CN110642963A - 一种提取阿胶中硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸的方法 - Google Patents

一种提取阿胶中硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提取阿胶中阿胶硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸的方法，该提取方法通过酶解、DEAE离子交换、高效液相色谱分离等一系列步骤，能够将阿胶中硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸提取出来，并利用液相色谱‑离子阱/飞行时间质谱（LC‑MS‑ITTOF）确定阿胶中阿胶硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸二糖组分含量，这对开发阿胶作为保健食品和药品的新功能有重要意义。

Description

一种提取阿胶中硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸的方法
技术领域
本发明属于天然产物制备纯化领域；具体涉及一种提取阿胶中硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸二糖的方法。
背景技术
阿胶为传统的保健食品和中药成分，其主要的药理作用为补血、改善钙代谢平衡、抗休克、增强免疫等，多用于妇科疾病治疗，已被证实在血液疾病治疗、抗炎症、抗凝血和抗衰老等方面具有作用。阿胶主要成分包括氨基酸、蛋白质、糖胺聚糖、微量元素和多肽等。目前对阿胶中活性成分的研究主要集中在氨基酸、蛋白质和微量元素上，对阿胶中糖胺聚糖的研究较少。
糖胺聚糖（GAG）主要分为四大类，硫酸乙酰肝素/肝素(HS/HP)、硫酸软骨素/硫酸皮肤素(CS/DS)、透明质酸(HA)、硫酸角质素(KS)，其化学结构均是由重复的二糖单元组成。其中，CS/DS由乙酰氨基半乳糖(GalNAc)和己糖醛酸(GlcA/IdoA)以β1-3糖苷键交替连接而成，二糖单元以β1-4连接。硫酸皮肤素在形成聚合物后，部分葡萄糖醛酸(GlcA)转化为艾杜糖醛酸(IdoA)。二糖单元通常会发生不同程度的硫酸化修饰，其硫酸化修饰位点主要有GlcA的2位氧硫酸化，GalNAc的4位氧硫酸化和6位氧硫酸化。不同程度以及不同位点的硫酸化修饰致使硫酸软骨素/硫酸皮肤素所发挥的生物功能也有所不同。硫酸软骨素/硫酸皮肤素主要在神经系统发育、创伤修复、抗凝血、抗肿瘤以及关节炎的治疗方面发挥重要的作用。HA为唯一一种没有依附于核心蛋白且不含硫酸基团的GAG，二糖重复单元为乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和葡萄糖醛酸(GlcA)以β1-3糖苷键交替连接而成，二糖重复单元之间以β1-4连接。HA在修复瘢痕、肿瘤侵染、炎症等方面发挥重要的作用。
由于目前国内外尚未对阿胶中CS/DS/HA的提取方法和结构检测进行相关报道，本发明开创性的建立了一种从阿胶中提取CS/DS/HA组分的方法，并首次对其结构进行解析，这对于研究阿胶的药用价值提供了化学成分基础，有助于开发阿胶新的保健和药用功能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取阿胶中硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸二糖的方法。以阿胶为原料，通过酶解、乙醇沉淀、离子交换色谱法分离、高效液相色谱分离一系列步骤提取和纯化了阿胶中的硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸（CS/DS/HA），通过液相色谱/电喷雾-离子阱/飞行时间质谱定量分析其二糖组分。本发明的方法为研究阿胶的药用价值提供了化学成分基础，有助于开发阿胶新的保健和药用功能。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种提取阿胶中硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸的方法，其步骤包括以下步骤：
(1)阿胶灰色链球菌蛋白酶酶解阿胶；
(2)乙醇沉淀步骤 (1)中的阿胶酶解液，收集沉淀，并干燥沉淀物；
(3)利用DEAE-SephacelTM离子交换色谱法分离步骤（2）所得沉淀物种中的蛋白质和目标糖肽；收集目标组分，对收集目标组分进行透析除盐，并冷冻干燥目标组分；(4)硫酸软骨素ABC酶酶解步骤（3）分离获得的目标组分，酶解液离心取上清液待用；
