WO2007026485A1 - ユニバーサル塩基 - Google Patents

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WO2007026485A1
WO2007026485A1 PCT/JP2006/314834 JP2006314834W WO2007026485A1 WO 2007026485 A1 WO2007026485 A1 WO 2007026485A1 JP 2006314834 W JP2006314834 W JP 2006314834W WO 2007026485 A1 WO2007026485 A1 WO 2007026485A1
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dmso
mmol
natural
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PCT/JP2006/314834
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English (en)
French (fr)
Inventor
Masanori Kataoka
Original Assignee
Inter-University Research Institute Corporation National Institutes Of Natural Sciences
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F7/00—Compounds containing elements of Groups 4 or 14 of the Periodic Table
    • C07F7/02—Silicon compounds
    • C07F7/08—Compounds having one or more C—Si linkages
    • C07F7/18—Compounds having one or more C—Si linkages as well as one or more C—O—Si linkages
    • C07F7/1804—Compounds having Si-O-C linkages

Definitions

  • the present invention relates to a novel universal base capable of non-specifically forming base pairs with four kinds of natural nucleobases.
  • Non-patent document 1 discloses many attempts have been made to obtain artificial nucleobases that form non-specific pseudo-pairs with natural nucleobases.
  • universal bases are a class of intercalators that do not form pseudo-base pairs with natural nucleobases.
  • inosine-based derivatives are known as universal bases that form pseudo-base pairs (Patent Documents 1, 2, etc.), but recent studies have revealed that they only act as guanines. (Non-patent document 1).
  • Non-Patent Document 2 the pyrimido [4,5-d] pyrimidine-2,4,5,7-tetraone and its derivatives used as the base of the universal base by the inventor form a pseudo-base pair with a natural nucleobase. It was not thought (Non-Patent Document 2).
  • Patent Document 1 Special Table 2005-511096
  • Patent Document 2 Special Table 2003-528883
  • Non-patent literature l Ohtsuka, E. et al, J. Biol. Chem., 260, 2605-2608 (1985)
  • Non-patent literature 2 Niess, R., Robins, RKJ Heterocyclic. Chem., 7, 243-244 (1970) Invention Disclosure
  • the present invention has no function of specifically recognizing opposite natural nucleobases (A, T, C, G) and forming base pairs, and is non-specific to any of the four natural nucleobases. It is an object of the present invention to provide an artificial nucleobase that forms a base pair.
  • R represents a monovalent group that removes a hydrogen atom
  • R is a universal base that can form non-specific base pairs with four natural nucleobases.
  • the present invention is also a method for forming these base pairs by mixing the above-mentioned universal bases in a solution containing natural nucleobases or oligonucleotides composed of natural nucleobases.
  • the universal base of the present invention is a novel compound having a completely different structure from the compound conventionally known as a universal base.
  • This universal base forms a pseudo base pair by dynamically changing its structure in response to the opposite base.
  • the universal base of the present invention has a structure having a substituent on the nitrogen atom at the 1-position of pyrimido [4,5-d] pyrimidine-2,4,5,7-tetraone (I ⁇ 1), and is represented by the following formula: Is done.
  • R may be any monovalent group except a hydrogen atom. It is preferable that the base pair is dissolved in a solution containing a natural nucleobase to be formed into a base pair or an oligonucleotide composed of a natural nucleobase at a concentration necessary to form a base pair, and there is no problem in base pair formation.
  • R for example, a hydrocarbon group that may contain a heteroatom (S, O, N, etc.), for example, an alkyl group, an alkenyl group, an alkyl group, an aryl group, a heterocyclic group, etc. It may be a protein, peptide fragment, natural nucleic acid, other artificial nucleic acid, synthetic polymer such as styrene beads, or the like. These may also be subjected to various efforts such as reactive groups and chromophores.
  • a heteroatom for example, an alkyl group, an alkenyl group, an alkyl group, an aryl group, a heterocyclic group, etc.
  • It may be a protein, peptide fragment, natural nucleic acid, other artificial nucleic acid, synthetic polymer such as styrene beads, or the like. These may also be subjected to various efforts such as reactive groups and chromophores.
