CN1183149C - 含有低聚糖的药物组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含有下式所示低聚糖或这些低聚糖混合物作为活性组分的药物组合物，新的式(I)所示低聚糖，它们的混合物以及它们的制备方法。

Description

含有低聚糖的药物组合物及其制备方法

本发明涉及含有下式低聚糖或这些低聚糖混合物作为活性组分的药物组合物式(I)所示新低聚糖、其混合物及其制备方法：

在式(I)中，n是0-25的整数，R₁、R₃、R₄、R₅、R₆和R₈相同或不同，它们代表氢原子或SO₃M基团，R₂和R₇相同或不同，它们代表氢原子或SO₃M基团或COCH₃基团，而M是钠、钙、镁或钾。

这些低聚糖因此含有偶数糖。

在式(I)中，R₄和R₆优选地是氢原子。

G.H.LEE及其同事在《色谱杂志》(J.Chromat.)，212，65-73(1981)中已经描述过式(I)所示低聚糖，其中n等于0，或者R₁、R₆和R₈代表氢原子，R₇代表SO₃M基团或COCH₃基团，M是钠，或者R₁和R₆代表氢原子，R₇代表COCH₃基团，R₈代表SO₃M基团，M是钠，或者R₆代表氢原子，R₁、R₇和R₈分别代表SO₃M基团，M是钠，但是他们没有说明这些产品的任何药学性能。

MW McLEAN及其同事在《Eur.J.Biochem.》1984，145，607中描述过式(I)所示低聚糖，其中n等于0，或者R₆和R₇代表氢原子，R₁和R₈代表SO₃M基团，M是钠，或者R₁、R₆和R₇代表氢原子，R₈代表SO₃M基团，M是钠，但是未说明这些产物的任何药学活性。

优选的药物组合物是含有式(I)所示低聚糖的组合物，其中：

-n是0-10的整数，特别地0-6的整数，更特别地1-6的整数，

-R₁、R₂、R₃、R₅、R₇和R₈相同或不同，它们代表氢原子或SO₃M基团，特别地R₁、R₂、R₃、R₅、R₇和R₈是SO₃M基团，

-M是钠。

特别优选的药物组合物是含有式(I)所示低聚糖的组合物，其中：

-n等于0，R₁、R₇和R₈代表SO₃M基团，R₆是氢原子，M是钠，

-n等于1，R₁、R₂、R₃、R₅、R₇和R₈代表SO₃M基团，R₄和R₆代表氢原子，M是钠，

-n等于2，R₁、R₂、R₃、R₅、R₇和R₈代表SO₃M基团，R₄和R₆代表氢原子，M是钠，

-n等于3，R₁、R₂、R₅、R₅、R₇和R₈代表SO₃M基团，R₄和R₆代表氢原子，M是钠，

-n等于4，R₁、R₂、R₃、R₅、R₇和R₈代表SO₃M基团，R₄和R₆代表氢原子，M是钠。

式(I)所示低聚糖是新的并且构成本发明的一部分，但不包括其中n等于0，或者R₁、R₆和R₈代表氢原子，R₇代表SO₃M基团或COCH₃基团，M是钠，或者R₁和R₆代表氢原子，R₇代表COCH₃基团，R₈代表SO₃M基团，M是钠，或者R₆代表氢原子，R₁、R₇和R₈代表SO₃M基团，M是钠，或者R₆和R₇代表氢原子，R₁和R₈代表SO₃M基团，M是钠，或者R₁、R₆和R₇代表氢原子，R₈代表SO₃M基团，M是钠的式(I)所示低聚糖。

通过碱金属硼氢化物或季铵硼氢化物与下式所示低聚糖作用可以制备式(I)所示低聚糖：

式中n是0-25的整数，R₁、R₃、R₄、R₅、R₆和R₈相同或不同，它们代表氢原子或SO₃M基团，R₂和R₇相同或不同，它们代表氢原子或SO₃M基团或COCH₃基团，M是钠、钙、镁或钾。

在整个反应期间，反应在含水介质中，在温度约25℃，pH7-10，优选地9-10的条件下进行。通过添加0.5摩尔/升氢氧化钠溶液保持pH不变。通过酸化反应介质，例如通过添加醋酸，直到pH4-5为止可停止该反应。

作为碱金属硼氢化物，可以列举硼氢化锂、硼氢化钠和硼氢化钾。

作为季铵硼氢化物，可以列举四丁基硼氢化铵。

式(II)低聚糖可以采用下述方法得到：通过对肝素进行酶的解聚作用，或通过对肝素苄酯或半合成肝素苄酯进行碱的解聚作用所得到的低聚糖(III)混合物，经凝胶色谱分离。

这种色谱分离使用装有聚丙烯酰胺-琼脂糖类凝胶，例如可以商标Ultrogel ACA202^R(Biosepra)从市场上购得的凝胶的柱。优选地，使用聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶柱组。柱的使用数量可根据体积、凝胶和待分离低聚糖进行调整。用含有磷酸盐缓冲液和氯化钠的溶液洗脱混合物。优选地，磷酸盐缓冲液是含有0.1摩尔/升氯化钠的0.02摩尔/升NaH₂PO₄/Na₂HPO₄(pH7)溶液。采用紫外光谱法(254nm)和离子法(IBF)检测不同的馏分。这样得到的馏分然后可以任选地，例如根据本领域技术人员已知的方法采用SAX(强阴离子交换)色谱进行纯化，特别是根据下述文献描述的方法进行纯化：K.G.Rice和R.J.Linhardt，《碳水化合物研究》(Carbohydrate Research)，190，219-233(1989)，A.Larnkjaer，S.H.Hansen和P.B.Ostergaard，《碳水化合物研究》，266，37-52(1995)和专利WO 90/01501(实施例2)。然后，将这些馏分冻干，再使用凝胶柱，例如Séphadex G 10^R凝胶柱(Pharmacia Biochemicals)进行脱盐。

