EA004768B1

EA004768B1 - Фармацевтические композиции, содержащие олигосахариды, и их получение

Info

Publication number: EA004768B1
Application number: EA200201024A
Authority: EA
Inventors: Пьер Мурье; Элизабет Перрэн; Кристиан Висков
Original assignee: Авентис Фарма С.А.
Priority date: 2000-03-28
Filing date: 2001-03-26
Publication date: 2004-08-26
Also published as: DE60109279T2; MXPA02009455A; PL357301A1; CN1426419A; PT1272499E; ES2236206T3; CA2403906A1; PL204419B1; HUP0300330A2; EE200200551A; NO20024590D0; KR20030001394A; YU72802A; FR2807043B1; FR2807043A1; EP1272499A1; CN1183149C; NZ521558A; HK1056564A1; AR034251A1

Abstract

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим в качестве действующего начала олигосахарид формулыили смесь этих олигосахаридов, к новым олигосахаридам формулы (I), их смесям и способам их получения.

Description

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим в качестве действующего начала олигосахарид формулы

или смесь этих олигосахаридов, к новым олигосахаридам формулы (I), их смесям и способам их получения.

В формуле (I) η обозначает целое число от 0 до 25, К₁, К₃, Кд, К₅, Кб и К₈, одинаковые или разные, обозначают атом водорода или радикал 8О₃М, К₂ и К₇, одинаковые или разные, обозначают атом водорода или радикал 8О₃М или СОСН₃ и М обозначает натрий, кальций, магний или калий.

Таким образом, эти олигосахариды включают четное число сахаридов.

В формуле (I) Кд и К₆ предпочтительно являются атомами водорода.

Олигосахариды формулы (I), для которых η равно 0 и либо Κι, Кб и К₈ обозначают атом водорода, К₇ обозначает радикал 8О₃М или СОСН₃, и М обозначает натрий, либо К и Кз обозначают атом водорода, К7 обозначает радикал СОСН₃, К₈ обозначает радикал 8О₃М, и М обозначает натрий, либо К_б обозначает атом водорода, К.1, К₇ и К₈ обозначают радикал 8О₃М, и М обозначает натрий, уже были описаны в статье О.Н. ТЕЕ е! со11., I. СЕгошаБ, 212, 65-73 (1981), но никаких фармакологических свойств указанных продуктов не было описано.

Олигосахариды формулы (I), для которых η равно 0 и либо К_б и К₇ обозначают атомы водорода, К1 и К8 обозначают радикал 8О3М, и М обозначает натрий, либо К₁, К_б и К₇ обозначают атом водорода, К₈ обозначает радикал 8О₃М, и М обозначает натрий, описаны в статье М.У. ΜΕ'Ι,ΕΑΝ е! со11., Еиг. I. ВюсЕеш., 1984, 145, б07, без какого-либо указания на фармакологическую активность.

Предпочтительными фармацевтическими композициями являются композиции, содержащие олигосахарид формулы (I), для которого η обозначает целое число от 0 до 10, в частности от 0 до б и еще более конкретно от 1 до 6;

К₁, К₂, К₃, К₅, К₇, К₈ могут быть одинаковыми или разными и обозначают атом водорода или радикал 8О₃М, и в частности К₁, К₂, К₃, К₅, К7, К8 представляют радикалы 8О3М;

М представляет натрий.

Особенно предпочтительными фармацевтическими композициями являются композиции, содержащие олигосахарид формулы (I), для которого η равно 0, К₁, К₇ и К₈ обозначают радикал 8О3М, Кб обозначает атом водорода, и М представляет натрий, η равно 1, К₁, К₂, К₃, К₅, К₇ и К₈ обозначают радикал 8О₃М, К_д и Кз обозначают атом водорода и М представляет натрий;

η равно 2, К₁, К₂, К₃, К₅, К₇ и К₈ обозначают радикал 8О₃М, К_д и Кз обозначают атом водорода, и М представляет натрий;

η равно 3, К₁, К₂, К₃, К₅, К₇ и К₈ обозначают радикал 8О₃М, К_д и Кз обозначают атом водорода, и М представляет натрий;

η равно 4, К₁, К₂, К₃, К₅, К₇ и К₈ обозначают радикал 8О₃М, К_д и Кз обозначают атом водорода, и М представляет натрий.

Олигосахариды формулы (I), за исключением тех, для которых η равно 0 и либо К₁, К, и К8 обозначают атом водорода, К7 обозначает радикал 8О₃М или СОСН₃, и М обозначает натрий, либо К₁ и Кз обозначают атом водорода, К7 обозначает радикал СОСН3, К8 обозначает радикал 8О₃М, и М обозначает натрий, либо Кз обозначает водород, К₁, К₇ и К₈ обозначают радикал 8О₃М, и М обозначает натрий, либо К_з и К7 обозначают атомы водорода, К1 и К8 обозначают радикал 8О₃М, и М обозначает натрий, либо К.1, К и К₇ обозначают атом водорода, К₈обозначает радикал 8О₃М, и М обозначает натрий, являются новыми и в качестве таковых входят в изобретение.

Олигосахариды формулы (I) могут быть получены действием боргидрида щелочного металла или четвертичного аммония на олигосахариды формулы

в которой η представляет целое число от 0 до 25, Кд, К₃, К_д, К₅, К и К₈, одинаковые или разные, обозначают атом водорода или радикал 8О3М, К2 и К7, одинаковые или разные, обозначают атом водорода или радикал 8О₃М или СОСН₃, и М обозначает натрий, кальций, магний или калий.

Упомянутую реакцию осуществляют в водной среде при температуре, близкой к 25°С, при рН в интервале от 7 до 10, предпочтительно от 9 до 10, в течение всей продолжительности реакции. Поддержания рН достигают добавлением раствора гидроксида натрия с концентрацией 0,5 моль/л. Реакцию прекращают подкислением реакционной среды, например, путем добавления уксусной кислоты до получения рН в интервале от 4 до 5.

В качестве боргидрида щелочного металла можно назвать боргидрид лития, натрия и калия.

В качестве боргидрида четвертичного аммония можно назвать боргидрид тетрабутиламмония.

Олигосахариды формулы (II) могут быть получены разделением смеси олигосахаридов (III), полученной ферментативной деполимеризацией гепарина, или щелочной деполимеризацией сложного бензилового эфира гепарина, или сложного бензилового эфира полусинтетического гепарина методом гель-хроматографии.

Указанную хроматографию осуществляют на колонках, заполненных гелем типа полиакриламид-агароза, таким как гель, поставляемый под маркой и11годе1 АСА202^Р (Вюкерта). Предпочтительно используют батарею колонок с полиакриламид-агарозным гелем. Число используемых колонок выбирают в зависимости от объема, геля и разделяемых олигосахаридов. Смесь элюируют раствором, содержащим фосфатный буфер и хлорид натрия. Предпочтительно раствор фосфатного буфера представляет собой раствор 0,02 моль/л ΝαΗ₂Ρ0.₁/Να₂ΗΡ0.₁(рН 7), содержащий 0,1 моль/л хлорида натрия. Детекцию различных фракций осуществляют методами УФ (254 Нм)-спектрометрии и ионной спектрометрии ДВР). Фракции, полученные таким образом, в случае необходимости, затем могут быть очищены, например, при помощи анионообменной хроматографии с сильным взаимодействием (8АХ-хроматографии Шгопд ашои ехсйаиде)) согласно методам, известным специалисту, и в частности согласно методам, описанным в статьях К.С. Рюе. Ρ.Ι. ЫпйагФ, СатЬойуйга!е Кекеатсй, 190, 219-233 (1989), А. Ьатик)аег, 8.Н. Наикеи, Р.В. Ойегдаатб, СатЬойубга!е Рекеатсй, 266, 37-52 (1995), и в международном патенте \¥О 90/01501 (пример 2). Затем фракции лиофилизуют, потом обессоливают на колонке, заполненной гелем, такой как колонка с гелем 8ерйабех С10^Р (Рйагтааа ВюсйетюаЕ).

Когда очистка методом 8АХхроматографии не осуществляется, лиофилизованные вещества, в случае необходимости, могут быть очищены простым или дробным осаждением согласно методам, известным специалисту, и в частности согласно методу, описанному во французском патенте РР 2548672. Обычно действуют согласно следующему протоколу.

