CN104764847B - 含n-乙酰化结构肝素寡糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及含N‑乙酰化肝素糖库的制备纯化方法，是以肝素酶Ⅰ深度酶解低分子量肝素来富集含N‑乙酰化结构寡糖，然后通过Bio‑Gel P10凝胶色谱法制备了包括二糖至十四糖的系列肝素寡糖粗样品，再利用强阴离子高效液相色谱等方法对粗样品进一步分离，分别提纯到4种六糖和3种八糖片段。应用肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ复合酶解与强阴离子色谱法分析各纯化寡糖的二糖组分，并结合肝素酶Ⅰ底物特异性，初步推断4种六糖和3种八糖的序列结构；最终应用电喷离子阱‑时间飞行质谱（ESI‑IT‑TOF‑MS）鉴定结构。本发明解决了含N‑乙酰化肝素寡糖难制备及结构测定问题，该问题的解决也将使肝素/硫酸类肝素特殊结构和功能之间关系的研究得以进一步开展。
Description
技术领域
本发明属于天然产物的分离纯化领域，更具体涉及含N-乙酰化结构肝素寡糖的制备方法。
背景技术
肝素(Heparin，HP)是带有大量负电荷的线性糖胺聚糖，在细胞表面和细胞基质中广泛表达。HP与众多的蛋白质相互作用，调控多种生物学功能。除了具有抗凝血及抗血拴生成的功能外, 肝素还具有抗平滑肌细胞增殖、抗炎症、抗肿瘤及抗病毒等功能, 而这些生物活性功能与肝素的特异结构密切相关。肝素聚糖链由50-200个重复的二糖单元构成，肝素六糖和八糖通过特殊的序列与多种蛋白质、酶等相互作用调控着肝素的生理功能。肝素六糖片段中C3位硫酸化和N位乙酰化部位是肝素具有抗凝血和抗带状疱疹病毒作用活性的必需位点。肝素的N位基团是它与多种细胞增长因子相互结合的必要位点，并且具有抑制肿瘤细胞来源的类肝素酶的活性。最引人关注的是，低分子量肝素在临床上有直接的抗癌活性，它有助于延长肿瘤患者的生存时间，这可能与肝素的微量结构有着密切关系。因此对微量结构肝素寡糖的序列分析，不仅对其结构与功能的研究具有重要意义，同时也为肝素作为有效的抑制剂提供了理论基础。
HP二糖是由己糖醛酸(Hexuronic acid，Hex A)与葡萄糖胺(Glucosamine，GlcN)以1-4糖苷键连接而成。肝素大部分结构是高硫结构， N-乙酰化结构是它的稀有结构，仅占整体的5%左右，这部分结构对于肝素功能也是至关重要的。N-乙酰化结构与硫酸类肝素中NS/NAc 区域结构相似。由于硫酸类肝素难于制备，天然来源的硫酸类肝素大概只有肝素量的1%。因此利用肝素制备HS类似的寡糖片段在思路和技术方法上具有创新性，也为肝素/硫酸类肝素结构与功能的研究提供了重要的乙酰寡糖库。
由于质谱精度高，可快速分析糖类精细结构，近年来质谱和液质联用技术被大量应用于分析HP二糖或寡糖。Kailemia MJ等应用质谱表征了一个类似肝素结构的五糖药物。Amster IJ等应用串联质谱分析了酶化学合成的肝素结构。
本发明应用酶I的特异性，能够酶解肝素中高度硫酸化的二糖，使得低含量的N-乙酰化肝素寡糖富集下来；之后利用多种色谱进行分离，能一次性制备一系列由六糖（dp6）到 十四糖 （dp14）的含N-乙酰化结构寡糖。最后结合酶解，高效液相色谱分离，质谱鉴定等方法确定寡糖的结构。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含N-乙酰化结构肝素寡糖的制备方法，即以低分子量的肝素为原料，经过酶解、分离纯化，得到4种六糖和3种八糖片段。本发明解决了含N-乙酰化肝素寡糖难制备及结构测定问题，并使肝素/硫酸类肝素特殊结构和功能之间关系的研究得以进一步发展。
为了实现本发明目的，本发明是通过如下技术方案实施的：
一种含N-乙酰化结构肝素寡糖的制备方法，包括以下步骤：
（1）以低分子量肝素为原料，经肝素酶Ⅰ酶解富集含N-乙酰化结构的寡糖；