采用SAX色谱进行纯化时，这些冻干物可任选地通过简单沉淀进行纯化，或根据本领域技术人员已知的方法，特别地根据专利FR 2 548672描述的方法进行分离。一般地，根据下述方案操作：

待纯化的冻干馏分在25℃溶于约10个体积蒸馏水中。通过添加甲醇或乙醇，沉淀所希望的低聚糖，同时采用HPLC色谱(高效液相色谱)控制其富集。添加甲醇或乙醇是根据所述低聚糖要达到的纯度和产率决定的。同样地，这种操作可使用原始冻干溶液分多个相继步骤进行。为此，分小份再添加不溶剂(甲醇或乙醇)，在每次添加步骤后分离所得到的沉淀。这样制备的沉淀可采用HPLC色谱分析。根据希望达到的纯度和产率，将适当的沉淀馏分合并。

根据本发明的一个实施方案，待纯化的冻干馏分可以溶于10-200体积含有0-30％醋酸钠的水中。醋酸钠的百分含量需要根据待处理低聚糖的性质(尺寸因素)预先加以调节。通过添加甲醇，沉淀所希望的低聚糖，同时采用HPLC色谱(高效液相色谱)控制其富集。甲醇的添加根据所述低聚糖要达到的纯度和产率决定。同样地，这种操作可使用原始冻干溶液分多个相继步骤进行。为此，分小份再添加不溶解剂(甲醇)，在每次添加后分离所得到的沉淀。这样制备的沉淀可采用HPLC色谱分析。根据希望达到的纯度和产率，将适当的沉淀馏分合并。

对于n＝0、1或2的式(II)所示中间产物，优选使用通过酶的解聚作用得到的混合物(III)。

可使用肝素酶I(EC 4.2.2.7)，在pH7磷酸盐缓冲液中，在氯化钠和BSA(牛血清白蛋白)存在下，在温度10-18℃，优选地15℃下进行这种解聚作用8-10天，优选地9天。例如通过将反应介质加热到100℃达2分钟停止这种解聚作用，采用冻干方法回收该混合物。优选地，每25克肝素使用7UI肝素酶。磷酸盐缓冲液一般在0.1摩尔/升氯化钠存在下含有0.05摩尔/升NaH₂PO₄/Na₂HPO₄(pH7)。BSA浓度一般是2％。

对于n＝0、1、2、3或4的式(II)所示中间体，优选使用通过肝素苄酯的解聚作用所得到的混合物(III)。

根据在专利US 5 389 618、EP 40 144、FR 2 548 672中描述的方法可以制备肝素苄酯。酯化率优选地是50-100％。更优选地，酯化率是70-90％。

这种解聚作用可在含水介质中，使用碱金属氢氧化物(例如氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铯)或季铵氢氧化物(例如四丁基氢氧化铵)，优选地以浓度为0.1-0.2摩尔/升，在温度40-80℃下进行5-120分钟。在一种优选方式中，在温度60-70℃下，使用0.15摩尔/升氢氧化钠溶液进行5-15分钟。通过加入如醋酸之类的酸进行中和可停止该解聚反应。在每体积醋酸钠加入10重量％后，通过加入甲醇，优选地每1个体积反应介质为2个体积，可沉淀低聚糖混合物，然后过滤。

根据本发明的优选特征，化学解聚后得到的低聚糖混合物呈含水溶液形式，可使用具有适当标称截止极限的膜(Millipore销售的再生纤维素的Pellicon类)通过超滤进行富集；膜的类型应按照待回收的富集低聚糖种类进行调整。对于n＝0的低聚糖(II)，使用标称截止极限1kDa的膜，对于n＝1的低聚糖(II)，使用1kDa或3kDa膜，对于n＝3或4的低聚糖(II)，使用5kDa膜。在这种操作过程中，回收渗透液，排掉剩余物。因此，富集产物的部分可以是开始低聚糖混合物的50-10％，同时保留至少80％所希望的低聚糖。

对于n＝0-25的式(II)所示中间体，优选使用用半合成的硫酸化多糖苄酯通过解聚作用所得到的混合物(III)。根据在专利WO 94/29352和WO 96/14425中描述的方法，使用由K5多糖得到的半合成硫酸化多糖制备半合成硫酸化多糖苄酯。酯化、解聚和回收的条件与前面针对肝素苄酯所描述的条件相同。

在所有上述方法中，原始肝素可以来自猪、绵羊、山羊或牛，可以来自动物的粘液、肺或皮。

优选地，使用猪、绵羊粘液的肝素或牛肺的肝素，更优选地，使用猪粘液或牛肺的肝素。

式(I)所示低聚糖具有消炎性质，于是可以用于预防或治疗与涉及产生例如一氧化氮(NO)细胞毒素物质的炎症过程相关的疾病，特别当中性白细胞或巨噬细胞迁移并在组织中被激活时，它们释放出其细胞毒素物质的诱导形式。动脉血管丰富的这种组织在愈合或痉挛后，在局部缺血的组织部位产生中性白细胞迁移、活化和粘附。这些局部缺血可以出现在脑部(脑血管意外伤害)，或者在心肌(心肌梗塞)，或者在下肢(所谓周围局部缺血)部位。于是，式(I)低聚糖可以用于预防和/或治疗其中脑的炎症起着可能导致死亡的有害作用的神经变性疾病，其中可以列举脑局部缺血、心肌局部缺血(心肌梗塞)、周围的局部缺血、中枢神经系统创伤，特别是头盖骨、脊柱和颅-脊创伤，多发性硬化、神经病疼痛和周围神经病，运动神经元疾病，其中包括肌萎缩性脊髓侧索硬化、渐进式脊柱萎缩、婴儿肌肉萎缩和主侧索硬化、神经爱滋病、Alzheimer病、帕金森病和Huntington舞蹈症和特别在关节部位的某些骨关节炎形式。

