CN101045754A

CN101045754A - 透明质酸分离纯化的方法

Info

Publication number: CN101045754A
Application number: CN 200710017757
Authority: CN
Inventors: 郭育涛; 江元汝; 陈斌; 李东亮
Original assignee: Xian University of Architecture and Technology
Current assignee: Xian University of Architecture and Technology
Priority date: 2007-04-28
Filing date: 2007-04-28
Publication date: 2007-10-03
Anticipated expiration: 2027-04-28
Also published as: CN100591696C

Abstract

本发明公开了一种透明质酸分离纯化的方法，将得到的透明质酸提取物加入到碱性缓冲水溶液中，并加入胰蛋白酶，在常温下搅拌；向上述混合液中加入卤苯，搅拌，然后离心抽取上清液；向上述清液中加入0.15mol/L－0.25mol/L的氯化钠，并搅拌溶解，然后加至少2.5倍体积的95％以上的乙醇并搅动，静置至沉淀发生后离心，沉淀物既为分解蛋白质的透明质酸。本发明方法操作步骤少，操作简便；生成的产品成本费用低，产品质量好。

Description

透明质酸分离纯化的方法

技术领域

本发明涉及一种分离纯化透明质酸(Hyaluronic acid，简称HA)的方法。

背景技术

HA是一种由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺为双糖单位聚合而成的大分子生物多糖。HA有生物相容性、生物降解性及光学活性等。HA主要用于临床治疗、化妆品、医疗用品研究等方面。在生物分离工程领域，寻求生物物质分离新技术、新方法是长期以来关注的重点之一。对HA分离纯化方法的研究从1952年以来不断有相关的论文发表和专利报道。

用活性炭和粉末纤维素吸附剂对微生物发酵HA提取物的分离纯化方法(Biochimica et Biophysica Acta，1957.Vol.24：397-400)。该方法的最大缺点是：随着蛋白质被吸附剂的除去，部分HA随之带入而损失掉。此外，由于动物组织中的HA是以与蛋白质聚糖的形式存在，在对动物源HA分离纯化中，用此法会在除去蛋白质的过程中损失大量的HA。因此该法不宜用于动物源HA的分离纯化。

用氯仿结合膜滤法从牛眼球玻璃体中分离纯化HA的方法(U.S.Pat.No4,141,973)，该法的最大缺点是：分离过程中使用常规方法不易得到的DNase及RNase两类核酸酶。

用胰蛋白酶水解法从牛关节液中制取HA的方法(WO 86/06728)。该法的最大缺点是：分离过程中多次在磷酸盐溶液中进行酶分解及其附属过程，因此，操作过程复杂。

用溴化十六烷基三甲铵(CTAB)从发酵液中分离HA的方法(U.S.No.4,782,046)；一种用超滤与氯化十六烷基吡啶(CPC)沉淀结合的方法从发酵液中分离HA的方法(WO 92/08799)。该类方法最大的缺点是：在实施用CTAB或CPC分离纯化HA过程中，要经过多次CTAB或CPC沉淀HA及盐溶过程，操作过程繁杂。有的得到的HA产物既含有蛋白质又含有核酸(WO 92/08799)。

用CPC结合DEAE-纤维素从人脐带、牛眼玻璃体、鸡冠中分离纯化HA的方法(生物化学杂志，1996年第12卷第2期)。该方法的最大缺点是：分离纯化过程中在除去蛋白质的同时造成大量HA的损失。此外，操作复杂。

用氯仿、链霉蛋白酶及CPC从鸡冠中制备HA的方法(医药工业，1986，17.7)。该法的最大缺点是：由于先在pH4.5-5.0之间，用氯仿变性除去蛋白质造成HA随部分蛋白质的除去而损失及HA分子发生降解。此外，由于使用CPC，操作过程复杂。

一种利用离子交换树脂层析分离纯化HA的方法(离子交换与吸附1999.15.4)及(中国医药工业杂志，.2001.32.17)。该类方法目前仅处于实验室研究阶段。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种透明质酸分离纯化的方法，该方法操作步骤少，操作简便；成本费用低；产品质量好。

