SK13932002A3

SK13932002A3 - Farmaceutické kompozície, ktoré obsahujú oligosacharidy, oligosacharidy a ich príprava a použitie

Info

Publication number: SK13932002A3
Application number: SK1393-2002A
Authority: SK
Inventors: Pierre Mourier; Elisabeth Perrin; Christian Viskov
Original assignee: Aventis Pharma S. A.
Priority date: 2000-03-28
Filing date: 2001-03-26
Publication date: 2003-06-03
Also published as: DE60109279T2; MXPA02009455A; PL357301A1; CN1426419A; PT1272499E; ES2236206T3; CA2403906A1; PL204419B1; HUP0300330A2; EE200200551A; NO20024590D0; KR20030001394A; YU72802A; FR2807043B1; FR2807043A1; EP1272499A1; CN1183149C; NZ521558A; HK1056564A1; AR034251A1

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka farmaceutických kompozícii, ktoré obsahujú ako účinnú látku oligosacharid všeobecného vzorca I

alebo zmes týchto oligosacharidov, týchto nových oligosacharidov všeobecného vzorca I, ich zmesí a spôsobov ich prípravy.

Podstata vynálezu

V uvedenom všeobecnom vzorci I n znamená celé číslo od 0 do 25, R¹, R³, R⁴, R⁵, R⁶ a R⁸, ktoré sú rovnaké alebo odlišné,

I znamenajú atóm vodíka alebo skupinu SO₃M, R² a R⁷, ktoré sú rovnaké alebo odlišné, znamenajú atóm vodíka alebo skupinu SO₃M alebo skupinu COCH₃ a M znamená sodík, vápnik, horčík alebo draslík.

Tieto oligosacharidy takto obsahujú párny počet sacharidov.

Vo všeobecnom vzorci I R⁴ a R^s výhodne znamenajú atómy vodíka.

Oligosacharidy všeobecného vzorca I, v ktorom n znamená 0 a buď R¹, R⁶ a R⁸ znamenajú atóm vodíka, R⁷ znamená skupinu SO3M alebo skupinu COCH3 a M znamená sodík, alebo R¹ a R⁶ znamenajú atóm vodíka, R⁷ znamená skupinu COCH3, R⁸ znamená skupinu SO3M a M znamená sodík, alebo R⁶ znamená atóm vodíka, R¹, R⁷ a R⁸ znamenajú skupinu SO3M a M znamená sodík, už boli opísané v G. H. Lee a kol., J. Chróm. 212, 65-73 (1981), pričom sa však týmto zlúčeninám nepripísali žiadne farmakologické vlastnosti.

Oligosacharidy všeobecného vzorca I, v ktorom n znamená 0 a buď R⁶ a R⁷ znamenajú atómy vodíka, R¹ a R⁸ znamenajú skupinu SO₃M a M znamená sodík, alebo R¹, R⁶ a R⁷ znamenajú atóm vodíka, R⁸ í

znamená skupinu SO₃M a M znamená sodík, sú opísané v MW McLean a kol., Eur. J. Biochem., 1984, 145, 607, pričom ani v tomto prípade sa týmto zlúčeninám neprisúdili žiadne farmakologické vlastnosti.

Vhodnými farmaceutickými kompozíciami sú kompozície, ktoré obsahujú oligosacharid všeobecného vzorca I, v ktorom:

- n znamená celé číslo od 0 do 10, najmä celé číslo od 0 do 6 a obzvlášť celé číslo od 1 do 6,

R¹, R², R³, R⁵, R⁷, R⁸, ktoré sú rovnaké alebo odlišné, znamenajú atóm vodíka alebo skupinu SO3M a najmä R¹, R², R³, R⁵, R⁷, R⁸ znamenajú skupinu SO3M a

- M znamená sodík.

Obzvlášť výhodnými farmaceutickými kompozíciami sú kompozície, ktoré _ obsahujú oligosacharid všeobecného vzorca I, v ktorom:

- n znamená 0, R¹, R⁷ a R⁸ znamenajú skupinu SO₃M, R⁶ znamená atóm vodíka a M znamená sodík,

- n znamená 1, R¹, R², R³, R⁵, R⁷, R⁸ znamenajú skupinu SO₃M, R⁴ a R⁶ znamenajú atóm vodíka a M znamená sodík,

- n znamená 2, R¹, R², R³, R⁵, R⁷, R⁸ znamenajú skupinu SO₃M, R⁴ a R⁶ znamenajú atóm vodíka a M znamená sodík,

- n znamená 3, R¹, R², R³, R⁵, R⁷, R⁸ znamenajú skupinu SO₃M, R⁴ a R° znamenajú atóm vodíka a M znamená sodík,

- n znamená 4, R¹, R², R³, R⁵, R⁷, R⁸ znamenajú skupinu SO₃M, R⁴ a R⁶ znamenajú atóm vodíka a M znamená sodík.

Oligosacharidy všeobecného vzorca I s výnimkou tých, v ktorých n znamená 0 a buď R¹, R⁶ a R⁸ znamenajú atóm vodíka, R⁷znamená skupinu SO3M alebo skupinu COCH3 a M znamená sodík, alebo R¹ a R⁶ znamenajú atóm vodíka, R⁷ znamená skupinu COCH3, R⁸ znamená skupinu SO3M a M znamená sodík, alebo R^s znamená vodík, R¹, R⁷ a R⁸ znamenajú skupinu SO3M a M znamená sodík, alebo R⁵ a R⁷znamenajú atómy vodíka, Ŕ¹ a R⁸ znamenajú skupinu SO₃M a M znamená sodík, alebo R¹, R⁶ a R⁷ znamenajú atóm vodíka, R⁸ znamená skupinu SO3M a M znamená sodík, sú novými zlúčeninami a ako také tvoria súčasť vynálezu.

Oligosacharidy všeobecného vzorca I sa môžu pripraviť pôsobením borohydridu alkalického kovu, alebo kvartérneho amónia na oligosacharidy všeobecného vzorca II

OH (II) v ktorom n znamená celé číslo od 0 do 25, R¹, R³, R⁴, R⁵, R^c a R⁸, ktoré sú rovnaké alebo odlišné, znamenajú atóm vodíka alebo skuv pinu SO3M, R² a R⁷, ktoré sú rovnaké alebo odlišné, znamenajú atóm vodíka alebo skupinu SO₃M alebo skupinuCOCH₃ a M znamená sodík, vápnik, horčík alebo draslík.

Táto reakcia sa uskutočňuje vo vodnom prostredí pri teplote blízko 25 °C, pri pH medzi 7 a 10, výhodne medzi 9 a 10, po celý čas reakcie. Udržiavanie pH pri uvedenej teplote sa dosiahne pridaním roztoku hydroxidu sodného s koncentráciou 0,5 mol/1. Reakcia sa preruší okyslením reakčnej zmesi, napríklad pridaním kyseliny octovej až kým sa nedosiahne pH medzi hodnotami 4 a 5.

Ako borohydrid alkalického kovu je možné uviesť borohydrid lítny, borohydrid sodný a borohydrid draselný.

Ako borohydrid kvartérneho amónia je možné uviesť tetrabutylamóniumborohydrid.

Oligosacharidy všeobecného vzorca II sa môžu získať rozdelením zmesi oligosacharidov III, ktorá sa získa enzymaťickou depolymerizáciou heparínu alebo bázickou depolymerizáciou benzylesteru heparínu alebo hemisyntézneho benzylesteru heparínu, pomocou chromatografie na géle.

Táto chromatografia sa uskutočňuje v kolónach, ktoré sú naplnené gélom polyakrylamid-agarózového typu, ktorý je napríklad komerčne dostupný pod označením Ultrogel ACA202 (Biosepra). Výhodne sa použije batéria kolón s polyakrylamid-agarózovým gélom. Počet použitých kolón je prispôsobený objemu, gélu a oligosacharidom, ktoré je potrebné rozdeliť. Zmes sa zriedi roztokom, ktorý obsahuje fosfátový pufer a chlorid sodný. Výhodne je roztokom fosfátového pufra 0,02 mol/l roztok NaH2PO₄/Na2HPO₄(pH 7), ktorý obsahuje 0,1 mol/l chloridu sodného. Dezekcia jednotlivých frakcií sa uskutočňuje UV spektrometriou (254 nm) a iónovou spektrometriou (IBF). Takto získané frakcie sa môžu potom prečistiť napríklad pomocou chromatografie typu SAX [chromatografia, ktorá používa silný ionomenič (Strong Anión Exchange)], ktorá sa uskutočňuje sebe známym spôsobom a najmä spôsobmi opísanými v K. G. Rice a R. J. Linhardt, Carbohydrate Research 190, 219-233 (1989); A. Larnkjaer, S. H. Hansen a P. B. Ostergaard, Carbohydrate Research, 166, 37-52 (1995); a v patentovom dokumente WO 90/01501 (príklad 2). Uvedené frakcie sa potom lyofilizujú a potom sa odsolia v kolóne naplnenej gélom, akou je napríklad kolóna naplnená gélom Sephadex G10 (Pharmacia Biochemicals).

