CN112175109B - 一种超低分子量肝素钠及其制备方法 - Google Patents

一种超低分子量肝素钠及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种超低分子量肝素钠及其制备方法，属于生物医药领域，将普通肝素在用亚硝酸钠降解成低分子量肝素钠，并在体系中连续降解，并及时把超低分子量肝素钠通过膜分离出来了低分子量肝素钠的进一步降解成肝素碎片磺酸基从肝素上脱落，并可实现肝素钠原料几乎全部解聚成超低分子量肝素钠。该制备方法降解条件温和，可减少磺酸基从肝素上的脱落，并可实现肝素钠原料几乎全部解聚成超低分子量肝素钠。通过该方法制备的超低分子肝素钠收率高，平均分子量小于3000Da，具有更高的抗Fxa生物活性。

Description

一种超低分子量肝素钠及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种超低分子肝素钠。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
低分子肝素是从普通肝素通过降解得到的低分子肝素制品，具有分子量低(分子量低于8000Da)、生物利用率高、血浆半衰期长等优点，特别是其引起的出血副作用大幅降低，普遍受到医护工作者的欢迎。主要用于血栓栓塞性疾病的预防，如肾病综合症，手术后静脉血栓的形成等。
从普通肝素到低分子肝素的降解方法较多，目前采用的降解方法主要有亚硝酸降解、β-消除降解法、过氧化物降解法以及肝素酶降解等等。
超低分子肝素是在低分子肝素的生产方法的基础上进一步降解分离得到的肝素衍生品，其平均分子量小于3000Da。与低分子肝素相比，超低分子肝素具有临床出血现象更低，其抗血栓作用更强，皮下注射更易吸收的特点。
但发明人发现：现有技术大部分采用亚硝酸钠降解法，然后通过乙醇分子量分级得到，收率在20-40％，成本很高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种超低分子肝素钠的制备方法，该制备方法降解条件温和，可减少磺酸基从肝素上的脱落，并可实现肝素钠原料几乎全部解聚成超低分子量肝素钠。通过该方法制备的超低分子肝素钠收率高，平均分子量小于3000Da，具有更高的抗Fxa生物活性。
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面，提供了一种超低分子量肝素钠的制备方法，包括：
向精品肝素钠溶液中加入氯化钠和亚硝酸钠的混合溶液，并使其发生降解反应，调节溶液体系的PH值至2.0～3.0；降解的同时进行超滤，边过滤边加入氯化钠和亚硝酸钠的混合溶液，保持截留区反应液体积和PH不变，收集滤过液，并调节滤过液PH值为中性，至反应完成；
向滤过液中加入硼氢化钠，进行还原反应，还原反应完成后进行超滤，边过滤边加入氯化钠溶液，收集截留液；
将截留液进行醇沉，脱水，干燥，得到超低分子量肝素钠。
本发明提供的制备方法是将普通肝素在用亚硝酸钠降解成低分子量肝素钠，并在体系中连续降解，并及时把超低分子量肝素钠通过膜分离出来减少了低分子量肝素钠的进一步降解成肝素碎片磺酸基从肝素上脱落，并可实现肝素钠原料几乎全部解聚成超低分子量肝素钠。该制备方法可行且降解条件温和，因而保证了最终产物的抗凝活性。
另一方面，由于肝素钠是线形链状分子，在超滤过程中，难以选择性地直接分离出超低分子量肝素钠。为此，本发明经过研究发现：在氯化钠存在下进行降解和超滤分离，可以将超低分子量肝素钠转化为球形，从而在降解后能够通过膜及时分离出来，有效实现了连续降解。
本发明的第二个方面，提供了任一上述的方法制备的超低分子量肝素钠。
本发明制备的超低分子量肝素钠抗凝活性更高、纯度高、平均分子量在2000～3000Da。
本发明的第三个方面，提供了上述的超低分子量肝素钠在生物医药领域中的应用。
