JPWO2007026485A1 - ユニバーサル塩基 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明において、発明者がユニバーサル塩基のベースとして利用したピリミド[4,5-d]ピリミジン-2,4,5,7-テトラオン及びその誘導体は、天然核酸塩基と疑似塩基対を形成するとは考えられていなかった(非特許文献2)。
また、例えば、PCR法における配列未特定遺伝子や不特定遺伝子のクローニングを行う場合、ヒトゲノム中の一塩基多型の検出を行う場合には、又はアンチジーン法による不特定遺伝子の発現抑制を行う場合には、Rは天然又は非天然のオリゴヌクレオチド鎖が好ましい。核酸成分の高選択的抽出や除去をなどを行う場合には、Rは水溶性官能基、例えば、水酸基、チオール基、カルボキシル基、アミド基又はアミジン基等を有するアルキル基などが好ましい。ヌクレオチド成分の選択的除去や抽出を行う場合には、Rは脂溶性官能基、例えば、炭素数が5以上のアルキル基又はシロキシ基、エステル基、アリール基などを含むアルキル基などが好ましい。
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
フッ素樹コートした撹拌子を備えた200mLナス型フラスコに、無水エタノール90mLを加え氷浴中撹拌しながら金属ナトリウム2.8g(120mmol)を注意深く加え、完全に溶解するまで撹拌した。その後、2−ヒドロキシエチル尿素6.3g(60mmol)とシアノ酢酸エチル6.4mL(60mmol)を加え、7時間還流させた。得られた反応溶液をろ過した後、エタノールで洗い、水に溶解させて1.0M希塩酸で中和した後にろ過をし、得られる白色固体を水で再結晶させることにより、白色結晶として化合物1を得た(6.1g, 35.6mmo1、収率59.4%);1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) : δ 3.54 (t, 2H, NCH2CH2, 9.6 Hz), 3.83 (t, 2H, CH20H, 9.6 Hz), 4.57(br, 1H, CHCNH2), 5.09 (br, 1H, OH), 6,61 (br, 2H, NH2), lO.32 (br, 1H, NH); 13C NMR (DMSO-d6, 100MHz) : δ 44.13 (NaC2CH2), 59.28 (CH20H), 76.52 (CHCNH2), 151.87, 157.04, 162.89。
フッ素樹脂コートした撹拌子を備えた50 mLナス型フラスコに、上記で得た化合物1を1.0 g(5.8 mmol), t-ブチルジフェニリルクロロシラン(東京化成製、1.7 mL, 6.4 mmol), イミダゾール(ナカライ製、875 mg, 12.8 mmol),ジメチルホルムアミド(キシダ製)6 mL を加え、60℃で1.5時間反応させた後、撹拌している水1L中に、パスツールピペットを用いてゆっくり滴下した。しばらく撹拌した後、ろ過し、乾燥させることにより、白色固体として化合物2を得た(2.2 g, 5.4 mmol,収率92.0%)。
1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz): δ 0.96(s, 9H, C(CH3)3), 3.76(br, 2H, NCH2), 4.04(br, 2H, CH2OH), 4.60(br, 1H, CHCNH2), 6.70(br, 2H, NH2), 7.41(m, 6H), 7.58(m, 4H), 10.32(br, 1H, NH); 13C NMR(DMSO-d6, 100 MHz): δ 19.11(SiC(CH3)3), 26.92(SiC(CH3)3), 42.06(NCH2CH2), 61.55(NCH2CH2), 76.15(CHCNH2), 127.96, 128.33, 130.33, 130.08, 134.94, 135.48, 151.85, 158.75, 162.94
フッ素樹脂コートした撹拌子を備えた 100 mL ナス型フラスコに、上記で得た化合物2を13.7 g(33.3 mmol)とジメチルホルムアミド(40 mL)を加え、室温下で撹拌しながら滴下漏斗でイソシアナトギ酸エチル3.9 g(東京化成製、33.9 mmol)を30分かけて滴下した。その後、室温で24時間撹拌し、減圧濃縮し、減圧乾燥させ、酢酸エチルで洗浄することにより白色固体として化合物3を得た(7.0 g, 13.3 mmol,収率40.1%)。
1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz): δ 0.94(s, 9H, Si(CH3)3), 1.22(t, 3H, OCH2CH3, 7.2 Hz), 3.81(br, 2H, NCH2, 4.8 Hz), 4.12(q, 2H, OCH2CH3, 4.8 Hz), 4.18(t, 2H, NCH2CH2, 4.8 Hz), 7.42(m, 6H), 7.53(M, 4H), 8.36(br, 1H), 10.85(br, 1H), 11.35(br, 1H), 12.39(br, 1H); 13C NMR(DMSO-d6, 100 MHz): δ 14.68(OCH2CH3), 19.05(SiC(CH3)3), 26.89(SiC(CH3)3), 43.12(NCH2), 60.61(OCH2CH3), 61.12(NCH2CH2), 81.06(COCCO), 128.30, 130.39, 132.94, 135.42, 148.77, 150.77, 159.94, 164.45, 166.23