V prípade, že sa prečistenie neuskutoční pomocou chromatografie SAX, môžu sa lyofilizáty prečistiť jednoduchým alebo frakcionovaným zrážaním, ktoré sa uskutoční známymi metódami a najmä metódou opísanou v patente FR 2548672. Všeobecne sa postupuje nasledujúcim spôsobom:

Lyofilizovaná frakcia určená na prečistenie sa rozpustí pri teplote 25 °C v asi desiatich objemoch destilovanej vody. Prídavkom metanolu alebo etanolu sa vyzráža požadovaný oligosacharid, pričom sa jeho koncentrácia kontroluje vysoko výkonnou kvapalinovou chromatografiou (CLHK, Chromatografie Liquide Haute Performance). Množstvo pridaného metanolu alebo etanolu sa stanoví v závislosti od požadovanej čistoty a požadovaného výťažku uvedeného oligosacharidu. Rovnako sa môže táto operácia uskutočniť v niekoľkých nasledujúcich stupňoch, pričom sa vychádza z pôvodného roztoku lyofilizátu. Kvôli tomu sa pridá desolubilizujúce činidlo (metanol alebo etanol) v malých množstvách a vylúčená zrazenina sa izoluje po každom prídavku uvedeného činidla. Takto získané zrazeniny sa analyzujú vysoko výkonnou kvapalinovou chromatografiou. Podľa požadovanej čistoty a požadovaného výťažku sa zlúčia adekvátne frakcie zrazeniny.

V rámci jednej varianty vynálezu môže byť lyofilizovaná frakcia určená na prečistenie rozpustená v 10 až 200 objemoch vody, ktorá , obsahuje 0 až 30 % octanu sodného. Percentuálny obsah octanu sodného sa určí dopredu v závislosti od povahy oligosacharidu, ktorý sa má spracovať (v závislosti od jeho velkosti). Pridaním metanolu sa vyzráža požadovaný oligosacharid, pričom sa stupeň jeho obohatenia (a teda jeho koncentrácia) kontroluje vysoko výkonnou kvapalinovou chromatografiou. Množstvo pridaného metanolu sa stanoví v závislosti od požadovanej čistoty a od požadovaného výťažku uvedeného oligosacharidu. Rovnako sa môže táto operácia uskutočniť v niekoľkých následných stupňoch, pričom sa vychádza z prvotného roztoku lyofilizátu. Preto sa pridáva desolubilizačné činidlo (metanol) po malých množstvách a po každom prídavku metanolu sa izoluje získaná parciálna zrazenina. Takto získané čiastkové zrazeniny sa analyzujú vysoko výkonnou kvapalinovou chromatografiou. Podľa požadovanej čistoty a požadovaného výťažku oligosacharidu sa zlúčia príslušné frakcie získaných zrazenín.

V prípade medziproduktov všeobecného vzorca II, v ktorých n = 0, 1 alebo 2, je výhodné vychádzať zo zmesí III, ktorá sa získa enzymatickou depolymerizáciou.

Táto depolymerizácia sa uskutočňuje použitím heparinázy I (EC 4.2.2.7) v prostredí roztoku fosfátového pufra s pH 7, v prítomnosti chloridu sodného a bovinného sérového albumínu BSA (Albumíne de Sérum Bovin) , pri teplote 10 až 18 °C, výhodne pri teplote 15 °C, v priebehu 8 až 10 dní, výhodne v priebehu 9 dní. Depolymerizácia sa preruší napríklad zahriatím reakčnej zmesi na teplotu 100 °C v priebehu 2 minút, potom sa zmes lyofilizujé.' Je výhodné použiť 7 Ul heparinázy na 25 g heparínu. Roztok fosfátového pufru všeobecne obsahuje 0,05 mol/1 NaH2PO₄/Na2HPO4 (pH 7) v prítomnosti 0,1 mol/k chloridu sodného. Koncentrácia bovinného sérového albumínu BSA predstavuje zvyčajne 2 %.

V prípade medziproduktov vzorca II, v ktorých n = 0, 1, 2, 3 alebo 4, je výhodné vychádzať zo zmesi III, ktorá sa získa depolymerizáciou benzylesteru heparínu.

Benzylester heparínu sa môže pripraviť metódami, ktoré sú opísané v patentových dokumentoch US 5 389 618, EP 40 144 a PR 2 548 672. Miera esterifikácie- výhodne predstavuje 50 až 100 %. Výhodne bude miera esterifikácie predstavovať 70 až 90 %.

Táto depolymerizácia sa uskutočňuje vo vodnom prostredí, pričom sa použije hydroxid alkalického kovu (napríklad hydroxid lítny, hydroxid draselný, hydroxid sodný alebo hydroxid cézny) alebo kvartérne amónium (napríklad tetrabutylamóniumhydroxid), výhodne s molaritou medzi 0,1 a 0,2 mol/1, pri teplote 40 až 80 °C v priebehu 5 až 120 minút. Výhodne sa pracuje počas 5 až 15 minút pri teplote 60 až 70 °C, pričom sa použije roztok hydroxidu sodného s koncentráciou 0,15 mol/1. Depolymerizačná reakcia sa preruší neutralizačným pridaním kyseliny, akou je napríklad kyselina octová. Po pridaní 10 % hmotn./obj. octanu sodného sa zmes oligosacharidov vyzráža pridaním metanolu, výhodne sa pridajú 2 objemy metanolu na 1 objem reakčnej zmesi a zmes sa filtruje.

V rámci výhodnej formy uskutočnenia vynálezu sa zmes oligosacharidov, získaná po chemickej depolymerizácii vo forme vodného roztoku, obohatí ultrafiltráciou na membránach s príslušným nominálnym separačným prahom (typ Pellicon na báze regenerovanej celulózy komerčne uvedený na trh spoločnosťou Millipore); typ membrány sa volí v závislosti od typu obohatených oligosacharidov, ktoré sú určené na izoláciu.

Pre oligosacharidy II, v ktorých n = 0, sa použije membrána s nominálnym separačným prahom 1 kDa, pre oligosacharidy II, v ktorých n = 1, sa použije membrána s nominálnym separačným prahom 1 kDa alebo 3 kDa, pre oligosacharidy II, v ktorých n = 2, sa použije membrána s nominálnym separačným prahom 3 kDa, pre oligosacharidy II, v ktorých n = 3 alebo 4, sa použije membrána s nominálnym separačným prahom 5 kDa. V priebehu tejto operácie sa permeát zachová, zatiaľ čo zadržaný podiel predstavuje odpad. Takto môže frakcia obohateného produktu predstavovať 50 až 10 % východiskovej zmesi oligosacharidov, pričom sa zachová aspoň 80 % požadovaného oligosacharidu.

V prípade medziproduktov II, v ktorých n = 0 až 25, sa výhodne vychádza zo zmesi III, ktorá sa získa depolymerizáciou benzylesteru' hemisyntézneho sulfátovaného polysacharidu. Benzylester hemisyntézneho sulfátovaného polysacharidu sa pripraví z hemisyntéznych sulfátovaných polysacharidov, ktoré sa získajú z polysacharidu K5 metódou opísanou v patentových dokumentoch WO94/29352 >a WO96/14425. Esterifikačné, depolymerizačné a izolačné podmienky sú rovnaké ako podmienky, ktoré sú už opísané pre benzylester heparínu.

V rámci všetkých uvedených postupov môže byť východiskovým heparínom heparín prasacieho, ovčieho, kozieho alebo bovinneho pôvodu a môže pochádzať z hlienu (slizu) pľúc alebo kože zvierat. Výhodne sa použije heparín z prasacieho alebo ovčieho hlienu a z pľúc hovädzieho dobytka alebo ešte výhodnejšie heparín z prasacieho hlienu alebo pľúc hovädzieho dobytka.

Oligosacharidy všeobecného vzorca I majú protizápalové vlastnosti a môžu sa takto použiť na prevenciu a liečenie chorôb, ktoré sú spojené so zápalovými procesmi, pri ktorých sa uplatňujú cytotoxické látky, ako napríklad oxid dusnatý (NO), jeho indukovatelná forma sa uvoľňuje najmä prostredníctvom neutrofilov alebo makrofágov, v prípade, že neutrofily a makrofágy migrujú a sú aktivované na úrovni tkaniva. Migrácia, aktivácia a adhézia neutrofilov prebieha na úrovni ischemizovaných tkanivových zón následkom oklúzie alebo spazmu tkaniva vaskularizujúcej artérie. K týmto ischémiám môže dochádzať buď na cerebrálnej úrovni (cerebrálna vaskulárna príhoda) alebo na úrovni myokardu (infarkt myokardu) alebo na úrovni spodných končatín (ischémia označovaná ako periférna). Oligosacharidy všeobecného vzorca I sa môžu takto použiť na prevenciu alebo/a liečenie neurodegeneratívnych chorôb, v ktorých hrá cerebrálny zápal zhubnú úlohu, ktorá môže mať za následok smrť, pričom z týchto chorôb možno uviesť cerebrálnu ischémiu, srdcovú ischémiu (infarkt myokardu), periférnu ischémiu, úrazy centrálnej nervovej sústavy a najmä úrazy lebky, úrazy 'chrbtice a kombinované úrazy lebky a chrbtice, roztrúsenú sklerózu, neuropatické bolesti a periférnu neuropatiu, ochorenia motoneurónu a z nich amyotrofnú laterálnu sklerózu, progresívnu spinálnu atrofiu, infantilnú svalovú atrofiu a primárnu laterálnu sklerózu, neuro-AIDS, Alzheimerovu chorobu, Parkinsonovu chorobu, Huntingtonovu choreu a niektoré formy osteoartritidy, najmä s kĺbovou lokalizáciou.

