DE60109279T2

DE60109279T2 - Pharmazeutische zusammensetzungen mit oligosacchariden und deren herstellung

Info

Publication number: DE60109279T2
Application number: DE60109279T
Authority: DE
Inventors: Pierre Mourier; Elisabeth Perrin; Christian Viskov
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 2000-03-28
Filing date: 2001-03-26
Publication date: 2006-04-13
Anticipated expiration: 2021-03-27
Also published as: AR034251A1; FR2807043B1; BR0109617A; KR20030001394A; NO20024590L; HK1056564A1; ZA200207707B; AU782713B2; PT1272499E; IL151832A0; SK286745B6; EA004768B1; ATE290543T1; NO20024590D0; SK13932002A3; FR2807043A1; DE60109279D1; MXPA02009455A; YU72802A; EA200201024A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die als Wirkstoff ein Oligosaccharid der Formel:
oder ein Gemisch dieser Oligosaccharide enthalten, die neuen Oligosaccharide der Formel (I), ihre Gemische und ihre Herstellungsverfahren.
In der Formel (I) ist n eine ganze Zahl von 0 bis 25, R₁, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₈, die gleich oder verschieden sind, stellen ein Wasserstoffatom oder einen SO₃M-Rest dar, R₂ und R₇, die gleich oder verschieden sind, stellen ein Wasserstoffatom oder einen SO₃M- oder COCH₃-Rest dar und M ist Natrium, Calcium, Magnesium oder Kalium, oder ein Gemisch dieser Oligosaccharide mit Ausnahme derjenigen, für die n gleich 0 ist und entweder R₁, R₆ und R₈ Wasserstoffatome sind, R₇ einen SO₃M- oder COCH₃-Rest darstellt und M Natrium ist, oder R₁ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen, R₇ einen COCH₃-Rest darstellt, R₈ einen SO₃M-Rest darstellt und M Natrium ist, oder R₆ einen Wasserstoff darstellt, R₁, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen und M Natrium ist, oder R₆ und R₇ Wasserstoffatome darstellen, R₁ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen und M Natrium ist, oder R₁, R₆ und R₇ ein Wasserstoffatom darstellen, R₈ einen SO₃M-Rest darstellt und M Natrium ist.
Diese Oligosaccharide umfassen so eine gerade Anzahl von Sacchariden.
In der Formel (I) sind R₄ und R₆ vorzugsweise Wasserstoffatome.
Oligosaccharide der Formel (I), für die n gleich 0 ist und entweder R₁, R₆ und R₈ ein Wasserstoffatom darstellen, R₇ einen SO₃M- oder COCH₃-Rest darstellt und M Natrium ist, oder R₁ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen, R₇ einen COCH₃-Rest darstellt, R₈ einen SO₃M-Rest darstellt und M Natrium ist, oder R₆ ein Wasserstoffatom darstellt, R₁, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen und M Natrium ist, wurden bereits von G. H. LEE et coll., J. Chromat. 212, 65–73 (1981) beschrieben, aber für diese Produkte ist keinerlei pharmakologische Eigenschaft beschrieben.
Oligosaccharide der Formel (I), für die n gleich 0 ist und entweder R₆ und R₇ Wasserstoffatome darstellen, R₁ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen und M Natrium ist, oder R₁, R₆ und R₇ ein Wasserstoffatom darstellen, R₈ einen SO₃M-Rest darstellt und M Natrium ist, sind von MW McLEAN et coll., Eur. J. Biochem., 1984, 145, 607 ohne irgendeine Angabe einer pharmakologischen Wirksamkeit beschrieben.
Die bevorzugten pharmazeutischen Zusammensetzungen sind diejenigen, die ein Oligosaccharid der Formel (I) enthalten, für das:

– n eine ganze Zahl von 0 bis 10 und insbesondere von 0 bis 6 und noch spezieller von 1 bis 6 ist,
– R₁, R₂, R₃, R₅, R₇, R₈ gleich oder verschieden sind und ein Wasserstoffatom oder einen SO₃M-Rest darstellen und insbesondere R₁, R₂, R₃, R₅, R₇, R₈ SO₃M-Reste sind,
– M Natrium ist.

Die besonders bevorzugten pharmazeutischen Zusammensetzungen sind diejenigen, die ein Oligosaccharid der Formel (I) enthalten, für das:

– n gleich 0 ist, R₁, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen, R₆ ein Wasserstoffatom darstellt und M Natrium ist,
– n gleich 1 ist, R₁, R₂, R₃, R₅, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen, R₄ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen und M Natrium ist,
– n gleich 2 ist, R₁, R₂, R₃, R₅, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen, R₄ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen und M Natrium ist,
– n gleich 3 ist, R₁, R₂, R₃, R₅, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen, R₄ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen und M Natrium ist,
– n gleich 4 ist, R₁, R₂, R₃, R₅, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen, R₄ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen und M Natrium ist.

Die Oligosaccharide der Formel (I) mit Ausnahme derjenigen, für die n gleich 0 ist und entweder R₁, R₆ und R₈ ein Wasserstoffatom darstellen, R₇ einen SO₃M- oder COCH₃-Rest darstellt und M Natrium ist, oder R₇ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen, R₇ einen COCH₃-Rest darstellt, R₈ einen SO₃M-Rest darstellt und M Natrium ist, oder R₆ einen Wasserstoff darstellt, R₁, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen und M Natrium ist, oder R₆ und R₇ Wasserstoffatome darstellen, R₁ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen und M Natrium ist, oder R₁, R₆ und R₇ ein Wasserstoffatom darstellen, R₈ einen SO₃M-Rest darstellt und M Natrium ist, sind neu und sind als solche Teil der Erfindung.
Die Oligosaccharide der Formel (I) können durch Einwirkung eines Alkalimetall- oder quartären Ammoniumborhydrids auf Oligosaccharide der Formel:
worin n eine ganze Zahl von 0 bis 25 ist, R₁, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₈, die gleich oder verschieden sind, ein Wasserstoffatom oder einen SO₃M-Rest darstellen, R₂ und R₇, die gleich oder verschieden sind, ein Wasserstoffatom oder einen SO₃M- oder COCH₃-Rest darstellen und M Natrium, Calcium, Magnesium oder Kalium ist, hergestellt werden.
Diese Reaktion erfolgt in wässrigem Medium bei einer Temperatur nahe 25°C bei einem pH zwischen 7 und 10 und vorzugsweise zwischen 9 und 10 während der gesamten Reaktionsdauer. Der pH wird durch Zugabe einer Natronlösung mit 0,5 mol/l aufrechterhalten. Die Reaktion wird durch Ansäuern des Reaktionsmediums beispielsweise durch Zugabe von Essigsäure bis zum Erhalt eines pH zwischen 4 und 5 angehalten.
Als Alkalimetallborhydrid kann man Lithium-, Natrium- und Kaliumborhydrid anführen.
Als quartäres Ammoniumborhydrid kann man Tetrabutylammoniumborhydrid anführen.
Die Oligosaccharide der Formel (II) können durch Trennung eines Gemischs von Oligosacchariden (III), das durch enzymatische Depolymerisation von Heparin oder basische Depolymerisation des Benzylesters von Heparin oder eines Benzylesters von halbsynthetischem Heparin erhalten wird, durch Gelchromatographie erhalten werden.
Diese Chromatographie erfolgt über Säulen, die gefüllt sind mit Gel vom Typ Polyacrylamid-Agarose, wie dasjenige, das unter der Marke Ultrogel ACA202^® (Biosepra) verkauft wird. Vorzugsweise verwendet man eine Reihe von Säulen mit Polyacrylamid-Agarose-Gel. Die Anzahl an verwendeten Säulen wird in Abhängigkeit von dem Volumen, dem Gel und den zu trennenden Oligosacchariden angepasst. Das Gemisch wird mit einer Lösung, die einen Phosphatpuffer und Natriumchlorid enthält, eluiert. Vorzugsweise ist die Phosphatpufferlösung eine Lösung mit 0,02 mol/l NaH₂PO₄/Na₂HPO₄ (pH 7), die 0,1 ml/l Natriumchlorid enthält. Die Detektion der verschiedenen Fraktionen wird durch UV-Spektroskopie (254 nm) und Ionenspektroskopie (IBF) durchgeführt. Die so erhaltenen Fraktionen können dann gegebenenfalls gereinigt werden, beispielsweise durch SAX-Chromatographie (strong anion exchange), gemäß den dem Fachmann bekannten Verfahren und insbesondere gemäß den Verfahren, die beschrieben sind von K. G. Rice und R. J. Linhardt, Carbohydrate Research 190, 219–233 (1989), A. Larnkjaer, S. H. Hansen und P. B. Ostergaard, Carbohydrate Research, 266, 37–52 (1995) und in dem Patent WO90/01501 (Beispiel 2). Die Fraktionen werden anschließend lyophilisiert, dann über einer mit Gel gefüllten Säule, wie eine Säule mit Sephadex G10^®-Gel (Pharmacia Biochemicals), entsalzt.