本发明解决的技术问题的技术方案是：它包括以下步骤：

(1)将得到的透明质酸提取物加入到碱性缓冲水溶液中，并加入胰蛋白酶，在常温下搅拌；

(2)向上述混合液中加入卤苯，搅拌，然后离心抽取上清液；

(3)向上述清液中加入0.15mol/L-0.25mol/L的氯化钠，并搅拌溶解，然后加至少2.5倍体积的95％以上的乙醇并搅动，静置至沉淀发生后离心，沉淀物既为分解蛋白质的透明质酸；

(4)加分解蛋白质的透明质酸到离子溶液中搅拌溶解，然后加至少2.5倍体积的95％以上的乙醇并搅动，静置至沉淀发生后离心，沉淀物为固性物中含至少42％的透明质酸；

(5)将步骤(4)的沉淀物加入离子溶液中搅拌溶解，然后加入活性炭，或活性炭和高岭土，搅拌、离心，上清液经滤膜抽滤，滤液既为透明质酸溶液，然后加至少2.5倍体积的95％以上的乙醇并搅动，静置至沉淀发生后离心，沉淀物为透明质酸含量((以绝干物计))至少60％。

本发明根据不同要求可以制备不同纯度的产品。因此它还包以下步骤：

(6)将步骤(5)的上清液经滤膜抽滤后的透明质酸溶液用35000Da透析袋在去离子水透析3-4h，然后，向透析后的溶液中加羧甲基纤维素并搅拌，最后离心或抽滤；羧甲基纤维素的使用量为10～30g/l；

(7)将上述滤液，冷冻，真空干燥，得无色透明片状透明质酸产物，或向其中加氯化钠至0.15mol/L～0.25mol/L，加至少2.5倍体积的95％以上的乙醇并搅动，静置至沉淀发生后离心，沉淀物经冷冻，真空干燥，得到白色粉末状透明质酸产物。

所述将步骤(1)碱性缓冲水溶液是由NaHCO₃和Na₂CO₃或NaHCO₃和NaOH，NaHCO₃的使用量为0.01～120g/l，碳酸钠Na₂CO₃的用量为0～100g/l，或NaOH为0～1g/l；所述碳酸氢钠及碳酸钠最佳浓度是1～10g/L。

所述步骤(1)所用的胰蛋白酶为粗制胰蛋白酶或精制胰蛋白酶，用量范围为透明质酸提取物中每毫克蛋白质用2～100个活力单位的酶量，酶的分解温度为20～42℃，分解时间为0.5～90h；酶的分解温度范围是30～33℃，酶加量是透明质酸提取物中每毫克蛋白质用8～25个活力单位的酶量，时间是24h以内。

所述步骤(2)加入卤苯是氯苯、溴苯、氟苯或碘苯，最好是氯苯、溴苯；加入的体积比为：5～25％。

所述步骤(3)离子溶液为含盐的磷酸盐缓冲液的盐，盐为NaCl，其浓度为5.8～18g/l，磷酸盐为NaH₂PO₄和Na₂HPO₄，NaH₂PO₄的浓度为0.0110g/l，Na₂HPO₄的浓度为0.01g/l。

所述步骤(5)中活性炭用量范围为10～120g/l，最佳为30～60g/l；高岭土的使用量为1～100g/l，最佳为10～30g/l；活性炭与高岭土的比为1∶0～2。

所述步骤(5)的滤膜孔径为不小与0.45μm，最好是0.22μm及其以下。

本发明的有益效果是：

利用碳酸盐控制水溶液的pH，用胰蛋白酶水解HA提取物中的蛋白质，然后把经乙醇回收的分解蛋白质后的HA，加到含氯化钠、磷酸二氢钠及磷酸氢二钠的溶液中形成一种离子溶液，向该离子溶液加入乙醇，大量的蛋白质成分不但不沉淀反而溶解，从而一次分离去除大量蛋白质，并为以后的HA高回收率创造了条件。此后，经过活性碳混合高岭土吸附，残留的大量蛋白质成分被去除及微量核酸被全部除去。最后，经过透析及羧甲基纤维素处理，微量蛋白质成分进一步减少。结果，发酵源HA提取物经本发明方法分离纯化纯度达到99.97％以上，动物源的达到99.5％以上。