Protizápalová účinnosť týchto produktov sa stanoví in vivo pri teste produkcie NOx (dusitan a dusičnan) indukovanej lipopolysacharidom (LPS), ktorý pochádza z E. Coli, ktorý sa uskutoční podlá protokolu opísaného M-Yamashita-om a kol. V Eur. J. Pharmacol, 338, 2, 151-158 (1997) alebo J. E. Shellito-m a kol. v Am. J. Respir. Celí. Mol. Biol., 13, 1, 45-53 (1995).·

Myším samčekom CDI (Charles River, telesná hmotnosť 25 až 35 g) sa v čase TO injikuje intravenózne bolus 0,5 mg/kg oligosacharidu a v T+15 minút subkutánne 1 alebo 2 mg/kg oligosacharidu. V čase T + 30 sa pokusným zvieratám podá 100 mg/kg lipopolysacharidu (LPS), ktorý pochádza z E. Col (Sigma L3129, sérotyp 0127:B8). V čase T+3 hodiny sa pokusným zvieratám znova subkutánne injikuje 1 alebo 2 mg/kg oligosacharidu. V čase T+5 hodín a 30 minút sa pokusným zvieratám odoberie pomocou očnej punkcie vzorka krvi a stanovenie koncentrácie NOx (dusitan a dusičnan) v plazme sa uskutočni kolorimetrickou metódou podlá

Griessa po redukcii dusičnanu na dusitan, pričom sa použije nitrát-reduktázy nasledujúcim spôsobom:

ml vzorky plazmy sa zmieša s 88 ml deionizovanej vody a získaná zmes sa inkubuje v tme počas jednej hodiny pri teplote okolia so 40 ml fosfátového pufra (0,31 M, pH 7,5), 20 ml beta-NADPH (redukovaný nikotínamid-adenín-dinukleotid-fosfát) (0,86 mM) , 20 ml FDA (flavín-adenín-dinukleotid) 0,11 mM) a 20 ml nitrát-reduktázy (2U/ml) (Boehringer Mannhein). Pridá sa 10 ml ZnSO₄ (1 M) na vyzrážanie proteínov a po premiešaní sa vzorky odstredia pri 20 OOOg v priebehu 5 minút. Nakoniec sa 50 ml supernatantu inkubuje počas 10 minút pri teplote okolia so 100 ml Griessovho činidla [1 % sulfanilamid v zmesi kyseliny fosforečnej a 0,1 % naftyletyléndiamínu. ¹ v deionizovanej vode (obj./obj.)]. Použitím mikroplatňového spektrofotometra sa odčítajú optické hustoty pri 540 nm, pričom každý bod sa stanoví dvakrát. Ako štandardy pre kolorimetrickú metódu sa použijú KNO₃a NaNO₂.

Pri tomto teste inhibujú oligosacharidy podľa vynálezu viac než 50 % tvorby NOx.

Oligosacharidy všeobecného vzorca I zlepšujú prežitie a rast motoneurónov a sú teda obzvlášť vhodné na prevenciu alebo/a liečenie motoneuronálnych ochorení, medzi ktoré patrí najmä amyotrofná laterálna skleróza, progresívna spinálna atrofia, infantilná svalová atrofia a primárna laterálna skleróza.

Je známe, že kultúry motoneurónov podliehajú apoptóže v prípade, že sú realizované v neprítomnosti trofickej podpory (napríklad BDNF alebo NT5). Najnovšie sa zistilo, že oligosacharidy podľa vynálezu umožňujú prežitie a rast motoneurónov. Táto aktivita sa testovala na kultúrach atrocytov a motoneutrónov, ktoré sú zbavené neurotrofického faktoru podľa nasledujúceho protokolu.

Kultúry obohatené motoneurónmi

Kultúry obohatené o motoneuróny sa pripravia použitím centrifúgovej metódy, ktorá je opísaná v R. K. Schnaar a A. E. Schaffner, J. Neurosci., 1, 204-217 (1981) a modifikované spôsobom opísaným v W. Camu a C. E. Henderson, J. Neurosci. Methods, 44, 59-70 (1992). Miechy potkaních embryí E15 sa sterilné vyberú a zbavia sa dorzálnych spinálnych reťazcov. Miechy sa potom porozrezávajú a inkubujú v priebehu 15 minút pri teplote 37 °C v PBS (soľný fosfátový pufer: NaCl 137 mM, KC1 2,68, Na₂HPO₄ 6,45, KH₂PO₄ 1,47 nM) , ku ktorému sa pridá 0,05 % trypsínu. Rozrušenie buniek sa dokončí rozotrením koncom 1 ml pipety v kultivačnom prostredí, ktoré je obohatené 0,1 % bovinným sérovým albumínom (BSA) a 0,1 mg/ml ADNázy.

Suspenzia buniek sa rozloží na pás 6,5 % (hmotn./obj.) metrizamidu v prostredí L15 (komerčne poskytnutý spoločnosťou Gibco BRL) a odstredí pri 500g v priebehu 15 minút. Pás rozmedzia, ktorý obsahuje motoneuróny, sa izoluje, zriedi v prostredí L15 a inkubuje v priebehu 45 minút pri teplote okolia v kultivačných boxoch predbežne impregnovaných myším anti-IgG a supernatantovým hybridómom MC192 [(Chandler CE a kol., J. Biol. Chem., 259, 6882 (1984)]. Suspendované bunky ,sa premyjú prostredím L15 a motoneuróny sa eluujú za mierneho miešania supernatantovým hybridómom MC192. Motoneuróny sa potom nanesú v kultivačných boxoch v hustote 650 buniek na 24 mm na monovrstvy astrocytov v prostredí L15, ku ktorému sa pridal hydrogenuhličitan sodný (22 MM), koalbumín (0,1 mg/ml), putrescin (0,1 mM) , inzulín (5 pg/ml), seleničitan sodný (31 nM), glukóza (20 mM), ¹ progesterón (21 nM) , .penicilín- (100 Ul/ml) a streptomycín (100 μρ/πιΐ). Kultúry sa udržiavajú pri teplote 37 °C v navlhčenej atmosfére, ktorá obsahuje 5 % CO₂.

Kultúra astrocytov z miechy

Astrocyty sa získajú z krysích embryí mierne modifikovanou metódou opísanou v R. P. Saneto a J. De Vellis, Neurochemistry a practical approach (A. J. Turner a H. S. St. John) IRL Press, Oxford-Washington DC, str. 27-63 (1987).

Miechy sa pokusným zvieratám sterilné odoberú a zbavia sa mening a dorzálnych gangliónov. Päť až desať miech sa prevedie do PBS (soľný fosfátový pufor: NaCI 137 mM, KCl 2,68 mM, Na2HPO₄1,47 mM) a rozreže pred inkubáciou, ktorá sa uskutočni pri teplote 37 °C v priebehu 25 minút v PBS, ku ktorému sa pridalo 0,25 % trypsinu. Enzymatický proces sa preruší pridaním 10 ml modifikovaného prostredia Dubelcco-Eagle (DMEM), ku ktorému sá pridalo 10 % fetálneho teľacieho séra (FCS) a bunky sa izolujú odstredením. Ďalšia etapa mechanickej dezintegrácie sa uskutoční použitím konca 1 ml pipety. Bunky sa rozotrú v hustote 1,5 x 10⁶buniek na 25 cm² kultivačného prostredia v DMEM s 10 % ECS. Po dvoch dňoch in vitro sa kultúram dodávajú živiny každý deň v priebehu celej doby štúdie. Keď sa získa viditeľná monovrstva buniek, kultúry sa miešajú v priebehu 48 hodín pri rýchlosti otáčania miešadla 250 otáčok za minútu' a nasledujúci deň sa monovrstvy spracujú cytozín-arabinozidom (IO^-5 M) v priebehu 48 hodín. Monovrstvy astrocytov sa potom množia, kým sa dosiahne hustota 5 na 35 mm na kultivačných platniach pre kultivačné fľaše s 25 cm² na začiatku štúdie.

Uvedené kultúry spinálnych astrocytov sú tvorené z viac než 98 % bunkami, ktoré sú imunoreaktívne na proteín gliálnej fibrilárnej kyseliny (GFAP).

Monovrstvy astrocytov sa exponujú buď samotným PBS (referenčný pokus) alebo testovaným produktom v roztoku v PBS v priebehu 24 hodín použitím koncentrácií 0,1 až 10 ng/ml. Monovrstvy astrocytov sa potom premyjú DMEM a udržiavajú sa počas hodín v kultivačnom prostredí, ku ktorému sa pridajú motoneuróny. Po dvoch hodinách kultivácie a po uplynutí 2 hodín alebo dní sa ku kultivačnému prostrediu pridáva vehikulum alebo testovaný produkt.