根据M.YAMASHITA及其同事，《Eur.J.Pharmacol》，338，2，151-158(1997)或J.E.SHELLITO及其同事，《Am.J.Respir.CellMol.Biol.》13，1，45-53(1995)描述的方案，在使用来自大肠杆菌的脂多聚糖(LPS)诱导产生NOx(亚硝酸盐和硝酸盐)的试验中，在活体内证明了这些产品的消炎活性。

在T₀时刻，往雄性CD1鼠(Charles河，25-35克)体内通过药团静脉内注射0.5毫克/千克低聚糖，在T+15分钟皮下注射1或2毫克/千克低聚糖。在T+30分钟给药100毫克/千克来自大肠杆菌(SigmaL3129，血清型：0127：B8)的脂多聚糖(LPS)。在T+3小时，再次皮下注射1或2毫克/千克低聚糖。在T+5小时30分钟，采用眼穿刺回收血浆试样，在按照下述方式用硝酸盐还原酶将硝酸盐还原成亚硝酸盐后，采用Griess比色法测定血清中的NOx(硝酸盐和亚硝酸盐)浓度：12毫升血浆试样与88毫升去离子水混合，在黑暗中用40毫升磷酸盐缓冲液(0.31M，pH7.5)、20毫升β-NADPH(还原性的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)(0.86mM)、20毫升FDA(黄素腺嘌呤二核苷酸)(0.11mM)和20毫升硝酸还原酶(2U/毫升)(Boehringer Mannheim)在室温下培养1小时。添加10毫升硫酸锌(1M)以便沉淀蛋白质，混合后，试样在20 000克下离心5分钟。最后，50毫升上清液与100毫升Griess试剂(1％磺胺在磷酸/萘基乙二胺混合物中，0.1％在去离子水中(V/V))在室温下培养10分钟。使用微板分光光度计在540nm处读取光密度；每个点测量两次。硝酸钾和亚硝酸钠用作该比色法的标准。

在这个试验中，本发明的低聚糖对50％以上NO_x的生成产生抑制作用。

另外，式(I)的低聚糖增加了运动神经元的存活率和促进其生长，因此在预防和/或治疗运动神经元疾病中，例如肌萎缩性脊髓侧索硬化、渐进式脊柱萎缩、婴儿肌肉萎缩和主侧索硬化是特别有效的。

人们知道，如果在没有营养的支持(例如BDNF，NT5)下进行这些培养，运动神经元的培养物会因细胞程序死亡而消失。现在发现，本发明的低聚糖能使运动神经元存活和生长。根据下述方案，使用星形细胞和无神经营养因子的运动神经元的共培养物试验这种活性：

运动神经元富集培养：

使用R.L.SCHNAAR和A.E.SCHAFFNER，《神经科学杂志》(J.Neurosci.)，1，204-217(1981)描述的离心法，和W.CAMU和C.E.HENDERSON，《神经科学与方法杂志》(J.Neurosci.Methods)，44，59-70(1992)改进的离心法，制备富集运动神经元的培养物。无菌解剖E15大鼠胚胎脊髓，取出背部脊索。然后，切断这些背部脊索，在添加有0.05％胰蛋白酶的PBS(磷酸缓冲盐水：氯化钠137mM，氯化钾2.68mM、磷酸氢二钠6.45mM、磷酸二氢钾1.47mM)中，在37℃培养15分钟。在添加0.1％胎牛血清白蛋白(BSA)和0.1毫克/毫升DNA酶的培养介质中，通过用1毫升移液管端部捣碎完成细胞分离。细胞悬浮液于6.5％(重量/体积)之碘苯甲酰氨基葡萄糖在L15介质(由GibcoBRL销售)中的带上展开，在500克下离心15分钟。收集含有运动神经元的界面带，稀释在L15介质中，然后在预先涂布了鼠的anti-IgG和MC192杂交瘤细胞(Chandler CE及其同事，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，259，6882(1984))上清液的培养箱中，于室温下培养45分钟。悬浮细胞用L15介质洗涤，在缓慢搅拌下用MC192杂交瘤细胞上清液洗脱。在L15介质中添加碳酸氢钠(22mM)、辅白蛋白(0.1毫克/毫升)、腐胺(0.1mM)、胰岛素(5微克/毫升)、亚硒酸钠(31nM)、葡萄糖(20mM)、黄体酮(21nM)、青霉素(110UI/毫升)和链霉素(100微克/毫升)，在培养箱中，在单层星细胞上展开这些运动神经元，其密度达到每24毫米为650个细胞。培养物保持在37℃与5％CO₂的潮湿气氛中。

脊髓星细胞的培养：

根据稍微改进的R.P.SANETO和J.DE VELLIS在《神经化学，实践途径》(Neurochemistry，a practical approach)(A.J.TURNER和H.S.St JOHN)，IRL出版社，牛津-华盛顿DC，第27-63页(1987)中描述的方法，使用鼠胚胎获得星细胞。无菌解剖脊髓，除去髓膜和脊神经节。五至十个脊髓转移到PBS(磷酸盐缓冲盐水：氯化钠137mM，氯化钾2.68mM、磷酸氢二钠6.45mM、磷酸二氢钾1.47mM)中，切后再在添加0.25％胰蛋白酶的PBS中于37℃培养25分钟。通过添加10毫升改进的Dubelcco-Eagle介质(DMEM)，其中添加了10％牛胎血清(FCS)，停止酶处理，离心收集细胞。使用1毫升移液管端部进行另一个机械分离步骤。在10％FCS的DMEM中，按照每25毫升培养介质为1.5×10⁶细胞的密度展开细胞。在试管中2天后，在整个研究期间每天都加培养物。当得到可见细胞单层时，这些培养物按照每分钟250转搅拌48小时，次日，用胞核嘧啶阿拉伯糖苷(10^-5摩尔)处理这些单层达48小时。从研究开始，对于25毫升培养瓶，在培养板上扩增星细胞单层，达到密度为每35毫米五个为止。

脊髓星细胞培养物由98％以上对胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)具有免疫活性的细胞组成。

