CN1847268A

CN1847268A - 低分子肝素或者其盐、含有其的医药组合物及其制造方法

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Publication number: CN1847268A
Application number: CN 200610072424
Authority: CN
Inventors: 坂本和加子; 小田中亘
Original assignee: QP Corp
Current assignee: Kewpie Corp
Priority date: 2005-04-11
Filing date: 2006-04-11
Publication date: 2006-10-18
Also published as: JP2006291028A

Abstract

提供不需要大规模的设备用简便的方法就可以高效率地得到的、而且杂质含量被极度降低的低分子肝素或者其盐，含有其的医药品组合物，以及低分子肝素或者其盐的制造方法。本发明的低分子肝素或者其盐，可以通过将肝素和/或其盐低分子化后，用还原剂进行处理，将前述还原剂除去和/或分解后，将所述溶液的pH调整到4或者更小而得到。

Description

低分子肝素或者其盐、含有其的医药组合物及其制造方法

技术领域

本发明涉及低分子肝素或者其盐，含有其的医药组合物以及其制造方法。

背景技术

肝素是具有广泛的分子量分布且平均相对分子量为10000～30000的粘多糖类的一种，其在动物的活体组织(例如肠粘膜、肺、脾脏、肝脏、肌肉、腱)及细胞(例如肥大细胞)中广泛存在。肝素因为具有强抗血液凝固作用，所以除了在治疗和预防心肌梗塞、脑栓塞等各种血栓栓塞症以外，还在血液透析、输血、血液检查等时的血管导管或者注射针插入时，被用于防止血液凝固。

特别是在使用血液透析装置或人工心肺装置等体外循环装置时，由于在透析膜及过滤膜上灌流血液凝固，有时前述膜会发生孔堵塞。为了防止这种现象，有必要控制血液的凝固能力。

另一方面，将分子量调整到一定范围内的低分子肝素，具有持续保持抗血液凝固活性以及抗血栓作用、减少促进出血作用的特征。因此，低分子肝素除了适合用于治疗和预防心肌梗塞、脑栓塞等各种血栓栓塞症以外，也适合在使用血液透析装置及人工心肺装置等的体外循环装置时使用。

作为高效率地制造高纯度的低分子肝素方法，例如，可以举出用透析膜的精制方法(参照专利文献1)。但是，根据该方法，为了在工业上制造低分子肝素或者其盐，需要大规模的工业设备，所以在成本及设备方面不容易实施。

[专利文献1]特许2628507号公报

发明内容

本发明的目的在于提供不需要大规模的工业设备用简便的方法就可以高效率地得到、而且杂质含量被极度降低的低分子肝素或者其盐，含有其的医药品组合物，以及低分子肝素或者其盐的制造方法。

为了完成上述目的，本发明人等对将肝素或者其盐低分子化的方法反复进行了精心研究，结果发现：通过将肝素和/或其盐低分子化后，用还原剂进行处理，将前述还原剂除去和/或分解后，将溶液的pH调整到4或者更小，可以使收率不降低、且有效地降低杂质的含量，从而完成了本发明。

本发明的低分子肝素或者其盐，可以通过如下方式得到：将肝素和/或其盐低分子化后，用还原剂进行处理，将前述还原剂除去和/或分解后，将溶液的pH调整到4或者更小。

在此，对于上述本发明的低分子肝素或者其盐而言，前述低分子化可以通过将前述肝素和/或其盐与亚硝酸盐反应而得到。

在此，对于上述本发明的低分子肝素或者其盐而言，前述亚硝酸盐的含量可以是5ppm或更少。

在此，对于上述本发明的低分子肝素或者其盐而言，可以通过先将前述溶液的pH调整到4或者更小，然后将前述溶液的pH调整到5.5～8后添加溶剂使其产生沉淀物，回收该沉淀物而得到。在这种情况下，前述溶剂可以是选自乙醇、甲醇及丙酮中的至少1种。