Imunochemická identifikácia motoneurónov

Bunky sa fixujú v 4 % paraformaldehyde a 0,1 % glutaraldehyde v PBS (pH 7,4 pri teplote 4 °C v priebehu 15 minút). Kultúry sa potom premyjú a nešpecifické miesta sa blokujú 2 % bovinným sérovým albumínom (BSA) v PBS a 0,1 % Tritonom X100. Tieto kultúry sa postupne inkubujú s protilátkami p75^LNGRF (už citovaný Chandlerov článok) cez noc a s biotinylizovaným kozím sérom (1/125 Gibco) a streptavidenperoxidázou (1/200, Gibco) v priebehu 60 minút. Protilátky sa zviditelnia použitím reakcie typu DAB/H₂C>2. i

Počítanie buniek štatistickou analýzou

Imunoreaktívne bunky pre slabo aktívny neutrofínový receptor p75^lngrf, ktorý má neurity dlhšie než priemery 4 buniek, sú považované za motoneurónovo živé. Počet týchto neurónov sa vyhodnotí počítaním označených buniek na ploche 0,825 cm² pod mikroskopom pri dvestonásobnom zväčšení. Získané hodnoty sa vyjadria ako počet motoneurónov na cm² alebo' ako percentuálny počet motoneurónov prítomných v kultúrach udržiavaných pri absencii trofického faktora, vztiahnutý na kontrolný referenčný pokus. Stanovenie sa uskutočňuje aspoň trikrát.

Štatistické analýzy sa uskutočnia použitím Študentovho testu (t-test).

Pri predbežnom ošetrení oligosacharidmi podlá vynálezu sa počet motoneurónov, ktoré rastú na monovrstve astrocytov, zvýši o 20 až 50 %.

V nasledujúcich príkladoch, ktoré majú iba ilustračný charakter a nijako neobmedzujú rozsah vynálezu, bude ilustrovaná príprava oligosacharidov všeobecného vzorca I a príslušných medziproduktov .

Skratky uvedené v týchto príkladoch majú nasledujúce významy:

AIs: (kyselina 4-deoxy-2-O-sulfo-a-L-treo-hex-enopyranozylurónová)- (1—>4)-2-deoxy-2-sulfoamino-6-0-sulfo-a-D-glukopyranóza, tetrasodná sol, alebo AUAp2D-(1—»4)a-D-GlcNp2S6S;

Is: (kyselina 2-sulfo-a-L-idopyranozylurónová)- (l-»4)-2-deoxy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-ct-D-glukopyranóza, tetrasodná sol (kyselina 2-sulfo-a-L-idopyranozylurónová)- (1—>4)-2-deoxy-6-0-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glukopyranóza, tetrasodná soľ, alebo cc-L-IdoAp2S-(1—»4 )-a-D-GlcNp2S6S ;

lis : (kyselina α-L-idopyranozylurónová)-(1—>4 ) -2-deoxy-6-0-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glukopyranóza, trojsodná sol, alebo a-L-IdoAp- (1—>4) -a-D-GlcNp2S6S;

IIIs: (kyselina 2-sulfo-a-L-idopyranozylurónová)-(1—»4)-2-deoxy-2-sulfoamino-a-D-glukopyranóza, trojsodná sol, alebo a-L-IdoAp2S- (1—>4)-a-D-GlcNp2S;

IdoAp: kyselina idopyranozylurónová;

GlcNp: 2-amino-2-deoxyglukopyranóza;

AUap: kyselina 4-deoxy-a-L-threo-hex-enopyranozyl-urónová;

S: sulfát.

Príklady usk-utočnenia vynálezu

Príklady prípravy zmesí medziproduktov vzorca II

Príklad A i

Príprava oligosacharidov vzorca II, v ktorom n = 0, 1 a 2, enzymatickou depolymerizáciou a separáciou g heparínu sa rozpustí v 250 ml roztoku fosfátového pufra, ktorý obsahuje 0,05 mol/1 NaP^PO^ (pH = 7), 0,2 mol/1 chloridu sodného a 2 % BSA (bovinný sérový albumín) . Do takto získanej zmesi sa zavádza 7 UI heparinázy I (EC 4.2.2.2.7.) a získaný roztok sa ochladí na teplotu 15 °C, ktorý sa pri tejto teplote sa udržuje v priebehu celej depolymerizačnej reakcie. Priebeh tejto reakcie sa sleduje odoberaním alikvotných vzoriek a analýzou týchto vzoriek pomocou permeačnej gélovej chromatografie. Po uplynutí 9 dní sa enzymatická reakcia preruší zahriatím reakčnej zmesi na teplotu 100 °C v priebehu 10 minút. Zmes sa potom ochladí a následne lyofilizuje. Takto sa získa zmes oligosacharidov III.

I ¹

Ziskana zmes oligosacharidov sa potom chromatografuje použitím nasledujúceho postupu:

Chromatografia sa uskutočňuje v kolónach naplnených polyakrylamid-agarózovým gélom, ktorý je známy pod označením Ultrogel ACA 202, pričom sa zmes eluuje roztokom, ktorý obsahuje fosfátový pufor (0,02 mol/1 NaH₂PO₄) pH = 7 a 0,1 mol/1 chloridu sodného. Detekcia sa uskutočňuje pomocou UV spektrometrie (254 nm) a iónovej spektrometrie (IBF) . Získané produkty sa môžu poprípade prečistiť pomocou chromatografie SAX na silnom ionomeniči alebo frakčným zrážaním, ktoré sa uskutoční postupom opísaným v patentovom dokumente FR 2 548 672. Frakcie izolovaného produktu sa lyofilizujú a potom odsolia v kolóne naplnenej sephadexovým gélom G10 (Oharmacia Biochemicals).

Touto metódou sa získajú 3 g disacharidu Als, 1100 mg zmesi hexasacharidu, ktorá obsahuje typicky 55 % derivátu Als-Is-Is, 35 % Als-Is-IIs a 10 % derivátu AIs-ís-IIIs. Táto posledná uvedená zmes sa buď prečistí známymi metódami s cielom oddeliť každú zo zložiek alebo sa uvedená zmes použije ako taká na transformáciu na deriváty vzorca I.

Príklad B

Príprava oligosacharidov vzorca II, v ktorom n = 0, 1, 2, 3 alebo 4, depolymerizáciou benzylesteru heparidu a separáciou

a) Príprava benzylesteru heparínu

Benzylester heparínu sa pripraví postupom opísaným v príklade 3 patentového dokumentu US 5,389,618.

b) Depolymerizácia

100 g benzylesteru heparinu sa rozpustí v 1,9 1 demineralizovanej vody. Zmes sa potom za miešania zahreje na teplotu 60 °C. Po získaní homogénneho roztoku sa do roztoku naraz zavedie asi 35 ml 23 % roztoku hydroxidu sodného. Po 10 minútach reakcie sa roztok ochladí a neutralizuje 80 ml 2 N roztoku kyseliny octovej. K tomuto roztoku sa pridá 10 % (hmotn./obj.) octanu sodného. Zmes oligosacharidov sa vyzráža pridaním asi 2 objemov metanolu. Zrazenina sa izoluje pomocou filtrácie, dvakrát sa premyje metanolom a potom sa vysuší za zníženého tlaku pri teplote oligosacharidov II.

Po vysušení sa získa 73,8 g zmesi

c) Obohatenie oligosacharidom, v ktorom n = 1 g zmesi oligosacharidov, ktorá sa získa v predchádzajúcom stupni sa rozpustí v asi 35 objemoch vody. Získaný roztok sa ultrafiltruj e cez membránu so separačným prahom 3 kDa (Pellicon). Keď vytečie 600 ml permeátu, zadržaný podiel sa zriedi 500 ml vody. V ultrafiltrácii sa pokračuje až do okamihu, keď vytečie 'ďalších 450 ml permeátu. Obidve frakcie permeátu sa zlúčia a zahustia za zníženého tlaku do sucha. Získa sa 6,1 g žltkastého bieleho tuhého produktu. Analýza tohto tuhého produktu, ktorá sa uskutočnila pomocou permeačnej gélovej chromatografie ukázäla, že produkt obsahuje asi 30 % oligosacharidu vzorca II, v ktorom n = 1.

d) Frakcionácia ultrafiltrovaných zmesí oligosacharidov

Obohatená zmes sa frakcionalizuje v kolónach, ktoré sú naplnené polyakrylamid-agarózovým gélom známym pod označením Ultrogel ACA 202 (použijú sa dve kolóny v sérii, pričom tieto kolóny majú priemer 10 cm a výšku 50 cm) . 5 g zmesi obohatenej ultrafiltráciou sa rozpustí v 25 ml vody a potom eluuje roztokom chloridu sodného s koncentráciou 0,2 mol/1 rýchlosťou 5 ml/min. Na spodku kolóny sa odoberajú frakcie s objemom 25 ml. Detekcia produktu sa uskutoční DV spektrometriou (254 nm) alebo iónovou spektrometriou (IBF). Frakcie produktu, v ktorom n = 1, sa izolujú, lyofilizujú a potom odsolia v kolóne, ktorá je naplnená sephadexovým gélom G10. Po lyofilizácii sa získa 1 g tetrasacharidu, ktorý obsahuje typicky 70 % derivátu AIs-Is vzorca II (R¹, R², R³, R⁵, R⁷, R⁸ = SO₃Na; R⁴, R⁶ = H a M = Na) . Derivát AIs-Is sa môže prípadne prečistiť pomocou chromatografie SAX použitím silného aniónového meniča alebo výhodne frakčným . I ₍ · zrážaním, ktoré sa uskutoční postupom opísaným v patentovom dokumente FR 2 548 672 a variantom tohto postupu opísaným v rámci vynálezu.