Очищаемую лиофилизованную фракцию растворяют при 25°С приблизительно в десяти объемах дистиллированной воды. Добавлением метанола или этанола осаждают желаемый олигосахарид, контролируя его обогащение хроматографически, методом ВЭЖХ (Высокоэффективная Жидкостная Хроматография). Добавка метанола или этанола устанавливается в зависимости от степени чистоты и желаемого выхода вышеупомянутого олигосахарида. Также данная операция может быть осуществлена в несколько последовательных стадий, исходя из начального раствора лиофилизованного вещества. Для этого добавку, понижающую раствори мость (метанол или этанол), добавляют небольшими порциями и после каждого добавления выделяют полученный осадок. Осадки, полученные таким образом, анализируют методом ВЭЖХ. Соответственно степени чистоты и желаемому выходу объединяют тождественные фракции осадка.

Согласно варианту настоящего изобретения очищаемая лиофилизованная фракция может быть растворена в 10-200 объемах воды, содержащей от 0 до 30% ацетата натрия. Процентное содержание ацетата натрия должно быть предварительно установлено в зависимости от природы очищаемого олигосахарида (зависимость от размера). Добавлением метанола осаждают желаемый олигосахарид, контролируя его обогащение методом ВЭЖХ. Добавку метанола устанавливают в зависимости от степени чистоты и желаемого выхода вышеупомянутого олигосахарида. Также данная операция может быть осуществлена в несколько последовательных стадий, исходя из начального раствора лиофилизованного вещества. Для этого добавку, понижающую растворимость (метанол), добавляют небольшими порциями и после каждого добавления выделяют полученный осадок. Осадки, полученные таким образом, анализируют методом ВЭЖХ. Соответственно степени чистоты и желаемому выходу объединяют тождественные фракции осадка.

Для промежуточных продуктов формулы (II), для которых и=0, 1 или 2, предпочтительно исходить из смеси (III), полученной ферментативной деполимеризацией.

Упомянутую деполимеризацию осуществляют с помощью гепариназы I (ЕС 4.2.2.7) в среде фосфатного буферного раствора с рН 7 в присутствии хлорида натрия и БСА (В 8 А) (бычий сывороточный альбумин) при температуре, находящейся в интервале от 10 до 18°С, предпочтительно при 15°С, в течение времени от 8 до 10 дней, предпочтительно 9 дней. Деполимеризацию прекращают, например, нагреванием реакционной среды при 100°С в течение 2 мин и выделяют смесь лиофилизацией. Предпочтительно использовать 7 МЕ гепариназы I на 25 г гепарина. Фосфатный буферный раствор содержит обычно 0,05 моль/л NаН₂РО₄/Nа₂НРО₄ (рН 7) в присутствии 0,1 моль/л хлорида натрия. Концентрация БСА составляет обычно 2%.

Для промежуточных продуктов формулы (II), для которых и=0, 1, 2, 3 или 4, предпочтительно исходить из смеси (III), полученной деполимеризацией сложного бензилового эфира гепарина.

Сложный бензиловый эфир гепарина может быть получен согласно методам, описанным в патентах И8 5389618, ЕР 40144, РР 2548672.

Степень этерификации будет составлять преимущественно от 50 до 100%. Предпочтительно она будет составлять от 70 до 90%.

Деполимеризацию осуществляют в водной среде при помощи гидроксида щелочного металла (например, гидроксида лития, натрия, калия или цезия) или гидроксида четвертичного аммония (например, гидроксида тетрабутиламмония), предпочтительно при молярности в интервале от 0,1 до 0,2 моль/л при температуре в диапазоне от 40 до 80°С в течение времени от 5 до 120 мин. В предпочтительном варианте реакцию осуществляют в течение 5-15 мин при температуре в диапазоне от 60 до 70°С с раствором 0,15 моль/л гидроксида натрия. Реакцию деполимеризации прекращают путем нейтрализации добавлением кислоты, такой как уксусная кислота. После добавления 10 мас.% на объем ацетата натрия смесь олигосахаридов осаждают добавлением метанола, предпочтительно 2 объемов на 1 объем реакционной смеси, и фильтруют.

Согласно предпочтительному аспекту изобретения смесь олигосахаридов, полученную после химической деполимеризации в форме водного раствора, обогащают ультрафильтрацией через мембраны с соответствующим номинальным порогом разделения (типа РеШеои из регенерированной целлюлозы, поставляемой фирмой Мййроге); при этом тип мембраны выбирают в зависимости от типа обогащаемых олигосахаридов, подлежащих выделению. Для олигосахаридов (II), для которых п=0, используют мембрану с номинальным порогом разделения 1 кДа, для олигосахаридов (II), для которых п=1, используют мембрану с номинальным порогом разделения 1 или 3 кДа, для олигосахаридов (II), для которых п=2, используют мембрану с номинальным порогом разделения 3 кДа, для олигосахаридов (II), для которых п=3 или 4, используют мембрану с номинальным порогом разделения 5 кДа. В ходе указанной операции фильтрат выделяют, а остаток после фильтрования выбрасывают. Таким образом, доля обогащенного продукта может составлять от 50 до 10% от исходной смеси олигосахаридов при содержании желаемого олигосахарида по меньшей мере 80%.

Для промежуточных продуктов формулы (II), для которых п принимает значения от 0 до 25, предпочтительно исходить из смеси (III), полученной деполимеризацией сложного бензилового эфира полусинтетического сульфатированного полисахарида. Сложный бензиловый эфир полусинтетического сульфатированного полисахарида получают на основе полусинтетических сульфатированных полисахаридов, полученных на основе полисахарида К5, согласно методам, описанным в международных патентах ^094/29352 и \У096/14425. Условия этерификации, деполимеризации и выделения являются теми же самыми, что условия, описанные перед этим для сложного бензилового эфира гепарина.

Во всех предыдущих способах исходный гепарин может быть по природе свиным, овечьим, козьим или бычьим и может происходить из слизи, легких или кожи животных.

Предпочтительно используют гепарин из свиной или овечьей слизи или из легких быка и, еще более предпочтительно, свиной слизи или легких быка.

Олигосахариды формулы (I) обладают противовоспалительными свойствами и, следовательно, могут быть использованы для профилактики или лечения заболеваний, связанных с воспалительным процессом, вовлекающим продукцию цитотоксических веществ, таких как монооксид азота (N0), индуцируемая форма которого выделяется, в частности, нейтрофилами или макрофагами, когда они мигрируют и активированы на уровне ткани. Миграция, активация и адгезия нейтрофила происходят на уровне тканевых зон, пораженных ишемией вследствие окклюзии или спазма артерии, васкуляризирующей данную ткань. Упомянутые ишемии могут происходить или на церебральном уровне (нарушение мозгового кровообращения), или на уровне миокарда (инфаркты миокарда), или на уровне нижних конечностей (ишемии, называемые периферическими). Олигосахариды формулы (I) могут также быть использованы для профилактики и/или лечения нейродегенеративных заболеваний, для которых церебральное воспаление играет губительную роль, способную привести к смерти, среди которых можно назвать церебральные ишемии, сердечные ишемии (инфаркты миокарда), периферические ишемии, повреждения центральной нервной системы, и в частности черепномозговые, спинно-мозговые и черепно-спинномозговые травмы, рассеянный склероз, невропатические боли и периферические невропатии, заболевания мотонейронов, среди которых боковой амиотрофический склероз, прогрессирующая спинальная атрофия, детская мышечная атрофия и первичный боковой склероз, нейроСПИД, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и хорея Гентингтона и некоторые формы остеоартритов, в частности суставной локализации.

Противовоспалительная активность данных продуктов показана ш νίνο в тесте на продукцию ΝΟ_Χ (нитрит и нитрат), индуцированную липополисахаридом (ЛПС) (ЬР8), происходящим из Е. сой, согласно протоколу, описанному в статьях: М. УАМА8НПА е! со11., Еиг. 1. Рйагтасо1., 338, 2, 151-158 (1997), или ТЕ. ЗНЕЬЫТО е! со11., Ат. 1. Векрй. Се11 Мо1. Бю1., 13, 1, 45-53 (1995).