星细胞单层或者只与PBS(对照)接触，或者与浓度为0.1-10纳克/毫升待试验产品的PBS溶液接触24小时。然后，用DMEM洗涤星细胞单层，与其中添加有运动神经元的培养介质一起保持2小时。加料后两小时的2-3天期间还往培养介质再添加载体和待试验产品。

运动神经元的免疫化学鉴定

这些细胞用4％多聚甲醛和0.1％戊二醛的PBS溶液固定(pH7.4，在4℃，15分钟)。然后，这些培养物进行洗涤，这些非特异性位点用2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液和0.1％Triton X100^R阻断。这些培养物相继地与p75^LNGRF抗体(前面引用的Chandler的文章)在4℃培育一夜，再与生物素化羊血清(1/125，Gibco)和抗生蛋白链菌素过氧化酶(1/200，Gibco)培育60分钟。使用DAB/过氧化氢反应，可目视观测这些抗体。

培养物计数与统计分析

低活性p75^LNGRF的神经营养素受体的免疫反应细胞，具有其长度大于4个细胞直径的神经突，这些细胞被看作是活的运动神经元。通过在放大200倍的显微镜下计数在0.825厘米²表面范围内的标记细胞数，可评估运动神经元数。这些值表示为每厘米²运动神经元数，或与对照相比，保持无营养因子时在培养物中存在的运动神经元数的百分数。这些实验进行至少三次。

采用Student检验(t-检验)，进行统计分析。

通过采用本发明的低聚糖进行预处理，在星细胞单层上生长的运动神经元数从20％增加到50％。

下述实施例说明式(I)所示低聚糖和中间产物的制备方法。

在这些实施例中，缩写的意义如下：

ΔIs：(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏-hex吡喃己糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脱氧-2-磺基氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖，四钠盐或ΔUAp2S-(1→4)-a-D-GlcNp2S6S

Is：(2-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脱氧-2-磺基氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖，四钠盐(2-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖，四钠盐或α-L-艾杜Ap2S-(1→4)-α-D-GlcNp2S6S

IIs：(α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖，三钠盐或α-L-艾杜Ap-(1→4)-α-D-GlcNp2S6S

IIIs：(2-磺基-α-L-ido吡喃糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脱氧-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖，三钠盐或α-L-idoAp2S-(1→4)-α-D-GlcNp2S

IdoAp：ido吡喃糖基糖醛酸

GlcNp：2-氨基-2-脱氧-吡喃葡糖

ΔUap：4-脱氧-α-L-苏-己-eno吡喃糖基糖醛酸

S：硫酸盐。

式(II)所示中间体混合物的制备实施例

实施例A-采用酶解聚作用和分离制备其中n＝0、1和2的式(II)所示低聚糖。

将25克肝素溶解于250毫升含有0.05摩尔/升NaH₂PO₄/Na₂HPO₄(pH7)、0.2摩尔/升氯化钠和2％BSA(牛血清白蛋白)的磷酸缓冲液。往该混合物添加7UI肝素酶I(EC 4.2.2.2.7)，得到的溶液冷却到15℃，然后在整个解聚反应期间都保持在这个温度下。抽取等份试样跟踪反应进程，采用凝胶渗透色谱进行分析。在9天后，通过将反应介质加热到100℃达两分钟，可停止该酶反应。冷却的混合物再进行冻干。这样得到低聚糖(III)混合物。

得到的低聚糖(III)混合物再根据下述方法进行色谱分离：该色谱法采用装有以其名称Ultrogel ACA 202被公知的聚丙烯酰胺-琼脂糖的柱进行，该混合物用含有磷酸缓冲液(0.02摩尔/升NaH₂PO₄/Na₂HPO₄)pH7和0.1摩尔/升氯化钠的溶液洗脱。采用紫外光谱测定法(254nm)和离子测定法(IBF)进行检测。这些产物可以任选地采用SAX(强阴离子交换)色谱法或根据专利FR 2 548 672中描述的方法，采用分步沉淀进行纯化。回收的产物部分进行冻干，再用G10^Rsephadex(Pharmacia Biochemicals)凝胶装填的柱进行脱盐。

采用这种方法，得到3克二糖ΔIs，1100毫克典型地含有55％ΔIs-Is-Is、35％ΔIs-Is-IIs和10％ΔIs-Is-IIIs的六糖混合物。这后一种混合物可采用本领域技术人员已知的方法进行纯化以便分离成各个组分，或原样使用以便将其转化成式(I)所示还原衍生物。

实施例B-通过肝素苄酯解聚作用与分离制备式(II)所示其中n＝0、1、2、3或4的低聚糖

a-制备肝素苄酯

根据US 5 389 618的实施例3制备肝素苄酯

b-解聚反应

将100克肝素苄酯溶解于1.9升软化水中。该混合物在搅拌下升温到60℃。在得到均匀溶液后，仅一次加入约35毫升23％氢氧化钠溶液。在反应10分钟后，冷却该溶液，再用80毫升约2N醋酸溶液进行中和。往这种溶液，添加10％(重量/体积)醋酸钠。通过添加约2个体积甲醇沉淀低聚糖混合物。沉淀经过滤分离后，用甲醇洗涤两次，然后在50℃减压下干燥。干燥后，得到73.8克式(II)所示低聚糖混合物。

c-其中n＝1的低聚糖的富集

将30克前面得到的低聚糖混合物溶解于约35个体积水中。这种溶液用3kDa膜(Pellicon)进行超过滤。取出600毫升渗透液，余下的用500毫升水稀释。继续这种操作直到再取出450毫升渗透液为止。这两份渗透液合并，再在减压下浓缩至干。得到6.1克微黄白色固体。采用凝胶渗透色谱法分析固体表明，它含有约30％其中n＝1的式(II)所示低聚糖。