  • R is preferably a natural or non-natural oligonucleotide chain.
  • R is preferably a water-soluble functional group such as an alkyl group having a hydroxyl group, a thiol group, a carboxyl group, an amide group, or an amidin group.
  • R is preferably a fat-soluble functional group, for example, an alkyl group having 5 or more carbon atoms or an alkyl group containing a siloxane group, an ester group, an aryl group, or the like.
  • the universal base of the present invention can be a purine-type or a pyrimidine-type base by rotation about the bond. That is, the universal base of the present invention, as shown in the following formula, when the opposite base is an adenine type base (A) or cytosine (C), an amide type configuration, or an amide type base guanine. Amidine type arrangement for (G) or thymine (T) To form base pairs with all natural nucleobases.
  • the solvent used when the universal base of the present invention forms a base pair with a natural nucleobase is generally preferably an aprotic organic solvent.
  • DMSO and DMF are preferred when considering the adsorption of water, alcohol, and nucleosides when considering the synthesis and use of buffers and oligonucleotides.
  • the concentration of universal base or natural nucleobase is usually about ImM.
  • PPT 5,7-Tetraone derivative
  • PPT (H) is completely insoluble in water and various organic solvents.
  • 1-alkyl substituents have a solubility of 100 M or more even with simple methyl, ethyl, and aryl.
  • the improvement in solubility in aqueous solutions becomes significant when a heterofunctional alkyl substituent having 1 or more carbon atoms is introduced, and the solubility in organic solvents is improved by introducing an alkyl group having 3 or more carbon atoms into the 1-position nitrogen atom. Or it becomes remarkable by introduction
  • This DMSO is an anhydrous dimethyl sulfoxide in which oxygen is removed by freezing and degassing and the argon is dissolved, and it is prepared in advance and mixed with the DMSO solution of the substrate and left overnight (12 hours). What was done was used.
  • Fig. 2 shows a plot of the absorbance at the wavelength at which the absorbance changed versus the mixing ratio. If there is no interaction between the substrates, the absorbance of the substrate's absorption spectrum is proportional to the mixing ratio (Beer's law), but if the linear force determined by the Beer's law deviates, the interaction between the substrates Existence is suggested.
  • 2-Amino-6-chloro-9-methylpurine was used as a starting material, and a methyl group was introduced according to the literature. At that time, purification by the column described in the literature was not carried out and the process proceeded to the next stage.
  • Benzyl alcohol (40 mL) and metal sodium (760 mg, 23.5 mmol) were stirred in an lOOmL eggplant flask using a magnetic stir bar for 1 hour at room temperature. Thereto was added 2-amino-6-clo-9-methylpurine (1.98 g, 7.8 mmol), and the mixture was stirred at 70 ° C. for 48 hours.
  • the reaction solution was separated with ethyl acetate water, and the water tank was extracted twice with ethyl acetate. The organic layers were combined, washed with saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure.
  • the universal base of the present invention includes cloning of unspecified genes and unspecified genes in PCR methods, detection of single nucleotide polymorphisms in the human genome, suppression of unspecified gene expression by anti-gene methods, and nucleic acid components. Highly selective extraction and removal of In these cases, this universal base may be introduced into another artificial nucleic acid, introduced into another biological substance, or supported on polystyrene beads depending on the application. In addition, this universal base alone can be used for selective removal and extraction of nucleotide components.
  • Fig. 1 is a graph showing changes in absorbance of a mixture of the universal base (PPT) of the present invention and four natural nucleobases.
  • FIG. 2 is a plot of the absorbance in FIG. 1 against the mixing ratio.
  • FIG. 3 is a graph showing changes in absorbance of a mixture of AT and GT.
  • FIG. 4 is a plot of the absorbance in FIG. 3 against the mixing ratio.