在此，对于上述本发明的低分子肝素或者其盐而言，在将前述溶液的pH调整到4或者更小时，可以将pH调整到2.5或者更小而得到。

在此，对于上述本发明的低分子肝素或者其盐而言，在¹H-NMR谱中，在3.65～3.75ppm范围单峰基本没有被检测出，而且，在¹³C-NMR谱中，在61.5～62.5ppm范围峰也基本不能被检测出。

本发明的医药组合物含有上述本发明的低分子肝素或者其盐作为有效成分。

本发明的低分子肝素或者其盐的制造方法，包括

(1)将肝素和/或其盐低分子化后，使其与还原剂反应的工序，以及

(2)除去和/或分解前述还原剂后，将前述溶液的pH调整到4或者更小的工序。

在此，对于上述本发明的低分子肝素或者其盐的制造方法而言，在前述工序(2)之后，可以进一步含有工序(3)：将前述溶液的pH调整到5.5～8后，添加溶剂使其产生沉淀物，回收该沉淀物的工序。

在此，对于上述本发明的低分子肝素或者其盐的制造方法而言，可以把在前述工序(2)中将前述溶液的pH调整到4或者更小的工序和前述工序(3)作为一个组合，将前述组合多次反复进行。

在此，对于上述本发明的低分子肝素或者其盐的制造方法而言，前述低分子化可以通过使前述肝素和/或其盐与亚硝酸盐反应而进行。

在该种情况下，前述亚硝酸盐的含量可以是5ppm或更少。

在此，对于上述本发明的低分子肝素或者其盐的制造方法而言，在前述工序(2)中将前述溶液的pH调整到4或者更小时，可以将pH调整到2.5或更小。

对本发明的低分子肝素或者其盐而言，可以不需要大规模的设备、用简便的方法就可以高效率地得到，而且杂质含量被极度降低。

通过本发明的低分子肝素或者其盐的制造方法，由于可以简便高效地精制，所以不需要大规模的设备、不经过长时间的精制工序、而且不使收率下降，就能经济地得到低分子肝素或者其盐。

对于本发明的医药组合物而言，可以通过含有上述本发明的低分子肝素或者其盐作为有效成分，发挥抗凝作用，而且，预示着与出血有相关性的活化部分凝血激酶时间(APTT)延长作用减弱。即，通过本发明的医药组合物，不促进出血，可以起到抗血液凝固作用以及抗血栓作用。更具体地说，本发明的医药组合物可以用于防止血液体外循环时的灌流血液的凝固以及泛发性血管内血液凝固症。

附图说明

[图1]是在实施例1中得到的低分子肝素Na的¹H-NMR谱(在3.65～3.75ppm范围没有观察到单峰)。

[图2]是在实施例1中得到的低分子肝素Na的¹³C-NMR谱(在61.5～62.5ppm范围没有观察到峰)。

[图3]是在比较例1中得到的低分子肝素Na的¹H-NMR谱(在3.65～3.75ppm范围观察到单峰(以“A”表示))。

[图4]是在比较例1中得到的低分子肝素Na的¹³C-NMR谱(在61.5～62.5ppm范围观察到峰(以“A”表示))。

具体实施方式

下面对本发明进行说明。在本发明中“％”指“质量％”，“份”指“质量份”。

1.低分子肝素及其盐

本发明的低分子肝素或者其盐(以下也称“低分子肝素等”)可以通过将肝素和/或其盐低分子化后，用还原剂进行处理，将前述还原剂除去和/或分解之后，将溶液的pH调整到4或者更小而得到。

在本发明中，“肝素”是指含有葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺以α1→4糖苷键结合的二糖结构单元、艾杜糖醛酸和N-乙酰葡糖胺以α1→4糖苷键结合的二糖结构单元的多糖类。另外，在肝素中，N-乙酰葡糖胺的C6位上的羟基以及C2位上的氨基的至少一方可以被硫酸酯化，而且，葡糖醛酸或者艾杜糖醛酸的C2位上的羟基也可以被硫酸酯化。