Príklady prípravy oligosacharidov vzorca I

Príklad 1

Do reaktora sa nadávkuje roztok 300 mg oligosacharidu vzorca II s teplotou 25 °C, v ktorom n je rovné 0, R¹, R⁷ a R⁸znamenajú skupinu SO3M, R⁶ znamená atóm vodíka a M znamená sodík, v 2 ml vody. Za miešania sa pridá naraz 212 mg borohydridu sodného. pH sa nastaví na hodnotu medzi 9 a 10 pridaním roztoku hydroxidu sodného s koncentráciou 0,5 mol/1. Po 12 hodinách sa postupne pridáva kyselina octová, až kým sa nedosiahne pH medzi 4 a 5. Zmes sa mieša počas jednej hodiny, potom sa pH nascaví na hodnotu 6,7 pridaním roztoku hydroxidu sodného s koncentráciou 0,5 mol/1. Zmes sa potom zahustí za zníženého tlaku pri teplote 50 °C do sucha.

Získaný koncentrát sa za miešania magnetickým miešadlom disperguje v 10 ml metanolu. Po sedimentácii cez noc sa suspenzia odfiltruje cez membránu Whatman GF/B. Tuhý podiel zachytený na filtri sa rozpustí dvoma podielmi 10 ml destilovanej vody. Tento roztok sa potom zahustí za zníženého tlaku pri teplote 50 °C do sucha. Získa sa 580 mg bieleho tuhého produktu.

Tento produkt sa potom za miešania na magnetickom miešadle disperguje v 15 ml metanolu. Po 30 minútach miešania sa suspenzia prefiltruje cez membránu Whatman GF/B. Získaný filtračný koláč sa rozpustí v dvoch 10 ml podieloch destilovanej vody. Získaný podiel sa zahustí do sucha za zníženého tlaku pri teplote 50 ’C. Takto sa získa 250 mg oligosacharidu vzorca I, v ktorom n je rovné 0, R¹, R⁷ a R⁸ znamenajú skupinu SO₃M, R⁶ znamená atóm vodíka a M znamená sodík, vo forme zmesi diastereoizomérov.

I a II sú konštitutívne cukry disacharidov, pričom I je redukovaný zvyšok a II je zvyšok nenasýtenej kyseliny urónovej [(kyselina 4-deoxy-2-0-sulfo-alfa-L-treo-hex-4-enopyranozylurónová- (1—>4)-2-deoxy-6-0-sulfo-2-sulfoamino-D-glucitol, tetrasodná sol) ; (kyselina 4-deoxy-2-0-sulfo-alfa-L-treo-hex-4-enopyranozylurónová- (1—>4)-2-deoxy-6-0-sulfo-2-sulfoamino-D-manitcl, tetrasodná soľ);

protónové	spe	:ktrum v D2O, 600	MHz, T	=	305 K,	delta v ppm:
3, 38	(1H,	m,	H-2^(I>) ,				¹
3, 70	(1H	kaži	dý, resp. Dd, J	= 6 a	12	Hz a	dd, J = 5 a
	2H-	1^!I>)	t
3,86	(1H,	t,	J = 5 Hz, H-3^(I))	/
4,13	(1H,	dd.	J = 8 a 11 Hz,	H-6^(I)) ,
4,18	(1H,	m,	H-4^(I)),4,25 (2H,	m, H-6	(II) 1	) ,
4,25	(2H,	m,	H-6^(II>),
4,35	(1H,	m,	H-5^(I>) ,
4,65	(1H,	m,_	H-2^(II)) ,
5, 67	(1H,	s,	H-l'¹¹’),
6,00	(1H,	d,	J = 5 Hz, H-4^(II)	) ] ·

Príklad 2

Do reaktora sa naleje roztok 60 mg oligosacharidu všeobecného vzorca II s teplotou 25 °C, v ktorom n je rovné 1, R¹, R², R³, R⁵, R⁷ a R⁸ znamenajú skupinu SO3M, R⁴ a R⁶ znamenajú atóm vodíka a M znamená sodík, v 1,2 ml vody. Za miešania sa pridá naraz 18 mg borohydridu sodného. pH sa nastaví na hodnotu medzi 9 a 10 pridaním roztoku hydroxidu sodného s koncentráciou 0,5 mol/1. Po 12 hodinách sa postupne pridáva kyselina octová, až kým sa nedosiahne hodnota pH medzi 4 a 5. Zmes sa mieša v priebehu 1 hodiny, potom sa pridá 5 ml metanolu. Suspenzia sa prefiltruje cez membránu Whatman GF/B a izolovaný tuhý podiel sa dvakrát premyje 0,5 ml metanolu. Po vysušení sa získa 42 mg oligosacharidu všeobecného vzorca I, v ktorom n je rovné 1, R¹,

R², R³, R⁵, R⁷ a R⁸ znamenajú skupinu SO3M, R⁴ a R⁶ znamenajú atóm vodíka a M znamená sodík, vo forme zmesi diastereoizomérov.

Ί

I až IV sú konštitutívne cukry tetrasacharidov, pričom I je redukovaný zvyšok a IV je zvyšok nenasýtenej kyseliny urónovej [(kyselina 4-deoxy-2-0-sulfo-alfa-L-treo-hex-4-enopyranozylurónová-(1—>4)-2-deoxy-6-0-sulfο-2-suífoamino-alfa-D-glukopyranozyl-(1—>4 ) - kyselina 2-O-sulfo-alfa-L-idopyranozylurónová-(1—>4) -2-deoxy-2-sulfoamino-6-0-sulfo-D-glucidtol, oktasodná sol) ; (kyselina 4-deoxy-2-0-sulfo-alfa-L-treo-hex-4-enopyranozylurónová-(l->4) -2-deoxy-6-0-sulfo-2-sulfoamino-alfa-D-glukopyranozyl- (l->4) -kyselina 2-0-sulfo-alfa-L-idopyranozylurónová- (l->4) -2-deoxy-2-deoxy-6-0-sulfο-2-sulfoamino-D-manitol, oktasodná soľ) ;

protónové spektrum v D₂0, 400 MHz, T = 298 K, delta v ppm:

3,25 (1H, dd, J = 10 a 3 Hz, H-2^(III)),

3,37 (1H, m, H-2^(I)),

3,59 (1H, m, H-3 ¹¹¹¹¹ ) ,

3,75 (2H, m,·, 2H-1^(I1) ,

3,79 (1H, t, J = 9 Hz, H-4^(III)) ,

3,86 (1H, m, H-3^(I1), medzi 4,05 a 4,40 (10H, masív, H-4^(I>/2H-5^(I)/2H-6^(I), H-2^(II)/

H-3^UI	7h-<	1 (II)	, 2H-6	(III) !	H-3^(IV1),
4,58	(1H,	m,	H-2^(IV)	),
4,60	(1H,	m,	H-5^(II)	) ,5,	27 (1H, d,
5,27	(1H,	d,	J = 4	Hz,	H-1^(II>),
5,42	(1H,	d,	J = 4	Hz,	H-1^(III)) ,
5, 47	(1H,	d,	J = 2	Hz,	H-l^<IV) ) ,
5, 95	(1H,	d,	J = 5	Hz,	H-4^(IV1) ] .

Príklad 3

Do reaktora sa naleje roztok 100 mg oligosacharidu všeobecného vzorca II s teplotou 25 °C, v ktorom n je 2, R¹, R², R³, R⁵, R⁷ a R⁸ znamenajú skupinu SO₃M, R⁴ a R⁶ znamenajú atóm vodíka a M znamená sodík, v 2 ml vody. Za miešania sa naraz pridá 20 mg borohydridu sodného. pH sa nastaví na hodnotu medzi 9 a 10 pridaním roztoku hydroxidu sodného s koncentráciou 0,5 mol/l. Po 12 hodinách sa postupne pridáva kyselina octová, až kým sa nedosiahne hodnota pH medzi 4 a 5. Zmes sa mieša v priebehu jednej hodiny, potom sa nastaví pH na hodnotu 6,7 pridaním roztoku hydroxidu sodného s koncentráciou 0,5 mol/l. Zmes sa zriedi destilovanou vodou v takom množstve, aby sa dosiahol objem 20 ml. Pridá sa 2,5 g octanu sodného a potom 3 objemy metanolu. Suspenzia sa prefiltruje cez membránu Whatman GF/B a izolovaný tuhý podiel sa dvakrát premyje 2 ml metanolu. Po vysušení sa získa 61 mg oligosacharidu všeobecného vzorca I, v ktorom n je rovné 2, R¹, R², R³, R⁵, R⁷ a R⁸ znamenajú skupinu

SO₃M, R⁴ a R⁶ znamenajú atóm vodíka a M znamená sodík, vo forme zmesi diastereoizomérov.