与本发明相比，目前普遍使用的CPC等季胺盐类沉淀HA法，要达到99.5％以上纯度，至少需要三次CPC反复沉淀和溶解(朱宛中等，眼用透明质酸制备工艺改进，中国生物制品学杂志，1996年第3期)，酶水解后需要2-3次氯仿处理；这些在操作步骤上及操作难度上均超过本发明。本发明在操作步骤上及操作方便上均有优势。

本发明方法中使用的碳酸盐及磷酸盐均是普通化学试剂，价格低，使用量少，及本发明在稳定条件下操作；而使用季胺盐方法中的CPC等的价格很高，多次使用，用量较大，加之CPC类方法操作难度大。这使得本发明在生产成本上占有优势。

本发明操作均在pH≥7及温和条件下进行，避免对HA长链分子造成不良影响的操作的被使用。

依据本发明方法，最终产物的掺杂物蛋白质达到瑞典Headon小于0.5％的要求。特别是本发明的发酵源HA纯度达到高纯度99.99％以上。本发明的产物之一，具体步骤(5)的结果，发酵源纯度可达到99.6％以上，动物源纯度可达90.8％以上，因此，可根据化妆品及药品对HA纯度要求的不同制备不同纯度的产品。

此外，本发明中使用了卤苯，不但在于卤苯对蛋白质的变性及溶解脂的能力与通常使用的氯仿相近，而且氯苯的沸点比氯仿高。这样使用氯苯比使用氯仿自然挥发量少的多，因此既减少了试剂的用量，又减少了对环境的污染。

动物源HA及发酵源HA提取物主要分离纯化步骤后的结果，分别见表1及表2：

表1 来自牛眼玻璃体的HA提取物主要分离纯化步骤后的结果

项目名称	HA含量^*％	蛋白质含量^*％	纯化倍数^*	总蛋白质除去率％	HA回收率％
项目名称	HA含量^*％	蛋白质含量^*％	纯化倍数^*	总蛋白质除去率％	HA回收率％	提取物	9.1	91.47
步骤4	67.6	32.38	22.3	95.9	90.75	提取物	9.1	91.47
步骤4	67.6	32.38	22.3	95.9	90.75	步骤5	97.8	2.18	21.45	3.87	94.14
步骤6	99.57	0.43	5.17	0.000585	92.62	步骤5	97.8	2.18	21.45	3.87	94.14

注：①*表示绝干物。

②纯化倍数系纯化前后单位体积或质量中HA与蛋白质之比的比的倒数。

表2 来自发酵HA提取物主要分离纯化步骤后的结果

项目名称	HA含量^*％	蛋白质含量^*％	纯化倍数	总蛋白质除去率％	HA回收率％
项目名称	HA含量^*％	蛋白质含量^*％	纯化倍数	总蛋白质除去率％	HA回收率％	提取物	93.99	6.01
步骤4	98.3	1.7	3.7	71.17	99.0	提取物	93.99	6.01
步骤4	98.3	1.7	3.7	71.17	99.0	步骤5	99.6	0.4	4.31	21.63	97.2
步骤6	99.99	0.04	10.04	0.0599	95.1	步骤5	99.6	0.4	4.31	21.63	97.2

具体实施方式

本发明的具体步骤如下：

(1)将得到的HA提取物加入到碱性缓冲水溶液中，并加入胰蛋白酶，在一定温度下搅拌一定时间。

(2)向上述搅拌液中加入卤苯，然后强烈搅拌30min，最后，离心并抽取上清液。

(3)向上述清液中加氯化钠至0.2mol/L并搅拌溶解，然后加2.5倍以上体积的95％以上的乙醇或无水乙醇并搅动，静置沉淀发生后离心。沉淀物既为分解蛋白质的HA。

(4)加分解蛋白质的HA到一种离子溶液中搅拌溶解，然后加至少2.5倍体积的95％以上的乙醇并搅动，静置至沉淀发生后离心，沉淀物既为分解蛋白质的透明质酸；

(5)将分解蛋白质的透明质酸溶入与(4)相同的离子溶液中，然后加入活性炭及高岭土，搅拌1h后离心，上清液经滤膜抽滤。滤液既为HA溶液(加乙醇回收可得HA含量60％以上的产物)。

(6)将步骤(5)的HA溶液用35000Da透析袋在去离子水透析3-4h，然后，向透析后的溶液中加羧甲基纤维素并搅拌，最后离心或抽滤(加乙醇回收可得HA含量90％以上的产物)。