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Abstract

　【課題】　　相対する天然核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）を特異的に認識し塩基対を形成するという機能を全くもたず、４種のいずれの天然核酸塩基とも非特異的に塩基対を形成する人工核酸塩基を提供する。 　【解決手段】　　下式 （式中、Ｒは、水素原子を除く、一価の基を表す。）で表され、４種の天然核酸塩基と非特異的に塩基対を形成することのできるユニバーサル塩基である。 　

Description

明 細 書
ユニバーサル塩基
技術分野
[0001] この発明は、非特異的に 4種の天然核酸塩基と塩基対を形成することのできる新規 なユニバーサル塩基に関する。 背景技術
[0002] 天然核酸塩基と非特異的に擬似塩基対を形成する人工核酸塩基、即ちュニバー サル塩基を得る試みは多く成されている。しかし、一般にユニバーサル塩基と呼ばれ ているものはインターカレーターの類であり、これは天然核酸塩基と疑似塩基対を形 成することはない。一方、疑似塩基対を形成するユニバーサル塩基としてイノシンを ベースとした誘導体が知られているが（特許文献 1、 2等）、グァニンとしてのみふるま うことが最近の研究で明らかとなつて 、る (非特許文献 1)。
本発明において、発明者がユニバーサル塩基のベースとして利用したピリミド [4,5- d]ピリミジン- 2,4,5,7-テトラオン及びその誘導体は、天然核酸塩基と疑似塩基対を形 成するとは考えられて 、なかった (非特許文献 2)。
[0003] 特許文献 1 :特表 2005- 511096
特許文献 2：特表 2003-528883
非特許文献 l : Ohtsuka, E. et al, J. Biol. Chem., 260, 2605-2608(1985) 非特許文献 2 : Niess, R.， Robins, R. K. J.Heterocyclic. Chem., 7, 243-244(1970) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明は、相対する天然核酸塩基 (A、 T、 C、 G)を特異的に認識し塩基対を形成 するという機能を全く持たず、 4種のいずれの天然核酸塩基とも非特異的に塩基対を 形成する人工核酸塩基を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明者らは、ピリミド [4,5-d]ピリミジン- 2,4,5,7-テトラオン（下式）
Figure imgf000003_0001
に注目した。この無置換のピリミド [4,5-d]ピリミジン- 2,4,5,7-テトラオンは水や有機溶 媒に対する溶解度が極めて低ぐ通常天然核酸塩基と塩基対を形成する場は溶液 状態であるため、目的とする塩基対形成機能を実現することができない。そこで、発 明者らは、この 1位に水素原子以外のアルキル基等を導入したところ、水や有機溶媒 に対する溶解度が上がり、実際に天然核酸塩基と塩基対を形成するための溶液中 の濃度程度に溶解することを見出し、更に、 4種の天然核酸塩基との塩基対形成試 験を行ったところ、当該化合物が 4種のいずれの天然核酸塩基とも非特異的に塩基 対を形成することを見出し、本発明を完成するに至った。
[0006] 即ち、本発明は、下式
[化 1]
Figure imgf000003_0002
(式中、 Rは、水素原子を除ぐ一価の基を表す。）で表され、 4種の天然核酸塩基と 非特異的に塩基対を形成することのできるユニバーサル塩基である。
また本発明は、天然核酸塩基又は天然核酸塩基から成るオリゴヌクレオチドを含む 溶液に上記ユニバーサル塩基を混合することによりこれらの塩基対を形成させる方 法である。
発明の効果
[0007] 本発明のユニバーサル塩基は、従来ユニバーサル塩基と称されてきたィ匕合物とは 構造が全く異なる新規な化合物である。このユニバーサル塩基は、相対する塩基に 呼応して動的に構造を変化させることにより疑似塩基対を形成する。