Самцам мышей СП1 (Сйаг1ек КВег, 25-35 г) в момент времени Т0 внутривенно вводят болюс

0,5 мг/кг олигосахарида, в момент времени Т+15 мин подкожно вводят 1 или 2 мг/кг олигосахарида. В момент времени Т+30 мин вводят 100 мг/кг липополисахарида ЛПС (ЪР8), происходящего

Ί из Ε. со11 (81дта Ь3129, серотип 0127:В8). В момент времени Т+3 ч вновь подкожно вводят 1 или 2 мг/кг олигосахарида. В момент времени Т+5 ч 30 мин берут пробу крови глазной пункцией и концентрации NΟ_x (нитрита и нитрата) в плазме определяют колориметрическим методом Грисса (Спекк) после восстановления нитрата в нитрит нитратредуктазой следующим образом: 12 мл пробы плазмы смешивают с 88 мл деионизованной воды и инкубируют в темноте 1 ч при комнатной температуре с 40 мл фосфатного буфера (0,31 М, рН 7,5), 20 мл β-НАДФВ (ΝΑΟΡΗ) (никотинамид-аденин-динуклеотидфосфат восстановленный) (0,86 мМ), 20 мл ФАД (ΕΌΑ) (флавинадениндинуклеотид) (0,11 мМ) и 20 мл нитратредуктазы (2Е/мл) (2И/т1) (Воейппдег Маппйет). Для осаждения протеинов добавляют 10 мл ΖηδΟ₄ (1М), после чего пробы центрифугируют при 20000 д в течение 5 мин. Наконец, 50 мл супернатанта инкубируют 10 мин при комнатной температуре со 100 мл реактива Грисса (1% сульфаниламида в смеси фосфорная кислота/нафтиэтилендиамин 0,1% в деионизованной воде (об./об.)). Оптические плотности считывают при 540 нм на спектрофотометре для чтения микропланшетов; каждую точку определяют 2 раза. Для колориметрического метода в качестве стандарта используют КИО₃ и ΝαΝΟ₂.

В данном тесте олигосахариды согласно изобретению ингибируют образование №З_х более чем на 50%.

С другой стороны, олигосахариды формулы (I) увеличивают выживаемость и рост мотонейронов и, следовательно, особенно полезны для профилактики и/или лечения мотонейрональных заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз, прогрессирующая спинальная атрофия, детская мышечная атрофия, первичный боковой склероз.

Известно, что культуры мотонейронов погибают в результате апоптоза, если они получены в отсутствие трофического носителя (ΒΌΝΕ, ΝΤ5, например). Теперь было обнаружено, что олигосахариды согласно изобретению дают возможность для выживания и роста мотонейронов. Указанная активность была протестирована на сокультурах астроцитов и мотонейронов, лишенных нейротрофического фактора, согласно следующему протоколу.

Культуры, обогащенные мотонейронами

Культуры, обогащенные мотонейронами, получают, используя метод центрифугирования, описанный в статье КЬ. δΟΗΝΑΑΚ, А.Е. δΟΗΑΕΕΝΕΒ, 1. №иго8С1., 1, 204-217 (1981), и модифицированный в статье А. САМИ, С.Е. ΗΕΝΏΕΒ8ΟΝ, 1. №игокск МеФойк, 44, 59-70 (1992). Спинной мозг эмбрионов крыс Е15 стерильно препарируют и освобождают от спинномозговых дорсальных хорд. Затем их разрезают и инкубируют 15 мин при 37°С в ΡΒ8 (солевой фосфатный буфер: №1С1 137 мМ, КС1 2,68 мМ, Ν;·ι₂ΗΡΟ₄ 6,45 мМ, КН₂РО₄ 1,47 мМ), в который добавляют 0,05% трипсина. Разъединение клеток завершают растиранием концом пипетки объемом 1 мл в культуральной среде, к которой добавлены 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,1 мг/мл ДНКазы. Суспензию клеток наносят на полоску с метризамидом 6,5% масса/объем в среде Ь15 (поставляемой С1Ько ΒΚΕ) и центрифугируют при 500 д в течение 15 мин. Область межфазной границы, содержащую мотонейроны, выделяют, растворяют в среде Ь15 и инкубируют 45 мин при комнатной температуре в чашках для культур, на которые предварительно были нанесены анти-1дС мыши и супернатант гибридомы МС192 (С.Е. Сйапб1ег е1 со11., 1. Вю1. Сйет., 259, 6882 (1984)). Суспендированные клетки промывают средой Ь15 и мотонейроны элюируют при слабом перемешивании супернатантом гибридомы МС192. Мотонейроны наносят с плотностью 650 клеток на 24 мм в чашки для культур на монослои астроцитов в среде Ь15, в которую добавлены бикарбонат натрия (22 мМ), коальбумин (0,1 мг/мл), путресцин (0,1 мМ), инсулин (5 мкг/мл), селенит натрия (31 нМ), глюкоза (20 мМ), прогестерон (21 нМ), пенициллин (100 МЕ/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл). Культуры сохраняют при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО2.

Культура астроцитов спинного мозга

Астроциты получают из эмбрионов крыс согласно слегка модифицированному способу Р.П. Сането и Дж. Де Веллиса (Β.Ρ. 8ΑΝΕΤΟ е1 1. ΌΕ АЕБЫЗ), в книге №игосйет1кйу, а ргасйса1 арргоасй (АД. ΤυΚΝΕΒ е1 Η.8. 8ΐ 1ΟΗΝ) 1КЬ Ргекк, ОхГогй-Аак1ипд1оп ОС, р.27-63 (1987). Спинной мозг эмбрионов крыс стерильно препарируют, освобождают от оболочек и дорсальных ганглиев. От пяти до десяти препаратов спинного мозга помещают в РВ8 (солевой фосфатный буфер: №1С1 137 мМ, КС1 2,68 мМ, №₂ΗΡΟ.·ι 6,45 мМ, КН₂РО₄ 1,47 мМ) и разрезают перед инкубацией при 37°С в течение 25 мин в РВ8, в который добавлено 0,25% трипсина. Ферментативную обработку прекращают добавлением 10 мл модифицированной по способу Дульбекко среды Игла (ОМНМ). в которую добавлено 10% зародышевой телячьей сыворотки (ЕС8), и клетки собирают центрифугированием. Другую стадию механического разъединения осуществляют, используя конец пипетки объемом 1 мл.

Клетки наносят с плотностью 1,5-10⁶ клеток на 25 см² культуральной среды в ОМБМ, содержащую 10% ЕС8. После 2 дней ίη уйго культуры питают каждый день в течение всей продолжительности испытания. Когда получен видимый монослой клеток, культуры перемешивают 48 ч со скоростью 250 об./мин и на следующий день монослои обрабатывают арабинозидом цитозина (10^-5 М) в течение 48 ч. Затем монослои астроцитов амплифицируют при плотности пять на 35 мм на культуральных планшетах для чашек для культивирования площадью 25 см² в начале испытания.

Культуры спинальных астроцитов более чем на 98% состоят из клеток, иммунореактивных для глиального фибриллярного кислотного протеина (ГФКП) (ОЕАР) .

Монослои астроцитов подвергают воздействию либо одного РВ8 (контрольные образцы), либо тестируемого продукта в растворе РВ8 в течение 24 ч при концентрации от 0,1 до 10 нг/мл. Затем монослои астроцитов промывают ΌΜΕΜ и выдерживают 2 ч в культуральной среде, в которую добавлены мотонейроны. Через 2 ч после питания и в течение 2 или 3 дней носитель или тестируемый продукт также добавляют в культуральную среду.

Иммунохимическая идентификация мотонейронов

Клетки фиксируют в (РВ8), содержащем 4% параформальдегида и 0,1% глутарового альдегида (рН 7,4 при 4°С в течение 15 мин). Затем культуры промывают и неспецифические места блокируют 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в РВ8 и 0,1% Ττίΐοη Х100^Я. Упомянутые культуры последовательно инкубируют с антителами р75^ъновт (упоминавшаяся перед этим статья Сйап61ет) в течение ночи при 4°С и с биотинилизованной козьей сывороткой (1/125 01Ьсо) и стрептавиденпероксидазой (1/200 01Ьсо) в течение 60 мин. Антитела определяют визуально, используя реакцию ДАБ/перекись водорода.