另外，作为本发明中的“肝素盐”，没有特别的限定，优选药学上可以允许的盐，例如，可以举出钠盐，钾盐，锂盐，钙盐，钡盐，锌盐，镁盐，铵盐等。

1.1.原料

可以作为本发明的低分子肝素等原料使用的肝素及其盐(以下也称之为“原料肝素及其盐”或者“原料肝素等”)，其平均相对分子量为10000～30000，优选使用平均相对分子量为10000～20000。

作为本发明所使用的原料肝素及其盐，可以使用该粗提取物以及精制物中的任何一种。肝素在动物的器官内广泛地分布。例如，作为本发明中使用的原料肝素及其盐，可以使用源自猪肠粘膜的物质。

1.2.低分子肝素或者其盐

在本发明中，“低分子肝素或者其盐”是指比原料肝素及其盐分子量低的物质。

本发明的低分子肝素或者其盐，其平均相对分子量通常为2000～10000，优选为3000～8000，更优选为4000～6000。

另外，本发明的低分子肝素或者其盐是具有不同分子量物质的混合物，优选其90％的分子量在2000～9000之间分布。

另外，作为本发明的低分子肝素盐，没有特别的限定，优选为本发明的低分子肝素的药学上可以允许的盐。作为药学上可以允许的盐，只要是被允许作为医药品使用的盐就没有特别的限定，例如像达肝素钠(ダルテパリンナトリウム)所代表的那样，作为肝素制剂一般是钠盐，钙盐。

对于本发明的低分子肝素或者其盐而言，有没有杂质可以用公知的分析方法(例如¹H-NMR、¹³C-NMR)来确认。

本发明的低分子肝素或者其盐，在¹H-NMR波谱中，在3.65～3.75ppm范围单峰基本没有被检测出来，而且，在¹³C-NMR波谱中，在61.5～62.5ppm范围峰也基本不能被检测出来。由此，本发明的低分子肝素或者其盐的杂质含量被极度降低。另外，上述¹H-NMR以及¹³C-NMR的测定是在重水中、30℃下进行的。

本发明的低分子肝素或者其盐，优选亚硝酸盐的含量为5ppm或更少。亚硝酸盐的含量可以通过测定添加了格里斯-罗米季恩亚硝酸试剂后的吸光度来测定，例如，可以用后述实施例中记载的方法来测定。

如果吸收或者经口摄取例如亚硝酸钠或者亚硝酸钾等亚硝酸盐，则会表现出青紫(唇，指甲，皮肤等)、错乱、痉挛、眼花、头疼、呕吐、晕厥等症状。因此，在本发明的低分子肝素或者其盐的制造工序中，在使用亚硝酸盐的情况下，必需从本发明的低分子肝素或者其盐中充分地除去亚硝酸盐。通过本发明的低分子肝素或者其盐，因可以由后述的制造方法得到，所以亚硝酸盐等杂质被极度降低。因此，不会因残留的亚硝酸盐而引起上述症状。

2.低分子肝素或者其盐的制造方法

2.1.工序(1)

本发明的低分子肝素等的制造方法，包括工序(1)：将原料肝素等低分子化后，使其与还原剂反应。

在本发明中，原料肝素等的低分子化可以通过将原料肝素等与亚硝酸盐反应而进行。更具体地说，可以举出例如将原料肝素等以及亚硝酸盐(亚硝酸钠，亚硝酸钾等)加入到溶剂后，将得到的反应液搅拌规定时间的方法。在该种情况下，作为能使用的溶剂，只要能使原料肝素等以及亚硝酸盐溶解的溶剂，就没有特别的限定，可以举出水、醇(例如甲醇，乙醇，正丙醇，2-丙醇，正丁醇，仲丁醇)、或者水和醇的混合溶剂等水系溶剂。