Wenn die Reinigung nicht durch SAX-Chromatographie durchgeführt wird, können die Lyophilisate gegebenenfalls durch einfaches oder fraktioniertes Fällen gemäß den dem Fachmann bekannten Verfahren und insbesondere gemäß dem in dem Patent FR2548672 beschriebenen Verfahren gereinigt werden. Allgemein arbeitet man gemäß dem folgenden Protokoll:
Die lyophilisierte Fraktion, die gereinigt werden soll, wird bei 25°C in etwa zehn Volumina destilliertem Wasser gelöst. Durch Zugabe von Methanol oder Ethanol fällt man das gewünschte Oligosaccharid aus, wobei man seine Anreicherung durch HPLC-Chromatographie (High Performance Liquid Chromatography) kontrolliert. Die Zugabe von Methanol oder Ethanol wird in Abhängigkeit von der gewünschten Reinheit und Ausbeute besagten Oligosaccharids festgelegt. Desgleichen kann dieser Vorgang in mehreren aufeinander folgenden Schritten ausgehend von der anfänglichen Lyophilisatlösung durchgeführt werden. Dazu fügt man das fällende Mittel (Methanol oder Ethanol) in kleinen Anteilen hinzu und man isoliert nach jeder Zugabe den erhaltenen Niederschlag. Die so hergestellten Niederschläge werden durch HPLC-Chromatographie analysiert. Je nach gewünschter Reinheit und Ausbeute vereinigt man die entsprechenden Niederschlagsfraktionen.
Gemäß einer Variante der vorliegenden Erfindung kann die lyophilisierte Fraktion, die gereinigt werden soll, in 10 bis 200 Volumina Wasser, das 0 bis 30% Natriumacetat enthält, gelöst werden. Der Prozentsatz an Natriumacetat wird zuvor in Abhängigkeit von der Art des zu behandelnden Oligosaccharids eingestellt (von der Größe abhängig). Durch Zugabe von Methanol fällt man das gewünschte Oligosaccharid aus, wobei man seine Anreicherung durch HPLC-Chromatographie (High Performance Liquid Chromatography) kontrolliert. Die Zugabe von Methanol wird in Abhängigkeit von der gewünschten Reinheit und Ausbeute besagten Oligosaccharids festgelegt. Desgleichen kann dieser Vorgang in mehreren aufeinander folgenden Schritten ausgehend von der anfänglichen Lyophilisatlösung durchgeführt werden. Dazu fügt man das fällende Mittel (Methanol) in kleinen Anteilen hinzu und man isoliert nach jeder Zugabe den erhaltenen Niederschlag. Die so hergestellten Niederschläge werden durch HPLC-Chromatographie analysiert. Je nach gewünschter Reinheit und Ausbeute vereinigt man die entsprechenden Niederschlagsfraktionen.
Für die Zwischenstufen der Formel (II), für die n = 0, 1 oder 2, ist es bevorzugt, von einem Gemisch (III) auszugehen, das durch enzymatische Depolymerisation erhalten wird.
Diese Depolymerisation erfolgt mittels Heparinase I (EC 4.2.2.7) in einer Phosphatpufferlösung mit pH 7 in Gegenwart von Natriumchlorid und BSA (Rinderserumalbumin) bei einer Temperatur zwischen 10 und 18°C und vorzugsweise 15°C 8 bis 10 Tage und vorzugsweise 9 Tage lang. Die Depolymerisation wird beispielsweise durch Erhitzen des Reaktionsmediums während 2 Minuten auf 100°C angehalten und das Gemisch wird durch Lyophilisieren gewonnen. Es ist bevorzugt, 7 IE Heparinase I auf 25 g Heparin zu verwenden. Die Phosphatpufferlösung umfasst im Allgemeinen 0,05 mol/l NaH₂PO₄/Na₂HPO₄ (pH 7) in Gegenwart von 0,1 mol/l Natriumchlorid. Die Konzentration an BSA beträgt im Allgemeinen 2%.
Für die Zwischenstufen der Formel (II), für die n = 0, 1, 2, 3 oder 4, ist es bevorzugt, von einem Gemisch (III) auszugehen, das durch Depolymerisation eines Benzylesters von Heparin erhalten wird.
Der Benzylester von Heparin kann gemäß den Verfahren, die in den Patenten US5389618 , EP40144 , FR2548672 beschrieben sind, hergestellt werden. Der Veresterungsgrad liegt vorzugsweise zwischen 50 und 100%. Speziell liegt er zwischen 70 und 90%.
Die Depolymerisation erfolgt in wässrigem Medium mittels eines Alkalimetallhydroxids (beispielsweise Lithiumhydroxid, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Cäsiumhydroxid) oder eines quartären Ammoniumhydroxids (beispielsweise Tetrabutylammoniumhydroxid) vorzugsweise mit einer Molarität zwischen 0,1 und 0,2 mol/l bei einer Temperatur zwischen 40 und 80°C 5 bis 120 Minuten lang. Bei einer bevorzugten Form arbeitet man 5 bis 15 Minuten lang bei einer Temperatur zwischen 60 und 70°C mit einer Natriumhydroxidlösung mit 0,15 mol/l. Die Depolymerisationsreaktion wird durch Neutralisation durch Zugabe einer Säure, wie Essigsäure, angehalten. Nach Zugabe von 10% in Gewicht pro Volumen Natriumacetat wird das Gemisch von Oligosacchariden durch Zugabe von Methanol, vorzugsweise 2 Volumina auf 1 Volumen Reaktionsmedium, gefällt und filtriert.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung wird das nach chemischer Depolymerisation in Form einer wässrigen Lösung erhaltene Gemisch von Oligosacchariden durch Ultrafiltration über Membranen mit einer geeigneten nominalen Trenngrenze (Typ Pellicon aus regenerierter Cellulose, verkauft von Millipore) angereichert; wobei der Membrantyp in Abhängigkeit vom Typ der angereicherten Oligosaccharide, die gewonnen werden sollen, angepasst wird. Für die Oligosaccharide (II), für die n = 0, verwendet man eine Membran mit einer nominalen Trenngrenze von 1 kDa, für die Oligosaccharide (II), für die n = 1, verwendet man eine 1 kDa- oder eine 3 kDa-Membran, für die Oligosaccharide (II), für die n = 2, verwendet man eine 3 kDa-Membran, für die Oligosaccharide (II), für die n = 3 oder 4, verwendet man eine 5 kDa-Membran. Im Verlauf dieses Vorgangs wird das Permeat gewonnen und das Retentat verworfen. So kann die Fraktion an angereichertem Produkt 50 bis 10% des anfänglichen Gemischs von Oligosacchariden darstellen, wobei man wenigstens 80% des gewünschten Oligosaccharids behält.
Für die Zwischenstufen der Formel (II), für die n = 0 bis 25, ist es bevorzugt, von einem Gemisch (III) auszugehen, das durch Depolymerisation eines Benzylesters eines partialsynthetischen sulfatierten Polysaccharids erhalten wird. Der Benzylester des partialsynthetischen sulfatierten Polysaccharids wird aus partialsynthetischen sulfatierten Polysacchariden, die aus dem Polysaccharid K5 erhalten werden, und gemäß den in den Patenten WO94/29352 und WO96/14425 beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Veresterungs-, Depolymerisations- und Gewinnungsbedingungen sind die gleichen wie diejenigen, die zuvor für den Heparinbenzylester beschrieben wurden.
Bei allen vorhergehenden Verfahren kann das Ausgangsheparin von Schwein, Schaf, Ziege oder Rind kommen und kann aus den Schleimhäuten, der Lunge oder der Haut der Tiere stammen.
Vorzugsweise verwendet man ein Heparin aus Schweine-, Schafschleimhaut oder aus Rinderlungen und noch stärker bevorzugt Schweineschleimhaut oder Rinderlunge.