（2）然后通过Bio-Gel P-10凝胶色谱法分离得到系列肝素寡糖粗样品；
（3）再利用强阴离子高效液相色谱方法对步骤（2）的粗样品进一步分离，分别提纯得到4种六糖和3种八糖片段；
（4）最后利用肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ复合酶解与强阴离子色谱法分析各纯化寡糖的二糖组分，并结合肝素酶Ⅰ底物特异性，分析4种六糖和3种八糖的序列结构；最后利用质谱法测定寡糖的分子量。
所述的步骤（1）具体为：将分子量为100～300 mg的肝素溶解在1~3ml、0.1 M、pH7.0乙酸钠缓冲溶液中，然后加入30～70mIU肝素酶Ⅰ，在37°C水浴中酶解6~12h后，再加入30~70 mIU肝素酶Ⅰ，继续酶解6～12h；然后加热至100°C沸腾3min终止反应，10000 rpm离心10min，取上清液，冻干。
所述的步骤（2） 具体为：将步骤（1）得到的冻干样品用1ml 0.15～0.25M碳酸氢铵溶解，上样到串联Bio-Gel凝胶层析柱；然后用0.15～0.25M碳酸氢铵洗脱，流速0.2ml/min，自动收集仪收集；分离的寡糖用紫外分光光度计检测，检测波长232 nm；依次收集每个色谱峰对应的糖片段；55°C加热24h 挥发碳酸氢铵，冷冻干燥获得肝素寡糖粗样品。
所述的步骤（3） 具体为：利用强阴离子高效液相色谱分离粗样品；色谱柱为ProPac离子柱，4.0×250mm；色谱条件：流动相A 为pH 2.0～4.0的超纯水，流动相B 为pH2.0～4.0、1.5～2.5M NaCl溶液；具体操作方法为：先将步骤（2）制得的粗样品溶解在1mlpH 2.0～4.0的水，注入样品；色谱流速1ml/min，先冲2ml pH3.5的水；NaCl 线性梯度从0至 0.8 M、2.1 - 7.1 min，0.8 至1.5 M、7.1 - 47.1 min进行洗脱，洗脱得到的寡糖用紫外分光光度计检测，检测波长232 nm；收集各色谱峰对应的寡糖样品，以截留分子量500的透析膜透析2天，冻干，得到 dp6a 、dp6b、dp6c、dp6d、dp8a 、dp8b、dp8c 纯样品。
所述的步骤（4）具体为：取7种步骤（3）制得的纯样品各100 μg，分别加入5mIU的肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ复合酶解，并采用强阴离子交换色谱分析，色谱分离条件如下：流动相A为pH 2.0～4.0的超纯水，流动相B为pH 2.0～4.0、1.5～2.5M NaCl；样品溶解于1ml pH 3.5的水；色谱流速1ml/min；先冲2ml pH3.5的水；NaCl 线性梯度从 0-0.5M、2.1-35.1min，然后 0.5-1.0M、35.1–57.1 min洗脱，洗脱得到的寡糖用紫外分光光度计检测，检测波长232 nm；得到寡糖结构为：
dp6a △HexA-GlcNS-HexA-GlcNS-HexA2S-GlcNS6S；
dp6b △HexA2S-GlcNS6S- HexA2S-GlcNAc- HexA 2S-GlcNS6S；
dp6c △HexA-GlcNS6S-HexA-GlcNAc6S-HexA2S-GlcNS6S；
dp6d △HexA-GlcNS6S- HexA 2S-GlcNAc6S- HexA 2S-GlcNS6S；
dp8a △HexA2S-GlcNS-[HexA2S-GlcNAc-HexA-GlcNS]-HexA2S-GlcNS6S；
dp8b △HexA2S-GlcNS6S-[HexA2S-GlcNAc-HexA-GlcNS]-HexA2S-GlcNS6S；
dp8c △HexA2S-GlcNS6S-[ HexA 2S-GlcNAc- HexA-GlcNAc6S]- HexA 2S-GlcNS6S；
最后利用质谱法测定寡糖的分子量。
肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的复合配比为1:1:1。
所述步骤（4）中质谱法的检测条件为：离子化模式：ESI源；负离子模式；雾化气为高纯N2，流速1.50 L／min；干燥气为高纯N2，流速10 L／min；加热模块温度200℃；曲形脱溶剂管的温度为200℃；离子源电压4.5 kV；检测器电压1.6kV；质量扫描范围：m／z 200～2000；
测定方法：分别准确吸取10 µl、50 µg/ml的dp6a、dp6b、 dp6c、dp6d、dp8a、dp8b、dp8c，在负离子模式下，手动注入质谱仪；测得分子离子峰质荷比为：dp6a，[M-2H]2- m/z704.5428；dp6b，[M-2H]2- m/z 805.4776；dp6c，[M-2H]2- m/z 765.5191；dp6d，[M-2H]2- m/z805.4681；dp8a，[M-3H]3- m/z 649.0288；dp8b，[M-3H]3- m/z 689.6623；dp8c，[M-3H]3- m/z675.6822。
附图说明
图1 为Bio-Gel P-10凝胶色谱柱分离肝素寡糖的色谱图；
图2 强阴离子色谱分离dp6 和 dp8；
图3 dp6a，dp6b，dp6c和dp6d 质谱图；
图4 dp8a，dp8b和dp8c 质谱图。
具体实施方式
实施例1
1）将200 mg低分子量肝素溶解在2.0ml、0.1 M、pH 7.0乙酸钠缓冲溶液中（含0.1mM乙酸钙和100μg/ml BSA），加入50 mIU肝素酶Ⅰ，在37°C水浴中酶解12h后，再加入50mIU肝素酶Ⅰ继续酶解12 h；然后加热至100°C沸腾3min终止反应，10000 rpm离心10min，取上清液，冻干；
2）取冻干的样品用1ml 0.2M碳酸氢铵溶解，上样到串联Bio-Gel层析柱，0.2M碳酸氢铵洗脱，流速0.2ml/min，自动收集仪收集；分离的寡糖用紫外分光光度计检测，检测波长232 nm；依次收集每个色谱峰对应的糖片段，55°C加热24h 挥发碳酸氢铵，冷冻干燥获得肝素寡糖粗样品；
3）利用强阴离子高效液相色谱（ProPac PA-1柱，4.0×250mm）进一步分离获得的dp6和dp8寡糖；流动相A 为pH 3.5的超纯水（HCl 调pH值），流动相B 为pH 3.5、2M NaCl溶液（HCl调pH值）；先将dp6和dp8粗样品溶解在1ml pH 3.5的水，注入样品。；色谱流速1ml/min，先冲2ml pH3.5的水；NaCl 线性梯度从0 ~ 0.8 M (2.1 - 7.1 min)，0.8 ~1.5 M(7.1 - 47.1 min)洗脱的寡糖用紫外分光光度计检测，检测波长232 nm；收集色谱峰对应的寡糖样品，以截留分子量500透析膜进行透析2天，冻干；得到 dp6a 、dp6b、dp6c、dp6d、dp8a 、dp8b、dp8c 纯样品。
4）结构分析方法包括：
取制备的dp6a 、dp6b、dp6c、dp6d、dp8a 、dp8b、dp8c各100μg，分别加入5mIU的肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ完全酶解强阴离子交换色谱分析，色谱分离条件如下：流动相A为pH 2.0～4.0的超纯水，流动相B为pH2.0～4.0、1.5～2.5M NaCl溶液；样品溶解于1ml pH 3.5的水；色谱流速1ml/min；先冲2ml pH 3.5的水，NaCl 线性梯度从 0-0.5M（2.1-35.1min），然后 0.5-1.0M (35.1–57.1 min) 洗脱的寡糖用紫外分光光度计检测，检测波长232 nm；
分析得到寡糖结构为：
dp6a △HexA-GlcNS-HexA-GlcNS-HexA2S-GlcNS6S
dp6b △HexA2S-GlcNS6S- HexA2S-GlcNAc- HexA 2S-GlcNS6S