発明を実施するための最良の形態 本発明のユニバーサル塩基は、ピリミド [4,5- d]ピリミジン- 2,4,5,7-テトラオン (ィ匕 1) の 1位の窒素原子に置換基を有する構造を持ち、下式で表される。
[化 1]
Figure imgf000004_0001
式中、 Rは、水素原子を除く一価の基であれば如何なるものでもよい。塩基対を形 成しようとする天然核酸塩基又は天然核酸塩基から成るオリゴヌクレオチドを含む溶 液に塩基対を形成するに必要な濃度で溶解し、塩基対形成に支障のないことが好ま しい。
[0009] このような Rとして、例えば、ヘテロ原子（S, O, Nなど）を含んでもよい炭化水素基 、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキ-ル基、ァリール基、複素環基などであ つてもよいし、タンパク質やペプチド断片、天然核酸や他の人工核酸、スチレンビー ズ等の合成ポリマー等であってもよい。また、これらに反応基や発色団などの各種マ 一力一を付してもよい。
また、例えば、 PCR法における配列未特定遺伝子や不特定遺伝子のクローニング を行う場合、ヒトゲノム中の一塩基多型の検出を行う場合には、又はアンチジーン法 による不特定遺伝子の発現抑制を行う場合には、 Rは天然又は非天然のオリゴヌタレ ォチド鎖が好ましい。核酸成分の高選択的抽出や除去をなどを行う場合には、 Rは 水溶性官能基、例えば、水酸基、チオール基、カルボキシル基、アミド基又はアミジ ン基等を有するアルキル基などが好まし 、。ヌクレオチド成分の選択的除去や抽出を 行う場合には、 Rは脂溶性官能基、例えば、炭素数が 5以上のアルキル基又はシロキ シ基、エステル基、ァリール基などを含むアルキル基などが好ましい。
[0010] 本発明のユニバーサル塩基は、その結合を軸とした回転により、プリン型、ピリミジ ン型の両塩基になりうる。即ち、本発明のユニバーサル塩基は、下式に示すように、 相対する塩基がアミジン型の塩基であるアデニン (A)又はシトシン (C)の場合はアミ ド型の配置、アミド型塩基であるグァニン (G)又はチミン (T)の場合はアミジン型配置 をとり、すべての天然核酸塩基と塩基対を形成することができる。
[化 3]
Figure imgf000005_0001
Figure imgf000005_0002
本発明のユニバーサル塩基を天然核酸塩基と塩基対を形成させる場合に用いる 溶媒は、一般的には非プロトン性有機溶媒が好ましいが、 DNAの溶解度や、生体内 で使うことを想定した場合には緩衝液、オリゴヌクレオチドの合成や利用を考えた場 合は水やアルコール、ヌクレオシドの吸着を考えた場合には DMSOや DMFが好ま L 、。この塩基対形成にお 、てはユニバーサル塩基や天然核酸塩基の濃度は通常 ImM程度である。
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものでは ない。
実施例 1
本実施例では、下式
[化 1]
Figure imgf000005_0003
(式中、 Rは、 -CH CH OTBDPSを表す。）で表されるピリミド [4,5- d]ピリミジン- 2,4
2 2 ,5,7-テトラオン誘導体 (以下「PPT」と ヽぅ。）を合成した
反応スキームを下式に示す。
[化 4]
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000006_0002
3 4 (PPT)
[0013] 1 ヒドロキシェチル 6 アミノウラシル（化合物 1)の合成
フッ素榭コートした撹拌子を備えた 200mLナス型フラスコに、無水エタノール 90m Lを力卩ぇ氷浴中撹拌しながら金属ナトリウム 2. 8g(120mmol)を注意深く加え、完全に 溶解するまで撹拌した。その後、 2 ヒドロキシェチル尿素 6.3g(60mmol)とシァノ酢酸 ェチル 6. 4mL(60mmol)を加え、 7時間還流させた。得られた反応溶液をろ過した後 、エタノールで洗い、水に溶解させて 1. 0M希塩酸で中和した後にろ過をし、得られ る白色固体を水で再結晶させることにより、白色結晶として化合物 1を得た (6.1g, 35.6 mmol、収率 59.4%) ; NMR (DMSO— d6, 400 MHz)： δ 3.54 (t, 2H, NCH CH , 9.