Die Oligosaccharide der Formel (I) weisen entzündungshemmende Eigenschaften auf und können so für die Prophylaxe oder die Behandlung von Krankheiten verwendet werden, die mit einem entzündlichen Prozess zusammenhängen, der die Produktion von cytotoxischen Substanzen, wie Stickstoffmonoxid (NO), einschließt, dessen induzierbare Form insbesondere von den Neutrophilen oder den Makrophagen freigesetzt wird, wenn diese wandern und in einem Gewebe aktiviert werden. Die Migration, die Aktivierung und die Adhäsion der Neutrophile erfolgt in den Gewebezonen, die auf Grund eines Verschlusses oder eines Krampfes einer Arterie, die dieses Gewebe versorgt, ischämisch sind. Diese Ischämien können sich entweder im Gehirn (zerebrovaskulärer Zwischenfall) oder am Herzmuskel (Myokardinfarkt) oder an den unteren Gliedmaßen (peripher genannte Ischämien) ereignen. Die Oligosaccharide der Formel (I) können so für die Prophylaxe und/oder die Behandlung der neurodegenerativen Erkrankungen verwendet werden, für die die zerebrale Entzündung eine lebensgefährliche Rolle, die zum Tod führen kann, spielt, unter denen man anführen kann die zerebralen Ischämien, die kardialen Ischämien (Myokardinfarkt), die peripheren Ischämien, die Traumen des zentralen Nervensystems und insbesondere die Schädel-Hirn-, spinalen und cranio-spinalen Traumen, die Multiple Sklerose, die neuropathischen Schmerzen und die peripheren Neuropathien, die Motoneuronerkrankungen, darunter die amyotrophe Lateralsklerose, die progressive spinale Muskelatrophie, die infantile Muskelatrophie und die primäre Lateralsklerose, Neuro-AIDS, die Alzheimer-Krankheit, die Parkinson-Krankheit und Chorea Huntington und bestimmte Formen von Osteoartrithis, insbesondere mit Lokalisierung in den Gelenken.
Die entzündungshemmende Wirksamkeit dieser Produkte wird in vivo bei dem Test der Produktion von NOx (Nitrit und Nitrat), die von einem von E. coli stammenden Lipopolysaccharid (LPS) induziert wird, gemäß dem von M. YAMASHITA et coll., Eur. J. Pharmacol, 338, 2, 151–158 (1997) oder J. E. SHELLITO et coll. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 13, 1, 45–53 (1995) beschriebenen Protokoll nachgewiesen.
Man injiziert männlichen CD1-Mäusen (Charles River, 25–35 g) bei T0 intravenös als Bolus 0,5 mg/kg Oligosaccharid, bei T + 15 Minuten subkutan 1 oder 2 mg/kg Oligosaccharid. Bei T + 30 Minuten verabreicht man 100 mg/kg Lipopolysaccharid (LPS), das von E. coli stammt (Sigma L3129, Serotyp 0127: B8). Bei T + 3 Stunden injiziert man von neuem subkutan 1 oder 2 mg/kg Oligosaccharid. Bei T + 5 Stunden 30 Minuten wird eine Blutprobe durch Punktion am Auge gewonnen und die Konzentrationen an NOx (Nitrit und Nitrat) im Plasma werden mit dem kolorimetrischen Verfahren von Griess nach Reduktion des Nitrats zu Nitrit durch Nitratreduktase auf die folgende Weise bestimmt: 12 ml der Plasmaprobe werden mit 88 ml deionisiertem Wasser gemischt und im Dunkeln 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 40 ml Phosphatpuffer (0,31 M, pH 7,5), 20 ml β-NADPH (reduziertes Nicotinamid-Adenin-Dinucleotidphosphat) (0,86 mM), 20 ml FAD (Flavin-Adenin-Dinucleotid) (0,11 mM) und 20 ml Nitratreduktase (2 E/ml) (Boehringer Mannheim) inkubiert. 10 ml ZnSO₄ (1 M) werden hinzugefügt, um die Proteine auszufällen, und nach Mischen werden die Proben 5 Minuten lang mit 20 000 g zentrifugiert. Schließlich werden 50 ml des Überstands 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 100 ml Griess- Reagenz (Sulfanilamid 1%ig in einem Gemisch Phosphorsäure/Naphthylethylendiamin 0,1%ig in deionisiertem Wasser (V/V)) inkubiert. Die optischen Dichten werden bei 540 nm mit einem Mikroplatten-Spektrometer abgelesen; wobei jeder Punkt 2 Mal bestimmt wird. KNO₃ und NaNO₂ werden als Standard für das kolorimetrische Verfahren verwendet.
Bei diesem Test inhibieren die erfindungsgemäßen Oligosaccharide die Bildung von NOx zu mehr als 50%.
Außerdem erhöhen die Oligosaccharide der Formel (I) das Überleben und das Wachstum der Motoneuronen und sind so besonders geeignet bei der Vorbeugung und/oder Behandlung der motoneuralen Erkrankungen, wie der amyotrophen Lateralsklerose, der progressiven spinalen Muskelatrophie, der infantilen Muskelatrophie, der primären Lateralsklerose.
Es ist bekannt, dass die Motoneuronenkulturen durch Apoptose sterben, wenn sie in Abwesenheit von trophischem Substrat (beispielsweise BDNF, NT5) ausgeführt werden. Es wurde jetzt gefunden, dass die erfindungsgemäßen Oligosaccharide das Überleben und das Wachstum der Motoneuronen ermöglichen. Diese Wirksamkeit wurde an Co-Kulturen von Astrozyten und Motoneuronen, denen der neurotrophe Faktor entzogen wird, gemäß dem folgenden Protokoll untersucht:
AN MOTONEURONEN ANGEREICHERTE KULTUREN:
Die an Motoneuronen angereicherten Kulturen werden hergestellt, indem man das Zentrifugationsverfahren anwendet, das von R. L. SCHNAAR und A. E. SCHAFFNER, J. Neurosci., 1, 204–217 (1981) beschrieben wurde und von W. CAMU und C. E. HENDERSON, J. Neurosci. Methods, 44, 59–70 (1992) modifiziert wurde. Rückenmark von E15-Rattenembryonen wird steril seziert und vom dorsalen Rückenmark befreit. Es wird dann geschnitten und 15 Minuten bei 37°C in PBS (phosphatgepufferte Salzlösung: NaCl 137 mM, KCl 2,68 mM, Na₂HPO₄ 6,45 mM, KH₂PO₄ 1,47 mM), dem 0,05% Trypsin zugesetzt worden waren, inkubiert. Die Dissoziation der Zellen wird durch Trituration mit der Spitze einer 1 ml-Pipette in dem Kulturmedium, dem 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1 mg/ml ADNase zugesetzt wurden, vervollständigt. Die Suspension der Zellen wird auf eine Schicht Metrizamid, 6,5% Gewicht/Volumen in L15-Medium (verkauft von Gibco BRL), aufgetragen und 15 Minuten lang mit 500 g zentrifugiert. Die Zwischenphase, die die Motoneuronen enthält, wird gewonnen, in L15-Medium verdünnt und 45 Minuten bei Raumtemperatur in Kulturgefäßen, die zuvor mit Mäuse-anti-IgG und mit Hybridom MC192-Überstand beschichtet wurden, inkubiert (Chandler CE et coll., J. Biol. Chem. 259, 6882 (1984). Die suspendierten Zellen werden mit L15-Medium gewaschen und die Motoneuronen werden unter schwachem Rühren mit dem Hybridome MC192-Überstand eluiert. Die Motoneuronen werden mit einer Dichte von 650 Zellen pro 24 mm in Kulturgefäße auf die Astrozytenmonolagen in L15-Medium, dem man Natriumbicarbonat (22 mM), Coalbumin (0,1 mg/ml) Putrescin (0,1 mM), Insulin (5 μg/ml), Natriumselenit (31 nM), Glucose (20 mM), Progesteron (21 nM), Penicillin (100 IE/ml) und Streptomycin (100 μg/ml) zugesetzt hatte, ausgebracht. Die Kulturen werden in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 5% CO₂ bei 37°C gehalten.