在与亚硝酸盐的反应中，通过氨基己糖苷(ヘキソサミニド)键的断裂，进行低分子化(解聚反应)。由此，得到原料肝素等低分子化合物。

原料肝素等低分子化的程度，可以通过适当调整反应时间、反应温度、使用溶剂的种类、以及在反应液中原料肝素等的浓度等来控制。

在本发明中，用还原剂处理原料肝素等低分子化物。经过该处理，可以将前述低分子化物的末端基还原。由此，可以得到本发明的低分子化肝素。

在此，作为还原剂，没有特别的限定，但例如从可以在水系溶剂中反应、而且能保持前述低分子化物中的羧基及乙酰基不被还原的角度讲，优选硼氢化钠(NaBH₄)或者氰基硼氢化钠(NaBH₃CN)。

例如，在用亚硝酸盐将原料肝素等低分子化时，推测所得到的低分子化物末端基的至少一部分是-ONO基。通过用还原剂处理前述低分子化物，可以将该-ONO基变换成-OH基。

2.2.工序(2)

本发明的低分子肝素等的制造方法，在工序(1)之后，包括工序(2)：将还原剂除去和/或分解后，将溶液的pH调到4或者更小的工序。

将还原剂除去和/或分解，优选用适合于所使用的还原剂的方法来进行。即，可以将还原剂从反应液中除去，或者也可以将还原剂在反应液中分解，或者也可以将还原剂的分解以及除去两方面进行。另外，也可以通过将对原料肝素等低分子化物难溶的溶剂添加到反应液中，使前述低分子化物沉淀，回收该沉淀物，从而除去还原剂。在此，作为前述的难溶性溶剂，可以使用后述的溶剂。

例如，在使用硼氢化钠作为还原剂时，还原剂和原料肝素等低分子化物进行反应后，例如将盐酸加入到反应液中，分解过剩的硼氢化钠。进而，例如可以将氢氧化钠水溶液加入到反应液中进行中和后，添加溶剂使沉淀物(本发明的低分子化肝素)析出，回收该沉淀物。通过该方法，可以将本发明的低分子化肝素和还原剂高效率地分离。在此，用于产生沉淀物而使用的溶剂，只要是能使沉淀物产生的溶剂，就没有特别的限定，优选对本发明的低分子化肝素溶解性低的物质，例如，可以是乙醇、甲醇、异丙醇、二乙醚、丙酮、乙酸乙酯等或者这些物质的2种或更多种的混合液，可以适当地含有水。作为前述溶剂，优选选自乙醇、甲醇以及丙酮中的至少1种，进一步优选含水乙醇(90～98(V/V)％乙醇水溶液)。

接着，使得到的前述沉淀物溶解于溶剂中，调制溶液。在此，用于调制前述溶液而使用的溶剂没有特别的限定，只要能使前述沉淀物溶解就可以。例如，可以例示出将上述原料肝素等低分子化时使用的溶剂(例如水)及氯化钠水溶液等。

接着，除去和/或分解还原剂后，将溶液的pH调整到4或者更小。在此，作为用于将前述溶液的pH调到4或者更小而使用的物质，例如可以举出酸或酸性阳离子交换树脂。

作为酸，没有特别的限定，优选在医药品的制造中能使用的物质。作为酸，例如可以举出盐酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，以及醋酸、冰醋酸、富马酸、苹果酸等有机酸。

作为酸性阳离子交换树脂，没有特别的限定，例如，可以举出强酸性阳离子交换树脂(DIAION SK1B、DOWEX 50W)、弱酸性阳离子交换树脂(Duolite C-464)等，优选强酸性阳离子交换树脂。

在前述工序(2)中，将溶液的pH调整到pH为4或者更小时，前述溶液的pH为4或者更小，优选将其调整到2.5或者更小。在此，如果将前述溶液的pH调整到比4高，则得到的低分子肝素和杂质不能进行充分解离，此后即使用色谱柱等进行精制，杂质的除去率也低。