(5)利用高效液相色谱分离步骤（4）所得上清液，收集含有特征吸收的阿胶硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸（CS/DS/HA）组分，置于高温下除去碳酸氢铵；
(6)液质联用色谱检测和分析步骤（5）所得阿胶硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸（CS/DS/HA）组分，计算阿胶硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸二糖的组分含量。
上述步骤(1)的具体步骤为：市售阿胶溶于超纯水中配置成阿胶溶液，然后将配制好的灰色链球菌蛋白酶酶液加入到阿胶溶液中，将阿胶充分酶解。
进一步的，在50-70℃水浴加热下，将市售阿胶溶于超纯水中配置成浓度为0.05g/ml~0.1g/ml的阿胶溶液；将灰色链球菌蛋白酶加入阿胶溶液中，使其终浓度为0.2 mg/ml~1mg/ml，然后酶解液在36-40℃水浴加热酶解24-48 h。
上述步骤(2)的具体步骤为：向步骤(1)中酶解充分的阿胶酶解液中加入饱和乙酸钠的乙醇溶液，离心收集沉淀后高温除去乙醇，得到干燥沉淀物。
进一步的，在步骤1中酶解后的阿胶酶解液样品溶液中加入饱和乙酸钠的乙醇溶液，酶解液与饱和乙酸钠的乙醇溶液的体积比为1:3，置于2-5℃中沉淀24-48 h，离心收集沉淀后，在50-70℃下干燥沉淀物。
步骤(3)的具体步骤为：用DEAE-SephacelTM阴离子交换树脂填装柱子；配制平衡液和洗脱液，将步骤(2)中的干燥沉淀物溶解后过DEAE-SephacelTM阴离子交换柱，用平衡液洗涤干净后，再用洗脱液洗脱柱子并收集馏分；利用UV监测馏分的吸光度，绘制曲线。
进一步的，上述步骤（3）中，所述平衡液：含有0.2 M氯化钠、10-80 mM乙酸钠、0.01%-0.1%曲拉通、pH=6.0-7.0；所述洗脱液含有0.25-1.0 M氯化钠、10-80 mM乙酸钠、0.01-0.1%%曲拉通、pH=6.0-7.0。所述DEAE-SephacelTM阴离子交换树脂填装成体积为5-10ml的柱子并用平衡液平衡柱子；将步骤2中干燥的沉淀物溶于平衡液中，配置成浓度为0.25 g/mL 的溶液依次进行样品上柱、平衡液洗涤柱子和洗脱液洗脱，收集洗脱液。利用UV212 nm监测洗脱液的吸光度，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集目标组分。采用1000-5000 Da的透析袋对收集组分进行透析，2-5℃中用超纯水透析2-4天后，冷冻干燥浓缩目标组分。
步骤(4)的具体步骤为：配制含有PBS酶缓冲液，将硫酸软骨素ABC酶溶于酶解缓冲液中，加入步骤(3)中的干燥的目标组分，充分酶解硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸（CS/DS/HA）长链至二糖单元，灭活、离心取上清液待用。
进一步的，取步骤(3)干燥的目标组分1-100 ng，加入10-100 μL1 mIU/μL硫酸软骨素ABC酶酶反应液，混匀后，于36-40℃水浴中酶解24-48 h；酶解结束后，100℃水浴终止反应，灭活时间为2-5 min；于2-5℃，10000-12000 r/min条件下离心10-20 min，取上清液，并用超纯水洗涤沉淀，与上清液混合，稀释至100-200 μL备用。
步骤(5)的具体步骤为：利用高效液相色谱分离纯化步骤（4）所得上清液中的阿胶阿胶硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸（CS/DS/HA）二糖组分，收集含有特征吸收的阿胶硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸（CS/DS/HA）组分，置于高温除去碳酸氢铵。
进一步的，取步骤（4）中的上清液，以≤200 μL的上样体积过分子排阻色谱柱SuperdexTM 75 10/300 GL，流动相为0.1-0.2M碳酸氢铵溶液，流速为0.3-0.5 mL/min，UV检测波长为232 nm；CS/DS/HA二糖在38.9-44.1 min出峰并进行收集；流动相中的NH4HCO3通过50-70℃挥发除去。
步骤(6)的具体步骤为：荧光标记后的阿胶硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸（CS/DS/HA）二糖，通过液质联用色谱条件已建立的标准曲线，得到阿胶中CS/DS/HA二糖的含量与摩尔百分比。