(7)将上述滤液，冷冻，真空干燥，得无色透明片状透明质酸(HA)产物。或向其中加氯化钠至0.15mol/L～0.25mol/L，加至少2.5倍体积的95％以上的乙醇并搅动，静置至沉淀发生后离心，沉淀物经冷冻，真空干燥，得到白色粉末状透明质酸产物。

所述将步骤(1)碱性缓冲水溶液是由NaHCO₃和Na₂CO₃或NaHCO₃和NaOH，NaHCO₃的使用量为0.01～120g/l，碳酸钠Na₂CO₃的用量为0～100g/l，或NaOH为0～1g/l；所述碳酸氢钠及碳酸钠最佳浓度是1-10g/L。

本发明所用的碱性缓冲水溶液是指由碳酸氢钠和碳酸钠组成，或碳酸氢钠和氢氧化钠组成(或相应的钾盐)，这里碳酸氢钠的使用量为0.01～120g/L，碳酸钠的用量为0～100g/L，氢氧化钠的用量为0～1g/L。

本发明所用的胰蛋白酶为粗制胰蛋白酶(生物化学实验指导，清华大学出版社.2004年1月1版：199～202页)或精制胰蛋白酶。用量为HA提取物中每毫克蛋白质加2～100活力个单位的量(pH7.5，温度为37℃条件，每分钟分解产生1μg酪氨酸为1个单位)，酶的分解温度为20～42℃，分解时间为0.5～90h，较好的温度范围是30～33℃，较好的酶加量是HA提取物中每毫克蛋白质加8～25个活力单位的酶量，时间最好控制24h以内。

为了减少试剂用量和减少环境污染，本发明向酶水解液中加入的非极性溶剂卤苯是氯苯或溴苯以代替通常的氯仿。这一步的离心，工业化时可用碟片式离心机半连续工作。

本发明溶解纯化产物I的离子溶液为由氯化钠及磷酸二氢钠(或钾)和磷酸氢二钠(或钾)组成的溶液。氯化钠较好的浓度范围为5～18g/L，磷酸二氢钠或磷酸二氢钾较好的浓度范围0.01～0.5g/L，磷酸氢二钠或磷酸氢二钾较好的浓度为0.1～2.5g/L。

本发明向HA水溶液中加入的活性炭、高岭土及羧甲基纤维素介质均经过稀盐酸浸泡、稀碱浸泡、抽滤、用去离子水洗至中性和干燥过程处理。活性炭用量较好的范围为30～150g/L；高岭土的使用量为40～80g/L。羧甲基纤维素较好的用量范围为1～5g/L。

HA的定量分析法用咔唑法(Analytical Biochemistry.1962.4：330～334)，分子量用粘度法(Biochem.Biophys.1960.42.476～486)，蛋白质的测定用Folin-酚法，核酸的检查用二苯胺法、地衣酚法和紫外扫描。结构检查用IR。

本发明不但可以在实验室实施，而且容易实现工业化，酶分解及加卤苯等过程只需一个搅拌釜。卤苯与水相的分离只需一台碟片式离心机。固液分离时需要一台常用离心过滤机和一个抽滤装置，透析需要一台中空纤维透析装置。所有这些都表明，本发明是容易实现从实验室到工业生产过程的放大。

本发明HA提取物的取得是由原材料经水溶液提取，制得HA提取液后，向提取液中加入氯化钠、乙醇，经沉淀、离心或过滤获得的。从不同原材料中提取HA提取液的方法是：(1)从微生物发酵液中制取HA提取液：参见(无锡轻工大学学报.2000.Vol.19No.5：437-439)。(2)从动物眼玻璃体中制取HA提取液：剥去眼球外层皮革及除去晶状体，加入0.37g/L的EDTA-Na，组织捣碎机捣1～2min，后于2000r/min离心10分钟或抽滤，得HA提取液。(3)从人脐带中制取HA提取液：取冷冻人脐带切片后，按重量的4～6倍加入去离子水，并按0.37g/L的浓度加入EDTA-Na，缓慢搅拌2～3h，离心或过滤得HA提取液。(4)从鸡冠中制取HA提取液：新鲜公鸡冠冷冻后切成片，加入6倍体积的无水乙醇或95％的乙醇，搅拌10～20min，离心或抽滤，按重量向离心得到的固体物中加入5-8倍的去离子水，并按0.37g/L的浓度加入EDTA-Na，搅拌3～4h，离心或抽滤，得HA提取液。