在前述工序(2)中，在将溶液的pH调整到4或者更小时，pH的下限值没有特别的限定，特别是可以通过将pH调整到2.5或者更小，得到作为医药品使用的足够纯度的低分子肝素。另外，即使将pH调整到2.5或者更小时，也与将pH调整到2.5的效果大致相同。

2.3.工序(3)

对于本发明低分子肝素等的制造方法而言，在前述工序(2)之后，可以进一步包括工序(3)：将溶液的pH调整到5.5～8后，加入溶剂使其产生沉淀物，回收该沉淀物。在此，回收的沉淀物是低分子肝素盐。

在前述工序(3)中，更优选将溶液的pH调整到6.5±0.8，进一步优选调整到6.5±0.5。

在前述工序(3)中，在调整前述溶液的pH时，可以使用碱。作为碱，只要是在医药品的制造中允许使用的碱即可，例如，可以举出氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠等。

在本发明中，通过进行如下简便工序就可以高效率地除去杂质：在前述工序(2)中，将溶液的pH调整到4或者更小，然后，在前述工序(3)中，将溶液的pH调整到5.5～8。此时的作用机理推测如下。

认为在前述工序(2)中，通过如下方式可以分离杂质和低分子肝素盐：将溶液的pH调整到4或者更小，将原料肝素等低分子化时使用的试剂(例如，亚硝酸盐及其他杂质(例如乙二醇、EDTA、醋酸、甲基硫酸铵、甲基硫酸钠等))从低分子肝素中解离，在前述工序(3)中，将前述溶液的pH调整到5.5～8后，用肝素难溶性溶剂(乙醇等)使低分子肝素盐沉淀。由此，可以得到纯度高的低分子肝素或者其盐。

另外，更优选把在前述工序(2)中将溶液的pH调整到4或者更小的工序和前述工序(3)作为一个组合，将前述组合多次重复进行。通过该方法，可以将杂质含量进一步降低。另外，在该方法中，将由前述工序(3)回收的沉淀物溶解于溶剂中，将得到的溶液的pH调整到4或者更小。此时使用的溶剂只要是能溶解低分子肝素的物质就可以，例如，可以使用在前述工序(2)中使沉淀物溶解时使用的溶剂。

本发明的低分子肝素盐，可以通过在进行了上述工序后，根据需要进行其他精制(例如色谱柱精制)后，实施真空干燥或者冷冻干燥等干燥处理而得到。

2.4.本发明的制造方法的一个例子

下面显示了本发明的制造方法的一个例子，但本发明的制造方法不限于此。

(a)用盐酸将日本药典规定的的肝素钠水溶液调整到酸性后，加入亚硝酸钠水溶液，进行低分子化反应(解聚反应)。反应中用盐酸将反应液维持在酸性。

(b)接着，向反应液中加入氢氧化钠水溶液进行中和，使反应停止。

(c)接着，将反应液加热，加入还原剂(硼氢化钠)，进行还原反应(以上相当于前述工序(1))。

(d)接着，向反应液中加入盐酸，分解过剩的硼氢化钠后，用氢氧化钠水溶液中和。

(e)接着，向反应液中加入溶剂(乙醇)直到沉淀物析出为止，静置后用离心分离回收沉淀物。

(f)接着，使该沉淀物在氯化钠水溶液中溶解，制成溶液。

(g)接着，用盐酸将该溶液的pH调整到4或者更小(2.2±0.3)(以上相当于前述工序(2))