KULTUR VON RÜCKENMARKSASTROZYTEN:
Die Astrozyten werden aus Rattenembryonen gemäß dem Verfahren von R. P. SANETO und J. DE VELLIS, in Neurochemistry, a practical approach (A. J. TURNER und H. S. St JOHN), IRL Press, Oxford-Washington DC, S. 27–63 (1987), das leicht verändert wurde, erhalten. Das Rückenmark wird steril seziert, von den Meningen und den Dorsalganglien befreit. Fünf bis zehn Rückenmarkpräparate werden in PBS (phosphatgepufferte Salzlösung: NaCl 137 mM, KCl 2,68 mM, Na₂HPO₄ 6,45 mM, KH₂PO₄ 1,47 mM) überführt und geschnitten, bevor sie bei 25 Minuten lang 37°C in PBS, dem 0,25% Trypsin zugesetzt worden waren, inkubiert werden. Die enzymatische Behandlung wird durch Zugabe von 10 ml modifiziertem Dubelcco-Eagle-Medium (DMEM), dem man 10% fötales Kälberserum (FCS) zugesetzt hatte, gestoppt und die Zellen werden durch Zentrifugieren gesammelt. Ein weiterer Schritt zur mechanischen Dissoziation wird ausgeführt, indem man die Spitze einer 1 ml-Pipette verwendet. Die Zellen werden mit einer Dichte von 1,5 × 10⁶ Zellen pro 25 cm² Kulturmedium in DMEM mit 10% FCS ausgebracht. Nach 2 Tagen in vitro werden die Kulturen jeden Tag während der gesamten Dauer der Untersuchung ernährt. Wenn eine sichtbare Monolage Zellen erhalten wurde, werden die Kulturen 48 Stunden mit 250 Upm gerührt und am nächsten Tag werden die Monolagen mit Cytosin-Arabinosid (10^–5 M) 48 Stunden lang behandelt. Die Astrozytenmonolagen werden dann mit einer Dichte von fünf pro 35 mm auf Kulturplatten für 25 cm²-Kulturfläschchen zu Beginn der Untersuchung vermehrt.
Die Kulturen spinaler Astrozyten bestehen zu mehr als 98% aus für das saure Gliafaserprotein (GFAP) immunreaktiven Zellen.
Die Astrozytenmonolagen werden entweder dem PBS allein (Kontrolle) oder dem zu testenden, in PBS gelösten Produkt in der Konzentration von 0,1 ng/ml bis 10 ng/ml 24 Stunden lang ausgesetzt. Die Astrozytenmonolagen werden dann mit DMEM gewaschen und 2 Stunden mit Kulturmedium, dem die Motoneuronen zugesetzt sind, belassen. Der Träger oder das zu untersuchende Produkt wird nochmals zwei Stunden nach dem Nähren und 2 oder 3 Tage lang dem Kulturmedium zugesetzt.
IMMUNOCHEMISCHE IDENTIFIZIERUNG DER MOTONEURONEN
Die Zellen werden in 4% Paraformaldehyd und 0,1% Glutaraldehyd in PBS (pH 7,4 bei 4°C, 15 Minuten lang) fixiert. Die Kulturen werden dann gewaschen und die nicht spezifischen Stellen mit 2% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS und 0,1% Triton X100^® blockiert. Diese Kulturen werden nacheinander mit Antikörpern von p75^LNGRF (zuvor angeführter Artikel von Chandler) eine Nacht bei 4°C und mit biotinylisiertem Ziegenserum (1/125, Gibco) und Streptaviden-Peroxydase (1/200, Gibco) 60 Minuten lang inkubiert. Die Antikörper werden sichtbar gemacht, indem man die DAB/Wasserstoffperoxid-Reaktion verwendet.
ZÄHLEN DER ZELLEN UND STATISTISCHE ANALYSE
Die Zellen, die für den neutrophinen Rezeptor mit geringer Aktivität p75^Ingfr immunreaktiv sind und Neuriten vorweisen, die länger als die Durchmesser von 4 Zellen sind, werden als lebensfähige Motoneuronen betrachtet. Die Anzahl an Motoneuronen wird durch Zählen der markierten Zellen auf einer Oberfläche von 0,825 cm² unter einem Mikroskop mit 200-facher Vergrößerung bestimmt. Die Werte werden ausgedrückt als eine Anzahl an Motoneuronen pro cm² oder als ein Prozentsatz der Anzahl an Motoneuronen, die in den in Abwesenheit von trophischem Faktoren gehaltenen Kulturen vorliegen, verglichen mit der Kontrolle. Die Versuche werden mindestens 3 Mal durchgeführt.
Die statistischen Analysen werden unter Verwendung des Student-Tests (t-Test) ausgeführt.
Durch Vorbehandlungen mit den Oligosacchariden der vorliegenden Erfindung wird die Anzahl an Motoneuronen, die auf der Astrozytenmonolage wachsen, um 20 bis 50% erhöht.
Die folgenden Beispiele sind repräsentativ für die Herstellung der Oligosaccharide der Formel (I) und der Zwischenstufen.
In diesen Beispielen sind die Bedeutungen der Abkürzungen die folgenden:
ΔIs: (4-Deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-enopyranosyluronsäure)-(1→4)-2-deoxy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-α-D-glucopyranose, Tetranatriumsalz oder aber ΔUAp2S-(1→4)-α-D-GlcNp2S6S
Is: (2-Sulfo-α-L-idopyranosyluronsäure)-(1→4)-2-deoxy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-α-D-glucopyranose, Tetranatriumsalz (2-sulfo-α-L-idopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-α-D-glucopyranose, Tetranatriumsalz oder aber a α-L-IdoAp2S-(1→4)-α-D-GlcNp2S6S
Ils: (α-L-Idopyranosyluronsäure)-(1→4)-2-deoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-α-D-glucopyranose, Trinatriumsalz oder aber α-L-IdoAp-(1→4)-α-D-GlcNp2S6S
Ills: (2-Sulfo-α-L-Idopyranosyluronsäure)-(1→4)-2-deoxy-2-sulfoamino-α-D-glucopyranose, Trinatriumsalz oder aber α-L-IdoAp2S-(1→4)-α-D-GlcNp2S
IdoAp: Idopyranosyluronsäure
GlcNp: 2-Amino-2-deoxy-glucopyranose
ΔUap: 4-Deoxy-α-L-threo-hex-enopyranosyluronsäure
S: Sulfat.
BEISPIELE ZUR HERSTELLUNG DER ZWISCHENGEMISCHE DER FORMEL (II)
BEISPIEL A – Herstellung der Oligosaccharide der Formel (II), für die n = 0, 1 und 2, durch enzymatische Depolymerisation und Trennung
25 g Heparin in 250 ml einer Phosphatpufferlösung auflösen, die 0,05 mol/l NaH₂PO₄/Na₂HPO₄ (pH = 7), 0,2 mol/l Natriumchlorid und 2% BSA (Rinderserum albumin) enthält. Man führt in das Gemisch 7 IE Heparinase I (EC 4.2.2.2.7) ein und die erhaltene Lösung wird auf 15°C abgekühlt, dann während der gesamten Dauer der Depolymerisationsreaktion auf dieser Temperatur gehalten. Das Fortschreiten der Reaktion wird durch verteilte Entnahmen von Aliquoten verfolgt und durch Gelpermeationschromatographie analysiert. Nach 9 Tagen wird die Enzymreaktion angehalten, indem man das Reaktionsmedium zwei Minuten lang auf 100°C erhitzt. Das abgekühlte Gemisch wird anschließend lyophilisiert. Man erhält so ein Gemisch von Oligosacchariden (III).
Das erhaltene Gemisch von Oligosacchariden (III) wird dann gemäß dem folgenden Verfahren chromatographiert: Die Chromatographie erfolgt über Säulen, die mit Polyacrylamid-Agarose-Gel, bekannt unter der Bezeichnung Ultrogel ACA 202, gefüllt sind, und das Gemisch wird mit einer Lösung eluiert, die einen Phosphatpuffer (0,02 mol/l NaH₂PO₄/Na₂HPO₄) pH = 7 und 0,1 mol/l Natriumchlorid enthält. Die Detektion wird mit UV-Spektroskopie (254 nm) und Ionenspektroskopie (IBF) durchgeführt. Die Produkte können gegebenenfalls durch SAX-Chromatographie (strong anion exchange) oder durch fraktionierte Fällung gemäß dem in dem Patent FR 2548672 beschriebenen Verfahren gereinigt werden. Die Fraktionen mit gewonnenem Produkt werden lyophilisiert, dann über einer mit Sephadex G10^®-Gel (Pharmacia Biochemicals) gefüllten Säule entsalzt.
Durch dieses Verfahren erhält man 3 g Disaccharid ΔIs, 1100 mg eines Hexasaccharidgemischs, das typischerweise 55% ΔIs-Is-Is-Derivat, 35% ΔIs-Is-Ils und 10% ΔIs-Is-Ills enthält. Dieses letztere Gemisch kann gemäß den dem Fachmann bekannten Verfahren gereinigt werden, um davon jeden Bestandteil abzutrennen, oder so, wie es ist, für die Umwandlung in reduzierte Derivate der Formel (I) verwendet werden.