d-超滤的低聚糖混合物的分离

该富集混合物采用装有以其名称Ultrogel ACA 202被公知的聚丙烯酰胺-琼脂糖的柱(使用四个串联柱，柱直径为10厘米，高为50厘米)分离。5克通过超滤富集的混合物溶于25毫升水中，然后用0.2摩尔/升氯化钠溶液以速度5毫升/分钟进行洗脱。在柱底回收多个馏分，每个馏分25毫升。采用紫外光谱测定法(254nm)和离子测定法(IBF)检测产物。回收其中n＝1的产物馏分，冻干，然后用G 10^Rsephadex凝胶装填的柱进行脱盐。在冻干后，得到1克四糖，它典型地含有70％式II的ΔIs-Is衍生物(R₁、R₂、R₃、R₅、R₇、R₈＝SO₃Na；R₄、R₆＝H和M＝Na)。ΔIs-Is衍生物可以任选地采用SAX(强阴离子交换)色谱法或根据专利FR 2 548 672中描述的方法与本发明中描述的实施方案，按照分步沉淀的一种优选方式进行纯化。

式(I)所示低聚糖的制备实施例

实施例1

在反应器中，加入300毫克式(II)所示低聚糖在2毫升水中的25℃溶液，式中n等于0，R₁、R₇和R₈代表SO₃M基团，R₆代表氢原子和M是钠。在搅拌下，一次添加212毫克硼氢化钠。这时，通过添加0.5摩尔/升氢氧化钠溶液将该溶液的pH调节到9-10。在12小时后，渐进地添加醋酸，直到pH达到4-5为止。该混合物搅拌1小时，然后通过添加0.5摩尔/升氢氧化钠将该溶液的pH再调节到6.7。这时，该混合物在50℃减压下浓缩至干。浓缩物在磁力搅拌下分散在10毫升甲醇中。在沉降一夜后，用WhatmanGF/B膜过滤悬浮液。过滤器上的固体用2份10毫升蒸馏水溶解。这种溶液这时在50℃减压下浓缩至干。得到580毫克白色固体。该固体再在磁力搅拌下分散在15毫升甲醇中。在搅拌30分钟后，用WhatmanGF/B膜过滤悬浮液。滤饼用2份10毫升蒸馏水溶解。得到的溶液在50℃减压下浓缩至干。这样得到250毫克式(I)所示呈非对映异构体混合物形式的低聚糖。式中n等于0，R₁、R₇和R₈代表SO₃M基团，R₆代表氢原子和M是钠。采用I和II标记二糖的结构糖，I是还原残基和II是不饱和糖醛酸残基[(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏-4-吡喃己糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-D-葡糖醇，四钠盐]；(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏-4-吡喃己糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-D-甘露醇，四钠盐)：在D₂O中质子谱，600MHz，T＝305K，δ，以ppm计：3.38(1H，m，H-2^(I))，3.70和3.75(每个1H，分别dd，J＝6和12Hz和dd，J＝5和12Hz，2H-1^(I))，3.86(1H，t，J＝5Hz，H-3^(I))，4.13(1H，dd，J＝8和11Hz，H-6^(I))，4.18(1H，m，H-4^(I))，4.25(2H，m，H-6^(I)和H-3^(II))，4.35(1H，m，H-5^(I))，4.65(1H，m，H-2^(II))，5.67(1H，s，H-1^(II))，6.00(1H，d，J＝5Hz，H-4^(II))]。

实施例2

在反应器中，加入60毫克式(II)所示低聚糖在1.2毫升水中的25℃溶液，式中n等于1，R₁、R₂、R₃、R₅、R₇和R₈代表SO₃M基团，R₄和R₆代表氢原子，M是钠。在搅拌下，一次添加18毫克硼氢化钠。这时，通过添加0.5摩尔/升氢氧化钠溶液将pH调节到9-10。在12小时后，渐进地添加醋酸，直到pH达到4-5为止。该混合物搅拌1小时，然后添加5毫升甲醇。用WhatmanGF/B膜过滤悬浮液。回收的固体用甲醇洗涤两次，每次0.5毫升。干燥后得到42毫克式(I)所示呈非对映异构体混合物形式的低聚糖，式中n等于1，R₁、R₂、R₃、R₅、R₇和R₈代表SO₃M基团，R₄和R₆代表氢原子，M是钠，采用I～IV标记四糖的结构糖，I是还原残基和IV是不饱和糖醛酸残基[(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏-4-吡喃己糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-磺基氨基-6-O-磺基-D-葡糖醇，八钠盐]；(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏-4-吡喃己糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-D-甘露醇，八钠盐)：在D₂O中质子谱，400MHz，T＝298K，δ，以ppm计：3.25(1H，dd，J＝10和3Hz，H-2^(III))，3.37(1H，m，H-2^(I))，3.59(1H，m，H-3^(III))，3.75(2H，m，2H-1^(I))，3.79(1H，t，J＝9Hz，H-4^(III))，3.86(1H，m，H-3^(I))，4.05-4.40(10H，未分辨的峰，H-4^(I)/H-5^(I)/2H-6^(I)，H-2^(II)/H-3^(II)/H-4^(II))，2H-6^(III)，H-3^(IV))，4.58(1H，m，H-2^(IV))，4.60(1H，m，H-5^(II))，5.27(1H，d，J＝4Hz，H-1^(II))，5.42(1H，d，J＝4Hz，H-1^(III))，5.47(1H，d，J＝2Hz，H-1^(IV))，5.95(1H，d，J＝5Hz，H-4^(IV))。