由于本发明的制备方法条件温和，超低分子量肝素钠的得率和抗凝活性更高，因此，有望在生物医药领域得到广泛的应用。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的制备方法是将普通肝素在用亚硝酸钠降解成低分子量肝素钠，并在体系中连续降解，并及时把超低分子量肝素钠通过膜分离出来减少了低分子量肝素钠的进一步降解成肝素碎片磺酸基从肝素上脱落，并可实现肝素钠原料几乎全部解聚成超低分子量肝素钠。该制备方法可行且降解条件温和，因而保证了最终产物的抗凝活性。
(2)本发明将低分子肝素钠经过两级膜超滤，并控制盐度而进行高选择性分离、纯化得到抗凝活性更高的超低分子肝素钠，按照本方法制备的超低分子肝素钠的抗Xa效价在80～160U/mg、抗XIIa效价在0.5～10U/mg，平均分子量在2000～3000Da。
(3)由于肝素钠是线形链状分子，在超滤过程中，难以选择性地直接分离出超低分子量肝素钠。为此，本发明经过研究发现：在氯化钠存在下进行降解和超滤分离，可以将超低分子量肝素钠转化为球形，从而在降解后能够通过膜及时分离出来，有效实现了连续降解。
(4)本发明的方法简单、操作方便、实用性强，适合工业化生产。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
一种超低分子肝素钠的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制A溶液：3-6％的氯化钠(W/V)内含2-3％的亚硝酸钠(按照投入肝素钠的重量计算)水溶液(将溶液的PH调至2-3)
(2)取精品肝素钠，用配成5-15％的肝素钠水溶液，室温下边搅拌边加入A溶液，不断监测不断调整溶液的酸碱度使其稳定在PH至2.0至3.0。确认反应后(产生大量气泡后)用3000道尔顿的膜进行超滤，边过滤边加4％的氯化钠内含2-3％的亚硝酸钠水溶液，保持截留区反应液体积不变，维持截留区液体的PH为2.0-3.0，在反应液无气泡产生并经检测溶液中没有肝素钠后停止超滤。
(3)随时收集(2)得到的滤过液，并及时调节ph至中性，直至反应结束(确认步骤2无气泡产生并且检验步骤2中无肝素钠)。然后在滤过液中加入硼氢化钠(加入量为1％肝素钠重量)还原反应6-12小时后，用1000道尔顿的膜进行超滤过滤，边过滤边加入滤液体积3-8倍的4％的氯化钠溶液；当截留液体积为肝素重量的10倍体积时停止过滤，取截留液。
(4)将步骤(3)得到的截留液用3倍体积以上的乙醇沉淀，脱水，干燥，即得超低分子量肝素钠。
(5)将(3)中所得的超低分子量肝素钠，按照生物检定法(中国药典2015年版四部通则1431)中的量反应平行线测定法，采用4×4法进行实验设计与统计计算，进行效价检测。
最终得到超低分子肝素钠，其抗Xa效价在150～210IU/mg，抗XIIa效价在0.5～15U/mg，平均分子量在2000～3000Da。
在一些实施例中，上述超低分子肝素钠制备方法中步骤(3)所述乙醇可以用甲醇替代。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
以下实施例中，各浓度皆为质量体积百分比浓度，特别说明的除外。
实施例1
(1)取精品肝素钠100g，配成10％的肝素钠水溶液1000ml，加入4％的氯化钠内含2％的亚硝酸钠(亚硝酸钠按照投入肝素钠的重量计算)水溶液(溶液的PH调至2.2)室温下边搅拌边加入6mol/L盐酸调节PH至2.2,反应产生气泡后用3000道尔顿的膜进行超滤，边过滤边加4％的氯化钠内含2％的亚硝酸钠(亚硝酸钠按照投入肝素钠的重量计算)水溶液，保持截留区反应液体积不变，整个过程保持ph2.2，要随时调整。在反应液无气泡产生并经检测溶液中没有肝素钠后停止超滤。
(2)收集步骤(1)得到的滤过液，并及时调节ph至7.0，然后在过滤液中加入固体硼氢化钠1g(加入量为1％肝素钠重量)还原反应6小时后，用1000道尔顿的膜进行超滤过滤，边过滤边加入滤液体积6倍的4％的氯化钠溶液；继续过滤，当截留液体积为1000ml(肝素重量的10倍体积时)停止过滤，取截留液。
(3)将(2)中的截留液用3000ml的乙醇沉淀，脱水，干燥，即得超低分子量肝素钠。