(h)接着，用氢氧化钠将该溶液pH调整到5.5～8。

(i)接着，向该溶液中加入溶剂(乙醇)直到沉淀物析出为止，静置后用离心分离回收沉淀物(以上相当于前述工序(3))。

(k)接着，将沉淀物溶解于蒸馏水中，进行色谱柱精制。

(l)接着，进行膜过滤，在得到的溶出液中加入乙醇直到沉淀析出为止，静置后，用离心分离回收沉淀物。

(m)对所回收的沉淀物进行真空干燥，得到低分子肝素钠。

3.医药组合物

本发明的医药组合物是将本发明的低分子肝素或者其盐作为有效成分的医药用制剂。作为本发明的医药品组合物的一个方式，例如，可以举出达肝素钠注射液。该达肝素钠注射液是把用亚硝酸钠进行了低分子化的肝素钠作为主剂而被作成制剂的静脉注射用医药品。达肝素钠注射液可以用于在血液透析时防止血液体外循环时的灌流血液的凝固，以及治疗泛发性血管内血液凝固。

4.实施例

接着，基于实施例、比较例、试验例以及应用例对本发明进一步详细说明。本发明并不限于这些例子。

4.1.测定方法

对在本实施例中得到的低分子肝素进行¹H-NMR以及¹³C-NMR测定。在本实施例中¹H-NMR以及¹³C-NMR的测定条件表示在下面。另外，对于在本实施例以及比较例中得到的低分子肝素是否残留有亚硝酸盐进行了测定。

4.1.1.调制试样溶液

称取各试样(低分子肝素或者其盐)约50mg，使其溶解于0.75mL重水(D₂O)中，添加约3mg三甲基硅丙烷磺酸钠(DSS)作为内标试剂。

4.1.2. ¹H-NMR的测定条件

装置： VXR-400S(VARIAN公司制)

观测频率：399.9MHz

温度： 30℃

基准： DSS(0ppm)

用以上条件求出各试样的¹H-NMR谱。在¹H-NMR谱中特别是在3.65～3.75ppm范围下，确认是否观察到单峰(杂质的信号)。

4.1.3. ¹³C-NMR的测定条件

装置： VXR-400S(VARIAN公司制)

观测频率：100.5MHz

温度： 30℃

基准： DSS(0ppm)