实施例3

在反应器中，加入100毫克式(II)所示低聚糖在2毫升水中的25℃溶液，式中n等于2，R₁、R₂、R₃、R₅、R₇和R₈代表SO₃M基团，R₄和R₆代表氢原子，M是钠。在搅拌下，一次添加20毫克硼氢化钠。这时，通过添加0.5摩尔/升氢氧化钠溶液将该溶液的pH调节到9-10。在12小时后，渐进地添加醋酸，直到pH达到4-5为止。该混合物搅拌1小时，然后通过添加0.5摩尔/升氢氧化钠将pH再调节到6.7。这时该混合物用蒸馏水稀释，其量足以达到20毫升。添加2.5克醋酸钠，倒入3个体积甲醇。然后用WhatmanGF/B膜过滤悬浮液。回收的固体用甲醇洗涤两次，每次2毫升。干燥后得到61毫克式(I)所示低聚糖，式中n等于2，R₁、R₂、R₃、R₅、R₇和R₈代表SO₃M基团，R₄和R₆代表氢原子，M是钠，呈非对映异构体混合物形式。采用I到VI标记六糖的结构糖，I是还原残基和VI是不饱和糖醛酸残基[(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏-4-吡喃己糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脱氧-2-磺基氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-ido吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-磺基氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-ido吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-磺基氨基-6-O-磺基-D-葡糖醇，十二钠盐]；(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏-4-吡喃己糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-D-甘露醇，十二钠盐)：在D₂O中质子谱，600MHz，T＝305K，δ，以ppm计：3.25(2H，m，H-2^{(III) 和(V)})，3.38(1H，m，H-2^(I))，3.61(2H，t，J＝10Hz，H-3^(III)和(V))，3.70-3.83(4H，未分辨的峰，2H-1^(I)和H-4^(III)和(V))，3.86(1H，t，J＝5Hz，H-3^(I))，4.00(2H，m，H-5^(III)和(V))，4.07(1H，m，H-4^(IV))，4.08(1H，m，H-4^(I))，4.10-4.45(13H，未分辨的峰，H-5^(I)/2H-6^(I)，H-2^(II)/H-3^(II)/H-4^(II)，2H-6^(III)，H-2^(IV)/H-3^(IV)，2H-6^(V)，H-3^(VI))，4.60(1H，s，H-2^(VI))，4.62(1H，s，H-5^(II))，4.78(1H，s，H-5^(IV))，5.17(1H，s，H-1^(IV))，5.28(1H，d，J＝4Hz，H-1^(II))，5.38(1H，d，J＝3Hz，H-1^(V))，5.44(1H，d，J＝3Hz，H-1^(III))，5.47(1H，d，J＝2Hz，H-1^(VI))，5.96(1H，d，J＝5Hz，H-4^(VI))]。

实施例4

在反应器中，加入100毫克式(II)所示低聚糖在2毫升水中的25℃溶液，式中n等于3，R₁、R₂、R₃、R₅、R₇和R₈代表SO₃M基团，R₄和R₆代表氢原子，M是钠。在搅拌下，分两次添加30毫克硼氢化钠。这时，通过添加0.5摩尔/升氢氧化钠溶液将pH调节到9-10。在12小时后，渐进地添加醋酸，直到pH达到4-5为止。该混合物搅拌1小时，然后通过添加0.5摩尔/升氢氧化钠将pH再调节到6.7。这时该混合物用蒸馏水稀释，其量足以达到20毫升。添加2克醋酸钠，倒入3个体积甲醇。然后用WhatmanGF/B膜过滤悬浮液。回收的固体用甲醇洗涤两次，每次1毫升。干燥后得到68毫克白色固体。在HPLC(高压液相色谱法)控制后，产物没有完全被还原，再完全重复前面全部操作。在干燥后得到45毫克式(I)所示低聚糖，式中n等于3，R₁、R₂、R₃、R₅、R₇和R₈代表SO₃M基团，R₄和R₆代表氢原子，M是钠，呈非对映异构体混合物形式。采用I到VIII标记八糖的结构糖，I是还原残基和VIII是不饱和糖醛酸残基[(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏-4-吡喃己糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-磺基氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-D-葡糖醇，十六钠盐]；(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏-4-吡喃己糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D--吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-D-甘露醇，十六钠盐)]：在D₂O中质子谱，600MHz，T＝305K，δ，以ppm计：3.25(3H，m，H-2^(III)，H-2^(V)，H-2^(VII))，3.38(1H，m，H-2^(I))，3.61(3H，m，H-3^(III)，H-3^(V)，H-3^(VII))，3.70-3.83(5H，未分辨的峰，2H-1^(I)和H-4^(III)，H-4^(V)，H-4^(VII))，3.86(1H，t，J＝5Hz，H-3^(I))，4.00(3H，m，H-5^(III)，H-5^(V)，H-5^(VII))，4.08(3H，m，H-4^(I)，H-4^(IV)，H-4^(VI))，4.10-4.45(17H，未分辨的峰，H-5^(I)/2H-6^(I)，H-2^(II)/H-3^(II)/H-4^(II)，2H-6^(III)，H-2^(IV)/H-3^(IV)，2H-6^(V)，H-2^(VI)/H-3^(VI)，2H-6^(VII)，H-3^(VIII))，4.59(1H，s，H-2^(VIII))，4.62(1H，s，H-5^(II))，4.78(2H，s，H-5^(IV)，H-5^(VI))，5.17(2H，s，H-1^(IV)，H-1^(VI))，5.28(1H，d，J＝4Hz，H-1^(II))，5.38(2H，m，H-1^(V)，H-1^(VII))，5.44(1H，d，J＝3Hz，H-1^(III))，5.47(1H，s，H-1^(VIII))，5.96(1H，d，J＝5Hz，H-4^(VIII)]。