(4)取(3)中所得的超低分子量肝素钠，按照生物检定法(中国药典2015年版四部通则1431)中的量反应平行线测定法，采用4×4法进行实验设计与统计计算，进行效价检测。
抗Xa因子效价三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000缓冲液(pH8.4)取三羟甲基氨基甲烷6.06g，氯化钠10.23g，乙二胺四醋酸二钠2.8g，聚乙二醇60001.0g，加水800ml使溶解，用盐酸调节pH值至8.4，加水稀释至1000ml。
标准品溶液(S)与供试品溶液(T)取低分子肝素标准品，按说明书方法溶解，再用上述缓冲液(pH8.4)分别定量稀释制成4种浓度的溶液，作为标准品溶液，溶液的浓度应在lo剂量-反应的线性范围内(每1ml中含0.01～0.1IU)，记为S1、S2、S3、S4；精密称取本品适量，按标准品溶液相同方法溶解并用上述缓冲液(pH8.4)分别定量稀释制成与4种标准品溶液浓度相当的溶液，作为供试品溶液，记为T1、T2、T3、T4。
抗凝血酶溶液取抗凝血酶适量，加上述缓冲液(pH8.4)制成每1ml中含抗凝血酶1IU的溶液。
Xa因子溶液取Xa因子适量，加上述缓冲液(pH8.4)溶解并稀释制成每1ml中约含0.4IU(7.1nkat)的溶液，必要时可调整其浓度，使按下述测定法测定时，B1、B2两管在405nm波长处的吸光度值在0.6～1.0范围内。
发色底物溶液取发色底物S-2765，加水制成3mmol/L的溶液，临用前用水稀释至1mmol/L。
测定法按B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B2的顺序依次向小管中分别精密加入20～50μl相同体积(V)的上述缓冲液(pH8.4)、标准品溶液或供试品溶液，再向每管精密加入相同体积的抗凝血酶溶液，混匀，37℃平衡2分钟，然后再精密加入Xa因子溶液40～100μl(2V)，混匀，37℃平衡2分钟，按2V体积精密加入发色底物溶液，混匀，37℃准确保温2分钟后，各精密加入2V体积的50％醋酸溶液终止反应。用适宜设备在405nm的波长处测定各管的吸光度。空白缓冲液B1、B2两管的吸光度相差不得过0.05。以吸光度为纵坐标，标准品溶液(或供试品溶液)浓度的对数值为横坐标分别作线性回归，计算效价及实验误差。平均可信限率(FL％)不得大于10％。
抗IIa因子效价三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000缓冲液(pH8.4)照抗Xa因子效价项下的方法制备。
标准品溶液(S)与供试品溶液(T)照抗Xa因子效价项下的方法制备，溶液的浓度一般为每1ml中含0.005～0.05IU。
抗凝血酶溶液照抗Xa因子效价项下的方法制备，溶液的浓度为每1ml中含抗凝血酶0.25IU。
凝血酶溶液取凝血酶适量，加上述缓冲液(pH8.4)溶解并稀释成每1ml中约含5IU的溶液，必要时可调整其浓度，使按下述测定法测定时，B1、B2两管在405nm波长处的吸光度值在0.6～1.0范围内。
发色底物溶液取发色底物S-2238，加水制成浓度为3mmol/L的溶液，临用前用水稀释至0.625mmol/L。
测定法按B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B2的顺序依次向小管中分别精密加入20～50μl相同体积(V)的上述缓冲液(pH8.4)、标准品溶液或供试品溶液，再向每管中精密加入相同体积的抗凝血酶溶液，混匀，37℃平衡2分钟，然后每管再精密加入凝血酶溶液40～100μl(2V)，混匀，37℃平衡2分钟，按2V体积精密加入发色底物溶液，混匀，37℃准确保温2分钟后，各精密加入2V体积的50％醋酸溶液终止反应。用适宜设备在405nm的波长处测定各管吸光度。空白缓冲液B1、B2两管的吸光度相差不得过0.05。以吸光度为纵坐标，标准品溶液(或供试品溶液)浓度的对数值为横坐标分别作线性回归，计算效价及实验误差。平均可信限率(FL％)不得大于10％。
(5)将(3)中所得的超低分子量肝素钠，按照分子排阻色谱法(《中国药典》2015年版二部附录ⅤH)进行分子量测定。