2 2
6 Hz), 3.83 (t, 2H, CH OH, 9.6 Hz), 4.57(br, IH, CHCNH ), 5.09 (br, IH, OH), 6,6
2 2
1 (br, 2H, NH ), 10.32 (br, IH, NH); 13C NMR (DMSO— d6, lOOMHz)： δ 44.13 (N
2
aC CH ), 59.28 (CH OH), 76.52 (CHCNH ), 151.87, 157.04, 162.89
2 2 2 2
[0014] l-(2-t-ブチルジフエ二ルシラ二口キシ)ェチル -6-アミノウラシル（化合物 2)の合成
フッ素榭脂コートした撹拌子を備えた 50 mLナス型フラスコに、上記で得た化合物 1 を 1.0 g(5.8 mmol), t-ブチルジフエ-リルクロロシラン (東京化成製、 1.7 mL, 6.4 mmol ),イミダゾール（ナカライ製、 875 mg, 12.8 mmol),ジメチルホルムアミド（キシダ製） 6 m Lを加え、 60°Cで 1.5時間反応させた後、撹拌している水 1L中に、ノ スツールピペット を用いてゆっくり滴下した。しばらく撹拌した後、ろ過し、乾燥させることにより、白色 固体として化合物 2を得た（2.2 g, 5.4 mmol,収率 92.0%)。
1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz): δ 0.96 (s, 9Η, C(CH ) ), 3.76 (br, 2H, NCH ), 4.04
3 3 2
(br, 2H, CH OH), 4.60 (br, 1H, CHCNH ), 6.70 (br, 2H, NH ), 7.41 (m, 6H), 7.58 (
2 2 2 m, 4H), 10.32 (br, 1H, NH); 13C NMR (DMSO— d6, 100 MHz): δ 19.11 (SiC(CH ) ),
3 3
26.92 (SiC(CH ) ), 42.06 (NCH CH ), 61.55 (NCH CH ), 76.15 (CHCNH ), 127.96, 1
3 3 2 2 2 2 2
28.33, 130.33, 130.08, 134.94, 135.48, 151.85, 158.75, 162.94
[0015] (6-ァミノ- l-「2- (t-ブチルジフエ-ルシラ -ロキシ)-ェチル 1-2.4-ジォキソ -1.2.3.4-テ トラヒドロピリミジン- 5-カルボニル）カルノ ミン酸ェチルエステル（化合物 3)の合成 フッ素榭脂コートした撹拌子を備えた 100 mLナス型フラスコに、上記で得た化合 物 2を 13.7 g(33.3 mmol)とジメチルホルムアミド (40 mL)をカ卩え、室温下で撹拌しなが ら滴下漏斗でイソシアナトギ酸ェチル 3.9 g (東京化成製、 33.9 mmol)を 30分かけて 滴下した。その後、室温で 24時間撹拌し、減圧濃縮し、減圧乾燥させ、酢酸ェチルで 洗浄することにより白色固体として化合物 3を得た（7.0 g, 13.3 mmol,収率 40.1%)。 JH NMR(DMSO-d6, 400 MHz): δ 0.94 (s, 9H, Si(CH ) ), 1.22 (t, 3H, OCH CH , 7.
3 3 2 3
2 Hz), 3.81 (br, 2H, NCH , 4.8 Hz), 4.12 (q, 2H, OCH CH , 4.8 Hz), 4.18 (t, 2H, N
2 2 3
CH CH , 4.8 Hz), 7.42 (m, 6H), 7.53 (M, 4H), 8.36 (br, 1H), 10.85 (br, 1H), 11.35 (b
2 2
r, 1H), 12.39 (br, 1H); 13C NMR (DMSO- d6, 100 MHz): δ 14.68 (OCH CH ), 19.05
2 3
(SiC(CH ) ), 26.89 (SiC(CH ) ), 43.12 (NCH ), 60.61 (OCH CH ), 61.12 (NCH CH ),
3 3 3 3 2 2 3 2 2