实施例5

在反应器中，加入65毫克式(II)所示低聚糖在1.2毫升水中的25℃溶液，式中n等于4，R₁、R₂、R₃、R₅、R₇和R₈代表SO₃M基团，R₄和R₆代表氢原子，M是钠。在搅拌下，一次添加18毫克硼氢化钠。这时，通过添加0.5摩尔/升氢氧化钠溶液将pH调节到9-10。在12小时后，渐进地添加醋酸，直到pH达到4-5为止。该混合物搅拌1小时，然后通过添加0.5摩尔/升氢氧化钠将pH再调节到6.7。这时该混合物用3毫升10％醋酸钠水溶液稀释，倒入3个体积甲醇(12毫升)。然后过滤悬浮液。回收的固体用3毫升甲醇洗涤。干燥后得到54毫克式(I)所示低聚糖，式中n等于4，R₁、R₂、R₃、R₅、R₇和R₈代表SO₃M基团，R₄和R₆代表氢原子，M是钠，呈非对映异构体混合物形式。采用I到X标记十糖的结构糖，I是还原残基和X是不饱和糖醛酸残基[(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏-4-吡喃己糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脱氧-2-磺基氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-D-葡糖醇，二十钠盐]；(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏-4-吡喃己糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-D-甘露醇，二十钠盐)]：在D₂O中质子谱，600MHz，T＝303K，δ，以ppm计：3.23(4H，m，H-2^(III)，H-2^(V)，H-2^(VII)，H-2^(IX))，3.35(1H，m，H-2^(I))，3.59(4H，m，H-3^(III)，H-3^(V)，H-3^(VII)，H-3^(IX))，3.65-3.80(6H，m)，3.85(1H，m，H-3^(I))，3.90-4.40(29H，m)，4.57(1H，m，H-2^(X))，4.59(1H，m，H-5^(II))，4.75(3H，m，H-5^(IV)，H-5^(VI)，H-5^(VIII))，5.15(3H，m，H-1^(IV)，H-1^(VI)，H-1^(VIII))，5.25(1H，m，H-1^(II))，5.37(3H，m，H-1^(V)，H-1^(VII)，H-1^(IX))，5.42(1H，m，H-1^(III))，5.45(1H，m，H-1^(X))，5.93(1H，d，J＝5Hz，H-4^(X))。

本发明的药物含有至少一种式(I)所示低聚糖或式(I)所示低聚糖混合物作为活性组分，呈组合物形式，其中它与任何其他在药学上可接受的惰性的或生理活性的产品组合。本发明的药物可以通过静脉内、皮下、口服、直肠、局部或肺部(吸入)给药。

用于静脉或皮下给药的无菌组合物一般是水溶液。这些组合物还可以含有添加剂，特别是润湿剂、等渗剂、乳化剂、分散剂或稳定剂。可以多种方式，例如通过往该组合物加入灭菌剂、灭菌过滤、辐照进行灭菌。它们还可以制备成无菌固体组合物形式，这些组合物可以在使用时溶于无菌水中或任何其他可注射无菌介质中。

作为用于口服给药的固体组合物，可以使用片剂、丸剂、粉剂(明胶胶囊、扁囊)或颗粒剂。在这些组合物中，在氩气流下，活性组分与一种或多种惰性稀释剂，例如淀粉、纤维素、糖、乳糖或二氧化硅混合。这些组合物还可以含有除稀释剂外的其他物质，例如一种或多种润滑剂，像硬脂酸镁或滑石，促进口腔吸收的剂，着色剂、包衣(糖衣丸)或清漆。

作为用于口服给药的液体组合物，可以使用药学上可接受的溶液、悬液、乳液、糖浆和酏剂，它们含有惰性稀释剂，例如水、乙醇、甘油、植物油或石蜡油。这些组合物可以含有除稀释剂外的其他物质，例如润湿产品、甜味剂、增稠剂、芳香剂或稳定剂。

用于直肠给药的组合物是栓剂或直肠用胶囊，除活性产品外，它们含有赋形剂，例如可可油、半合成甘油酯或聚乙二醇。

用于局部给药的组合物例如可以是膏、洗剂、洗眼剂、漱口剂、滴鼻剂或气雾剂。

这些剂量取决于所要达到的效果、治疗时间和所采用的给药方式；这些剂量一般是皮下用药每天每千克0.5-10毫克，即体重60千克的成人每天3-60毫克。

一般地，医生将根据待治疗者的年龄、体重和所有其他固有因素决定适当剂量。

本发明还涉及本发明低聚糖在制备用于预防或治疗与牵涉产生亚硝酸盐氧化物(NO)的炎症过程相关疾病或用于运动神经元存活和生长的药物方面的应用。

式(I)所示低聚糖在制备用于预防和治疗脑、心肌或周围血管局部缺血、骨关节炎、中枢神经系统创伤、头盖骨、脊柱和颅-脊创伤，多发性硬化、神经病疼痛和周围神经精神病，运动神经元疾病，肌萎缩性脊髓侧索硬化、神经爱滋病、Alzheimer病、帕金森病和Huntington舞蹈症的药物时，本发明是特别有利的。

本发明还涉及预防或/或治疗与牵涉产生细胞毒性物质，例如亚硝酸盐氧化物(NO)的炎症过程相关疾病和与运动神经元存活和生长相关疾病的方法。式(I)所示低聚糖因此可以用于预防和/或治疗其中脑的炎症起着可能导致死亡的有害作用的神经变性疾病，其中可以列举脑局部缺血、心肌局部缺血(心肌梗塞)、周围局部缺血、中枢神经系统创伤，特别是头盖骨、脊柱和颅-脊创伤，多发性硬化、神经病疼痛和周围神经病，运动神经元疾病，如肌萎缩性脊髓侧索硬化、渐进式脊柱萎缩、婴儿肌肉萎缩和主侧索硬化、神经爱滋病、Alzheimer病、帕金森病和Huntington舞蹈症和特别在关节部位的某些骨关节炎形式。

本发明还涉及运动神经元疾病的预防和/或治疗方法，例如肌萎缩性脊髓侧索硬化、渐进式脊柱萎缩、婴儿肌肉萎缩和主侧索硬化。

Claims (27)

1、含有下式所示低聚糖或这些低聚糖混合物作为活性组分的药物组合物：

式中n是0-25的整数，R₁、R₃、R₄、R₅、R₆和R₈相同或不同，它们代表氢原子或SO₃M基，R₂和R₇相同或不同，它们代表氢原子或SO₃M基团或COCH₃基团，而M是钠、钙、镁或钾。