Подсчет клеток и статистический анализ

Клетки, иммунореактивные для нейтрофинного рецептора низкой активности р75^1п8& и имеющие нейриты длиной более 4 диаметров клеток, рассматриваются как жизнеспособные мотонейроны. Число мотонейронов оценивают путем подсчета меченых клеток на площади 0,825 см² под микроскопом с увеличением 200 х. Величины выражают как число мотонейронов 2 на см или процент числа мотонейронов, присутствующих в культурах, поддерживаемых в отсутствие трофического фактора, по сравнению с контролем. Опыты осуществляют по меньшей мере 3 раза.

Статистические анализы осуществляют, используя тест Стьюдента (8!ибеп1) (т-тест).

Предварительными обработками олигосахаридами согласно настоящему изобретению число мотонейронов, которые растут на монослое астроцитов, увеличено на 20-50%.

Следующие примеры являются репрезентативными примерами получения олигосахаридов формулы (I) и промежуточных продуктов.

В данных примерах значения сокращений следующие.

ΔΗ: (4-дезокси-2-О-сульфо-а-Ь-трео-гексенопиранозилуроновая кислота)-(1 —4)-2-дезокси2-сульфоамино-6-О-сульфо-а-П-глюкопираноза, тетранатриевая соль или ΔυΑρ28-(1^4)-α-ΌО1сЫр2868

К (2-сульфо-а-Ь-идопиранозилуроновая кислота)-(1 —4)-2-дезокси-2-сульфоамино-6-Осульфо-й-О-глюкопираноза, тетранатриевая соль (2-сульфо-й-Ь-идопиранозилуроновая кислота)(1—4)-2-дезокси-6-О-сульфо-2-сульфоамино-йΌ-глюкопираноза, тетранатриевая соль или α-ЬИоАр28-(1->4)-(/.-1)-0>1с\р2868

П§: (α-Ь-идопиранозилуроновая кислота)(1—4)-2-дезокси-6-О-сульфо-2-сульфоамино-аΌ-глюкопираноза, тринатриевая соль или α-ЬИоАр-(1—4)-α-Ό-ΟΚΝρ2868

III8: (2-сульфо-а-Ь-идопиранозилуроновая кислота)-(1 —4)-2-дезокси-2-сульфоамино-й-Эглюкопираноза, тринатриевая соль или α-ЬИоАр28-(1—4)-а-О-О1с^28

ΙάοΑρ: идопиранозилуроновая кислота

ΟΚΝ|): 2-амино-2-дезоксиглюкопираноза

Δυаρ: 4-дезокси-а-Ь-трео-гексенопиранозилуроновая кислота

8: сульфат

Примеры получения промежуточных смесей формулы (II)

Пример А. Получение олигосахаридов формулы (II), для которых п=0, 1 и 2, ферментативной деполимеризацией и разделением.

Растворяют 25 г гепарина в 250 мл фосфатного буферного раствора, содержащего 0,05 моль/л NаΗ₂РО₄/Nа₂ΗРО₄ (рН=7), 0,2 моль/л хлорида натрия и 2% БСА (В8А) (бычий сывороточный альбумин). Вводят в смесь 7 ΜΕ гепариназы I (ЕС 4.2.2.2.7), полученный раствор охлаждают до 15°С и затем поддерживают при указанной температуре в течение всего времени протекания реакции деполимеризации. За протеканием реакции следят при помощи постепенного отбора проб, анализируемых методом гельпроникающей хроматографии. По истечении 9 дней ферментативную реакцию прекращают, нагревая реакционную среду до 100°С в течение 2 мин. Смесь охлаждают и затем лиофилизуют. Таким образом получают смесь олигосахаридов (III).

Затем полученную смесь олигосахаридов (III) хроматографируют по следующей методике. Хроматографию осуществляют на колонках, заполненных полиакриламид-агарозным гелем, известным под названием и1!тоде1 АСА 202, и смесь элюируют раствором, содержащим фосфатный буфер (0,02 моль/л NаН₂РО₄/Nа₂НРО₄рН=7 и 0,1 моль/л хлорида натрия). Детекцию осуществляют методом УФ (254 нм) и ионной спектрометрии ДВЕ). В случае необходимости продукты могут быть очищены методом 8АХхроматографии (йтопд ашоп ехсйапде) или дробным осаждением по методике, описанной во французском патенте ЕЯ 2548672. Выделенные фракции продукта лиофилизуют, затем обессоливают на колонке, наполненной гелем 8ерйабех О10^к (Рйатташа Вюсйетюак).

Описанным методом получают 3 г дисахарида ΔΚ 1100 мг смеси гексасахаридов, содержащей обычно 55% производного ΔI8-I8-I8, 35%

ΔΙδ-Ιδ-ΙΙδ и 10% ΔΙδ-Ιδ-ΙΙΙδ. Данная последняя смесь может быть очищена методами, известными специалисту, с выделением каждого из компонентов, или может быть использована как таковая для превращения в восстановленные производные формулы (Ι).

Пример В. Получение олигосахаридов формулы (ΙΙ), для которых п=0, 1, 2, 3 или 4, деполимеризацией сложного бензилового эфира гепарина и разделением.

a. Получение сложного бензилового эфира гепарина.

Сложный бензиловый эфир гепарина получают по примеру 3 американского патента И8 5389618.

b. Деполимеризация.

Растворяют 100 г сложного бензилового эфира гепарина в 1,9 л деминерализованной воды. Смесь выдерживают при 60°С при перемешивании. После получения гомогенного раствора однократно вводят приблизительно 35 мл 23%-ного раствора гидроксида натрия. После 10 мин реакции раствор охлаждают и нейтрализуют 80 мл раствора уксусной кислоты, приблизительно 2н. К полученному раствору добавляют 10% мас./объем ацетата натрия. Смесь олигосахаридов осаждают добавлением приблизительно 2 объемов метанола. Осадок выделяют фильтрованием, промывают метанолом в два приема, затем сушат при пониженном давлении при 50°С. После сушки получают 73,8 г смеси олигосахаридов (ΙΙ).

c. Обогащение олигосахаридом, для которого п=1.

Растворяют 30 г смеси олигосахаридов, полученной перед этим, приблизительно в 35 объемах воды. Полученный раствор подвергают ультрафильтрации на мембране 3 кДа (РеШсоп). После извлечения 600 мл отфильтрованного раствора остаток после фильтрования разбавляют 500 мл воды. Операцию проводят до извлечения дополнительных 450 мл отфильтрованного раствора. Обе фракции отфильтрованного раствора объединяют, затем концентрируют досуха при пониженном давлении. Получают 6,1 г твердого желтовато-белого вещества. Анализ твердого вещества методом гельпроникающей хроматографии показывает, что он содержит около 30% олигосахарида формулы (ΙΙ), для которого п=1.

6. Фракционирование смесей олигосахаридов, подвергнутых ультрафильтрации.

Обогащенную смесь фракционируют на колонках, наполненных полиакриламид-агарозным гелем, известным под названием и 11годе1 АСА 202 (используют четыре последовательно соединенные колонки диаметром 10 см и высотой 50 см). В 25 мл воды растворяют 5 г смеси, обогащенной ультрафильтрацией, затем элюируют раствором 0,2 моль/л хлорида натрия со скоростью 5 мл/мин. На выходе из колонки собирают фракции объемом 25 мл, детекцию про дуктов осуществляют методом УФ (254 нм) и ионной спектрометрии (ΙΒΡ). Фракции продукта, для которого п=1, выделяют, лиофилизуют, затем обессоливают на колонке, наполненной гелем 8ер11а6ех 610. После лиофилизации получают 1 г тетрасахарида, содержащего обычно 70% производного ΔΙδ-Ιδ формулы ΙΙ (К₁, Р₂. Р₃.