I až VI sú konštitutívne cukry hexasacharidov, pričom I je redukovaný zvyšok a VI je zvyšok nenasýtenej kyseliny urónovej [(kyselina 4-deoxy-2-0-sulfo-alfa-L-treo-hex-4-enopyranozylurónová- (1—>4) -2,-deoxy-2-sulfoamino-6-0-sulfo-alfa-D-glukopyranozyl- (1—>4)-kyselina 2-O-sulfo-alfa-L-idopyranozylurónová- (1—>4)-2-deoxy-2-sulfoamino-6-0-sulfo-alfa-D-glukopyranozyl-(l->4)-kyselina 2-O-sulfo-alfa-L-idopyranozylurónová- (1—>4) -2-deoxy-2-sulfoamino-6-O-sulfo-D-glucitol, dodekasodná soľ); (kyselina 4-deoxy-2-0-sulfo-alfa-L-treo-hex-4-enopyranozylurónová-(l->4) -2-deoxy-6-O-sulfoamino-aľfa-D-glukopyranozyl-(l->4) -kyselina 2-O-sulfo-alfa-L-idopyranozylurónová- (1—>4) -2-deoxy-6-0-sulf ο-2-sulfoamino-älfa-D-glukopyranozyl-(1—>4) -kyselina 2-O-sulfo-alfa-L-idopyranozylurónová- (1—>4) -2-deoxy-6-0-sulfo-2-sulfoamino-D-manitol,

dodekasodná soľ);
3,25	(2H,	m,	_H_2 (III) a (V) J
3, 38	(1H,	m,	H-2^(I)) ,
3, 61	(2H,	t,	J = 10 Hz, H-3^{lIII) a (V)} ) ,

medzi	3,7C	) a	3,83 (4H,	masív, 2Η-1^<Τ) a H-4^{(III) a}	^(V>),
3,86	(1H,	t,	J = 5 Hz,	H-3^(I)) ,
4,00	(2H,	m,	H-5^{(III) a} <^v>),
4,07	(1H,	m,	H-4^(IV)),
4,08	(1H,	m,	H-4 ^(I)) ,
medzi		4,10 a	4,45 (13H, masív,	H-5^(I)/2H-6^(I) ,
H-2^(II)/H-3	(IX)	/H-4^(II), 2H	1-6^(III), H-2 ^(IV> /H-3^(IV), 2H-	•6^(V), H-3^(VI)),
4,60	(1H,	S,	H-2^(VI>),
4, 62	(1H,	S,	H-5^(II)),
4,78	(1H,	S,	H-5^(IV1),
5, 17	(1H,	S,	H-1^(IV>),
5,28	(1H,	d,	J = 4 Hz,	H-1^(II)) ,
5,38	(1H,	d,	J = 3 Hz,	H-1^(V)) ,
5,44	(1H,	d,	J = 3 Hz,	H-1^(III>) ,
5,47	(1H,	d,	J = 2 Hz,	H-1^(VI>),
5, 96	(1H,	d,	J = 5 Hz,	H —4 ^ÍVI)) ] .
Príklad 4
	Do	reaktora sa	naleje roztok 100 mg oligosacharidu
všeobecného	vzorca II	s teplotou 25 °C, v ktorom n je rovné 3,
R¹, R‘	², R³	, R⁵, R⁷ a R⁸	znamenajú skupinu SO₃M,	R⁴ a R° znamenajú
atóm	vodíka	v-a M znamená sodík, v 2 ml vody.	Za miešania sa v

dvoch dávkach pridá 30 mg borohydridu sodného. pH sa upraví na hodnotu medzi 9 a 10 pridaním roztoku hydroxidu sodného s koncentráciou 0,5 mol/1. Po 12 hodinách sa postupne pridáva kyselina octová, až kým sa nedosiahne hodnota pH medzi 4 a 5. Zmes sa mieša počas 1 hodiny, potom sa pH upraví na hodnotu 6,7 pridaním roztoku hydroxidu sodného s koncentráciou 0,5 mol/1. Zmes sa potom zriedi destilovanou vodou v takom množstve, aby sa získala zmes s objemom 20 ml. Pridajú sa 2 g octanu sodného a potom sa prilejú 3 objemy metanolu. Suspenzia sa prefiltruje cez membránu Whatman GF/B a izolovaný tuhý podiel sa dvakrát premyje 1 ml metanolu. Po vysušení sa získa 68 mg bieleho tuhého produktu. Po kontrole vysoko výkonnou kvapalinovou chromatografiou sa zistilo, že produkt nie je celkom redukovaný, a preto sa zopakujú všetky predchádzajúce operácie. Po vysušení sa získa mg oligosacharidu všeobecného vzorca I, v ktorom R¹, R², R³, R⁵, R⁷ a R⁸ znamenajú skupinu SO3M, R⁴ a R⁶ znamenajú atóm vodíka a M znamená sodík, vo forme zmesi diastereoizomérov.

I až VIII sú konštitutívne cukry oktasacharidov, pričom I je redukovaný zvyšok a VIII je zvyšok nenasýtenej kyseliny urónovej [(kyselina 4-deoxy-2-0-sulfo-alfa-L-treo-hex-4-enopyranozylurónová-(1—>4 ) -2-deoxy-6-0-sulfo-2-sulfoamino-alfa-D-glukopyranozyl- (1—>4) -kyselina 2-0-sulfo-alfa-L-idopyranozylurónová- (1—>4)-2-deoxy-2-sulfoamino-6-0-sulfo-alfa-D-glukopyranozyl- (1—»4)-kyselina 2-O-sulfo-alfa-L-idopyranozylurónová-(1—>4) -2-deoxy-β-Ο-sulfo-2-sulfoamino-alfa-D-glukopyranozyl-(l->4) - kyselina 2-0-sulfo-alfa-L-idopyranozylurónová- (1—>4) -2-deoxy-6-0-sulfo-2-sulfoamino-D-glucinol, hexadekasodná soľ); (kyselina 4-deoxy-2-0-sulfo-alfa-L-treo-hex-4-enopyranozylurónová- (1—>4 ) -2-deoxy-6-0-sulfο-2-sulfoamino-alfa-D-glukopyranozyl- (1—>4) -kyselina 2-0-sulfo-alfa-L-idopyranozylurónová-(l—>4) — -2-deoxy-6-0-sulf oamino-alf a-D-glukopy ráno zyl- (l->4 ) - kyselina 2-0-sulfo-alfa-L-idopyranozylurónová- (l-»4) -2-deoxy-6-0-sulfo-2-sulfoamino-alfa-D-glukopyranozyl- (1—>4) -kyselina 2-0-sulfo-alfa-L-idopyrapozylurónová- (l->4)-2-deoxy-6-0-sulfo-2-sulfoamino-D-manitol, hexadekasodná sol);

protó:	nové	spektrum v	D₂0, 600 MHz, T = 305 K, delta v	ppm:
3,25	(3H,	m,	H-2^(III),	H-2^(V), H-2^(VII)),
3,38	(IH,	m,	H-2 ¹¹¹) ,
3, 61	(3H,	m,	H-3^(III),	H-3^(V), H-3^(VII>),
medzi	3,7C	1 a	3,83 (5H	, masív, 2H-1^(I) a H-4^(III), H-4^(V),	H-4^ÍVII)),
3,86	(IH,	t,	J = 5 Hz	, H-3^(I)),
4,00	(3H,	m,	H-5^(III),	H-5^(V), H-5^VII)),
4,08	(3H,	m,	H-4^(I), H	-4^(IV), H-4^(VI)),
medzi		4,1	0 a	4,45 (17H, masiv, H-	-5^(I)/2H-6^(I),
H-2^(I1	¹ /H-3	(II)	/H-4^(II>,	2H-6^(III), H-2 ^(IV1/H-3^(IV),	2H-6^(V),
H-2^(VI	’/H-3	(VI)	, 2H-6^VII)	, H-3^(VIII)),
4,59	(IH,	S,	H_2<^VIII))	t
4,62	(IH,	S,	H-R^(II) ) ,

4,78	(2H,	s,	H-5^(IV), H-5^(VI)),
5, 17	(2H,	S,	H⁽v>, h-1^(VII)),
5,44	(1H,	d,	J = 3 Hz, H-1^(III)) ,
5,47	(1H,	s,	H-1^(VIII>),
5, 96	(1H,	d,	J = 5 Hz, H-4‘^VIIIÍ)

Príklad 5

Do reaktora sa naleje roztok 65 mg oligosacharidu všeobecného vzorca II s teplotou 25 °C, v ktorom n je rovné 4, R¹, R², R³, R⁵, R⁷ a R⁸ znamenajú skupinu SO₃M, R⁴ a R⁶ znamenajú atóm vodíka a M znamená sodík, v 1,2 ml vody. Za miešania sa naraz pridá 18 mg borohydridu sodného. pH sa upraví na hodnotu medzi 9 a 10 pridaním roztoku hydroxidu sodného s koncentráciou 0,5 mol/l. Po 12 hodinách sa postupne pridáva kyselina octová až kým sa nedosiahne pH medzi 4 a 5. Zmes sa potom mieša počas jednej hodiny, potom sa pH reakčnej zmesi upraví na hodnotu 6,7 pridaním roztoku hydroxidu sodného s koncentráciou 0,5 mol/l. Zmes sa následne zriedi 3 ml 10 % vodného roztoku octanu sodného a k roztoku sa prilejú 3 objemy metanolu (12 ml). Suspenzia sa prefiltruje a izolovaný tuhý produkt sa premyje 3 ml metanolu. Po vysušení sa získa 54 mg oligosacharidu všeobecného vzorca I, v ktorom n je rovné 4, R¹, R², R³, R⁵, R⁷ a R⁸ znamenajú skupinu