进一步的，步骤（5）纯化后的阿胶CS/DS/HA二糖溶于5-20 μL 0.1 M AMAC（2-氨基吖啶酮）溶液中，锡纸避光，涡旋10-30 min后，加入5-200 μL 1.0 M NaBH3CN溶液，于40-50℃水浴加热3-5 h，进行避光反应；反应结束后，以上样量<20 μL过ODS柱，流动相A相为20-80 mM 醋酸铵，pH=5-7，流动相B相为100%甲醇，流速为0.3-0.5 mL/ min，CDL为100-200℃，Heat Block为100-200℃，N2流速为1.5 mL/min，检测电压为1.6-1.8 kV，利用标准曲线分析二糖组分。
本发明的优点在于：本发明通过酶解、乙醇沉淀、离子交换色谱法分离、高效液相色谱分离一系列步骤提取和纯化了阿胶中的硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸（CS/DS/HA），通过液相色谱/电喷雾-离子阱/飞行时间质谱定量分析其二糖组分。本发明的方法为研究阿胶的药用价值提供了化学成分基础，有助于开发阿胶新的保健和药用功能。
附图说明
图1利用DEAE柱所收集组分的紫外图：C1代表0.25 M盐浓度洗脱液所洗脱出的组分（1-20管），C2代表0.5 M盐浓度洗脱液所洗脱出的组分（21-40管），C3代表1.0 M盐浓度洗脱液所洗脱出的组分（41-60管）。
图2阿胶过S75柱分离纯化二糖的液相图：A为C1样品过S75柱，B为C2样品过S75柱，C为C3样品过S75柱；短横线代表CS/DS/HA二糖收集时间范围。
图3 CS/DS标准二糖结构。
图4 HA二糖结构。
图5阿胶中CS/DS/HA二糖的EIC图：A为C1中所含二糖的EIC图，B为C2中所含二糖的EIC图，C为C3中所含二糖的EIC图，D为200 ng CS/DS标准二糖的EIC图，E为300 ng HA标准二糖的EIC图。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1
一种提取阿胶中硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸的方法：
1. 阿胶灰色链球菌蛋白酶酶解阿胶
取1.25 g市售阿胶溶于10 mL超纯水中，并放置于70℃水浴中至完全溶解。水浴结束后，加入2.5 mg的灰色链球菌蛋白酶，37℃水浴加热48 h。
乙醇沉淀
在步骤1酶解后的酶解液中加入30ml饱和乙酸钠的乙醇溶液，然后在4℃沉淀24 h。离心后，在55℃下干燥沉淀物。
利用DEAE-SephacelTM离子交换色谱法分离蛋白质和目标糖肽
用DEAE-SephacelTM阴离子交换树脂填装成体积为5 mL的柱子并用平衡液平衡柱子。将步骤2中干燥的沉淀物溶于平衡液中，依次进行样品上柱、平衡液洗涤柱子和洗脱液洗脱，收集洗脱液。利用UV212 nm监测洗脱液的吸光度，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集目标组分。采用3000 Da的透析袋对收集的目标组分进行透析，4℃中用超纯水透析3天后，冻干浓缩目标组分。收集目标组分的紫外图见图1。图1结果表明：C1、C2、C3三种组分在波长212 nm处均有紫外吸收，紫外值在依次递减。
平衡液：0.2 M氯化钠、15 mM乙酸钠、0.01%曲拉通水溶液(pH=6.5)
洗脱液：0.25 M氯化钠、15 mM乙酸钠、0.01%曲拉通水溶液(pH=6.5)，收集组分C1；
0.5 M氯化钠、15 mM乙酸钠、0.01%曲拉通水溶液(pH=6.5)，收集组分C2；
1.0 M氯化钠、15 mM乙酸钠、0.01%曲拉通水溶液(pH=6.5)，收集组分C3；
DEAE提取糖胺聚糖的具体参数如下：
DEAE柱柱体积：5 mL
收集：3 mL/管
流动相：不同盐浓度的磷酸缓冲溶液
柱温：室温
检测器：UV检测器
检测波长：212 nm
4. 硫酸软骨素ABC酶酶解
取步骤3干燥样品C1、C2、C3各6.8 μg、8.1 μg、3.1 μg ，分别加入40 μL 1 mIU/μL硫酸软骨素ABC酶酶反应液（0.3%NaCl，20 mM磷酸缓冲溶液）中制备成制备成浓度为的溶液，加入硫酸软骨素ABC酶使其终浓度为1mIU/μL ，混匀后，于37℃水浴中酶解24 h。酶解结束后，100℃水浴终止反应，灭活时间为5 min。灭活后的酶解液于4℃，12000 r/min条件下离心15min，取上清液，并用超纯水洗涤沉淀，与上清液混合，稀释至200 μL备用。
利用高效液相色谱分离样品和杂质
取步骤4中的上清液，以≤200 μL的上样体积过分子排阻色谱柱SuperdexTM 75 10/300 GL。流动相为0.1 M碳酸氢铵溶液，流速为0.4 mL/min，UV检测波长为232 nm。CS/DS/HA二糖在38.9-44.1 min出峰并进行收集。流动相中的NH4HCO3通过55℃挥发除去。