フッ素樹脂コートした撹拌子を備えた50 mLナス型フラスコに、無水エタノール(ナカライ製)20 mLを加え氷浴中撹拌しながら金属ナトリウム60 mg(ナカライ製、2.6 mmol)を注意深く加え、完全に溶解するまで撹拌した。その後、上記で得た化合物3を600 mg(1.1 mmol)を加え、17時間還流させた。得られた反応溶液をろ過することにより得られる固体を1.0 M希塩酸で洗い、減圧乾燥させることにより、白色固体として化合物4(PPT)を得た(500 mg, 1.0 mmol,収率91.6%)。
1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz): δ 0.94(s, 9H, SiC(CH3)3), 3.83(t, 2H, NCH2CH2), 4.23(t, 2H, NCH2CH2), 7.38(m, 6H), 7.57(m, 4H), 9.79(br, 1H), 10.53(br, 1H); 13C NMR(DMSO-d6, 100 MHz): δ 19.16(SiC(CH3)3), 27.03(SiC(CH3)3), 42.27(NCH2), 61.12(NCH2CH2), 86.04(COCCO), 128.26, 130.14, 133.56, 135.43, 151.56, 157.86, 161.62, 162.60, 164.78; MS(ESI+)479.21(M +H+ calcd 479.17)
溶解試験は、表1に示す各溶媒を用い、溶質の濃度を1〜100mMとし、該当濃度において、一度50℃まで昇温した後、27℃まで冷却し、不溶物が残った場合「不溶」とし、残らない場合「可溶」とした。緩衝液の濃度は100mM、pHは7.0とした。
結果を下表に示す。
この試験のために下式
PPTと各N−メチル化天然核酸塩基(1−メチルシトシン(以下「C」という。)、1−メチルチミン(以下「T」という。)、9−メチルアデニン(以下「A」という。)、9−メチルグアニン(以下「G」という。))との混合物の濃度を一定(7.5mmol/l)に保ちつつ、混合比(モル比)を0:10〜10:0に変化させて、25℃において無水ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解させた。このDMSOは凍結脱気法によって酸素が除去されアルゴンが溶解している無水ジメチルスルホキシドであって、あらかじめ作成しておいた基質のDMSO溶液を混合して一晩(12時間)放置したものを用いた。
その後、紫外領域の吸光度変化を下記の条件で測定した。
−測定装置 JASCO V-550 SERIAL NO. C02951260
−温度コントローラー JASCO PSC-498T
−セル GL Science Type : AB20-SQ-0.1(光路長 0.1mm)
−セルアダプター CAS-10-1
−測定波長 : 200〜350nm
この吸光度が変化した波長における吸光度を混合比に対してプロットしたものを図2に示す。
基質同士の相互作用が無い場合に基質の吸収スペクトルの吸光度が混合比に比例する(Beer's則)が、Beer's則の定める直線から逸脱した場合には、基質同士の相互作用の存在が示唆される。
図2に示すように、PPTと4種の天然核酸塩基とのいずれの混合溶液においても大きな逸脱が観測され、PPTと各天然核酸塩基が塩基対を形成し、Beer's則の定める直線から逸脱したものと考えられる。
比較のため、A−T及びG−Tについて、実施例3と同様に塩基対形成試験をおこなった。結果を図3と4に示す。A−Tの場合には、塩基対形成によるBeer's則の直線からの逸脱が観察されたが、G−Tの場合には、塩基対が形成されずBeer's則の直線から逸脱していないことが観察された。
(1)1-メチルシトシンの合成
磁気撹拌子を備えた 100mL ナスフラスコに、シトシン(3.0g, 27mmol)、ジメチルホルムアミドジメチルアセタール(40mL)を加え、撹拌しながら120℃に加熱した。その後、トリフルオロ酢酸(0.2mL)を加え18時間撹拌した。反応溶液を室温まで冷ました後、氷浴で冷却した。析出した白色沈殿をろ取し、ジクロロメタン、エタノールに溶解させヘキサンより粉体化を行った。個体を集め真空乾燥を行うことで4-N-(N,N-ジメチルアミノメチレン)-1-メチルシトシンを3.6g収率 74%の白色個体として得た。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)
磁気撹拌子を備えた 100mL ナスフラスコに4-N-(N,N-ジメチルアミノメチレン)-1-メチルシトシン(1.0g, 5.5mmol)、メチルアミン30% エタノール溶液(50mL)を加え12時間撹拌した。析出した白色個体を集めエタノール-水より再結晶化を行うことで、目的物を 0.61g 収率 88% の白色個体として得た。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6):3.31(s, 3H), 5.59(d, 1H), 6.91(br, 2H), 7.54(d, 1H)13C NMR(100MHz, DMSO-d6):36.6, 92.9, 146.6, 156.3, 166.1 ; MS(ESI+)calcd for C5H7N3O+(M+H+)126.0662, found 126.0804.