dp6c △HexA-GlcNS6S-HexA-GlcNAc6S-HexA2S-GlcNS6S
dp6d △HexA-GlcNS6S- HexA 2S-GlcNAc6S- HexA 2S-GlcNS6S
dp8a △HexA2S-GlcNS-[HexA2S-GlcNAc-HexA-GlcNS]-HexA2S-GlcNS6S
dp8b △HexA2S-GlcNS6S-[HexA2S-GlcNAc-HexA-GlcNS]-HexA2S-GlcNS6S
dp8c △HexA2S-GlcNS6S-[ HexA 2S-GlcNAc- HexA-GlcNAc6S]- HexA 2S-GlcNS6S；
质谱检测的条件为：离子化模式：ESI源；负离子模式；雾化气(高纯N2)流速1.50L／min；干燥气(高纯N2)流速10 L／min；加热模块温度200℃；曲形脱溶剂管(CDL)温度200℃；离子源电压4.5 kV；检测器电压1.6kV；质量扫描范围：m／z 200～2000；准确吸取10ul，50ug/ml的dp6a、dp6b、 dp6c、dp6d、dp8a、dp8b、dp8c，在负离子模式下，手动注入质谱仪；测得分子离子峰质荷比为：dp6a，[M-2H]2- m/z 704.5428；dp6b，[M-2H]2- m/z 805.4776；dp6c， [M-2H]2- m/z 765.5191；dp6d， [M-2H]2- m/z 805.4681; dp8a， [M-3H]3- m/z649.0288; dp8b， [M-3H]3- m/z 689.6623; dp8c， [M-3H]3- m/z 675.6822。
实施例2
1）将100 mg低分子量肝素溶解在1.0ml、0.1 M、pH 7.0乙酸钠缓冲溶液中（含0.1mM乙酸钙和100μg/ml BSA），加入50 mIU肝素酶Ⅰ，在37°C水浴中酶解12h后，再加入50mIU肝素酶Ⅰ继续酶解12 h；然后加热至100°C沸腾3min终止反应，10000 rpm离心10min，取上清液，冻干；
2）取冻干的样品用1ml 0.2M碳酸氢铵溶解，上样到串联Bio-Gel层析柱，0.2M碳酸氢铵洗脱，流速0.2ml/min，自动收集仪收集；分离的寡糖用紫外分光光度计检测，检测波长232 nm；依次收集每个色谱峰对应的糖片段，55°C加热24h 挥发碳酸氢铵，冷冻干燥获得肝素寡糖粗样品；
3）利用强阴离子高效液相色谱（ProPac PA-1柱，4.0×250mm）进一步分离获得的dp6和dp8寡糖；流动相A 为pH 3.5的超纯水（HCl 调pH值），流动相B 为pH 3.5、2M NaCl溶液（HCl调pH值）；先将dp6和dp8粗样品溶解在1ml pH 3.5的水，注入样品；色谱流速1ml/min，先冲2ml pH3.5的水；NaCl 线性梯度从0 ~ 0.8 M (2.1 - 7.1 min)，0.8 ~1.5 M(7.1 - 47.1 min)洗脱的寡糖用紫外分光光度计检测，检测波长232 nm；收集色谱峰对应的寡糖样品，以截留分子量500透析膜进行透析2天，冻干；得到 dp6a 、dp6b、dp6c、dp6d、dp8a 、dp8b、dp8c 纯样品。
4）结构分析方法包括：
取制备的dp6a 、dp6b、dp6c、dp6d、dp8a 、dp8b、dp8c各100μg，分别加入5mIU的肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ完全酶解强阴离子交换色谱分析，色谱分离条件如下：流动相A为pH 2.0～4.0的超纯水，流动相B为pH2.0～4.0、1.5～2.5M NaCl溶液；样品溶解于1ml pH 3.5的水；色谱流速1ml/min；先冲2ml pH 3.5的水，NaCl 线性梯度从 0-0.5M（2.1-35.1min），然后 0.5-1.0M (35.1–57.1 min) 洗脱的寡糖用紫外分光光度计检测，检测波长232 nm；