分子量与分子量分布取本品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含10mg的溶液，
作为供试品溶液；另取低分子肝素分子量对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含10mg的溶液，作为对照品溶液。照分子排阻色谱法(中国药典2015年版四部通则0514)测定，以适合分离分子量为15000～100000蛋白的亲水性键合硅胶为填充剂；以0.1mol/L醋酸铵溶液为流动相；流速为每分钟0.5ml；柱温30℃；示差折光检测器。取达肝素钠对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含10mg的溶液，取25μl，注入液相色谱仪，调整色谱系统，使主峰与溶剂峰能够完全洗脱，重均分子量应在标示值的±200范围内。取对照品溶液25μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。准确计算色谱图中达肝素钠峰的总面积(不包括盐峰)及每个点的累积峰面积百分比，确定与低分子肝素分子量对照品附带的宽分布标样表中累积峰面积百分比最接近点的保留时间及对应的分子量，以保留时间为横坐标，分子量的对数值为纵坐标，使用GPC软件，拟合三次方程，建立校正曲线，相关系数应不小于0.990。再取供试品溶液25μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按下式计算本品的重均分子量，应为2000～3000Da。
Mw＝∑(RIiMi)/∑RIi
式中RIi为洗脱的i级分的物质量，即示差色谱图的峰高；Mi为由校正曲线计算得出的i级分的分子量。
实施例2
(1)取精品肝素钠100g溶解成15％的水溶液1000ml，加入3％的氯化钠内含3％的亚硝酸钠水溶液(溶液的PH调至2.5)，室温下边搅拌边加入6mol/L盐酸调节PH至2.5,反应气泡产生后用3000道尔顿的膜进行超滤，边过滤边加3％的氯化钠内含3％的亚硝酸钠水溶液，并保持PH至2.5，保持截留区反应液体积不变，在反应液无气泡产生并经检测溶液中没有肝素钠后停止超滤。
(2)收集(1)中的过滤液，并调节ph至7.0，然后在过滤液中加入固体硼氢化钠1g(加入量为1％肝素钠重量)还原反应12小时后，用1000道尔顿的膜进行超滤过滤，边过滤边加入滤液体积6倍的4％的氯化钠溶液；继续过滤，当截留液体积为1000ml(肝素重量的10倍体积时)停止过滤，取截留液。
(3)将(2)中的截留液用3000ml的乙醇沉淀，脱水，干燥，即得超低分子量肝素钠。
(4)取(3)中所得的超低分子量肝素钠，按照生物检定法(中国药典2015年版四部通则1431)中的量反应平行线测定法，采用4×4法进行实验设计与统计计算，进行效价检测。
(5)将(3)中所得的超低分子量肝素钠，按照分子排阻色谱法(《中国药典》2015年版二部附录ⅤH)进行分子量测定。
实施例3
(1)取精品肝素钠100g，用水溶解成8％的溶液1000ml。加入6％的氯化钠内含2.5％的亚硝酸钠水溶液(溶液的PH调至2.5)，室温下边搅拌边加入6mol/L盐酸调节PH至2.5,反应气泡产生后用3000道尔顿的膜进行超滤，边过滤边加6％的氯化钠内含2.5％的亚硝酸钠水溶液，保持ph值2.5，保持截留区反应液体积不变，在反应液无气泡产生并经检测溶液中没有肝素钠后停止超滤。
(2)收集(1)中的过滤液，并调节ph至7.0，然后在过滤液中加入固体硼氢化钠1g(加入量为1％肝素钠重量)还原反应6h后，用1000道尔顿的膜进行超滤过滤，边过滤边加入滤液体积4倍的4％的氯化钠溶液；继续过滤，当截留液体积为1000ml(肝素重量的10倍体积时)停止过滤，取截留液。
(3)将(2)中的截留液用3000ml的乙醇沉淀，脱水，干燥，即得超低分子量肝素钠。
(4)取(3)中所得的超低分子量肝素钠，按照生物检定法(中国药典2015年版四部通则1431)中的量反应平行线测定法，采用4×4法进行实验设计与统计计算，进行效价检测。