磁気撹拌子を備えた 100mL ナスフラスコに、チミン(2.0g, 16mmol)、ヘキサメチルジシラザン(32mL)、トリメチルシリルクロリド(4.1mL)を加え 140℃で反応液が透明になるまで17 時間撹拌した。反応溶液を 60℃まで冷ました後、ヨウ化メチル(10mL)を加え、60℃で 29 時間撹拌した。反応溶液に 6N 酢酸水溶液(6mL×10)を加え、反応溶液を減圧下留去し、残渣に 2-プロパノールを加え不溶物をろ取した。これをエタノール?水より再結晶化を行い、目的物を 1.6g 収率 72 %の白色固体として得た。
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6):δ1.73(d, 3H), 3.18(d, 3H), 7.49(t, 1H), 11.19(br, 1H) 13C NMR(100 MHz, DMSO-d6):δ11.9, 34.9, 108.1, 142.3, 151.2, 164.4;MS(ESI+)calcd for C6H8N2O2+(M+H+)141.0608,found 141.0669.
磁気撹拌子を備えた 300mL ナスフラスコに、アデニン(2.0g, 14.8mmol),テトラヒドロフラン(100mL),テトラブチルアンモニウムフルオリド 1.0M テトラヒドロフラン溶液(37mL, 37mmol)を加え撹拌中、ヨウ化メチル(2.72mL)を10分かけて滴下し2.5時間撹拌した。反応溶液を減圧下留去し、残渣にメタノールを加え不溶物をろ取した。これをエタノールー水より再結晶化を行い、目的物を 1.0g 収率 45% の白色個体として得た。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6):δ 3.70(s, 3H), 7.15(br, 2H), 8.07(s, 1H), 8.13(s, 1H)13C NMR(100 MHz, DMSO-d6):δ29.3, 118.6, 141.3, 149.8, 152.4, 155.9; MS(ESI+)calcd for C6H7N5+(M+H+)150.0774, found 150.0914
2-アミノ-6-クロロ-9-メチルプリンを出発物質とし、メチル基を文献に従って導入した。その際、文献記載のカラムによる精製は行わず次の段階へ進行した。
磁気撹拌子を用いた 100mL ナスフラスコにベンジルアルコール(40mL)、金属ナトリウム(760mg, 23.5mmol)を加え1時間室温で撹拌した。そこへ、2-アミノ-6-クロロ-9-メチルプリン(1.98g, 7.8mmol)を加え 70℃で 48 時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルー水で分液し、水槽を酢酸エチルで 2 回抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウム乾燥を行い、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=1:1、酢酸エチル:メタノール=9:1)で精製を行うことにより6-O-ベンジル-9-メチルグアニンを 1.2g 合計収率 26 %の白色個体として得た。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6):δ3.58(s, 3H), 5.48(s, 2H), 6.44(br, 2H), 7.33ミ7.49(m, 5H), 7.81(s, 1H)
磁気撹拌子を備えた 100mL ナスフラスコに、6-O-ベンジル-9-メチルグアニン(1.48g, mmol)、ジクロロメタン(20mL)、トリフルオロ作酸(10mL)を加え室温で 12 時間撹拌した。反応溶液を留去し、残渣をメタノールで共沸した。残渣をエタノールに溶解させたのち、ヘキサンで粉体化を行い固体を集め、エタノール-水より再結晶化を行い、目的物を 0.7g 収率 75 %の白色固体として得た。
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6):δ3.51(s, 1H), 6.40(br, 2H), 7.61(s, 1H), 10.49(br, 1H) 13C NMR(100 MHz, DMSO-d6):δ29.2, 116.5, 138.0, 151.5, 153.5, 156.8;MS(ESI+)calcd for C6H7N5O+(M+H+)166.0723, found 166.0860.
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