本发明所用的HA提取物均为从提取液中直接分离得到的湿样固体物，所用的水都为去离子水，所有数据都是三次测定的平均值。百分比是以质量计的。最终HA产品的IR谱图与相同来源的生化试剂HA的IR谱图在波形及吸收峰上是一致的；浓度1-3g/L的HA水溶液的核酸测定的吸收值均为零，紫外区扫描均无核酸吸收峰。

通过下面的从HA提取物中分离纯化HA的过程概要及详细实施例中，能更好地理解本发明，它们叙述了从发酵液、牛眼玻璃体、人脐带及公鸡冠HA提取物中分离纯化HA的具体过程。但本发明并不仅适用于从上述四种原料中分离纯化HA。

从HA提取物中分离纯化HA过程概要：

具体步骤(1)中，在不同的碱性缓冲溶液中酶解蛋白质，其它条件相同而结果是不同的。例如，使用0.01～0.1mol/L的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的缓冲溶液酶解牛盐源HA提取物中蛋白质，结果步骤(4)HA的纯度仅19～25％；步骤(5)HA纯度仅35～40％，蛋白质的去除率60～65％，HA的损失率20～33％。使用碳酸氢钠与碳酸钠，或碳酸氢钠和氢氧化钠，或单一碳酸氢钠，或碳酸氢钠和乙酸(调pH)组成的缓冲溶液，结果步骤(4)HA的纯度为40～68％之间，步骤(5)HA的纯度为60～98％之间。其中效果最好的是碳酸氢钠与碳酸钠组成的碱性缓冲溶液。例如，在碳酸氢钠浓度为0.3g/L，碳酸钠浓度为0.7g/L时，步骤(4)HA的纯度为45％，HA的损失率12％；步骤(5)HA的纯度为76％，HA的损失率6％。又例如，碳酸氢钠浓度为30g/L，碳酸钠浓度为70g/L时，步骤(4)HA的纯度为50％，HA的损失率12％；步骤(5)HA的纯度为66％，HA的损失率4％。效果较好的浓度是1～10g/L的碳酸氢钠及碳酸钠浓度，实例见后面实施例。

具体步骤(1)中，酶的加量、酶水解的温度及水解的时间是分离纯化HA要选取的条件之一，选取这些条件不同结果不同。例如，对牛眼源HA的分离纯化，酶的加量选每毫克蛋白质加2个活力单位的酶量，酶的水解温度选37℃，水解时间选60h，步骤(4)HA的纯度为48％，HA的损失率13％；步骤(5)HA的纯度为78％，HA的损失率5％。酶的加量选每毫克蛋白质加60个活力单位的酶量，酶的水解温度选30℃，水解时间选10h，步骤(4)HA的纯度为58％，HA的损失率10％；步骤(5)HA的纯度为94％，HA的损失率4％。三者协调较好的是：酶的加量选用HA提取物中每毫克蛋白质，加12个活力单位的酶量，酶的水解温度选33℃，水解时间选20h，结果见后面详细实例。

具体步骤(2)中，使用氯苯或溴苯，用量可以在0.2-0.3倍体积的水解液量范围。对发酵源HA提取物的纯化，步骤(5)纯度要求≤99.3％及纯化产物III纯度要求≤99.65％的，具体步骤(2)可以跳过。

具体步骤(4)中，离子溶液中各种离子的浓度不同时纯化的结果不同。例如，氯化钠的浓度为5.8g/L，磷酸氢二钠的浓度为0.15g/L，磷酸氢二钠的浓度为0.02g/L时，源自牛眼玻璃体HA提取物的纯化结果是：纯化I的纯度为58％及回收率为86％，纯化II的纯度为91％及回收率为90％。又例如，氯化钠的浓度为17.4g/L，磷酸氢二钠的浓度为1.5g/L，磷酸氢二钠的浓度为0.4g/L时，源自牛眼玻璃体HA提取物的纯化结果是：步骤(4)的纯度为63％及回收率为87％，步骤(5)的纯度为93％及回收率为95％。最佳的离子溶液浓度为氯化钠的浓度为12.4g/L，磷酸氢二钠的浓度为0.5g/L，磷酸氢二钠的浓度为0.1g/L，结果见后面详细实例。