S75-HPLC方法具体参数如下：
色谱柱：Superdex™ 75 10/300 GL(10 × 300–310 mm)
流速：0.4 mL/min
上样量：200 μL
流动相：0.1 M NH4HCO3
柱温：室温
检测器：UV检测器
检测波长：232 nm
收集时间：38.9-44.1 min；
通过上述方法分离CS/DS/HA二糖，得到的液相图见图2。图2结果表明：在38.9-44.1min，CS/DS/HA二糖在波长232 nm处有紫外吸收，且C1、C2、C3三种样品的紫外值在逐渐递减。
实施例 2
对实施例1提取所得阿胶中硫酸软骨素(CS)/硫酸皮肤素(DS)/透明质酸(HA)样品进行分析检测。
法建立CS/DS/HA二糖标准曲线
取CS/DS 8种标准糖样品混合浓缩后，溶于10 μL 0.1 AMAC（AMAC为2-氨基吖啶酮，溶解于乙酸：二甲亚砜=3:17的溶液中），锡纸避光，涡旋混匀20min。加入10 μL 1.0 MNaBH3CN（NaBH3CN溶解于超纯水中），于45℃水浴加热4 h，进行避光反应。CS/DS结果见图3。8种标准二糖的结构、m/z值见表一。标准曲线方程见表二。
取HA标准糖样品溶于5 μL 0.1 AMAC（AMAC溶解在乙酸：二甲亚砜=3:17的溶液中），避光涡旋混匀20min。再加入5 μL 1.0 M NaBH3CN（NaBH3CN溶解于超纯水中），于45℃水浴加热4 h，进行避光反应。HA的结构见图4。标准曲线方程见表二。
表一 8种CS/DS标准二糖结构与m/z值
Figure 295529DEST_PATH_IMAGE001
ODS-MS方法具体参数如下：
色谱柱：ODS-2 HYPERSIL(4.6×250 mm，5 μm)
流速：0.3 mL/min
上样量：≤20 uL
流动相： A相为40 mM 醋酸铵，pH=5.6；B相为100%甲醇
柱温：45℃
CDL和Heat Block温度：200℃
Nebulizing Gas：1.5 mL/min
检测电压：1.6 kV
线性梯度：0.1~5 min(15%B~15%B)，5~50 min(15%B~41%B)，50~60 min(41%B~100%B)
通过上述方法得到的标准曲线见表二。
表二 ODS-MS法建立CS/DS/HA二糖标准曲线
Figure 415931DEST_PATH_IMAGE002
2. LC/MS-ITTOF分析阿胶CS/DS/HA二糖结构
经液相S75柱纯化后的C1、C2、C3组分，55℃挥发碳酸氢铵3天。然后，浓缩至无水状态并进行衍生化处理，先加入5 μL 0.1 M AMAC在室温下涡旋振荡20 min，再加入5 μL 1.0 MNaBH3CN于45℃水浴中反应4 h。整个反应需注意避光。最后用ODS-MS方法分析阿胶中CS/DS/HA二糖结构，得到的质谱图见图5，组分含量见表三。图5为阿胶中CS/DS/HA二糖的EIC图：A为C1中所含二糖的EIC图，B为C2中所含二糖的EIC图，C为C3中所含二糖的EIC图，D为200 ng CS/DS标准二糖的EIC图，E为300 ng HA标准二糖的EIC图。 A图表明C1样品中仅含有HA一种二糖，B图表明C2样品中含有4S、6S、HA、0S四种二糖，C图表明C3样品中含有SB、4S、6S、HA四种二糖。表三为阿胶中CS/DS/HA二糖组分摩尔百分比和总含量，C1样品中仅有HA二糖，二糖含量为1508 ng/g，C2样品中有四种二糖，其中摩尔百分比最高的为4S，最低的为0S，C3样品中也有四种二糖，摩尔百分比最高的依旧为4S，但相较C2样品比例减少。
表三 阿胶中CS/DS/HA二糖组分摩尔百分比和总含量
Figure 664510DEST_PATH_IMAGE003
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (7)

1.一种提取阿胶中硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)阿胶灰色链球菌蛋白酶酶解阿胶；
(2)乙醇沉淀步骤 (1)中的阿胶酶解液，收集沉淀，并干燥沉淀物；
(3)利用DEAE-SephacelTM离子交换色谱法分离步骤（2）所得沉淀物种中的蛋白质和目标糖肽；收集目标组分，对收集目标组分进行透析除盐，并冷冻干燥目标组分；(4)硫酸软骨素ABC酶酶解步骤（3）分离获得的目标组分，酶解液离心取上清液待用；
(5)利用高效液相色谱分离步骤（4）所得上清液，收集含有特征吸收的阿胶硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸CS/DS/HA组分，置于高温下除去碳酸氢铵；