Р-, Ρ₈=8Ο₃,Ν;·ι; В₄, В₆=Н и Μ=Να). Производное ΔΙδ-Ιδ, в случае необходимости, может быть очищено методом 8АХ-хроматографии Щгопд ашоп ехсйапде) или, согласно предпочтительному аспекту, дробным осаждением по методике, описанной во французском патенте РВ 2548672, и ее варианту, описанному в настоящем изобретении.

Примеры получения олигосахаридов формулы (I)

Пример 1.

В реактор при 25°С вводят раствор 300 мг олигосахарида формулы (ΙΙ), в которой п равно 0, В₁, В₇ и В₈ обозначают радикал 8О₃М, Кб обозначает атом водорода и М представляет натрий, в 2 мл воды. При перемешивании за 1 раз добавляют 212 мг боргидрида натрия. Затем величину рН устанавливают в интервале от 9 до 10 путем добавления раствора 0,5 моль/л гидроксида натрия. По истечении 12 ч постепенно добавляют уксусную кислоту до получения рН в интервале от 4 до 5. Смесь перемешивают 1 ч, затем вновь доводят рН до 6,7 добавлением раствора 0,5 моль/л гидроксида натрия. Затем смесь концентрируют досуха при 50°С при пониженном давлении. Концентрат диспергируют в 10 мл метанола при перемешивании на магнитной мешалке. После осаждения в течение ночи суспензию фильтруют через мембрану \У11а1тап 6Р/В. Твердое вещество на фильтре растворяют, пропуская 2 порции по 10 мл дистиллированной воды. Полученный раствор затем концентрируют досуха при 50°С при пониженном давлении. Получают 580 мг белого твердого вещества. Затем твердое вещество диспергируют в 15 мл метанола при перемешивании на магнитной мешалке. После 30 мин перемешивания суспензию фильтруют через мембрану \У11а1шап 6Р/В. Осадок на фильтре растворяют, пропуская 2 порции по 10 мл дистиллированной воды. Полученный раствор концентрируют досуха при 50°С при пониженном давлении. Получают таким образом 250 мг олигосахарида формулы (Ι), для которого п равно 0, В₁, В₇ и В₈ обозначают радикал 8О₃М, В₆ обозначает атом водорода и М представляет натрий, в форме смеси диастереоизомеров. Записывают от Ι до ΙΙ сахара, образующие дисахариды, при этом Ι представляет восстановленный радикал, а ΙΙ представляет остаток ненасыщенной уроновой кислоты [(4-дезокси-2-О-сульфоа-Ь-трео-гекс-4-енопиранозилуроновая кислота)(1^4)-2-дезокси-6-О-сульфо-2-сульфоамино-Оглюцит, тетранатриевая соль; (4-дезокси-2-О13 сульфо-а-Ь-трео-гекс-4-еноииранозилуроновая кислота)-(1^4)-2-дезокси-6-О-сульфо-2-сульфоамино-Э-маннит, тетранатриевая соль; сиектр ЯМР ¹Н в 1ГО. 600 МГц, Т=305 К, δ в м.д.: 3,38 (1Н, м, Н-2⁽¹⁾), 3,70 и 3,75 (1Н каждый, соответствует дд, 1=6 и 12 Гц и дд, 1=5 и 12 Гц, 2Н-1⁽¹⁾),

3,86 (1Н, т, .1 5 Гц, Н-3⁽¹⁾), 4,13 (1Н, дд, .18 и 11 Гц, Н-6⁽¹⁾), 4,18 (1Н, м, Н-4 ). 4,25 (2Н, м, Н-6⁽¹⁾и Н-3⁽¹¹⁾), 4,35 (1Н, м, Н-5®), 4,65 (1Н, м, Н-2⁽¹¹⁾),

5,67 (1Н, с, Н-1⁽¹¹⁾), 6,00 (1Н, д, И Гц, Н-4⁽¹¹⁾)].

Пример 2.

В реактор при 25°С вводят раствор 60 мг олигосахарида формулы (II), в которой η равно

1, Кд, К₂, К₃, К₅, К₇ и К₈ обозначают радикал 8О₃М, Кд и Кб обозначают атом водорода и М иредставляет натрий, в 1,2 мл воды. При иеремешивании за 1 раз добавляют 18 мг боргидрида натрия. Затем величину рН устанавливают в интервале от 9 до 10 путем добавления раствора 0,5 моль/л гидроксида натрия. По истечении 12 ч постепенно добавляют уксусную кислоту до получения рН в интервале от 4 до 5. Смесь перемешивают 1 ч, затем добавляют 5 мл метанола. Суспензию фильтруют через мембрану ^йа!тап СГ/В, и выделенное твердое вещество промывают 2 раза 0,5 мл метанола. После сушки получают 42 мг олигосахарида формулы (I), для которого η равно 1, К!, К₂, К₃, К₅, К₇ и К₈обозначают радикал 8О₃М, К₄ и К₆ обозначают атом водорода и М представляет натрий, в форме смеси диастереоизомеров. Записывают от I до IV сахара, образующие тетрасахариды, при этом I представляет восстановленный радикал, а IV представляет остаток ненасыщенной уроновой кислоты [(4-дезокси-2-О-сульфо-а-Ь-треогекс-4-енопиранозилуроновая кислота)-(1 ^4)2-дезокси-6-О-сульфо-2-сульфоамино-а-О-глюкопиранозил-(1^4)-2-О-сульфо-а-Ь-идопиранозилуроновая кислота-(1 ^4)-2-дезокси-2-сульфоамино-6-О-сульфо-Э-глюцит, октанатриевая соль; (4-дезокси-2-О-сульфо-а-Ь-трео-гекс-4-енопиранозилуроновая кислота)-(1^4)-2-дезокси-6-О-сульфо-2-сульфоамино-а-О-глюкопиранозил-(1 ^4)2-О-сульфо-а-Ь-идопиранозилуроновая кислота(1^4)-2-дезокси-6-О-сульфо-2-сульфоамино-Оманнит, октанатриевая соль; спектр ЯМР ¹Н в 1ГО. 400 МГц, Т=298 К, δ в м.д.: 3,25 (1Н, дд, 1=10 и 3 Гц, Н-2^(ш)), 3,37 (1Н, м, Н-2®), 3,59 (1Н, м, Н-3^(ш)), 3,75 (2Н, м, 2Н-1®), 3,79 (1Н, т, .19 Гц, Н-4^(ш)), 3,86 (1Н, м, Н-3®), между 4,05 и 4,40 (10Н, массив, Н-4®/Н-5®/2Н-6®, Н-2⁽®/Н-3^(Щ/Н4⁽®), 2Н-6^(Ш), Н-3^а®), 4,58 (1Н, м, Η-2^σ®), 4,60 (1Н, м, Н-5⁽®), 5,27 (1Н, д, .14 Гц, Н-1^(щ), 5,42 (1Н, д, .14 Гц, Η-1^σ®), 5,47 (1Н, д, .12 Гц, НI 5,95 (1Н, д, И Гц, Η-4^σ®)].

Пример 3.

В реактор при 25°С вводят раствор 100 мг олигосахарида формулы (II), в которой η равно