I až X sú konštitutívne cukry dekasacharidov, pričom I je redukovaný zvyšok a X je zvyšok nenasýtenej kyseliny urónovéj [(kyselina 4-deoxy-2-0-sulfo-alfa-L-treo-hex-4-enopyranozylurónová-(l->4)-2-deoxy-2-sulfoamino-6-0-sulfo-alfa-D-glukopyranozyl- (l-»4 ) - kyselina 2-O-sulfo-alfa-L-idopyranozylurónová-( l->4) -2-deoxy-6-0-sulfo-2-sulfoamino-alfa-D-glukopyranozyl-(1—>4) - kyselina 2-O-sulfo-alfa-L-idopyranozylurónová- (1—>4) -2-deoxy-6-0-sulfo-2-sulfoamino-alfa-D-glukopyranozyl- (1—>4) -kyselina 2-O-sulfo-alf a-L-idopyranozylurónová - (l->4 ) -2-deoxy-6-0-sulfo-2-sulfoamino-alfa-D-glukopyranozyl - (l->4)-kyselina 2-O-sulfo-alfa-L-idopy23 ránozylurónová- (l-»4)-2-deoxy-6-0-sulfo-2-sulfoamino-D-glucitol, eikosodná soľ); (kyselina 4-deoxy-2-0-sulfo-alfa-L-treo-hex-4-enopyranozylurónová- (1—»4) -2-deoxy-6-0-sulfo-2-sulfoamino-alfa-D-glukopyranozyl- (1—>4)—kyselina 2-0-sulfo-alfa-L-idopyranozylurónová- (1—>4)-2-deoxy-6-0-sulfoamino-alfa-D-glukopyranozyl-(1—>4 ) - kyselina 2-0-sulfo-alfa-L-idopyranozylurónová- (1—>4 ) -2-deoxý-β-0-sulfo-2-sulfoamino-alfa-D-glukopyranozyl- (1—»4) - kyselina 2-0-sulfo-alfa-L-idopyranozylurónová-(1—>4) -2-deoxy-6-0-sulfo-2-sulfoamino-alfa-D-glukopyranozyl-(l-»4) -kyselina 2-0-sulfo-alfaL-idopyranozylurónová- (l-»4) -2-deoxy-6-0-sulfo-2-sulfoamino-D-manitol, eikosodná soľ);

protónové spektrum v D₂0, 600 MHz, T = 303 K, delta v ppm:

3,23	(4H,	m,	H-2^(I11	’, H-2^(V),	H-2	(VII) r	H
3, 35	(1H,	m,	H-2^(I))	Z
3,59	(4H,	m,	H-3^(m	>, H-3^1V),	H-3	(VII) r	H
medzi	3, 65	i a	3,80 (	6H, m) ,
3,85	(2H,	m,	H —3^ťI>)	Z
medzi	3, 9C	) a	4,40 (	29H, m),
4,57	(1H,	m,	H-2^(X))	Z
4,59	(1H,	m,	H-5^,ii!	),
4,57	(3H,	m,’	H-5^(IVi	, H-5^lVI),	H-5	(VIII) )	Z
5,15	(3H,	m,	H-1^(IV1	, H-1^(VI),	H-l	(VIII) J	z
5,25	(1H,	m,	H-1^(II>	),
5,37	(3H,	m,	H-1^(V1,	H-1^(VII),	H-l	^(IX1),
5,42	(1H,	m,	H-1^(I11
5,45	(1H,	m,	H-1^(X))	Z
5, 93	(1H,	d,	J = 5	Hz, H-4^<X)	) ·

Liečivá podľa vynálezu obsahujú ako účinnú látku aspoň jeden oligosacharid všeobecného vzorca I alebo zmes oligosacharidov všeobecného vzorca I vo forme kompozície, v ktorej je tento aspoň jeden oligosacharid v kombinácii s ľubovoľným iným farmaceutický kompatibilným produktom, ktorý môže byť inertný alebo fyziologicky účinný. Liečivá podľa vynálezu sa môžu podávať intravenózne, subkutánne, orálne, rektálne, topicky alebo pulmonálne (inhaláciou).

Sterilné kompozície na intravenózne alebo subkutánne podanie sú všeobecne tvorené vodnými roztokmi. Tieto kompozície môžu rovnako obsahovať prísady, najmä zmáčadlá, izotonizujúce činidlá, emulgačné činidlá, dispergačné činidlá a stabilizačné činidlá. Sterilizácia sa môže uskutočniť rôznymi spôsobmi, napríklad aseptizujúcou filtráciou, zabudovaním sterilizačných činidiel do kompozície alebo ožiarením. Tieto kompozície sa môžu rovnako pripraviť vo forme sterilných tuhých kompozícií, ktoré sa môžu bezprostredne pred použitím rozpustiť v sterilnej vode alebo v inom ľubovoľnom sterilnom injikovatelnom prostredí.

Ako tuhé kompozície na orálne podanie sa môžu použiť tablety, pilulky, prášky (v želatínových kapsuliach alebo vreckách) alebo granuly. V týchto kompozíciách sa účinná látka zmieša pod prúdom argónu s jedným alebo viacerými inertnými riedidlami, akými sú napríklad škrob, celulóza, sacharóza, laktóza alebo silika. Tieto kompozície môžu rovnako obsahovať látky iné než riedidlá, ako napríklad jedno alebo niekoľko mazív, napríklad stearát horečnatý alebo mastenec, činidlo, ktoré podporuje orálnu absorpciu, farbivo, povlakovú látku (dražé) alebo lak.

Ako kvapalné kompozície na orálne podanie sa môžu použiť farmaceutický prijateľné roztoky, suspenzie, emulzie, sirupy a elixíry, ktoré obsahujú inertné riedidlá, akými sú napríklad voda, etanol, glycerol, rastlinné oleje alebo parafínový olej; Tieto kompozície môžu rovnako obsahovať iné látky než riedidlá, ako napríklad zmáčadlá, sladidlá, zahusťovadlá, aromatizačné látky alebo stabilizačné činidlá.

Kompozície na rektálne podanie sú čapíky alebo rektálne kapsule, ktoré okrem účinnej látky obsahujú pomocné látky, akými sú napríklad kakaové maslo, polosyntetické glyceridy alebo polyetylénglykoly.

Kompozície na topické podanie môžu byť napríklad krémy, lotiony, ústne dezinfekčné prostriedky, náplasti, nosné kvapky alebo aerosóly.

Podané dávky účinnej látky budú závisieť od požadovaného účinku, od doby liečenia a od spôsobu podania. Tieto dávky sa všeobecne pohybujú medzi 0,5 a 10 mg/kg/deň pre subkutánne podanie, čo predstavuje dennú dávku 3 až 60 mg v prípade dospelého pacienta s telesnou hmotnosťou 60 kg.

Všeobecne to bude ošetrujúci lekár, ktorý stanoví dávkovanie účinnej látky v závislosti od veku, telesnej hmotnosti a všetkých ďalších osobných faktorov liečeného pacienta.

Vynález sa rovnako týka použitia oligosacharidov pódia vynálezu na prípravu liečiva určeného na prevenciu alebo liečenie chorôb spojených so zápalovým procesom, ktorý zahŕňa tvorbu oxidu dusnatého (NO), alebo určeného na prežitie a rast motoneurónov.

Vynález je obzvlášť výhodný na použitie oligosacharidov všeobecného vzorca I na prípravu liečiv určených na prevenciu a liečenie cerebrálnych, srdecových alebo periférnych vaskulárnych ischémií, osteoartritíd, poranenia centrálnej nervovej sústavy, poranenia lebky, chrbtice a kombinovaného poranenia lebky a chrbtice, roztrúsenej sklerózy, neuropatických bolestí a periférnych neuropatií, ochorenia motoneurónov, amyotrofnej laterálnej sklerózy, neuro-AIDS, Alzheimerovej choroby, Parkinsonovej choroby a Huntingtonovej chorei.

Vynález sa rovnako týka spôsobu prevencie alebo/a liečenia chorôb spojených so zápalovým procesom, ktorý zahŕňa tvorbu cytotoxických látok, akou je napríklad oxid dusnatý (NO), a ochorení spojených s prežitím a rastom motoneurónov. Oligosacharidy všeobecného vzorca I sa môžu takto použiť na prevenciu alebo/a liečenie neurodegeneratívnych chorôb, v ktorých hrá cerebrálny zápal zhubnú úlohu, ktorý prípadne končí smrťou, pričom z týchto chorôb je možné uviesť cerebrálnu ischémiu, srdcovú ischémiu (infarkt myokardu), periférnu ischémiu, poranenie nervovej sústavy a najmä poranenie chrbtice a kombinované poranenie lebky a chrbtice, roztrúsenú sklerózu, neuropatické bolesti a periférnu neuropatiu, ochorenie motoneurónov, ako napríklad amyotrofnú laterálnu sklerózu, progresívnu spinálnu atrofiu, infantilnú svalovú atrofiu a primárnu laterálnu sklerózu, neuro-AIDS, Alzheimerovu chorobu, Parkinsonovu chorobu a Huntingtonovu choreu a niektoré formy osteoartritíd, najmä s kĺbovou lokalizáciou.

