底物CBS溶液400μl,每次加试剂后都迅速漩涡振荡混匀,勿产生气泡,分别精确保温1 min、2 min和4 min，最后加入37%的醋酸600μl终止反应,在波长405 nm处测定吸收度，以对照品效价为横坐标,空白管减去对照管吸收值为纵坐标做标准曲线,根据供试品的吸收值差值在标曲上查出相应的效价值。
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