81.06 (COCCO), 128.30, 130.39, 132.94, 135.42, 148.77, 150.77, 159.94, 164.45, 166.23
[0016] 1-「2- (t-ブチルジフエ二ルシラニロキシ)-ェチル 1- 1H.8H-ピリミド「4,5- dlピリミジン- 2, 4.5.7-テトラオン (化合物 4)の合成
フッ素榭脂コートした撹拌子を備えた 50 mLナス型フラスコに、無水エタノーノレ (ナカ ライ製) 20 mLを加え氷浴中撹拌しながら金属ナトリウム 60 mg (ナカライ製、 2.6 mmol) を注意深く加え、完全に溶解するまで撹拌した。その後、上記で得た化合物 3を 600 mg(l.l mmol)を加え、 17時間還流させた。得られた反応溶液をろ過することにより得 られる固体を 1.0 M希塩酸で洗い、減圧乾燥させることにより、白色固体として化合物 4 (PPT)を得た（500 mg, 1.0 mmol,収率 91.6%)。
1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz): δ 0.94 (s, 9Η, SiC(CH ) ), 3.83 (t, 2H, NCH CH ),
3 3 2 2
4.23 (t, 2H, NCH CH ), 7.38 (m, 6H), 7.57 (m, 4H), 9.79 (br, 1H), 10.53 (br, 1H); 13
2 2
C NMR(DMSO-d6, 100 MHz): δ 19.16 (SiC(CH ) ), 27.03 (SiC(CH ) ), 42.27 (NCH
3 3 3 3
), 61.12 (NCH CH ), 86.04 (COCCO), 128.26, 130.14, 133.56, 135.43, 151.56, 157
2 2 2
.86, 161.62, 162.60, 164.78; MS (ESI+) 479.21 (M +H+ calcd 479.17)
実施例 2
本実施例では、実施例 1で得た PPTの溶解度を調べた。比較のため、 R=Hのもの (以下「PPT(H)」という。）に溶解度を調べた。
溶解試験は、表 1に示す各溶媒を用い、溶質の濃度を l〜100mMとし、該当濃度 において、一度 50°Cまで昇温した後、 27°Cまで冷却し、不溶物が残った場合「不溶 」とし、残らない場合「可溶」とした。緩衝液の濃度は 100mM、 pHは 7. 0とした。 結果を下表に示す。
[表 1]
Figure imgf000008_0001
PPT(H)は水及び各種有機溶媒に対して全く溶解しない。しかし、 1 アルキル置 換体は単純なメチル、ェチル、ァリルであっても 100 M以上の溶解性を示す。水溶 液に対する溶解度の向上は複素官能基化された炭素数 1以上のアルキル置換基の 導入で顕著となり、有機溶媒に対する溶解度の向上は 1位窒素原子への炭素数 3以 上のアルキル基の導入あるいはトリアルキルシロキシ基の導入で顕著となる。 実施例 3
[0018] 本実施例では、 PPTと 4種の天然核酸塩基との間の疑似塩基対形成を調べた c この試験のために下式
[化 5]
H3
Figure imgf000009_0001
9-メチルアデニン（A) 9-メチルグァニン（G) (C) 1-メチルチミン (T) の天然核酸塩基を用いた。これらの合成法は後述の合成例 1に示す。それぞれ 1位 又は 9位で塩基対形成をしな ヽように、 Nメチル化を行った。
[0019] 塩基対形成試験は以下の通りおこなった。
PPTと各 N—メチルイ匕天然核酸塩基（1—メチルシトシン（以下「C」という。）、 1—メ チルチミン（以下「T」という。）、 9—メチルアデニン（以下「Α」という。）、 9—メチルダ ァニン（以下「G」という。；)）との混合物の濃度を一定（7. 5mmol/l)に保ちつつ、混合 比（モル比）を 0 : 10〜： LO : 0に変化させて、 25°Cにおいて無水ジメチルスルホキシド (DMSO)に溶解させた。この DMSOは凍結脱気法によって酸素が除去されァルゴ ンが溶解して 、る無水ジメチルスルホキシドであって、あらかじめ作成してぉ 、た基 質の DMSO溶液を混合して一晩（12時間）放置したものを用いた。