分析得到寡糖结构为：
dp6a △HexA-GlcNS-HexA-GlcNS-HexA2S-GlcNS6S
dp6b △HexA2S-GlcNS6S- HexA2S-GlcNAc- HexA 2S-GlcNS6S
dp6c △HexA-GlcNS6S-HexA-GlcNAc6S-HexA2S-GlcNS6S
dp6d △HexA-GlcNS6S- HexA 2S-GlcNAc6S- HexA 2S-GlcNS6S
dp8a △HexA2S-GlcNS-[HexA2S-GlcNAc-HexA-GlcNS]-HexA2S-GlcNS6S
dp8b △HexA2S-GlcNS6S-[HexA2S-GlcNAc-HexA-GlcNS]-HexA2S-GlcNS6S
dp8c △HexA2S-GlcNS6S-[ HexA 2S-GlcNAc- HexA-GlcNAc6S]- HexA 2S-GlcNS6S；
质谱检测的条件为：离子化模式：ESI源；负离子模式；雾化气(高纯N2)流速1.50L／min；干燥气(高纯N2)流速10 L／min；加热模块温度200℃；曲形脱溶剂管(CDL)温度200℃；离子源电压4.5 kV；检测器电压1.6kV；质量扫描范围：m／z 200～2000；准确吸取10ul，50ug/ml的dp6a、dp6b、 dp6c、dp6d、dp8a、dp8b、dp8c，在负离子模式下，手动注入质谱仪；测得分子离子峰质荷比为：dp6a，[M-2H]2- m/z 704.5428；dp6b，[M-2H]2- m/z 805.4776；dp6c， [M-2H]2- m/z 765.5191；dp6d， [M-2H]2- m/z 805.4681; dp8a， [M-3H]3- m/z649.0288; dp8b， [M-3H]3- m/z 689.6623; dp8c， [M-3H]3- m/z 675.6822。
实施例3
1）将300 mg低分子量肝素溶解在1.0ml、0.1 M、pH 7.0乙酸钠缓冲溶液中（含0.1mM乙酸钙和100μg/ml BSA），加入50 mIU肝素酶Ⅰ，在37°C水浴中酶解12h后，再加入50mIU肝素酶Ⅰ继续酶解12 h；然后加热至100°C沸腾3min终止反应，10000 rpm离心10min，取上清液，冻干；
2）取冻干的样品用1ml 0.2M碳酸氢铵溶解，上样到串联Bio-Gel层析柱，0.2M碳酸氢铵洗脱，流速0.2ml/min，自动收集仪收集；分离的寡糖用紫外分光光度计检测，检测波长232 nm；依次收集每个色谱峰对应的糖片段，55°C加热24h 挥发碳酸氢铵，冷冻干燥获得肝素寡糖粗样品；
3）利用强阴离子高效液相色谱（ProPac PA-1柱，4.0×250mm）进一步分离获得的dp6和dp8寡糖；流动相A 为pH 3.5的超纯水（HCl 调pH值），流动相B 为pH 3.5、2M NaCl溶液（HCl调pH值）；先将dp6和dp8粗样品溶解在1ml pH 3.5的水，注入样品；色谱流速1ml/min，先冲2ml pH3.5的水；NaCl 线性梯度从0 ~ 0.8 M (2.1 - 7.1 min)，0.8 ~1.5 M(7.1 - 47.1 min)洗脱的寡糖用紫外分光光度计检测，检测波长232 nm；收集色谱峰对应的寡糖样品，以截留分子量500透析膜进行透析2天，冻干；得到 dp6a 、dp6b、dp6c、dp6d、dp8a 、dp8b、dp8c 纯样品。
4）结构分析方法包括：
取制备的dp6a 、dp6b、dp6c、dp6d、dp8a 、dp8b、dp8c各100μg，分别加入5mIU的肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ完全酶解强阴离子交换色谱分析，色谱分离条件如下：流动相A为pH 2.0～4.0的超纯水，流动相B为pH2.0～4.0、1.5～2.5M NaCl溶液；样品溶解于1ml pH 3.5的水；色谱流速1ml/min；先冲2ml pH 3.5的水，NaCl 线性梯度从 0-0.5M（2.1-35.1min），然后 0.5-1.0M (35.1–57.1 min) 洗脱的寡糖用紫外分光光度计检测，检测波长232 nm；