具体步骤5中，活性炭起吸附核酸及残余蛋白质作用，高岭土其辅助作用，这一步采用离心过滤，高岭土可不加。若前述的具体步骤(1)中酶水解不好时，这一步的HA回收率低，这是由于仍有较多的HA与蛋白质共价相连。这一步中，活性炭的加量根据步骤(5)中蛋白质的含量及HA的浓度变化，0.1％～0.3％的动物源HA加8～12％的活性炭，发酵源HA加3～5％的活性炭，活性炭超过15％不利于这一步的HA回收率。较好加量见详细实施例。

具体步骤(6)中，透析时间发酵源HA采用3h，动物源HA采用4h，透析时间长HA纯度不增加，HA回收率有所降低。例如透析6h，发酵源HA的回收率为93％，动物源HA的回收率为90％。羧甲基纤维素对HA纯度的提高有一定作用，尤其对动物源HA。对于要求纯度99.95％的发酵源HA还可以不加羧甲基纤维素，这一步羧甲基纤维素的加量为1～2g/L，HA的纯度可以提高0.02％以上。动物源HA，这一步加量为1～2g/L的羧甲基纤维素，HA的纯度提高0.02％以上。动物源HA，这一步加量为3～4g/L的羧甲基纤维素，HA的纯度提高0.18％。较好的加量和结果见下面详细实施例。

实施例：

实施例1：从牛眼玻璃体HA提取物中分离纯化操作条件较好时的一例

步骤1、取10g(未干燥样)牛眼源HA提取物，加浓度为8g/L的碳酸氢钠(NaHCO₃)水溶液450ml和浓度为2.6g/L的碳酸钠(Na₂CO₃)水溶液50ml，再加入0.25g的胰蛋白酶，在33℃、120r/min下搅拌20h。

步骤2、向上述溶液中加入150ml氯苯于1000r/min搅拌30min，然后与2500r/min离心20min，抽取上清液。

步骤3、然后加入5g氯化钠，搅拌溶解，再加入1500ml的无水乙醇或95％的乙醇，搅动混合，静置1h，后于2000rin/min离心10min，得到粗品HA。

步骤4、粗品HA加入到氯化钠浓度为10.6g/L、磷酸氢二钠浓度为0.2g/L、磷酸二氢钠的浓度为0.06g/L的500ml水溶液中，搅拌溶解，再向其中加入1500ml无水乙醇，搅动混合，静置1h，后于2000rin/min离心10min，并用75％的乙醇50ml洗涤沉淀HA(即纯化产物I)。

步骤5、将上述沉淀HA溶于100ml的氯化钠磷酸盐溶液(浓度同步骤4)中，搅拌溶解，再向溶液中加入4g活性炭和8g高岭土，搅拌1h，然后经0.22μm的滤膜抽滤，收集滤液。

步骤6、将上述滤液于35000Da的透析袋中于500ml去离子水中透析4h，然后保留中加入0.3g羧甲基纤维素，搅拌混合30min，经0.22μm的滤膜抽滤，收集滤液。

步骤7、向滤液中加入1g氯化钠，搅拌溶解，然后再加入3倍体积的95％的乙醇，搅动混合，静置1h，抽滤，并用20ml丙酮洗涤固体HA。将固体HA经冷冻，真空干燥，得到白色粉末状HA产物。这一实施例的纯化效果见表1。最终结果如下(本发明所提纯度指透明质酸与蛋白质相加透明质酸之后比值的百分数)：

HA纯度99.63％

收得率83.81％

分子量6.1×10⁵

实施例2：从发酵HA提取物中分离纯化操作条件较好时的一例

改变实施例1中：步骤(1)的酶加量为0.15g及水解时间12h；步骤(5)的氯化钠磷酸盐溶液的量为500ml，活性炭的量为25g和高岭土的量为40g；步骤(6)的透析用离子水为1500ml，透析时间为3h；步骤(7)的氯化钠为4g。这一实施例的纯化效果见表2。最终结果如下：