BEISPIEL B – Herstellung der Oligosaccharide der Formel (II), für die n = 0, 1, 2, 3 oder 4, durch Depolymerisation des Heparinbenzylesters und Trennung
a – Herstellung des Benzylesters von Heparin
Der Benzylester von Heparin wird gemäß dem Beispiel 3 des Patents US 5,389,618 hergestellt.
b – Depolymerisation
100 g Heparinbenzylester in 1,9 l entmineralisiertem Wasser auflösen. Das Gemisch wird unter Rühren auf 60°C gebracht. Nach Erhalt einer homogenen Lösung gibt man auf einmal etwa 35 ml einer 23%igen Natriumhydroxidlösung hinzu. Nach 10 Minuten Reaktion wird die Lösung dann abgekühlt und mit 80 ml einer etwa 2 N Essigsäurelösung neutralisiert. Zu dieser Lösung fügt man 10% in Gewicht/Volumen Natriumacetat hinzu. Das Oligosaccharidgemisch wird durch Zugabe von etwa 2 Volumina Methanol ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Filtrieren isoliert, mit Methanol zweimal gewaschen, dann unter vermindertem Druck bei 50°C getrocknet. Nach Trocknen erhält man 73,8 g eines Gemischs von Oligosacchariden (II).
c – Anreichern an Oligosaccharid, für das n = 1
30 g des zuvor erhaltenen Oligosaccharidgemischs in etwa 35 Volumina Wasser auflösen. Diese Lösung wird über eine 3 kDa-Membran (Pellicon) ultrafiltriert. Wenn 600 ml Permeat entnommen worden sind, verdünnt man das Retentat mit 500 ml Wasser. Der Vorgang wird fortgesetzt, bis zusätzliche 450 ml Permeat entnommen sind. Die beiden Permeatfraktionen werden vereinigt, dann unter vermindertem Druck bis zur Trockne konzentriert. Man erhält 6,1 g eines gelblich weißen Feststoffs. Die Analyse des Feststoffs durch Gelpermeationschromatographie zeigt, dass er etwa 30% Oligosaccharid der Formel (II), für das n = 1, enthält.
d – Fraktionierung der ultrafiltrierten Oligosaccharidgemische
Das angereicherte Gemisch wird über Säulen fraktioniert, die mit Polyacrylamid-Agarose-Gel, bekannt unter der Bezeichnung Ultrogel ACA 202, gefüllt sind (man verwendet 4 Säulen in Reihe mit einem Durchmesser von 10 cm und einer Höhe von 50 cm). 5 g des durch Ultrafiltration angereicherten Gemischs werden in 25 ml Wasser gelöst, dann mit einer Natriumchloridlösung mit 0,2 mol/l mit der Geschwindigkeit von 5 ml/min eluiert. Man gewinnt unten an der Säule 25 ml-Fraktionen. Die Detektion der Produkte wird mit UV-Spektroskopie (254 nm) und Ionenspektroskopie (IBF) durchgeführt. Die Fraktionen mit Produkt, für das n = 1, werden gewonnen, lyophilisiert, dann über einer mit Sephadex G10-Gel gefüllten Säule entsalzt. Nach Lyophilisieren erhält man 1 g Tetrasaccharid, das typischerweise 70% ΔIs-Is-Derivat der Formel (II) (R₁, R₂, R₃ R₅, R₇, R₈ = SO₃Na; R₄, R₆ = H und M = Na) enthält. Das ΔIs-Is-Derivat kann gegebenenfalls durch SAX-Chromatographie (strong anion exchange) oder gemäß einem bevorzugten Aspekt durch fraktionierte Fällung gemäß dem in dem Patent FR 2548672 beschriebenen Verfahren und der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Variante gereinigt werden.
BEISPIELE ZUR HERSTELLUNG DER OLIGOSACCHARIDE DER FORMEL (I)
BEISPIEL 1
Man gibt bei 25°C in einen Reaktor eine Lösung von 300 mg eines Oligosaccharids der Formel (II), worin n gleich 0 ist, R₁, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen, R₆ ein Wasserstoffatom darstellt und M Natrium ist, in 2 ml Wasser. Unter Rühren fügt man auf einmal 212 mg Natriumborhydrid hinzu. Der pH wird dann durch Zugabe einer Natriumhydroxidlösung mit 0,5 mol/l zwischen 9 und 10 eingestellt. Nach 12 Stunden fügt man schrittweise Essigsäure bis zum Erhalt eines pH zwischen 4 und 5 hinzu. Das Gemisch wird 1 Stunde gerührt, dann stellt man den pH durch Zugabe von Natronlauge mit 0,5 mol/l auf 6,7 ein. Das Gemisch wird dann unter vermindertem Druck bei 50°C bis zur Trockne konzentriert. Das Konzentrat wird unter magnetischem Rühren in 10 ml Methanol dispergiert. Nach einer Nacht Absetzen wird die Suspension über eine Whatman GF/B-Membran filtriert. Der Feststoff auf dem Filter wird durch Durchleiten von 2 Portionen von 10 ml destilliertem Wasser gelöst. Diese Lösung wird dann unter vermindertem Druck bei 50°C bis zur Trockne konzentriert. Man erhält 580 mg eines weißen Feststoffs. Der Feststoff wird dann unter magnetischem Rühren in 15 ml Methanol dispergiert. Nach 30 Minuten Rühren wird die Suspension über eine Whatmann GF/B-Membran filtriert. Der Kuchen wird durch Durchleiten von 2 Portionen von 10 ml destilliertem Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wird unter vermindertem Druck bei 50°C bis zur Trockne konzentriert. Man erhält so 250 mg eines Oligosaccharids der Formel (I), für das n gleich 0 ist, R₁, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen, R₆ ein Wasserstoffatom darstellt und M Natrium ist, in Form eines Gemischs der Diastereoisomere. Man bezeichnet die grundlegenden Zucker der Disaccharide mit I bis II, wobei I der reduzierte Rest und II der ungesättigte Uronsäurerest ist [(4-Deoxy-2-O-sulfo-α-L- threo-hex-4-enopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-D-glucitol, Tetranatriumsalz); (4-Deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-D-mannit, Tetranatriumsalz):
Protonenspektrum in D₂O, 600 MHz, T = 305 K, δ in ppm: 3,38 (1H, m, H-2^(I)), 3,70 und 3,75 (jeweils 1H, dd, J = 6 und 12 Hz, beziehungsweise dd, J = 5 und 12 Hz, 2H-1^(I)), 3,86 (1H, t, J = 5 Hz, H-3^(I)), 4,13 (1H, dd, J = 8 und 11 Hz, H-6^(I)), 4,18 (1H, m, H-4^(I)), 4,25 (2H, m, H-6^(I) und H-3^(II)), 4,35 (1H, m, H-5^(I)), 4,65 (1H, m, H-2^(II)), 5,67 (1H, s, H-1^(II)), 6,00 (1H, d, J = 5 Hz, H-4^(II))].
BEISPIEL 2
Man gibt bei 25°C in einen Reaktor eine Lösung von 60 mg eines Oligosaccharids der Formel (II), worin n gleich 1 ist, R₁, R₂, R₃, R₅, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen, R₄ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen und M Natrium ist, in 1,2 ml Wasser. Unter Rühren fügt man auf einmal 18 mg Natriumborhydrid hinzu. Der pH wird dann zwischen 9 und 10 durch Zugabe einer Natriumhydroxidlösung mit 0,5 mol/l eingestellt. Nach 12 Stunden fügt man schrittweise Essigsäure bis zum Erhalt eines pH zwischen 4 und 5 hinzu. Das Gemisch wird 1 Stunde gerührt, dann fügt man 5 ml Methanol hinzu. Die Suspension wird über eine Whatman GF/B-Membran filtriert und der gewonnene Feststoff wird mit 2 Mal 0,5 ml Methanol gespült. Nach Trocknen erhält man 42 mg eines Oligosaccharids der Formel (I), für das n gleich 1 ist, R₁, R₂, R₃, R₅, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen, R₄ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen und M Natrium ist, in Form eines Gemischs der Diastereoisomere. Man bezeichnet die grundlegenden Zucker der Tetrasaccharide mit I bis IV, wobei I der reduzierte Rest und IV der ungesättigte Uronsäurerest ist [(4-Deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-sulfo-α-L-idopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-D-glucitol, Octanatriumsalz); (4-Deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-sulfo-α-L-idopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-D-mannit, Octanatriumsalz): Protonenspektrum in D₂O, 400 MHz, T = 298 K, δ in ppm: 3,25 (1H, dd, J = 10 und 3 Hz, H-2^(III)), 3,37 (1H, m, H-2^(I)), 3,59 (1H, m, H-3^(III)), 3,75 (2H, m, 2H-1^(I)), 3,79 (1H, t, J = 9 Hz, H-4^(III)), 3,86 (1H, m, H-3^(I)), zwischen 4,05 und 4,40 (10H, Berg, H-4^(I)/H-5^(I)/2H-6^(II), H-2^(II)/H-3^(II)/H-4^(II)), 2H-6^(III), H-3^(IV)), 4,58 (1H, m, H-2^(IV)), 4,60 (1H, m, H-5^(II)), 5,27 (1H, d, J = 4 Hz, H-1^(II)), 5,42 (1H, d, J = 4 Hz, H-1^(III)), 5,47 (1H, d, J = 2 Hz, H-1^(IV)), 5,95 (1H, d, J = 5 Hz, H-4^(IV))].