(5)将(3)中所得的超低分子量肝素钠，按照分子排阻色谱法(《中国药典》2015年版二部附录ⅤH)进行分子量测定。
实施例4
(1)取精品肝素钠100g溶解成6％的水溶液1000ml，加入6％的氯化钠内含1.5％的亚硝酸钠水溶液(溶液的PH调至2.5)，室温下边搅拌边加入6mol/L盐酸调节PH至2.3,反应气泡产生后用3000道尔顿的膜进行超滤，边过滤边续加6％的氯化钠内含1.5％的亚硝酸钠水溶液，保持ph2.3，保持截留区反应液体积不变，在反应液无气泡产生并经检测溶液中没有肝素钠后停止超滤。
(2)收集(1)中的过滤液，并调节ph至7.0，然后在过滤液中加入固体硼氢化钠1g(加入量为1％肝素钠重量)还原反应12h后，用1000道尔顿的膜进行超滤过滤，边过滤边加入滤液体积4倍的4％的氯化钠溶液；当截留液体积为1000ml(肝素重量的10倍体积时)停止过滤，取截留液。
(3)将(2)中的截留液用3000ml的乙醇沉淀，脱水，干燥，即得超低分子量肝素钠。
(4)取(3)中所得的超低分子量肝素钠，按照生物检定法(中国药典2015年版四部通则1431)中的量反应平行线测定法，采用4×4法进行实验设计与统计计算，进行效价检测。
(5)将(3)中所得的超低分子量肝素钠，按照分子排阻色谱法(《中国药典》2015年版二部附录ⅤH)进行分子量测定。
通过上述实施案例获得了多批次的超低分子量肝素钠，按照《中国药典》的检测方法，对超低分子肝素钠进行了分子量及效价的检测，检测结果见下表1。
表1
Figure BDA0002762423800000111
Figure BDA0002762423800000121
对比例1亚硝酸钠完全降解法生产超低分子量肝素钠
取肝素钠配成10％的溶液，待完全溶解后调节ph至酸性，加入亚硝酸钠进行解聚反应，反应完成后用硼氢化钠还原，然后超滤。测试结果如表2所示
表2完全解聚工艺对比数据
Figure BDA0002762423800000122
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换，值得指出的是，使用此方法只要简单替换其中的反应条件，也可以实现低分子量肝素钠的生产以提高收率和活性。凡在本发明的精神和原则之内，通过“连续降解”与“原位分离”相结合的方式生产肝素、低分子量肝素、超低分子肝素、达肝素、依诺肝素、那曲肝素、肝素衍生物，肝素类似物的方法、设备，以及所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (7)

1.一种超低分子量肝素钠的制备方法，其特征在于，包括：
向精品肝素钠溶液中边搅拌边加入氯化钠和亚硝酸钠的混合溶液，不断监测不断调整溶液的酸碱度，使其稳定在pH值为2.0~3.0，使其发生降解反应；降解的同时用3000道尔顿的膜进行超滤，边过滤边向反应体系中加入氯化钠和亚硝酸钠的混合溶液，保持截留区反应液体积和pH值不变，随时收集滤过液，并及时调节滤过液pH值为中性，至反应完成；
向滤过液中加入硼氢化钠，进行还原反应，还原反应完成后用1000道尔顿的膜进行超滤，边过滤边加入氯化钠溶液，收集截留液；
将截留液进行醇沉，脱水，干燥，得到超低分子量肝素钠。
2.如权利要求1所述的超低分子量肝素钠的制备方法，其特征在于，所述亚硝酸钠的加入量为肝素钠质量的2~3%。
3.如权利要求1所述的超低分子量肝素钠的制备方法，其特征在于，所述氯化钠和亚硝酸钠的混合溶液中，氯化钠的质量体积浓度为4~6%。
4.如权利要求1所述的超低分子量肝素钠的制备方法，其特征在于，所述精品肝素钠溶液的质量浓度为5~15％。
5.如权利要求1所述的超低分子量肝素钠的制备方法，其特征在于，所述硼氢化钠加入量为肝素钠重量1~1.2%。
6.如权利要求1所述的超低分子量肝素钠的制备方法，其特征在于，所述还原反应的时间为6-12小时。
7.如权利要求1所述的超低分子量肝素钠的制备方法，其特征在于，所述氯化钠溶液加入量为滤过液体积3-8倍。
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