HA纯度99.96％

收得率90.6％

分子量5.8×10⁵

实施例3：从人脐带HA提取物中分离纯化HA

步骤及操作同实施例1，结果如下：

HA纯度99.51％

收得率97.17％

分子量4.5×10⁵

实施例4从公鸡HA提取物中分离纯化操作条件较好时的一例

改变实施例1中：步骤(1)碳酸氢钠的浓度为10g/L，碳酸钠的浓度为1.6g/L；步骤(4)的氯化钠浓度为11.6g/L、磷酸氢二钠浓度为0.15g/L、磷酸二氢钠的浓度为0.10g/L；步骤(5)的活性炭的量为10g和高岭土的量为20g；步骤(6)的羧甲基纤维素的量为0.5g。结果如下：

HA纯度99.52％

收得率83.6％

分子量4.8×10⁵

本发明碱性缓冲水溶液中盐可以为相应的钾盐，碱性缓冲水溶液还可以是乙酸钠与碳酸氢钠组成的溶液。

Claims

1、一种透明质酸分离纯化的方法，其特征是：它包括以下步骤：

(2)向上述混合液中加入卤苯，搅拌，然后离心抽取上清液；

(3)向上述清液中加入0.15mol/L～0.25mol/L的氯化钠，并搅拌溶解，然后加至少2.5倍体积的95％以上的乙醇并搅动，静置至沉淀发生后离心，沉淀物既为分解蛋白质的透明质酸；

(5)将步骤(4)的沉淀物加入离子溶液后搅拌溶解，然后加入活性炭，或活性炭和高岭土，搅拌、离心，上清液经滤膜抽滤，滤液既为透明质酸溶液，然后加至少2.5倍体积的95％以上的乙醇并搅动，静置至沉淀发生后离心，沉淀物中透明质酸含量至少60％。

2、根据权利要求1所述的透明质酸分离纯化的方法，其特征是：它还包以下步骤：

(6)将所述步骤(5)的经滤膜抽滤后所得的透明质酸溶液用35000Da透析袋在去离子水中透析3～4h，然后，向透析后的透明质酸溶液中加羧甲基纤维素并搅拌，最后离心或抽滤；羧甲基纤维素的使用量为10～30g/l；

3、根据权利要求1所述的透明质酸分离纯化的方法，其特征是：所述步骤(1)的碱性缓冲水溶液化学药品是由NaHCO₃和Na₂CO₃或NaHCO₃和NaOH组成，NaHCO₃的使用量为0.01～120g/L，碳酸钠Na₂CO₃的用量为0～100g/L，或NaOH为0～1g/L。

4、根据权利要求3所述的透明质酸分离纯化的方法，其特征是：所述碳酸氢钠及碳酸钠的最佳浓度是1～10g/L。

5、根据权利要求1所述的透明质酸分离纯化的方法，其特征是：所述步骤(1)所用的胰蛋白酶为粗制胰蛋白酶或精制胰蛋白酶，用量范围为透明质酸提取物中每毫克蛋白质用2～100个活力单位的酶量，酶的分解温度为20～42℃，分解时间为0.5～90h。

6、根据权利要求5所述的透明质酸分离纯化的方法，其特征是：酶的分解温度范围是30～33℃，酶加量是按透明质酸提取物中每毫克蛋白质用8～25个活力单位的酶量计，时间是24h以内。

7、根据权利要求1所述的透明质酸分离纯化的方法，其特征是：所述步骤(2)加入卤苯是氯苯、溴苯、氟苯或碘苯，最好是氯苯、溴苯；加入的体积比为：5～25％。

8、根据权利要求1所述的透明质酸分离纯化的方法，其特征是：所述步骤(4)的离子溶液为含盐的磷酸盐缓冲液，盐为NaCl，其浓度为5.8～18g/l，磷酸盐为NaH₂PO₄和Na₂HPO₄，NaH₂PO₄的浓度为0.01～10g/l，Na₂HPO₄的浓度为0.01g/l。

9、根据权利要求1所述的透明质酸分离纯化的方法，其特征是：所述步骤(5)中活性炭用量范围为10～120g/l，最佳为30～60g/l；高岭土的使用量为1～100g/l，最佳为10～30g/l；活性炭与高岭土的比为1∶0～2。

10、根据权利要求1所述的透明质酸分离纯化的方法，其特征是：所述步骤(5)的滤膜的孔径为不小于0.45μm，最好是0.22μm及以下孔径的滤膜。