その後、紫外領域の吸光度変化を下記の条件で測定した。
測定装置 JASCO V- 550 SERIAL NO. C02951260
温度コントローラー JASCO PSC-498T
セル GL Science Type： AB20- SQ- 0.1 (光路長 0.1mm)
セルアダプター CAS-10-1
測定波長： 200〜350nm
[0020] 吸光度変化を図 1に示す。吸光度は混合比に比例して変化することがわ力る。
この吸光度が変化した波長における吸光度を混合比に対してプロットしたものを図 2に示す。 基質同士の相互作用が無い場合に基質の吸収スぺ外ルの吸光度が混合比に比 例する（Beer's則）が、 Beer's則の定める直線力 逸脱した場合には、基質同士の相 互作用の存在が示唆される。
図 2に示すように、 PPTと 4種の天然核酸塩基との 、ずれの混合溶液にぉ 、ても大 きな逸脱が観測され、 PPTと各天然核酸塩基が塩基対を形成し、 Beer's則の定める 直線力も逸脱したものと考えられる。
[0021] 比較例 1
比較のため、八ー丁及び0—丁にっぃて、実施例 3と同様に塩基対形成試験をおこ なった。結果を図 3と 4に示す。 A— Tの場合には、塩基対形成による Beer's則の直線 力 の逸脱が観察された力 G— Tの場合には、塩基対が形成されず Beer's則の直 線から逸脱して 、な 、ことが観察された。
[0022] 合成例 1
(1) 1-メチノレシトシンの合成
磁気撹拌子を備えた lOOmLナスフラスコに、シトシン (3.0g, 27mmol)、ジメチルホル ムアミドジメチルァセタール (40mL)を加え、撹拌しながら 120°Cに加熱した。その後、ト リフルォロ酢酸 (0.2mL)を加え 18時間撹拌した。反応溶液を室温まで冷ました後、氷 浴で冷却した。析出した白色沈殿をろ取し、ジクロロメタン、エタノールに溶解させへ キサンより粉体ィ匕を行った。個体を集め真空乾燥を行うことで 4-N-(N,N-ジメチルアミ ノメチレン) -1-メチルシトシンを 3.6g収率 74%の白色個体として得た。 ^ NMR(400 M Hz, DMSO-d6)
磁気撹拌子を備えた lOOmLナスフラスコに 4-N- (Ν,Ν-ジメチルアミノメチレン) -1-メ チルシトシン (l.Og, 5.5mmol)、メチルァミン 30%エタノール溶液 (50mL)をカ卩ぇ 12時間 撹拌した。析出した白色個体を集めエタノール-水より再結晶化を行うことで、 目的物 を 0.61g収率 88%の白色個体として得た。 ^ NMR(400 MHz, DMSO- d6):3.31(s, 3 H), 5.59(d, IH), 6.91(br, 2H), 7.54(d, 1H)13C NMR(100MHz, DMSO- d6):36.6, 92.9,
146.6, 156.3, 166.1； MS(ESI+)calcd for C H N O+(M+H+)126.0662, found 126.080
5 7 3
4.
[0023] (2) 1-メチルチミンの合成 磁気撹拌子を備えた lOOmLナスフラスコに、チミン (2.0g, 16mmol)、へキサメチノレジ シラザン (32mL)、トリメチルシリルクロリド (4. lmL)をカ卩ぇ 140°Cで反応液が透明になる まで 17時間撹拌した。反応溶液を 60°Cまで冷ました後、ヨウ化メチル (lOmL)をカロえ、 60°Cで 29時間撹拌した。反応溶液に 6N酢酸水溶液 (6mL X 10)をカ卩え、反応溶液 を減圧下留去し、残渣に 2-プロパノールを加え不溶物をろ取した。これをエタノール ？水より再結晶化を行い、 目的物を 1.6g収率 72 %の白色固体として得た。
JH NMR(400 MHZ, DMSO- d6): δ 1.73(d, 3H), 3.18(d, 3H), 7.49(t, 1H), 11.19(br, 1 H) 13C NMR(100 MHz, DMSO- d6): δ 11.9, 34.9, 108.1, 142.3, 151.2, 164.4;MS(ESI +) calcd for C H N O + (M+H+) 141.0608, found 141.0669.