分析得到寡糖结构为：
dp6a △HexA-GlcNS-HexA-GlcNS-HexA2S-GlcNS6S
dp6b △HexA2S-GlcNS6S- HexA2S-GlcNAc- HexA 2S-GlcNS6S
dp6c △HexA-GlcNS6S-HexA-GlcNAc6S-HexA2S-GlcNS6S
dp6d △HexA-GlcNS6S- HexA 2S-GlcNAc6S- HexA 2S-GlcNS6S
dp8a △HexA2S-GlcNS-[HexA2S-GlcNAc-HexA-GlcNS]-HexA2S-GlcNS6S
dp8b △HexA2S-GlcNS6S-[HexA2S-GlcNAc-HexA-GlcNS]-HexA2S-GlcNS6S
dp8c △HexA2S-GlcNS6S-[ HexA 2S-GlcNAc- HexA-GlcNAc6S]- HexA 2S-GlcNS6S；
质谱检测的条件为：离子化模式：ESI源；负离子模式；雾化气(高纯N2)流速1.50L／min；干燥气(高纯N2)流速10 L／min；加热模块温度200℃；曲形脱溶剂管(CDL)温度200℃；离子源电压4.5 kV；检测器电压1.6kV；质量扫描范围：m／z 200～2000；准确吸取10ul，50ug/ml的dp6a、dp6b、 dp6c、dp6d、dp8a、dp8b、dp8c，在负离子模式下，手动注入质谱仪；测得分子离子峰质荷比为：dp6a，[M-2H]2- m/z 704.5428；dp6b，[M-2H]2- m/z 805.4776；dp6c， [M-2H]2- m/z 765.5191；dp6d， [M-2H]2- m/z 805.4681; dp8a， [M-3H]3- m/z649.0288; dp8b， [M-3H]3- m/z 689.6623; dp8c， [M-3H]3- m/z 675.6822。
Claims (4)
1.一种含N-乙酰化结构肝素寡糖的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）以低分子量肝素为原料，经肝素酶Ⅰ酶解富集含N-乙酰化结构的寡糖；
（2）然后通过Bio-Gel P-10凝胶色谱法分离得到系列肝素寡糖粗样品；
（3）再利用强阴离子高效液相色谱方法对步骤（2）的粗样品进一步分离，分别提纯得到4种六糖和3种八糖片段；
（4）最后利用肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ复合酶解与强阴离子色谱法分析各纯化寡糖的二糖组分，并结合肝素酶Ⅰ底物特异性，分析4种六糖和3种八糖的序列结构；最后利用质谱法测定寡糖的分子量；
所述的步骤（1）具体为：将100～300 mg的低分子量肝素溶解在1~3ml、0.1 M、pH 7.0乙酸钠缓冲溶液中，然后加入30～70mIU肝素酶Ⅰ，在37°C水浴中酶解6~12h后，再加入30~70mIU肝素酶Ⅰ，继续酶解6～12h；然后加热至100°C沸腾3min终止反应，10000 rpm离心10min，取上清液，冻干；
所述的步骤（4）具体为：取7种步骤（3）制得的纯样品各100 μg，分别加入5mIU的肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ复合酶解，并采用强阴离子交换色谱分析，色谱分离条件如下：流动相A为pH 2.0～4.0的超纯水，流动相B为pH 2.0～4.0、1.5～2.5M NaCl；样品溶解于1ml pH3.5的水；色谱流速1ml/min；先冲2ml pH3.5的水；NaCl 线性梯度从 0-0.5M、2.1-35.1min，然后 0.5-1.0M、35.1–57.1 min洗脱，对洗脱得到的寡糖检测；得到寡糖结构为：