2, К1, К₂, К₃, К₅, К₇ и К₈ обозначают радикал 8О₃М, К₄ и Ке обозначают атом водорода и М представляет натрий, в 2 мл воды. При переме- шивании за 1 раз добавляют 20 мг боргидрида натрия. Затем величину рН устанавливают в интервале от 9 до 10 путем добавления раствора 0,5 моль/л гидроксида натрия. По истечении 12 ч постепенно добавляют уксусную кислоту до получения рН в интервале от 4 до 5. Смесь перемешивают 1 ч, затем вновь доводят рН до 6,7 добавлением раствора 0,5 моль/л гидроксида натрия. Затем смесь разбавляют дистиллированной водой в количестве, достаточном для получения 20 мл. Добавляют 2,5 г ацетата натрия и приливают 3 объема метанола. Суспензию фильтруют через мембрану ^Ьа1тап СГ/В и выделенное твердое вещество промывают 2 раза 2 мл метанола. После сушки получают 61 мг олигосахарида формулы (I), для которого η равно 2, К1, К₂, К₃, К₅, К₇ и К₈ обозначают радикал 8О₃М, К₄ и К₆ обозначают атом водорода и М представляет натрий, в форме смеси диастереоизомеров. Записывают от I до VI сахара, образующие гексасахариды, при этом I представляет восстановленный радикал, а VI представляет остаток ненасыщенной уроновой кислоты [(4-дезокси-2-О-сульфо-а-Ь-трео-гекс-4-енопиранозилуроновая кислота)-(1^4)-2-дезокси-2сульфоамино-6-О-сульфо-а-О-глюкопиранозил(1 ^4)-2-О-сульфо-а-Ь-идопиранозилуроновая кислота-(1^4)-2-дезокси-2-сульфоамино-6-О-сульфо-а-О-глюкопиранозил-(1^4)-2-О-сульфо-а-Ьидопиранозилуроновая кислота-(1 ^4)-2-дезокси-2-сульфоамино-6-О-сульфо-Э-глюцит, додеканатриевая соль; (4-дезокси-2-О-сульфо-а-Ьтрео-гекс-4-енопиранозилуроновая кислота)(1^4)-2-дезокси-6-О-сульфо-2-сульфоамино-аО-глюкопиранозил-(1 ^4)-2-О-сульфо-а-Ь-идопиранозилуроновая кислота-(1^4)-2-дезокси-6О-сульфо-2-сульфоамино-а-О-глюкопиранозил(1 ^4)-2-О-сульфо-а-Ь-идопиранозилуроновая кислота-( 1 ^4)-2-дезокси-6-О-сульфо-2-сульфоамино-Э-маннит, додеканатриевая соль; спектр ЯМР ¹Н в 1)₇О. 600 МГц, Т=305 К, δ в м.д.: 3,25 (2Н, м, Н-2^{(ш) и (}®), 3,38 (1Н, м, Н-2®), 3,61 (2Н, т, 1=10 Гц, Н-3^{(ш) и (}®), между 3,70 и 3,83 (4Н, массив, 2Н-1® и Н-4^{(ш) и (}®) , 3,86 (1Н, т, .1 5 Гц, Н-3®), 4,00 (2Н, м, Н-5^{(ш) и (}®), 4,07 (1Н, м, Н4^®), 4,08 (1Н, м, Н-4®), между 4,10 и 4,45 (13Н, массив, Н- 5®/2Н-6®, НА^/НА^/НМ®/ 2Н-6^(Ш),, кА^/нА®, 2Н-6⁽®, Н-3^(у[)), 4,60 (1Н, с, Н2 4,62 (1Н, с, Н-5⁽®), 4,78 (1Н, с, Н-5³®),

5,17 (1Н, с, Н-1^а®), 5,28 (1Н, д, .14 Гц, Н-1^(щ),

5,38 (1Н, д, .1 3 Гц, Н-1⁽®), 5,44 (1Н, д, .1 3 Гц, Н-1^(ш)), 5,47 (1Н, д, .12 Гц, Н-1®⁴), 5,96 (1Н, д, ,|5 Гц, Н-4¹®·®)].

Пример 4.

В реактор при 25°С вводят раствор 100 мг олигосахарида формулы (II) , в которой η равно

3, Κι, К₂, К₃, К₅, К₇ и К₈ обозначают радикал

8О₃М, К₄ и К₆ обозначают атом водорода и М представляет натрий, в 2 мл воды. При перемешивании за 2 раза добавляют 30 мг боргидрида натрия. Затем величину рН устанавливают в интервале от 9 до 10 путем добавления раствора 0,5 моль/л гидроксида натрия. По истечении 12 ч постепенно добавляют уксусную кислоту до получения рН в интервале от 4 до 5. Смесь перемешивают 1 ч, затем вновь доводят рН до 6,7 добавлением раствора 0,5 моль/л гидроксида натрия. Затем смесь разбавляют дистиллированной водой в количестве, достаточном для получения 20 мл. Добавляют 2 г ацетата натрия и приливают 3 объема метанола. Суспензию фильтруют через мембрану №йа1шаи СЕ/В и выделенное твердое вещество промывают 2 раза 1 мл метанола. После сушки получают 68 мг белого твердого вещества. После контроля методом ЖХВД (СЬНР) (жидкостная хроматография при высоком давлении), если продукт не полностью восстановлен, полностью воспроизводят все предыдущие операции. После сушки получают 45 мг олигосахарида формулы (I), для которого η равно 3, К₁, К₂, К₃, К₅, К₇ и К₈ обозначают радикал 8О₃М, К₄ и К₆ обозначают атом водорода и М представляет натрий, в форме смеси диастереоизомеров. Записывают от I до VIII сахара, образующие октасахариды, при этом I представляет восстановленный радикал, а VIII представляет остаток ненасыщенной уроновой кислоты, [(4-дезокси-2-О-сульфо-а-Ь-треогекс-4-енопиранозилуроновая кислота)-(1 ^4)2-дезокси-6-О-сульфо-2-сульфоамино-а-О-глюкопиранозил-(1^4)-2-О-сульфо-а-Ь-идопиранозилуроновая кислота-(1^4)-2-дезокси-2-сульфоамино-6-О-сульфо-а-Э-глюкопиранозил-(1 ^-4)-2О-сульфо-а-Ь-идопиранозилуроновая кислота(1^4)-2-дезокси-6-О-сульфо-2-сульфоамино-аП-глюкопиранозил-(1^4)-2-О-сульфо-а-Ь-идопиранозилуроновая кислота-(1 ^4)-2-дезокси-6О-сульфо-2-сульфоамино-Э-глюцит, гексадеканатриевая соль; (4-дезокси-2-О-сульфо-а-Ьтрео-гекс-4-енопиранозилуроновая кислота)(1^4)-2-дезокси-6-О-сульфо-2-сульфоамино-аП-глюкопиранозил-(1^4)-2-О-сульфо-а-Ь-идопиранозилуроновая кислота-(1 ^4)-2-дезокси-6О-сульфо-2-сульфоамино-а-Э-глюкопиранозил(1 ^4)-2-О-сульфо-а-Ь-идопиранозилуроновая кислота-(1^4)-2-дезокси-6-О-сульфо-2-сульфоамино-а-О-глюкопиранозил-(1^4)-2-О-сульфоα-Ь-идопиранозилуроновая кислота-(1 ^4)-2дезокси-6-О-сульфо-2-сульфоамино-О-маннит, гексадеканатриевая соль; спектр ЯМР ¹Н в О₂О. 600 МГц, Т=305 К, δ в м.д.: 3,25 (3Н, м, Н-2^(ш), Η-2^(ν), Н-2^(та)), 3,38 (1Н, м, Н-2®), 3,61 (3Н, м, Н-3^(ш), Н-3⁽®, Н-3^(та)), между 3,70 и 3,83 (5Н, массив, 2Н-1® и Н-4^(ш), Η-4^(ν), Н-4^(та)), 3,86 (1Н, т, 1=5 Гц, Н-3®), 4,00 (3Н, м, Н-5^(ш), Н-5⁽®, Н5^(та)), 4,08 (3Н, м, Н-4®, Н-4™ Н-4 ^ν между 4,10 и 4,45 (17Н, массив, Н-5®/2Н-6®, Н-2^(щ/Н3^(П)/Н-4^(П), 2Н-6^(Ш), НА^/НА®, 211-6% Н2^(У[)/Н-3^(У[), 2Н-6^(та), Н-3®^ш)), 4,59 (1Н, с, Н2®^ш)), 4,62 (1Н, с, Н-5⁽®), 4,78 (2Н, с, Н-5^а®, Н5^т)), 5,17 (2Н, с, Н-1^а® Н-1^т)), 5,28 (1Н, д, 1=4 Гц, Н-1^(Щ), 5,38 (2Н, м, Н-1⁽®, Н-1^(та)), 5,44 (1Н, д, 1=3 Гц, Н-1^(ш)), 5,47 (1Н, с, Н-1®^ш)), 5,96 (1Н, д, 1=5 Гц, Н-4®^ш))].

Пример 5.