用以上条件求出各试样的¹³C-NMR谱。在¹³C-NMR波谱中特别是在61.5～62.5ppm范围下，确认是否观察到峰(杂质的信号)。

4.1.4.亚硝酸盐含量的测定方法

在本实施例中，亚硝酸盐含量是用以下表示的方法测定的。根据该测定方法，不仅亚硝酸钠，也可以对其它亚硝酸盐(亚硝酸钾)进行含量测定。

(a)用蒸馏水将试样(低分子肝素或者其盐)稀释100倍，制成1(W/V)％的试样溶液。

(b)与试样相对，将亚硝酸盐分别调制成2、4、6、8、10ppm的亚硝酸盐水溶液，将这些溶液作为标准溶液。

(c)将试样溶液以及标准溶液分别加入格里斯-罗米季恩亚硝酸试剂，放置10分钟后，以蒸馏水作为对照，测定在525nm的吸光度。

(d)通过由测定标准溶液的吸光度结果而得到的校正曲线，测定试样中含有的亚硝酸盐的含量。

4.2.实施例1

(a)将日本药典规定的肝素钠15.0g溶解于250mL溶剂(离子蒸馏水)中，调制反应液，接着，用4mol/L盐酸水溶液将该反应液的pH调整到2.5。

(b)接着，向反应液中加入10mL的5％亚硝酸钠，在室温进行1小时低分子化反应(解聚反应)。在反应中，用4mol/L盐酸水溶液将反应液的pH维持在pH2.5。

(c)接着，用4mol/L氢氧化钠水溶液将反应液的pH调整到7.0，使反应停止。

(d)接着，将反应液加热到40℃，加入1.0g还原剂(硼氢化钠)，进行2小时还原反应。

(e)接着，用4mol/L盐酸水溶液将反应液的pH调整到4.0，分解过剩的硼氢化钠。

(f)接着，用4mol/L氢氧化钠水溶液将反应液的pH调整到7.0。

(g)接着，向反应液中加入溶剂(乙醇)直到沉淀析出为止，静置后用离心分离回收沉淀物。

(h)接着，使该沉淀物溶解于150mL5％的氯化钠水溶液中，制成溶液。

(i)接着，用4mol/L盐酸水溶液将该溶液的pH调整到4或者更小(2.2±0.3)。

(j)接着，用4mol/L氢氧化钠水溶液将该溶液的pH调整到7.0。

(k)接着，向该溶液中加入溶剂(乙醇)直到沉淀物析出为止，静置后用离心分离回收沉淀物。

(l)接着，使该沉淀物溶解于200mL的蒸馏水中，进行色谱柱精制。

(m)接着，进行膜过滤，向其溶出液中加入乙醇直到沉淀析出为止。静置后，用离心分离回收沉淀物。

(n)对所回收的沉淀物进行真空干燥，得到白色粉末状的低分子肝素钠(达肝素钠)。

4.3.实施例2

除了将在实施例1中的工序(i)的溶液的pH调整到3.8±0.3以外，用与实施例1相同的方法，得到低分子肝素钠(达肝素钠)。

4.4.实施例3

除了将在实施例1中的工序(g)、(k)以及(m)的乙醇溶剂换成甲醇-丙酮(1∶1)的混合液来使用以外，用与实施例1相同的方法，得到低分子肝素钠(达肝素钠)。

4.5.实施例4

除了在实施例1中的工序(g)之后进行工序(l)的色谱柱精制、接着进行工序(h)～(k)的处理以外，用与实施例1相同的方法，得到低分子肝素钠(达肝素钠)。

4.6.比较例1

除了将实施例1中的工序(h)～(k)删除(即，工序(g)之后进行工序(l))以外，用与实施例1相同的方法，得到低分子肝素钠(达肝素钠)。

4.7.比较例2

除了将对实施例1中的工序(i)的pH调整到5.0±0.3以外，用与实施例1相同的方法，得到低分子肝素钠(达肝素钠)。

4.8.试验例

对于在实施例1以及比较例1中分别得到的低分子肝素钠的纯度，通过亚硝酸钠的含量以及用¹H-NMR和¹³C-NMR测定的检测杂质波谱来进行评价。

对亚硝酸钠的含量用前述方法测定吸光度来进行定量。

另外，在¹H-NMR和¹³C-NMR的测定中，用前述方法获得¹H-NMR谱和¹³C-NMR谱。更具体而言，确认在¹H-NMR谱中，在3.65～3.75ppm范围是否基本检测出单峰，而且在¹³C-NMR谱中，在61.5～62.5ppm范围是否基本检测出峰。

[表1]

	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	比较例1	比较例2
	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	比较例1	比较例2	亚硝酸钠(ppm)	1.7	3.9	2.2	1.9	50或更大^**	9.6
¹H-NMR(3.65-3.75ppm^*)	没有检测出	没有检测出	没有检测出	没有检测出	检测出	检测出	亚硝酸钠(ppm)	1.7	3.9	2.2	1.9	50或更大^**	9.6
¹H-NMR(3.65-3.75ppm^*)	没有检测出	没有检测出	没有检测出	没有检测出	检测出	检测出	¹³C-NMR(61.5-62.5ppm)	没有检测出	没有检测出	没有检测出	没有检测出	检测出	检测出

^*单(singlet)峰

^**在亚硝酸钠的纯度试验中，另外调制出相当于50ppm的标准溶液，比较吸光度。

由表1可知：在实施例1～4中，亚硝酸钠的含量为5ppm或更少，根据¹H-NMR和¹³C-NMR测定的结果，在¹H-NMR谱中，在3.65～3.75ppm范围基本没有检测出单峰，而且，在¹³C-NMR谱中，在61.5～62.5ppm范围基本没有检测出峰。由以上的结果确认了：实施例1～4的低分子肝素钠(达肝素钠)，杂质的含量降低到了足够作为医药品的程度。