BEISPIEL 3
Bei 25°C gibt man in einen Reaktor eine Lösung von 100 mg eines Oligosaccharids der Formel (II), worin n gleich 2 ist, R₁, R₂, R₃, R₅, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen, R₄ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen und M Natrium ist, in 2 ml Wasser. Unter Rühren fügt man auf einmal 20 mg Natriumborhydrid hinzu. Der pH wird dann zwischen 9 und 10 durch Zugabe einer Natriumhydroxidlösung mit 0,5 mol/l eingestellt. Nach 12 Stunden fügt man schrittweise Essigsäure bis zum Erhalt eines pH zwischen 4 und 5 hinzu. Das Gemisch wird 1 Stunde gerührt, dann stellt man den pH durch Zugabe von Natronlauge mit 0,5 mol/l auf 6,7 ein. Das Gemisch wird dann mit destilliertem Wasser in einer Menge, die ausreicht, um 20 ml zu erhalten, verdünnt. Man fügt 2,5 g Natriumacetat hinzu und man gießt 3 Volumina Methanol hinzu. Die Suspension wird über eine Whatman GF/B-Membran filtriert und der gewonnene Feststoff wird mit 2 Mal 2 ml Methanol gespült. Nach Trocknen erhält man 61 mg eines Oligosaccharids der Formel (I), für das n gleich 2 ist, R₁, R₂, R₃, R₅, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen, R₄ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen und M Natrium ist, in Form eines Gemischs der Diastereoisomere. Man bezeichnet die grundlegenden Zucker der Hexasaccharide mit I bis VI, wobei I der reduzierte Rest und VI der ungesättigte Uronsäurerest ist. [(4-Deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-sulfo-α-L-idopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-sulfo-α-L-idopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-D-glucitol, Dodecanatriumsalz); (4-Deoxy-2-O-sulfo-α-L-threohex-4-enopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-sulfo-α-L-idopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-sulfo-α-L-idopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-D-mannit, Dodecanatriumsalz): Protonenspektrum in D₂O, 600 MHz, T = 305 K, δ in ppm: 3,25 (2H, m, H-2^(III)und(V)), 3,38 (1H, m, H-2^(I)), 3,61 (2H, t, J = 10 Hz, H-3^(III)und(V)), zwischen 3,70 und 3,83 (4H, Berg, 2H-1^(I) und H-4^(III)und(V)), 3,86 (1H, t, J = 5 Hz, H-3^(I)), 4,00 (2H, m, H-5^(III)und(V)), 4,07 (1H, m, H-4^(IV)), 4,08 (1H, m, H-4^(I)), zwischen 4,10 und 4,45 (13H, Berg, H-5^(I)/2H-6^(I), H-2^(II)/H-3^(II)/H-4^(II), 2H-6^(III), H-2^(IV)/H-3^(IV), 2H-6^(V), H-3^(VI)), 4,60 (1H, s, H-2^(VI)), 4,62 (1H, s, H-5^(II)), 4,78 (1H, s, H-5^(IV)), 5,17 (1H, s, H-1^(IV)), 5,28 (1H, d, J = 4 Hz, H-1^(II)), 5,38 (1H, d, J = 3 Hz, H-1^(V), 5,44 (1H, d, J = 3 Hz, H-1^(III)), 5,47 (1H, d, J = 2 Hz, H-1^(VI)), 5,96 (1H, d, J = 5 Hz, H-4^(VI))].
BEISPIEL 4
Man gibt bei 25°C in einen Reaktor eine Lösung von 100 mg eines Oligosaccharids der Formel (II), worin n gleich 3 ist, R₁, R₂, R₃, R₅, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen, R₄ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen und M Natrium ist, in 2 ml Wasser. Unter Rühren fügt man auf zweimal 30 mg Natriumborhydrid hinzu. Der pH wird dann zwischen 9 und 10 durch Zugabe einer Natriumhydroxidlösung mit 0,5 mol/l eingestellt. Nach 12 Stunden fügt man schrittweise Essigsäure bis zum Erhalt eines pH zwischen 4 und 5 hinzu. Das Gemisch wird 1 Stunde gerührt, dann stellt man den pH durch Zugabe von Natronlauge mit 0,5 mol/l auf 6,7 ein. Das Gemisch wird dann mit destilliertem Wasser in einer Menge, die ausreicht, um 20 ml zu erhalten, verdünnt. Man fügt 2 g Natriumacetat hinzu und man gießt 3 Volumina Methanol hinzu. Die Suspension wird über eine Whatman GF/B-Membran filtriert und der gewonnene Feststoff wird mit 2 Mal 1 ml Methanol gespült. Nach Trocknen erhält man 68 mg eines weißen Feststoffs. Nach HPLC-Kontrolle (High Pressure Liquid Chromatography) wiederholt man, da das Produkt nicht vollkommen reduziert ist, alle vorhergehenden Arbeitsgänge vollständig. Nach Trocknen erhält man 45 mg eines Oligosaccharids der Formel (I), für das n gleich 3 ist, R₁, R₂, R₃, R₅, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen, R₄ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen und M Natrium ist, in Form eines Gemischs der Diastereoisomere. Man bezeichnet die grundlegenden Zucker der Octasaccharide mit I bis VIII, wobei I der reduzierte Rest und VIII der ungesättigte Uronsäurerest ist, [(4-Deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-sulfo-α-L-idopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-sulfo-α-L-idopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-sulfo-α-L-idopyranosyluronsäure-(1→4)- 2-deoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-D-glucitol, Hexadecanatriumsalz); (4-Deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-sulfo-α-L-idopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-sulfo-α-L-idopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-sulfo-α-L-idopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-D-mannit, Hexadecanatriumsalz): Protonenspektrum in D₂O, 600 MHz, T = 305 K, δ in ppm: 3,25 (3H, m, H-2^(III), H-2^(V), H-2^(VII)), 3,38 (1H, m, H-2^(I)), 3,61 (3H, m, H-3^(III), H-3^(V), H-3^(VII)), zwischen 3,70 und 3,83 (5H, Berg, 2H-1^(I) und H-4^(III)), H-4^(V), H-4^(VII)), 3,86 (1H, t, J = 5 Hz, H-3^(I)), 4,00 (3H, m, H-5^(III), H-5^(V), H-5^(VII)), 4,08 (3H, m, H-4^(I), H-4^(IV), H-4^(VI)), zwischen 4,10 und 4,45 (17H, Berg, H-5^(I)/2H-6^(I), H-2^(II)/H-3^(II)/H-4^(II), 2H-6^(III), H-2^(IV)/H-3^(IV), 2H-6^(V), H-2^(VI)/H-3^(VI), 2H-6^(VII), H-3^(VIII)), 4,59 (1H, s, H-2^(VIII)), 4,62 (1H, s, H-5^(II)), 4,78 (2H, s, H-5^(IV), H-5^(VI)), 5,17 (2H, s, H-1^(IV), H-1^(VI)), 5,28 (1H, d, J = 4 Hz, H-1^(II)), 5,38 (2H, m, H-1^(V), H-1^(VII)), 5,44 (1H, d, J = 3 Hz, H-1^(III)), 5,47 (1H, s, H-1^(VIII)), 5,96 (1H, d, J = 5 Hz, H-4^(VIII))].