В реактор при 25°С вводят раствор 65 мг олигосахарида формулы (II), в которой η равно 4, К₁, К₂, К.3, К₅, К₇ и К₈ обозначают радикал 8О₃М, К₄ и К₆ обозначают атом водорода и М представляет натрий, в 1,2 мл воды. При перемешивании за 1 раз добавляют 18 мг боргидрида натрия. Затем величину рН устанавливают в интервале от 9 до 10 путем добавления раствора 0,5 моль/л гидроксида натрия. По истечении 12 ч постепенно добавляют уксусную кислоту до получения рН в интервале от 4 до 5. Смесь перемешивают 1 ч, затем вновь доводят рН до 6,7 добавлением раствора 0,5 моль/л гидроксида натрия. Затем смесь разбавляют 3 мл 10%-ного водного раствора ацетата натрия и приливают 3 объема метанола (12 мл). Суспензию фильтруют и выделенное твердое вещество промывают 3 мл метанола. После сушки получают 54 мг олигосахарида формулы (I), для которого η равно 4, К₁, К₂, К₃, К₅, К₇ и К₈ обозначают радикал 8О₃М, К₄ и К₆ обозначают атом водорода и М представляет натрий, в форме смеси диастереоизомеров. Записывают от I до Х сахара, образующие декасахариды, при этом I представляет восстановленный радикал, а Х представляет остаток ненасыщенной уроновой кислоты (4дезокси-2-О-сульфо-а-Ь-трео-гекс-4-енопиранозилуроновая кислота)-(1^4)-2-дезокси-2-сульфоамино-6-О-сульфо-а-Э-глюкопиранозил-(1 ^4)2-О-сульфо-а-Ь-идопиранозилуроновая кислота(1^4)-2-дезокси-6-О-сульфо-2-сульфоамино-аО-глюкопиранозил-( 1 ^4)-2-О-сульфо-а-Ь-идопиранозилуроновая кислота-(1 ^4)-2-дезокси-6О-сульфо-2-сульфоамино-а-Э-глюкопиранозил(1 ^4)-2-О-сульфо-а-Ь-идопиранозилуроновая кислота-( 1 ^4)-2-дезокси-6-О-сульфо-2-сульфоамино-а-Э-глюкопиранозил-(1^4)-2-О-сульфоα-Ь-идопиранозилуроновая кислота-(1 ^4)-2дезокси-6-О-сульфо-2-сульфоамино-О-глюцит, эйконатриевая соль; (4-дезокси-2-О-сульфо-аЬ-трео-гекс-4-енопиранозилуроновая кислота)(1^4)-2-дезокси-6-О-сульфо-2-сульфоамино-аП-глюкопиранозил-(1^4)-2-О-сульфо-а-Ь-идопиранозилуроновая кислота-(1 ^4)-2-дезокси-6О-сульфо-2-сульфоамино-а-Э-глюкопиранозил(1 ^4)-2-О-сульфо-а-Ь-идопиранозилуроновая кислота-( 1 ^4)-2-дезокси-6-О-сульфо-2-сульфоамино-а-Э-глюкопиранозил-(1^4)-2-О-сульфоα-Ь-идопиранозилуроновая кислота-(1 ^4)-2дезокси-6-О-сульфо-2-сульфоамино-а-Э-глюкопиранозил-(1^4)-2-О-сульфо-а-Ь-идопиранозилуроновая кислота-(1^4)-2-дезокси-6-О-сульфо2-сульфоамино-О-маннит, эйконатриевая соль; спектр ЯМР ¹Н в О₂О, 600 МГц, Т=303 К, δ в м.д.: 3,23 (4Н, м, Н-2^(ш), 11-2 % 11-2 ^ν , Н-2^(к)),

3,35 (1Н, т, Н-2®), 3,59 (4Н, м, Н-3^(ш), Н-3⁽®, Н3^(та), Н-3^(к)), между 3,65 и 3,80 (6Н, м), 3,85 (1Н, м, Н-3®), между 3,90 и 4,40 (29Н, м), 4,57 (1Н, м, Н-2^(х)), 4,59 (1Н, м, Н-5^(п)), 4,75 (3Н, м, Н-5^([¥), Н-5 ^ν . Н-5^(уш)), 5,15 (3Н, м, Н-1^([¥), Н₁ ⁽νι⁾, н-1^(уш)), 5,25 (1Н, м, Н-1^(п)), 5,37 (3Н, м, Н1^(ν), Н-1^(та), Н-1^(к)), 5,42 (1Н, м, Н-1^(ш)), 5,45 (1Н, м, Н-1^(х)), 5,93 (1Н, д, 1=5 Гц, Н-4^(х)).

Лекарственные средства согласно изобретению содержат в качестве действующего начала по меньшей мере один олигосахарид формулы (I) или смесь олигосахаридов формулы (I) в форме композиции, в которой он ассоциирован с любым другим фармацевтически совместимым продуктом, который может быть инертным или физиологически активным. Лекарственные средства согласно изобретению могут быть применены внутривенно, подкожно, перорально, ректально, местно или легочным путем (ингаляция).

Стерильные композиции для внутривенно го или подкожного введения представляют обычно водные растворы. Упомянутые композиции могут, равным образом, содержать добавки, в частности смачиватели, изотонирующие агенты, эмульгаторы, диспергаторы и стабилизаторы. Стерилизация может осуществляться несколькими способами, например асептической фильтрацией, введением в композицию стерилизующих веществ, облучением. Равным образом, они могут быть получены в форме стерильных твердых композиций, которые могут быть растворены в момент применения в стерильной воде или в любой другой стерильной среде, пригодной для инъекции.

В качестве твердых композиций для перорального введения могут быть использованы таблетки, пилюли, порошки (желатиновые капсулы, крахмальные облатки) или гранулы. В указанных композициях действующее начало смешано с одним или несколькими инертными разбавителями, такими как крахмал, целлюлоза, сахароза, лактоза или диоксид кремния, в токе аргона. Эти композиции могут, равным образом, содержать вещества, отличные от разбавителей, например одно или несколько смазывающих веществ, таких как стеарат магния или тальк, агент, способствующий всасыванию в полости рта, краситель, защитную оболочку (драже) или лак.

В качестве жидких композиций для перорального введения можно использовать фармацевтически приемлемые растворы, суспензии, эмульсии, сиропы и эликсиры, содержащие инертные разбавители, такие как вода, этанол, глицерин, растительные масла или парафиновое масло. Эти композиции могут содержать вещества, отличные от разбавителей, например смачиватели, подсластители, загустители, ароматизирующие добавки или стабилизаторы.

Композиции для ректального введения представляют собой суппозитории или ректальные капсулы, которые содержат, помимо действующего вещества, эксципиенты, такие как масло какао, полусинтетические глицериды или полиэтиленгликоли.

Композициями для местного применения могут быть, например, кремы, лосьоны, примочки для глаз, жидкости для обработки глотки, капли для носа или аэрозоли.

Дозы зависят от желаемого эффекта, длительности лечения и используемого пути введения; обычно они составляют от 0,5 до 10 мг на кг в день при подкожном введении или от 3 до з0 мг в день для взрослого с массой тела з0 кг.

Обычно врач должен определять подходящую дозировку в зависимости от возраста, массы тела и всех других факторов, присущих пациенту.

Изобретение касается также применения олигосахаридов согласно изобретению для получения лекарственного средства, используемого для профилактики или лечения заболеваний, связанных с воспалительным процессом, вовлекающим продукцию монооксида азота (N0), или полезного для выживаемости и роста мотонейронов.

Изобретение особенно полезно для использования олигосахаридов формулы (I) для получения лекарственных средств, используемых для профилактики и лечения церебральных, сердечных или периферических сосудистых ишемий, остеоартритов, повреждений центральной нервной системы, черепно-мозговых, спинно-мозговых и черепно-спинно-мозговых травм, рассеянного склероза, невропатических болей и периферических невропатий, заболеваний мотонейронов, бокового амиотрофического склероза, нейро-СПИДа, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и хореи Гентингтона.