6 8 2 2
[0024] (3) 9-メチルアデニンの合成
磁気撹拌子を備えた 300mLナスフラスコに、アデニン (2.0g, 14.8mmol),テトラヒドロ フラン (lOOmL),テトラプチルアンモ -ゥムフルオリド 1.0Mテトラヒドロフラン溶液 (37mL , 37mmol)を加え撹拌中、ヨウ化メチル (2.72mL)を 10分かけて滴下し 2.5時間撹拌した 。反応溶液を減圧下留去し、残渣にメタノールを加え不溶物をろ取した。これをェタノ 一ルー水より再結晶化を行い、 目的物を l.Og収率 45%の白色個体として得た。 ^ NMR(400 MHz, DMSO- d6): δ 3.70(s, 3H), 7.15(br, 2H), 8.07(s, 1H), 8.13(s, 1H)13 C NMR(100 MHz, DMSO- d6): δ 29.3, 118.6, 141.3, 149.8, 152.4, 155.9; MS(ESI+)c alcd for C H N + (M+H+)150.0774, found 150.0914
6 7 5
[0025] (4) 9-メチルダァニンの合成
2-ァミノ- 6-クロ口- 9-メチルプリンを出発物質とし、メチル基を文献に従って導入し た。その際、文献記載のカラムによる精製は行わず次の段階へ進行した。
磁気撹拌子を用いた lOOmLナスフラスコにベンジルアルコール (40mL)、金属ナトリ ゥム (760mg, 23.5mmol)をカ卩ぇ 1時間室温で撹拌した。そこへ、 2-ァミノ- 6-クロ口- 9-メ チルプリン (1.98g, 7.8mmol)を加え 70°Cで 48時間撹拌した。反応溶液を酢酸ェチ ルー水で分液し、水槽を酢酸ェチルで 2回抽出した。有機層を合わせて飽和食塩 水で洗浄後、無水硫酸ナトリウム乾燥を行い、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲル力 ラムクロマトグラフィー（へキサン：酢酸ェチル = 1： 1、酢酸ェチル：メタノール =9 : 1) で精製を行うことにより 6-0-ベンジル -9-メチルダァニンを 1.2g合計収率 26 %の白 色個体として得た。 H NMR(400 MHz, DMSO- d6): δ 3.58(s, 3H), 5.48(s, 2H), 6.44( br, 2H), 7.33ミ 7.49(m, 5H), 7.81(s, 1H)
磁気撹拌子を備えた lOOmLナスフラスコに、 6-0-ベンジル -9-メチルダァニン (1.4 8g, mmol)、ジクロロメタン (20mL)、トリフルォロ作酸 (10mL)をカ卩ぇ室温で 12時間撹拌 した。反応溶液を留去し、残渣をメタノールで共沸した。残渣をエタノールに溶解させ たのち、へキサンで粉体ィ匕を行い固体を集め、エタノール-水より再結晶化を行い、 目的物を 0.7g収率 75 %の白色固体として得た。
JH NMR(400 MHZ, DMSO— d6): δ 3.51(s, 1H), 6.40(br, 2H), 7.61(s, 1H), 10.49(br, 1 H) 13C NMR(100 MHz, DMSO- d6): δ 29.2, 116.5, 138.0, 151.5, 153.5, 156.8;MS(ES I+)calcd for C H N O+(M+H+)166.0723, found 166.0860.
6 7 5
産業上の利用可能性
[0026] 本発明のユニバーサル塩基は、 PCR法における配列未特定遺伝子や不特定遺伝 子のクロー-ング、ヒトゲノム中の一塩基多型の検出、アンチジーン法による不特定 遺伝子の発現抑制、核酸成分の高選択的抽出'除去などに応用できる。これらの場 合、用途に応じて、このユニバーサル塩基を他の人工核酸へ導入することや、その 他の生体様物質への導入、ポリスチレンビーズへの担持などをおこなってもよい。ま た、このユニバーサル塩基単体をヌクレオチド成分の選択的除去や抽出に利用する ことちでさる。
図面の簡単な説明
[0027] [図 1]本発明のユニバーサル塩基 (PPT)と 4種の天然核酸塩基との混合物の吸光度 変化を示す図である。
[図 2]図 1の吸光度を混合比に対してプロットした図である。
[図 3]A—T及び G—Tの混合物の吸光度変化を示す図である。
[図 4]図 3の吸光度を混合比に対してプロットした図である。

Claims

請求の範囲 [1] 下式
[化 1]
O 0 O Nへ ί θ
(式中、 Rは、水素原子を除ぐ一価の基を表す。）で表され、 4種の天然核酸塩基と 非特異的に塩基対を形成することのできるユニバーサル塩基。
[2] 天然核酸塩基又は天然核酸塩基から成るオリゴヌクレオチドを含む溶液に請求項 1 に記載のユニバーサル塩基を混合することによりこれらの塩基対を形成させる方法。
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