BEISPIEL 5
Man gibt bei 25°C in einen Reaktor eine Lösung von 65 mg eines Oligosaccharids der Formel (II), worin n gleich 4 ist, R₁, R₂, R₃, R₅, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen, R₄ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen und M Natrium ist, in 1,2 ml Wasser. Unter Rühren fügt man auf einmal 18 mg Natriumborhydrid hinzu. Der pH wird dann zwischen 9 und 10 durch Zugabe einer Natriumhydroxidlösung mit 0,5 mol/l eingestellt. Nach 12 Stunden fügt man schrittweise Essigsäure bis zum Erhalt eines pH zwischen 4 und 5 hinzu. Das Gemisch wird 1 Stunde gerührt, dann stellt man den pH durch Zugabe von Natronlauge mit 0,5 mol/l auf 6,7 ein. Das Gemisch wird dann mit einer wässrigen 10%igen Natriumacetatlösung verdünnt und man gießt 3 Volumina Methanol (12 ml) hinzu. Die Suspension wird filtriert und der gewonnene Feststoff wird mit 3 ml Methanol gespült. Nach Trocknen erhält man 54 mg eines Oligosaccharids der Formel (I), für das n gleich 4 ist, R₁, R₂, R₃, R₅, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen, R₄ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen und M Natrium ist, in Form eines Gemischs der Diastereoisomere. Man bezeichnet die grundlegenden Zucker der Decasaccharide mit I bis X, wobei I der reduzierte Rest und X der ungesättigte Uronsäurerest ist. [(4-Deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4- enopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-sulfo-α-L-idopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-sulfo-α-L-idopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-sulfo-α-L-idopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-sulfo-α-L-idopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-D-glucitol, Eiconatriumsalz); (4-Deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-sulfo-α-L-idopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-sulfo-α-L-idopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-sulfo-α-L-idopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-sulfo-α-L-idopyranosyluronsäure-(1→4)-2-deoxy-6-O-sulfo-2-sulfoamino-D-mannit, Eiconatriumsalz): Protonenspektrum in D₂O, 600 MHz, T = 303 K, δ in ppm: 3,23 (4H, m, H-2^(III)), H-2^(V), H-2^(VII), H-2^(IX)), 3,35 (1H, m, H-2^(I)), 3,59 (4H, m, H-3^(III), H-3^(V), H-3^(VII), H-3^(IX)), zwischen 3,65 und 3,80 (6H, m), 3,85 (1H, m, H-3^(I)), zwischen 3,90 und 4,40 (29H, m), 4,57 (1H, m, H-2^(X)), 4,59 (1H, m, H-5^(II)), 4,75 (3H, m, H-5^(IV), H-5^(VI), H-5^(VIII)), 5,15 (3H, m, H-1^(IV), H-1^(VI), H-1^(VIII)), 5,25 (1H, m, H-1^(II)), 5,37 (3H, m, H-1^(V), H-1^(VII), H-1^(IX)), 5,42 (1H, m, H-1^(III)), 5,45 (1H, m, H-1^(X)), 5,93 (1H, d, J = 5 Hz, H-4^(X)).
Die erfindungsgemäßen Medikamente umfassen als Wirkstoff wenigstens ein Oligosaccharid der Formel (I) oder ein Gemisch von Oligosacchariden der Formel (I) in Form einer Zusammensetzung, worin es mit jedem anderen, pharmazeutisch kompatiblen Produkt, das inert oder physiologisch aktiv sein kann, kombiniert ist. Die erfindungsgemäßen Medikamente können intravenös, subkutan, oral, rektal, topisch oder pulmonal (Inhalation) angewandt werden.
Die sterilen Zusammensetzungen für eine intravenöse oder subkutane Verabreichung sind im Allgemeinen wässrige Lösungen. Diese Zusammensetzungen können auch Hilfsstoffe, insbesondere Benetzungsmittel, isotonisierende Mittel, Emulgatoren, Dispersionsmittel und Stabilisatoren enthalten. Die Sterilisation kann auf mehrere Arten erfolgen, beispielsweise durch aseptisierende Filtration, indem man der Zusammensetzung sterilisierende Mittel beimengt, durch Bestrahlung. Sie können auch in Form von sterilen festen Zusammensetzungen hergestellt werden, die zum Zeitpunkt der Verwendung in sterilem Wasser oder jedem anderen injizierbaren sterilen Medium aufgelöst werden können.
Als feste Zusammensetzungen für eine orale Verabreichung können Tabletten, Pillen, Pulver (Gelatinekapseln, -briefchen) oder Granulate verwendet werden. In diesen Zusammensetzungen wird der Wirkstoff mit einem oder mehreren inerten Verdünnungsmitteln, wie Stärke, Cellulose, Saccharose, Lactose oder Siliciumdioxid, unter einem Argonstrom gemischt. Diese Zusammensetzungen können auch andere Substanzen als die Verdünnungsmittel umfassen, beispielsweise ein oder mehrere Gleitmittel, wie Magnesiumstearat oder Talk, ein Mittel, das die Absorption im Mund begünstigt, einen Farbstoff, ein Umhüllungsmittel (Dragees) oder einen Lack.
Als flüssige Zusammensetzungen für eine orale Verabreichung kann man pharmazeutisch annehmbare Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Sirups und Säfte verwenden, die inerte Verdünnungsmittel, wie Wasser, Ethanol, Glycerin, Pflanzenöle oder Paraffinöl, enthalten. Diese Zusammensetzungen können andere Substanzen als die Verdünnungsmittel umfassen, beispielsweise Benetzungsmittel, Süßstoffe, Verdickungsmittel, Aromen oder Stabilisatoren.
Die Zusammensetzungen für eine rektale Verabreichung sind die Zäpfchen oder die Rektalkapseln, die außer dem Wirkstoff Hilfsstoffe, wie Kakaobutter, halbsynthetische Glyceride oder Polyethylenglykole enthalten.
Die Zusammensetzungen für eine topische Anwendung können beispielsweise Cremes, Lotionen, Augentropfen, Mund- und Rachenantiseptika, Nasentropfen oder Aerosole sein.
Die Dosen hängen von der gewünschten Wirkung, der Dauer der Behandlung und dem verwendeten Verabreichungsweg ab; sie liegen im Allgemeinen zwischen 0,5 mg und 10 mg pro kg pro Tag subkutan, also 3 bis 60 mg pro Tag für einen Erwachsenen von 60 kg.
Im Allgemeinen bestimmt der Arzt die geeignete Dosierung in Abhängigkeit von dem Alter, dem Gewicht und allen anderen dem zu behandelnden Patienten eigenen Faktoren.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Oligosaccharide für die Herstellung eines Medikaments, das sich für die Prophylaxe oder die Behandlung von Erkrankungen eignet, die mit einem entzündlichen Prozess, der die Produktion von Stickoxid (NO) einschließt, zusammenhängen, oder sich für das Überleben und das Wachstum von Motoneuronen eignet.
Die Erfindung ist besonders vorteilhaft für die Verwendung der Oligosaccharide der Formel (I) für die Herstellung von Medikamenten, die sich für die Prophylaxe und die Behandlung der zerebralen, kardialen oder peripheren vaskulären Ischämien, von Osteoarthritiserkrankungen, der Traumen des zentralen Nervensystems, der Schädel-Hirn-, spinalen und cranio-spinalen Traumen, der Multiplen Sklerose, der neuropathischen Schmerzen und der peripheren Neuropathien, der Motoneuronerkrankungen, der amyotrophen Lateralsklerose, von Neuro-AIDS, der Alzheimerkrankheit, der Parkinsonkrankheit und von Chorea Huntington eignen.