Изобретение касается также способа профилактики и/или лечения заболеваний, связанных с воспалительным процессом, вовлекающим продукцию цитотоксических веществ, таких как монооксид азота (N0), и заболеваний, связанных с выживаемостью и ростом мотонейронов. Олигосахариды формулы (I) могут также быть использованы для профилактики и/или лечения нейродегенеративных заболеваний, для которых церебральное воспаление играет губительную роль, способную привести к смерти, среди которых можно назвать церебральные ишемии, сердечные ишемии (инфаркты миокарда), периферические ишемии, повреждения центральной нервной системы, и в частности черепно-мозговые, спинно-мозговые и черепноспинно-мозговые травмы, рассеянный склероз, невропатические боли и периферические невропатий, заболевания мононейронов, такие как боковой амиотрофический склероз, прогрессирующая спинальная атрофия, детская мышечная атрофия и первичный боковой склероз, нейроСПИД, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и хорея Гентингтона и некоторые формы остеоартритов, в частности суставной локализации.

Настоящее изобретение касается также способа профилактики и/или лечения мотонейрональных заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз, прогрессирующая спинальная атрофия, детская мышечная атрофия и первичный боковой склероз.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве действующего начала олигосахарид формулы в которой η обозначает целое число от 0 до 25,

Кд, К₃, Кд, К₅, Кб и К₈, одинаковые или разные, обозначают атом водорода или радикал 8О3М,

К₂ и К₇, одинаковые или разные, обозначают атом водорода или радикал 8О₃М или СОСНз и

М обозначает натрий, кальций, магний или калий, или смесь указанных олигосахаридов.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, содержащая олигосахарид формулы (I), для которого Кд и Кб обозначают атом водорода, или смесь указанных олигосахаридов.

3. Фармацевтическая композиция по одному из пп.1 или 2, содержащая олигосахарид формулы (I), для которого η обозначает целое число от 0 до 10, или смесь указанных олигосахаридов.

д.

Фармацевтическая композиция по одному из пп.1 или 2, содержащая олигосахарид формулы (I), для которого η обозначает целое число от 0 до б, или смесь указанных олигосахаридов.

5. Фармацевтическая композиция по одному из пп.1 или 2, содержащая олигосахарид формулы (I), для которого η обозначает целое число от 1 до б, или смесь указанных олигосахаридов.

6. Фармацевтическая композиция по п.1, содержащая олигосахарид формулы (I), для которого η равно 0, Кд, К₇ и К₈ обозначают радикал 8О₃М, К_б обозначает атом водорода и М представляет натрий.

7. Фармацевтическая композиция по п.1, содержащая олигосахарид формулы (I), для которого η равно 1, Кд, К₂, К₃, К₅, К₇ и К₈ обозначают радикал 8О₃М, Кд и К обозначают атом водорода и М представляет натрий.

8. Фармацевтическая композиция по п.1, содержащая олигосахарид формулы (I), для которого η равно 2, К1, К2, К3, К5, К7 и К8 обозначают радикал 8О₃М, К_д и К₆ обозначают атом водорода и М представляет натрий.

9. Фармацевтическая композиция по п.1, содержащая олигосахарид формулы (I), для которого η равно 3, К1, К2, К3, К5, К7 и К8 обозначают радикал 8О₃М, К_д и К₆ обозначают атом водорода и М представляет натрий.

10. Фармацевтическая композиция по п.1, содержащая олигосахарид формулы (I), для которого η равно д, К1, К2, К3, К5, К7 и К8 обозначают радикал 8О₃М, К_д и К₆ обозначают атом водорода и М представляет натрий.

11. Олигосахарид формулы в которой η обозначает целое число от 0 до 25,

К1, К3, Кд, К5, Кб и К8, одинаковые или разные, обозначают атом водорода или радикал 8О3М,

К₂ и К₇, одинаковые или разные, обозначают атом водорода или радикал 8О₃М или СОСН3 и

М обозначает натрий, кальций, магний или калий, за исключением соединений, для которых η равно 0 и либо К1, Кб и К8 обозначают атомы водорода, К₇ обозначает радикал 8О₃М или СОСН₃ и М обозначает натрий, либо Кд и К₆обозначают атом водорода, К7 обозначает радикал СОСН₃, К₈ обозначает радикал 8О₃М и М обозначает натрий, либо Кб обозначает водород, Кд, К₇ и К₈ обозначают радикал 8О₃М и М обозначает натрий, либо Кб и К7 обозначают атомы водорода, Кд и К₈ обозначают радикал 8О₃М и М обозначает натрий, либо Кд, К_б и К₇ обозначают атом водорода, К8 обозначает радикал 8О₃М и М обозначает натрий.

12. Олигосахарид формулы (I) по п.11, для которого К_д и К_б обозначают атом водорода.

13. Олигосахарид формулы (I) по одному из пп.11 или 12, для которого η обозначает целое число от 0 до 10.

14. Олигосахарид формулы (I) по одному из пп.11 или 12, для которого η обозначает целое число от 0 до б.

15. Олигосахарид формулы (I) по одному из пп.11 или 12, для которого η обозначает целое число от 1 до б.

16. Олигосахарид формулы (I) по п.11, для которого η равно 0, Кд, К₇ и К₈ обозначают радикал 8О₃М, К₆ обозначает атом водорода и М представляет натрий.

17. Олигосахарид формулы (I) по п.11, для которого η равно 1, Кд, К₂, К₃, К₅, К₇ и К₈ обозначают радикал 8О₃М, К₄ и К₆ обозначают атом водорода и М представляет натрий.

18. Олигосахарид формулы (I) по п.11, для которого η равно 2, Кд, К₂, К₃, К₅, К₇ и К₈ обо значают радикал 8О₃М, Кд и К₆ обозначают атом водорода и М представляет натрий.

19. Олигосахарид формулы (I) по п.11, для которого п равно 3, К₁₅ К₂, К₃, К₅, К₇ и К₈ обозначают радикал 8О₃М, Кд и К₆ обозначают атом водорода и М представляет натрий.

20. Олигосахарид формулы (I) по п.11, для которого п равно 4, Κι, К₂, К₃, К₅, К₇ и К₈ обозначают радикал 8О₃М, К₄ и К₆ обозначают атом водорода и М представляет натрий.

21. Способ получения олигосахаридов формулы (I) по п.11, отличающийся тем, что воздействуют боргидридом щелочного металла или четвертичного аммония на олигосахариды формулы в которой п представляет собой целое число от

0 до 25,

К1, К₃, К₄ и К₅, одинаковые или разные, обозначают атом водорода или радикал 8О₃М,

К₂ и К₆, одинаковые или разные, обозначают атом водорода или радикал 8О₃М или СОСН₃ и

М обозначает натрий, кальций, магний или калий, и выделяют олигосахариды.

22. Способ по п.21, отличающийся тем, что реакцию проводят в водной среде при температуре, близкой к 25°С, и при рН в диапазоне от 7 до 10.

23. Способ по одному из пп.21 и 22, отличающийся тем, что рН, при котором проводят реакцию, находится в диапазоне от 9 до 10.

24. Способ по пп.21-23, отличающийся тем, что боргидрид щелочного металла или четвертичного аммония представляет боргидрид лития, натрия, калия или тетрабутиламмония.

25. Применение олигосахаридов формулы в которой п обозначает целое число от 0 до 25,

К1, К3, К4, К5, К6 и К8, одинаковые или разные, обозначают атом водорода или радикал 8О3М,

М обозначает натрий, кальций, магний или калий, или смеси этих олигосахаридов, для получения лекарственного средства, используемого для профилактики или лечения заболеваний, связанных с воспалительным процессом, вовлекающим продукцию монооксида азота (N0).

26. Применение олигосахаридов формулы (I) по п.25 для получения лекарственных средств, используемых для профилактики и лечения церебральных, сердечных или периферических сосудистых ишемий, остеоартритов, повреждений центральной нервной системы, черепно-мозговых, спинно-мозговых и черепноспинно-мозговых травм, рассеянного склероза, невропатических болей и периферических невропатий, заболеваний мотонейронов, бокового амиотрофического склероза, нейро-СПИДа, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и хореи Гентингтона.

27. Применение олигосахаридов формулы в которой п обозначает целое число от 0 до 25, К1, К3, К4, К5, К6 и К8, одинаковые или разные, обозначают атом водорода или радикал 8О3М,

М обозначает натрий, кальций, магний или калий, или смеси этих олигосахаридов, для получения лекарственного средства для профилактики и/или лечения заболеваний, связанных с выживаемостью и ростом мотонейронов.