与此相对，在比较例1得到的低分子肝素钠，不适合作为医药品，在比较例2中得到的低分子肝素钠，预示着要作为医药品需要进一步的精制工序。由以上的结果推测：在比较例1中得到的低分子肝素钠，由于没有经过相当于实施例1的工序(i)的工序(将还原剂除去和/或分解后，将溶液的pH调整到4或者更小的工序)，杂质不能充分地除去。另外，推测在比较例2中得到的低分子肝素钠，在相当于实施例1的工序(i)的工序中，由于将溶液的pH调整到约4或者更大，杂质不能充分地除去。

4.9.应用例

配合缓冲剂使最终pH达到6～7.5后，将在实施例1～4中得到的低分子肝素钠(达肝素钠)的粉末溶解于等渗的注射用蒸馏水中，准无菌地调制成每1mL中含有1000个低分子肝素国际单位。

接着，将该溶液用直径0.1μm的膜过滤器过滤后，在无菌环境下，使用自动管瓶充填密封机(立花制作所制)，向洗净以及灭菌后、制成无热原的管瓶中填充5mL，密封(加栓)后作成制剂。

得到的制剂(抗凝血剂)，平均相对分子量约为5000，使其中90％分布于2000～9000范围的达肝素钠在每1mL中含有1000个低分子肝素国际单位。由此，在本应用例中得到的制剂，具有适合于静脉注射用制剂的品质。

Claims

1.低分子肝素或者其盐，其特征为：其是将肝素和/或其盐低分子化后，用还原剂进行处理，将所述还原剂除去和/或分解后，将溶液的pH调整到4或者更小而得到的。

2.权利要求1所述的低分子肝素或者其盐，其特征为：所述低分子化是通过将所述肝素和/或其盐与亚硝酸盐反应进行的。

3.权利要求2所述的低分子肝素或者其盐，其特征为：所述亚硝酸盐的含量为5ppm或更少。

4.权利要求1所述的低分子肝素或者其盐，其特征为：其是通过将所述溶液的pH调整到4或者更小，然后将所述溶液的pH调整到5.5～8后添加溶剂使其产生沉淀物，回收该沉淀物而得到的。

5.权利要求4所述的低分子肝素或者其盐，其特征为：所述溶剂是选自乙醇、甲醇以及丙酮中的至少1种。

6.权利要求1所述的低分子肝素或者其盐，其特征为：其是在调整所述溶液的pH到4或者更小时，将pH调整到2.5或者更小而得到的。

7.权利要求1所述的低分子肝素或者其盐，其特征为：在¹H-NMR谱中，在3.65～3.75ppm范围基本没有检测出单峰，而且，在¹³C-NMR谱中，在61.5～62.5ppm范围基本没有检测出峰。

8.医药组合物，其特征为：含有权利要求1～7中的任一项所述的低分子肝素或者其盐作为有效成分。

9.低分子肝素或者其盐的制造方法，其特征为：包括

(2)除去和/或分解所述还原剂后，将所述溶液的pH调整到4或者更小的工序。

10.权利要求9所述的低分子肝素或者其盐的制造方法，其特征为：在所述工序(2)之后，进一步包括工序(3)：将所述溶液的pH调整到5.5～8后，添加溶剂使其产生沉淀物，回收该沉淀物。

11.权利要求10所述的低分子肝素或者其盐的制造方法，其特征为：把在所述工序(2)中将所述溶液的pH调整到4或者更小的工序和所述工序(3)作为一个组合，多次反复地进行所述组合。

12.权利要求9所述的低分子肝素或者其盐的制造方法，其特征为：所述低分子化是通过将所述肝素和/或其盐与亚硝酸盐反应而进行的。

13.权利要求12所述的低分子肝素或者其盐的制造方法，其特征为：所述亚硝酸盐的含量为5ppm或更少。

14.权利要求9所述的低分子肝素或者其盐的制造方法，其特征为：在所述工序(2)中，将所述溶液的pH调整到4或者更小时，将pH调整到2.5或更小。