Die Erfindung betrifft auch das Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Krankheiten, die mit einem entzündlichen Prozess zusammenhängen, der die Produktion von cytotoxischen Substanzen, wie Stickoxid (NO), einschließt, und der Krankheiten, die mit dem Überleben und dem Wachstum der Motoneuronen zusammenhängen. Die Oligosaccharide der Formel (I) können so für die Prophylaxe und/oder die Behandlung der neurodegenerativen Erkrankungen verwendet werden, für die die zerebrale Entzündung eine lebensgefährliche Rolle, die zum Tod führen kann, spielt, unter denen man anführen kann die zerebralen Ischämien, die kardialen Ischämien (Myokardinfarkt), die peripheren Ischämien, die Traumen des zentralen Nervensystems und insbesondere die Schädel-Hirn-, spinalen und cranio-spinalen Traumen, die Multiple Sklerose, die neuropathischen Schmerzen und die peripheren Neuropathien, die Motoneuronerkrankungen, wie die amyotrophe Lateralsklerose, die progressive spinale Muskelatrophie, die infantile Muskelatrophie und die primäre Lateralsklerose, Neuro-AIDS, die Alzheimer-Krankheit, die Parkinson-Krankheit und Chorea Huntington und bestimmte Formen von Osteoartrithis, insbesondere mit Lokalisierung in den Gelenken.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch das Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung der motoneuronalen Erkrankungen, wie die amyotrophe Lateralsklerose, die progressive spinale Muskelatrophie, die infantile Muskelatrophie und die primäre Lateralsklerose.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend als Wirkstoff ein Oligosaccharid der Formel:
worin n eine ganze Zahl von 0 bis 25 ist, R₁, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₈, die gleich oder verschieden sind, ein Wasserstoffatom oder einen SO₃M-Rest darstellen, R₂ und R₇, die gleich oder verschieden sind, ein Wasserstoffatom oder einen SO₃M- oder COCH₃-Rest darstellen und M Natrium, Calcium, Magnesium oder Kalium ist, oder ein Gemisch dieser Oligosaccharide mit Ausnahme derjenigen, für die n gleich 0 ist und entweder R₁, R₆ und R₈ Wasserstoffatome sind, R₇ einen SO₃M- oder COCH₃-Rest darstellt und M Natrium ist, oder R₁ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen, R₇ einen COCH₃-Rest darstellt, R₈ einen SO₃M-Rest darstellt und M Natrium ist, oder R₆ einen Wasserstoff darstellt, R₁, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen und M Natrium ist, oder R₆ und R₇ Wasserstoffatome darstellen, R₁ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen und M Natrium ist, oder R₁, R₆ und R₇ ein Wasserstoffatom darstellen, R₈ einen SO₃M-Rest darstellt und M Natrium ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, enthaltend ein Oligosaccharid der Formel (I), worin R₄ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen, oder ein Gemisch dieser Oligosaccharide.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, enthaltend ein Oligosaccharid der Formel (I), worin n eine ganze Zahl von 0 bis 10 ist, ein Gemisch dieser Oligosaccharide.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, enthaltend ein Oligosaccharid der Formel (I), worin n eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist, ein Gemisch dieser Oligosaccharide.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, enthaltend ein Oligosaccharid der Formel (I), worin n eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist, ein Gemisch dieser Oligosaccharide.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, enthaltend ein Oligosaccharid der Formel (I), worin n gleich 1 ist, R₁, R₂, R₃, R₅, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen, R₄ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen und M Natrium ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, enthaltend ein Oligosaccharid der Formel (I), worin n gleich 2 ist, R₁, R₂, R₃, R₅, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen, R₄ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen und M Natrium ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, enthaltend ein Oligosaccharid der Formel (I), worin n gleich 3 ist, R₁, R₂, R₃, R₅, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen, R₄ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen und M Natrium ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, enthaltend ein Oligosaccharid der Formel (I), worin n gleich 4 ist, R₁, R₂, R₃, R₅, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen, R₄ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen und M Natrium ist.
Oligosaccharid der Formel:
worin n eine ganze Zahl von 0 bis 25 ist, R₁, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₈, die gleich oder verschieden sind, ein Wasserstoffatom oder einen SO₃M-Rest darstellen, R₂ und R₇, die gleich oder verschieden sind, ein Wasserstoffatom oder einen SO₃M- oder COCH₃-Rest darstellen und M Natrium, Calcium, Magnesium oder Kalium ist, mit Ausnahme derjenigen, für die n gleich 0 ist und entweder R₁, R₆ und R₈ Wasserstoffatome sind, R₇ einen SO₃M- oder COCH₃-Rest darstellt und M Natrium ist, oder R₁ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen, R₇ einen COCH₃-Rest darstellt, R₈ einen SO₃M-Rest darstellt und M Natrium ist, oder R₆ einen Wasserstoff darstellt, R₁, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen und M Natrium ist, oder R₆ und R₇ Wasserstoffatome darstellen, R₁ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen und M Natrium ist, oder R₁, R₆ und R₇ ein Wasserstoffatom darstellen, R₈ einen SO₃M-Rest darstellt und M Natrium ist.
Oligosaccharid der Formel (I) gemäß Anspruch 10, worin R₄ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen.
Oligosaccharid der Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 10 oder 11, worin n eine ganze Zahl von 0 bis 10 ist.
Oligosaccharid der Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 10 oder 11, worin n eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist.
Oligosaccharid der Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 10 oder 11, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist.
Oligosaccharid der Formel (I) gemäß Anspruch 10, worin n gleich 1 ist, R₁, R₂, R₃, R₅, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen, R₄ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen und M Natrium ist.
Oligosaccharid der Formel (I) gemäß Anspruch 10, worin n gleich 2 ist, R₁, R₂, R₃, R₅, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen, R₄ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen und M Natrium ist.
Oligosaccharid der Formel (I) gemäß Anspruch 10, worin n gleich 3 ist, R₁, R₂, R₃, R₅, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen, R₄ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen und M Natrium ist.
Oligosaccharid der Formel (I) gemäß Anspruch 10, worin n gleich 4 ist, R₁, R₂, R₃, R₅, R₇ und R₈ einen SO₃M-Rest darstellen, R₄ und R₆ ein Wasserstoffatom darstellen und M Natrium ist.
Verfahren zur Herstellung der Oligosaccharide der Formel (I) gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Alkalimetall- oder quartäres Ammonium-borhydrid mit Oligosacchariden der Formel:
worin n eine ganze Zahl von 0 bis 25 ist, R₁, R₃, R₄ und R₅, die gleich oder verschieden sind, ein Wasserstoffatom oder einen SO₃M-Rest darstellen, R₂ und R₆, die gleich oder verschieden sind, ein Wasserstoffatom oder einen SO₃M- oder COCH₃-Rest darstellen und M Natrium, Calcium, Magnesium oder Kalium ist, umsetzt und die Oligosaccharide isoliert.
Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reaktion in wässrigem Medium bei einer Temperatur nahe 25°C und bei einem pH von 7 bis 10 ausführt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19 und 20, dadurch gekennzeichnet, dass der pH der Reaktion 9 bis 10 beträgt.
Verfahren gemäß Ansprüchen 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Alkalimetall- oder quartäre Ammonium-borhydrid Lithium-, Natrium-, Kalium- oder Tetrabutylammonium-borhydrid ist.
Verwendung der Oligosaccharide der Formel:
worin n eine ganze Zahl von 0 bis 25 ist, R₁, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₈, die gleich oder verschieden sind, ein Wasserstoffatom oder einen SO₃M-Rest darstellen, R₂ und R₇, die gleich oder verschieden sind, ein Wasserstoffatom oder einen SO₃M- oder COCH₃-Rest darstellen und M Natrium, Calcium, Magnesium oder Kalium ist, oder eines Gemischs dieser Oligosaccharide für die Herstellung eines Medikaments, das sich für die Prophylaxe oder die Behandlung von Erkrankungen eignet, die mit einem entzündlichen Prozess, der die Produktion von Stickoxid (NO) einschließt, zusammenhängen.
Verwendung der Oligosaccharide der Formel (I) gemäß Anspruch 23 für die Herstellung von Medikamenten, die sich eignen für die Prophylaxe und die Behandlung der zerebralen, kardialen oder peripheren vaskulären Ischämien, von Osteoarthritiserkrankungen, der Traumen des zentralen Nervensystems, der Schädel-, spinalen oder cranio-spinalen Traumen, der Multiplen Sklerose, der neuropathischen Schmerzen und der peripheren Neuropathien, der Motoneuronerkrankungen, der amytrophen Lateralsklerose, von Neuro-AIDS, der Alzheimerkrankheit, der Parkinsonkrankheit und von Chorea Huntington.
Verwendung der Oligosaccharide der Formel (I)
worin n eine ganze Zahl von 0 bis 25 ist, R₁, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₈, die gleich oder verschieden sind, ein Wasserstoffatom oder einen SO₃M-Rest darstellen, R₂ und R₇, die gleich oder verschieden sind, ein Wasserstoffatom oder einen SO₃M- oder COCH₃-Rest darstellen und M Natrium, Calcium, Magnesium oder Kalium ist, oder eines Gemischs dieser Oligosaccharide für die Herstellung eines Medikaments für die Prophylaxe und/oder die Behandlung der Erkrankungen, die mit dem Überleben und dem Wachstum der Motoneuronen zusammenhängen.