CN104610467B - 一种透明质酸四糖和六糖的分离方法 - Google Patents
一种透明质酸四糖和六糖的分离方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种透明质酸四糖和六糖的分离方法，属于生物工程技术领域。本发明采用Q Sepharose fast flow为离子交换剂，pH8～9Tris‑HCl为平衡液，pH80.125M的NaCl线性梯度洗脱，可将透明质酸四糖和六糖进行分离，脱盐后即得透明质酸四糖和六糖纯品。
Description
技术领域
本发明涉及一种透明质酸四糖和六糖的分离方法，尤其是一种分离水蛭透明质酸酶水解透明质酸得到的以葡萄糖醛酸为末端的透明质酸四糖和六糖的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic acid，简称HA)，俗称玻璃尿酸，是一种由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖为重复双糖单位，通过β-(1→4)和β-(1→3)糖苷键交替连接而成的大分子酸性黏性多糖，1934年由Meyer等人从牛玻璃球眼中首次提取获得，广泛用于医药、化妆品、食品等领域。研究表明,透明质酸能与细胞表面受体CD44作用，从而对癌细胞的耐药性产生影响。由牛睾丸来源的透明质酸酶水解透明质酸产生的透明质酸寡糖可与透明质酸竞争细胞表面CD44受体，从而降低癌细胞的耐药性。此外，研究还发现透明质酸寡糖具有促进血管生成、伤口愈合等重要作用。
水蛭来源的透明质酸酶的酶解作用方式不同于牛睾丸来源的透明质酸酶，前者水解透明质酸β-(1→3)糖苷键，生成以葡萄糖醛酸为末端的寡糖系列，而后者水解透明质酸β-(1→4)糖苷键，生成以氨基葡萄糖为末端的寡糖系列。目前常用的分离由牛睾丸透明质酸酶制备的透明质酸寡糖的方法有HPLC、离子交换法、体积排阻法等，而由于HPLC和体积排阻法不能用于大量制备，适用于工业化制备寡糖的方法只有离子交换法，常用的离子交换剂有DEAE和DOWEX 1×2。但这些方法并不适用于分离水蛭来源的透明质酸酶水解透明质酸得到的产物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种透明质酸四糖和六糖的分离方法，尤其是一种分离由水蛭透明质酸酶制备的以葡萄糖醛酸为末端的透明质酸四糖和六糖的方法。
所述方法主要包括以下内容：选用Q琼脂糖凝胶FF(Q Sepharose Fast Flow，QFF)填充的离子交换柱，高径比为3:1～6.25:1，平衡溶液(A液)选用pH 8～9、50mM以内的Tris-HCl缓冲溶液，平衡柱子时，平衡溶液流速为2～6ml/min；洗脱溶液(B液)为相应pH的1M NaCl溶液，采用线性梯度洗脱策略，洗脱体积为5～20倍的柱体积，NaCl浓度梯度为0.000M-0.125M NaCl；根据出峰的顺序收集样品，将洗脱收集到的样品浓缩后分别采用Superdex Peptide10/300GL脱盐，即得透明质酸四糖和六糖。
在本发明的一种实施方式中，所述方法主要包括以下步骤：(1)以2～6ml/min的速度用5个柱体积的平衡溶液平衡Q FF离子交换柱；(2)用1ml/min流速上样至样品穿透点为5％；(3)用平衡溶液清洗离子交换柱5个柱体积，流速2～6ml/min；(4)采用线性梯度洗脱策略，洗脱体积为5～20倍的柱体积，NaCl浓度梯度为0.000M-0.125M NaCl，流速为2～6ml/min，收集所得到的产物峰；(5)浓缩产物，再通过Superdex Peptide 10/300GL凝胶柱进行脱盐，即可得到四糖和六糖。
在本发明的一种实施方式中，所述Q FF离子交换柱为HiPrep 16/10Q FF离子交换柱。
在本发明的一种实施方式中，平衡溶液选用pH 8、10mM Tris-HCl缓冲溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述方法主要包括以下步骤：(1)以5ml/min的速度用5个柱体积的平衡溶液平衡HiPrep 16/10Q FF离子交换柱；(2)用1ml/min流速上样至样品穿透点为5％；(3)用平衡溶液清洗离子交换柱5个柱体积，流速5ml/min；(4)采用线性梯度洗脱策略，洗脱体积为5～20倍的柱体积，NaCl浓度梯度为0.000M-0.125M NaCl，流速为5ml/min，收集所得到的产物峰；(5)浓缩产物，再通过Superdex Peptide 10/300GL凝胶柱进行脱盐，即可得到四糖和六糖。
在本发明的一种实施方式中，所述样品是水蛭透明质酸酶水解透明质酸的产物。
透明质酸寡糖的聚合度越高，所需的洗脱离子强度越高，而透明质酸二糖在低浓度、高pH下不能交换于离子交换剂上，因此本发明适用于从含透明质酸寡糖四糖和六糖的酶解液中分离出四糖和六糖。通过本发明方法，首次分离出由水蛭透明质酸酶制备的透明质酸寡糖，分离效率、纯度高，具有较好的回收率(四糖回收率为93.85％，六糖回收率为90.61％)，检测限低，可用于大量制备透明质酸寡糖。
附图说明
图1制备的透明质酸寡糖(保留时间8.636min为二糖，10.884min为四糖，13.608min为六糖)
图2 Q FF分离后的四糖(保留时间为10.804)
图3 Q FF分离后的六糖(保留时间为13.715min)
具体实施方式
Q FF离子交换剂来自浙江争光实业股份有限公司，离子交换柱来自锦州市新科水处理设备厂。透明质酸酶是从水蛭中提取的或由基因工程菌重组表达水蛭透明质酸酶基因得到的。