dp6a △HexA-GlcNS-HexA-GlcNS-HexA2S-GlcNS6S；
dp6b △HexA2S-GlcNS6S- HexA2S-GlcNAc- HexA 2S-GlcNS6S；
dp6c △HexA-GlcNS6S-HexA-GlcNAc6S-HexA2S-GlcNS6S；
dp6d △HexA-GlcNS6S- HexA 2S-GlcNAc6S- HexA 2S-GlcNS6S；
dp8a △HexA2S-GlcNS-[HexA2S-GlcNAc-HexA-GlcNS]-HexA2S-GlcNS6S；
dp8b △HexA2S-GlcNS6S-[HexA2S-GlcNAc-HexA-GlcNS]-HexA2S-GlcNS6S；
dp8c △HexA2S-GlcNS6S-[ HexA 2S-GlcNAc- HexA-GlcNAc6S]- HexA 2S-GlcNS6S；
最后利用质谱法测定寡糖的分子量；
肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的复合配比为1:1:1。
2.根据权利要求1所述的含N-乙酰化结构肝素寡糖的制备方法，其特征在于：所述的步骤（2） 具体为：将步骤（1）得到的冻干样品用1ml 0.15～0.25M碳酸氢铵溶解，上样到串联Bio-Gel凝胶层析柱；然后用0.15～0.25M碳酸氢铵洗脱，流速0.2ml/min，自动收集仪收集；分离的寡糖用紫外分光光度计检测，检测波长232 nm；依次收集每个色谱峰对应的糖片段；55°C加热24h 挥发碳酸氢铵，冷冻干燥获得肝素寡糖粗样品。
3.根据权利要求1所述的含N-乙酰化结构肝素寡糖的制备方法，其特征在于：所述的步骤（3） 具体为：利用强阴离子高效液相色谱分离粗样品；色谱柱为ProPac离子柱，4.0×250mm；色谱条件：流动相A 为pH 2.0～4.0的超纯水，流动相B 为pH 2.0～4.0、1.5～2.5MNaCl溶液；具体操作方法为：先将步骤（2）制得的粗样品溶解在1ml pH 2.0～4.0的水，注入样品；色谱流速1ml/min，先冲2ml pH3.5的水；NaCl 线性梯度从0 至 0.8 M、2.1 - 7.1min，0.8 至1.5 M、7.1 - 47.1 min进行洗脱，对洗脱得到的寡糖检测；收集各色谱峰对应的寡糖样品，以截留分子量500的透析膜透析2天，冻干，得到 dp6a 、dp6b、dp6c、dp6d、dp8a、dp8b、dp8c 纯样品。
4.根据权利要求1所述的含N-乙酰化结构肝素寡糖的制备方法，其特征在于：质谱法的检测条件为：离子化模式：ESI源；负离子模式；雾化气为高纯N2，流速1.50 L／min；干燥气为高纯N2，流速10 L／min；加热模块温度200℃；曲形脱溶剂管的温度为200℃；离子源电压4.5kV；检测器电压1.6kV；质量扫描范围：m／z 200～2000；
测定方法：分别准确吸取10 µl、50 µg/ml的dp6a、dp6b、 dp6c、dp6d、dp8a、dp8b、dp8c，在负离子模式下，手动注入质谱仪；测得分子离子峰质荷比为：dp6a，[M-2H]2- m/z704.5428；dp6b，[M-2H]2- m/z 805.4776；dp6c，[M-2H]2- m/z 765.5191；dp6d，[M-2H]2- m/z805.4681；dp8a，[M-3H]3- m/z 649.0288；dp8b，[M-3H]3- m/z 689.6623；dp8c，[M-3H]3- m/z675.6822。
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