(6)液质联用色谱检测和分析步骤（5）所得阿胶硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸CS/DS/HA组分，计算阿胶硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸二糖的组分含量。
2.根据权利要求1所述的一种提取阿胶中硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸的方法，其特征在于：所述步骤(1)的具体步骤为：在50-70℃水浴加热下，将市售阿胶溶于超纯水中配置成浓度为0.05g/ml~0.1g/ml的阿胶溶液；将灰色链球菌蛋白酶加入阿胶溶液中，使其终浓度为0.2 mg/ml~1mg/ml，然后酶解液在36-40℃水浴加热酶解24-48 h。
3.根据权利要求1所述的一种提取阿胶中硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸的方法，其特征在于：所述步骤(2)的具体步骤为：在步骤1中酶解后的阿胶酶解液中加入饱和乙酸钠的乙醇溶液，酶解液与饱和乙酸钠的乙醇溶液的体积比为1:3，置于2-5℃中沉淀24-48h，离心收集沉淀后，在50-70℃下干燥沉淀物。
4.根据权利要求1所述的一种提取阿胶中硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸的方法，其特征在于：所述步骤(3)的具体步骤为：DEAE-SephacelTM阴离子交换树脂填装成体积为5-10 ml的柱子并用平衡液平衡柱子；将步骤2中干燥的沉淀物溶于平衡液中，配置成浓度为0.25 g/mL的溶液依次进行样品上柱、平衡液洗涤柱子和洗脱液洗脱，收集洗脱液；利用UV212 nm监测洗脱液的吸光度，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集目标组分；采用1000-5000 Da的透析袋对收集组分进行透析，2-5℃中用超纯水透析2-4天后，冷冻干燥浓缩目标组分；所述平衡液：含有0.2 M氯化钠、10-80 mM乙酸钠、0.01%-0.1%曲拉通、pH=6.0-7.0；所述洗脱液含有0.25-1.0 M氯化钠、10-80 mM乙酸钠、0.01-0.1%%曲拉通、pH=6.0-7.0。
5.根据权利要求1所述的一种提取阿胶中硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸的方法，其特征在于：所述步骤(4)的具体步骤为：取步骤(3)干燥的目标组分1-100 ng，加入10-100μL 1 mIU/μL硫酸软骨素ABC酶酶反应液，混匀后，于36-40℃水浴中酶解24-48 h；酶解结束后，100℃水浴终止反应，灭活时间为2-5 min；于2-5℃，10000-12000 r/min条件下离心10-20 min，取上清液，并用超纯水洗涤沉淀，与上清液混合，稀释至100-200 μL备用。
6.根据权利要求1所述的一种提取阿胶中硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸的方法，其特征在于：取步骤（4）中的上清液，以≤200 μL的上样体积过分子排阻色谱柱SuperdexTM75 10/300 GL，流动相为0.1-0.2M碳酸氢铵溶液，流速为0.3-0.5 mL/min，UV检测波长为232 nm；CS/DS/HA二糖在38.9-44.1 min出峰并进行收集；流动相中的NH4HCO3通过50-70℃挥发除去。
7.根据权利要求1所述的一种提取阿胶中硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸的方法，其特征在于：步骤(6)的具体步骤为：步骤（5）纯化后的阿胶CS/DS/HA二糖溶于5-20 μL 0.1M 2-氨基吖啶酮溶液中，锡纸避光，涡旋10-30 min后，加入5-200 μL 1.0 M NaBH3CN溶液，于40-50℃水浴加热3-5 h，进行避光反应；反应结束后，以上样量<20 μL过ODS柱，流动相A相为20-80 mM 醋酸铵，pH=5-7，流动相B相为100%甲醇，流速为0.3-0.5 mL/ min，CDL为100-200℃，Heat Block为100-200℃，N2流速为1.5 mL/min，检测电压为1.6-1.8 kV，利用标准曲线分析二糖组分。
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