寡糖混合液、四糖液和六糖液的液相色谱检测方法：色谱柱：YMC-Pack PolyamineII(250mm×4.6mm)；流动相：100mM磷酸二氢铵：乙腈(90：10)；流速0.5ml/min，检测波长210nm。
实施例1以葡萄糖醛酸为末端的透明质酸寡糖的制备
于含有去离子水98ml的38℃酶反应器中，加入1g透明质酸，38℃保温15min后，加入酶活为80万U/ml的水蛭透明质酸酶液2ml，反应进行32h后，沸水浴加热10min。8000转离心15min后弃沉淀取上清。如图1所示，上清液为含有透明质酸二糖、四糖和六糖的混合液。保留时间为8.636的样品为透明质酸二糖，保留时间为10.884的样品为透明质酸四糖，保留时间为13.608的样品为透明质酸六糖。
实施例2透明质酸四糖和六糖的分离及纯度检测
配制A液(平衡溶液)：pH 8、10mM Tris-HCl缓冲液，B液(洗脱溶液)：由A液配制的0.125M的NaCl缓冲溶液，通过以下条件进行透明质酸四糖和六糖的分离。
(1)以5ml/min的速度用5个柱体积的A液平衡HiPrep 16/10Q FF离子交换柱(高径3:1)。
(2)用1ml/min流速上样(实施例1制备的含有透明质酸四糖和六糖的混合液)至样品穿透点为5％。
(3)用A液洗去样品，洗脱5个柱体积，流速5ml/min。
(4)用A液和B液进行线性洗脱，使洗脱液中NaCl浓度为0.000M-0.125M，洗脱体积为15个柱体积，流速为5ml/min，依次收集所得到的峰，由于糖酸聚合度越低，交换能力越弱，二糖不能交换与色谱柱上，根据出峰的离子强度强弱可以判断，先出峰的为四糖、紧接出峰的为六糖。
(5)浓缩得到的峰，再通过Superdex Peptide 10/300GL凝胶柱或500～1000透析袋进行脱盐后冻干，即可得到四糖和六糖。
(6)将分离纯化的四糖和六糖通过HPLC法检测，如图2和图3可见四糖和六糖得到了很好的分离，六糖中含有微量的四糖。
(7)取冻干后的四糖和六糖，用咔唑硫酸法测定透明质酸寡糖的纯度，测定结果四糖纯度为64.86％，六糖纯度为58.31％。
实施例3透明质酸四糖和六糖回收率
取实例2中分离出的四糖和六糖各0.1000g，混合后溶于500μL，按照实施例2中操作，上样量为500μL，分离得到脱盐后的透明质酸寡糖，冻干后测定寡糖重量，其中四糖0.9385g、六糖0.9061g。四糖回收率为93.85％，六糖回收率为90.61％。
实施例4透明质酸分离下限
取实施例1中酶解液，取500μL，按照实施例2中操作，上样量为500μL，最后制得四糖132.46mg、六糖89.60mg，分离效果如实施例2，四糖纯度62.89％，六糖纯度55.34％。因此，该分离方法可分离还原糖量(以葡萄糖醛酸计)0.027mg～离子交换剂5％穿透点的样品。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (5)
1.一种透明质酸四糖和六糖的分离方法，其特征在于，选用Q琼脂糖凝胶FF填充的离子交换柱，高径比为3:1～6.25:1，平衡溶液为pH 8～9、50mM以内的Tris-HCl缓冲溶液，平衡柱子时，平衡溶液流速为2～6ml/min；洗脱溶液为相应pH的1M NaCl溶液，采用线性梯度洗脱策略，洗脱体积为5～20倍的柱体积，NaCl浓度梯度为0.000M-0.125M NaCl；将洗脱收集到的样品浓缩后分别采用Superdex Peptide 10/300GL脱盐，即得透明质酸四糖和六糖；
待分离样品是水蛭透明质酸酶水解透明质酸的产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法主要包括以下步骤：(1)以2～6ml/min的速度用5个柱体积的平衡溶液平衡Q FF离子交换柱；(2)用1ml/min流速上样至样品穿透点为5％；(3)用平衡溶液清洗离子交换柱5个柱体积，流速2～6ml/min；(4)采用线性梯度洗脱策略，洗脱体积为5～20倍的柱体积，NaCl浓度梯度为0.000M-0.125MNaCl，流速为2～6ml/min，收集所得到的产物峰；(5)浓缩产物，再通过Superdex Peptide10/300GL凝胶柱进行脱盐，即可得到四糖和六糖。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述Q FF填充的离子交换柱为HiPrep16/10Q FF离子交换柱。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，平衡溶液选用pH 8、10mM Tris-HCl缓冲溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法主要包括以下步骤：(1)以5ml/min的速度用5个柱体积的平衡溶液平衡HiPrep 16/10Q FF离子交换柱；(2)用1ml/min流速上样至样品穿透点为5％；(3)用平衡溶液清洗离子交换柱5个柱体积，流速5ml/min；(4)采用线性梯度洗脱策略，洗脱体积为5～20倍的柱体积，NaCl浓度梯度为0.000M-0.125MNaCl，流速为5ml/min，收集所得到的产物峰；(5)浓缩产物，再通过Superdex Peptide10/300GL凝胶柱进行脱盐，即可得到四糖和六糖。
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