2、权利要求1的药物组合物，其中含有其中R₄和R₆代表氢原子的式(I)所示低聚糖或这些低聚糖混合物。

3、权利要求1或2的药物组合物，其中含有式中n是0-10的整数的式(I)所示低聚糖或这些低聚糖混合物。

4、权利要求1或2的药物组合物，其中含有式中n是0-6的整数的式(I)所示低聚糖或这些低聚糖混合物。

5、权利要求1或2的药物组合物，其中含有式中n是1-6的整数的式(I)所示低聚糖或这些低聚糖混合物。

6、权利要求1的药物组合物，其中含有式(I)所示低聚糖，其中n等于0，R₁、R₇和R₈代表SO₃M基团，R₆是氢原子，M是钠。

7、权利要求1的药物组合物，其中含有式(I)所示低聚糖，其中n等于1，R₁、R₂、R₃、R₅、R₇和R₈代表SO₃M基团，R₄和R₆代表氢原子，M是钠。

8、权利要求1的药物组合物，其中含有式(I)所示低聚糖，其中n等于2，R₁、R₂、R₃、R₅、R₇和R₈代表SO₃M基团，R₄和R₆代表氢原子，M是钠。

9、权利要求1的药物组合物，其中含有式(I)所示低聚糖，其中n等于3，R₁、R₂、R₃、R₅、R₇和R₈代表SO₃M基团，R₄和R₆代表氢原子，M是钠。

10、权利要求1的药物组合物，其中含有式(I)所示低聚糖，其中n等于4，R₁、R₂、R₃、R₅、R₇和R₈代表SO₃M基团，R₄和R₆代表氢原子，M是钠。

11、下式所示低聚糖：

式中n是0-25的整数，R₁、R₃、R₄、R₅、R₆和R₈相同或不同，它们代表氢原子或SO₃M基团，R₂和R₇相同或不同，它们代表氢原子或SO₃M或COCH₃基团，而M是钠、钙、镁或钾，但不包括以下式(I)低聚糖：

a)n等于0，R₁、R₆和R₈代表氢原子，R₇代表SO₃M或COCH₃基团，M是钠，

b)n等于0，R₁和R₆代表氢原子，R₇代表COCH₃基团，R₈代表SO₃M基团，M是钠，

c)n等于0，R₆代表氢原子，R₁、R₇和R₈代表SO₃M基团，M是钠，

d)n等于0，R₆和R₇代表氢原子，R₁和R₈代表SO₃M基团，M是钠，以及

e)n等于0，R₁、R₆和R₇代表氢原子，R₈代表SO₃M基团，M是钠。

12、权利要求11的式(I)所示低聚糖，其中R₄和R₆代表氢原子。

13、权利要求11或12的式(I)所示低聚糖，其中n是0-10的整数。

14、权利要求11或12的式(I)所示低聚糖，其中n是0-6的整数。

15、权利要求11或12的式(I)所示低聚糖，其中n是1-6的整数。

16、权利要求11的式(I)所示低聚糖，其中n等于0，R₁、R₇和R₈代表SO₃M基团，R₆代表氢原子，M是钠。

17、权利要求11的式(I)所示低聚糖，其中n等于1，R₁、R₂、R₃、R₅、R₇和R₈代表SO₃M基团，R₄和R₆代表氢原子，M是钠。

18、权利要求11的式(I)所示低聚糖，其中n等于2，R₁、R₂、R₃、R₅、R₇和R₈代表SO₃M基团，R₄和R₆代表氢原子，M是钠。

19、权利要求11的式(I)所示低聚糖，其中n等于3，R₁、R₂、R₃、R₅、R₇和R₈代表SO₃M基团，R₄和R₆代表氢原子，M是钠。

20、权利要求11的式(I)所示低聚糖，其中n等于4，R₁、R₂、R₃、R₅、R₇和R₈代表SO₃M基团，R₄和R₆代表氢原子，M是钠。

21、权利要求11的式(I)所示低聚糖的制备方法，其特征在于使碱金属硼氢化物或季铵硼氢化物与下式所示低聚糖进行反应并分离这些低聚糖：

式中n是0-25的整数，R₁、R₃、R₄和R₅相同或不同，它们代表氢原子或SO₃M基团，R₂和R₆相同或不同，它们代表氢原子或SO₃M或COCH₃基团，M是钠、钙、镁或钾。

22、权利要求21的方法，其特征在于在含水介质中，在温度25℃与pH7-10的条件下进行该反应。

23、权利要求21或22的方法，其特征在于反应介质的pH是9-10。

24、权利要求21或22的方法，其特征在于碱金属硼氢化物或季铵硼氢化物是硼氢化锂、硼氢化钠、硼氢化钾或四丁基硼氢化铵。

25、下式所示低聚糖或这些低聚糖混合物在制备用于预防和/或治疗与牵涉产生亚硝酸盐氧化物的炎症过程相关的疾病的药物方面的用途：

式中n是0-25的整数，R₁、R₃、R₄、R₅、R₆和R₈相同或不同，它们代表氢原子或SO₃M基团，R₂和R₇相同或不同，它们代表氢原子或SO₃M或COCH₃基团，M是钠、钙、镁或钾。

26、权利要求25的式(I)所示低聚糖在制备用于预防和治疗脑局部缺血、心肌局部缺血、周围血管局部缺血、骨关节炎、中枢神经系统创伤，头盖骨、脊柱和颅-脊创伤，多发性硬化、神经病疼痛和周围神经病，运动神经元疾病，肌萎缩性脊髓侧索硬化、神经爱滋病、阿尔茨海默氏病、帕金森病和亨廷顿氏舞蹈症的药物方面的用途。

27、式(I)所示低聚糖或这些低聚糖混合物在制备用于预防和/或治疗与运动神经元存活和生长相关的疾病的药物方面的用途：

式中n是0-25的整数，R₁、R₃、R₄、R₅、R₆和R₈相同或不同，它们代表氢原子或SO₃M基团，R₂和R₇相同或不同，它们代表氢原子或SO₃M或COCH₃基团，M是钠、钙、镁或钾。