Vynález sa rovnako týka spôsobu prevencie alebo/a liečenia motoneuronálnych ochorení, akými sú napríklad amyotrófna laterálna skleróza, progresívna spinálna atrofia, infantilná svalová atrofia a primárna laterálna skleróza.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutická kompozícia, ktorá obsahuje ako účinnú látku oligosacharid všeobecného vzorca I

NHR⁷ v ktorom n znamená celé číslo od 0 do 25, R¹, R³, R⁴, R⁵, R° a R⁸> ktoré sú rovnaké alebo odlišné, znamenajú atómy vodíka alebo skupinu SO3M, R² a R⁷, ktoré sú rovnaké alebo odlišné, znamenajú atómy vodíka alebo skupinu SO3M alebo skupinu COCH3 a M znamená sodík, vápnik, horčík alebo draslík, alebo zmes týchto oligosacharidov .
2. Farmaceutická kompozícia podlá nároku 1, vyznačujúca sa tým, že obsahuje oligosacharid všeobecného vzorca I, v ktorom R⁴ a R⁶ znamenajú atóm vodíka, alebo zmes týchto oligosacharidov.
3. Farmaceutická kompozícia podlá niektorého z nárokov 1 alebo 2, vyznačujúca sa tým, že obsahuje oligosacharid všeobecného vzorca I, v ktorom n znamená celé číslo od 0 do 10, alebo zmes týchto oligosacharidov.
4. Farmaceutická kompozícia podlá niektorého z nárokov 1 alebo 2, vyznačujúca sa tým, že obsahuje oligosacharid všeobecného vzorca I, v ktorom n znamená celé číslo od 0 do 6, alebo zmes týchto oligosacharidov.
5. Farmaceutická kompozícia podlá niektorého z nárokov 1 alebo

2, vyznačujúca sa tým, že obsahuje oligosacharid všeobecného vzorca I, v ktorom n znamená celé číslo od 1 do 6, alebo zmes týchto oligosacharidov.
6. Farmaceutická kompozícia podlá nároku 1, vyznačujúca sa tým, že obsahuje oligosacharid všeobecného vzorca I, v ktorom n je rovné 0, R¹, R⁷ a R⁸ znamenajú skupinu

SO₃M, R⁶ znamená atóm vodíka a M znamená sodík.
7. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že obsahuje oligosacharid všeobecného vzorca I, v ktorom n je rovné 1, R¹, R², R³, R⁵, R⁷ a R⁸ znamenajú skupinu SO₃M, R⁴ a R⁶ znamenajú atóm vodíka a M znamená sodík.
8. Farmaceutická kompozícia podľa nár-oku 1, vyznačujúca sa tým, že obsahuje oligosacharid všeobecného vzorca I, v ktorom n je rovné 2, R¹, R², R³, R⁵, R⁷ a R⁸ znamenajú skupinu SO3M, R⁴ a R⁶ znamenajú atóm vodíka a M znamená sodík.
9. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že obsahuje oligosacharid všeobecného vzorca I, v ktorom n je rovné 3, R¹, R², R³, R⁵, R⁷ a R⁸ znamenajú skupinu SO₃Mjr R⁴ a R⁶ znamenajú atóm vodíka a M znamená sodík.
10. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že obsahuje oligosacharid všeobecného vzorca I, v ktorom n je rovné 4, R¹, R², R³, R⁵, R⁷ a R⁸ znamenajú skupinu SO3M, R⁴ a R⁶ znamenajú atóm vodíka a M znamená sodík.
11. Oligosacharid všeobecného vzorca I

NHR⁷ n

(I) v ktorom n znamená celé číslo od 0 do 25, R¹, R³, R⁴, R⁵, R⁶ a R⁸, ktoré sú rovnaké alebo odlišné, znamenajú atóm vodíka alebo skupinu SO3M, R² a R⁷, ktoré sú rovnaké alebo odlišné, znamenajú atóm vodíka, alebo skupinu SO3M alebo skupinu COCH3 a M znamená sodík, vápnik, horčík alebo draslík,

I s výnimkou oligosacharidov všeobecného vzorca I, v ktorom n je rovné 0 a buď R¹, R⁶ a R⁸ znamenajú atómy vodíka, R⁷ znamená skupinu SO3M alebo skupinu COCH3 a M znamená sodík, alebo R¹ a R⁶znamenajú atóm vodíka, R⁷ znamená skupinu COCH3, R⁸ znamená skupinu SO3M a M znamená sodík, alebo R⁶ znamená atóm vodíka, R¹, R⁷a R⁸ znamenajú skupinu SO₃M a M znamená sodík, alebo R⁶ a R⁷znamenajú atómy vodíka, R¹ a R⁸ znamenajú skupinu SO3M a M znamená sodík, alebo R¹, R⁶ a R⁷ znamenajú atóm vodíka, R⁸ znamená skupinu SO3M a M znamená sodík.
12. Oligosacharid všeobecného vzorca I podľa nároku 11, v ktorom R⁴ a R⁶ znamenajú atóm vodíka.
13. Oligosacharid všeobecného vzorca I podľa niektorého z nárokov 11 alebo 12, v ktorom n znamená celé číslo od 0 do 10.
14. Oligosacharid všeobecného vzorca I podľa niektorého z nárokov 11 alebo 12, v ktorom n znamená celé číslo od 0 do 6.
15. Oligosacharid všeobecného vzorca I podľa niektorého z nárokov 11 alebo 12, v ktorom n znamená celé číslo od 1 do 6.
16. Oligosacharid všeobecného vzorca I podľa nároku 11, v ktorom n je rovné 0, R¹, R⁷ a R⁸ znamenajú skupinu SO3M, R⁶ znamená atóm vodíka a M znamená sodík.
17. Oligosacharid všeobecného vzorca I podľa nároku 11, v ktorom n je rovné 1, R¹, R², R³, R⁵, R⁷ a R⁸ znamenajú skupinu

SO3M, R⁴ a R⁶ znamenajú atóm vodíka a M znamená sodík.
18. Oligosacharid všeobecného vzorca I podľa nároku 11, v ktorom n je rovné 2, R¹, R², R³, R⁵, R⁷ a R⁸ znamenajú skupinu

SO3M, R⁴ a R⁶ znamenajú atóm vodíka a M znamená sodík.
19. Oligosacharid všeobecného vzorca I podlá nároku 11, v ktorom n je rovné 3, R¹, R², R³, R⁵, R⁷ a R⁸ znamenajú skupinu

SO3M, R⁴ a R⁶ znamenajú atóm vodíka a M znamená sodík.
20. Oligosacharid všeobecného vzorca I podľa nároku 11, v ktorom n je rovné 4, R¹, R^r, R³, R⁵, R⁷ a R⁸ znamenajú skupinu

SO3M, R⁴ a R⁶ znamenajú atóm vodíka a M znamená sodík.
21. Spôsob prípravy oligosacharidov všeobecného vzorca I podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že sa uvedie do reakcie borohydrid alkalického kovu alebo kvartérneho amónia s oligosacharidmi všeobecného vzorca II

NHR⁷ v ktorom n znamená celé číslo od 0 do 25, R¹, R³, R⁴ a R⁵, ktoré sú rovnaké alebo odlišné, znamenajú atóm vodíka alebo skupinu SO3M, R² a R⁶, ktoré sú rovnaké alebo odlišné, znamenajú atóm vodíka alebo skupinu SO3M alebo skupinu COCH₃ a M znamená sodík, vápnik, horčík alebo draslík, pričom sa potom izolujú získané oligosacharidy.
22. Spôsob podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že sa reakcia uskutočňuje vo vodnom prostredí, pri teplote blízkej 25 °C a pri hodnote pH 7 až 10.
23. Spôsob júci podľa niektorého z nárokov 21 a 22, vyznačut ý m , že sa reakcia uskutočňuje pri hodnote pH
24. Spôsob podlá nároku 21 až 23, vyznačujúci sa tým, že borohydridom alkalického kovu alebo kvartérneho amónia je borohydrid lítny, sodný alebo draselný alebo tetrabutylamóniumborohydrid.

9 až 10.

v ktorom n znamená celé číslo od 0 do
25, R¹, R³, R⁴, R⁵, R^c a R⁸, ktoré sú rovnaké alebo odlišné, znamenajú atóm vodíka alebo skupinu SO₃M, R² a R⁷, ktoré sú rovnaké alebo odlišné, znamenajú atóm vodíka ...alebo skupinu SO3M alebo skupinu COCH3 a M znamená sodík, vápnik, horčík alebo draslík, alebo zmesi týchto oligosacharidov na prípravu liečiva, ktoré je určené na prevenciu alebo liečenie ochorení spojených so zápalovým procesom, ktorý zahŕňa tvorbu oxidu., dusnatého (NO).
26. Použitie oligosacharidov všeobecného vzorca I podlá nároku 25 na prípravu liečiv určených na prevenciu a liečenie cerebrálnych, srdcových alebo periférnych vaskulárnych ischémií, osteoartritíd, poranenia centrálnej nervovej sústavy, poranenia lebky, chrbtice a kombinovaného poranenia lebky a chrbtice, roztrúsenej sklerózy, neuropatických chorôb a periférnych neuropatií, chorôb motoneurónu, amyotrofnej laterálnej sklerózy, neuro-AIDS, Alzheimerovej choroby, Parkinsonovej choroby a Huntingtonovej chorei.
27. Použitie oligosacharidov všeobecného vzorca I

NHR⁷ v ktorom n znamená celé číslo od 0 do 25, R¹, R³, R⁴, R⁵, R⁶ a R⁸, ktoré sú rovnaké alebo odlišné, znamenajú atóm vodíka alebo skupinu SO3M, R² a R⁷, ktoré sú rovnaké alebo odlišné, znamenajú atóm vodíka alebo skupinu SO₃M alebo skupinu COCH3 a M znamená sodík, vápnik, horčík alebo draslík, alebo zmesi týchto oligosacharidov na prípravu liečiva určeného na prevenciu 7 a/alebo liečenie ochorení, ktoré sú spojené s prežitím a rastom motoneurónov.