JP5733760B2 - 蛍光発生分子および標的核酸検出方法 - Google Patents

蛍光発生分子および標的核酸検出方法 Download PDF

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Description

本発明は、核酸などの生体関連物質を検出するための標識試薬として有用な蛍光発生分子に関する。より詳細には、本発明は、２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基、２−シアノ−４−ニトロベンゼンスルホニル基または５−ニトロピリジン−２−イルスルホニル基を有する無蛍光性分子であって、該基が芳香族求核置換反応を受けると蛍光を発生することを特徴とする分子に関する。さらに本発明は、上記の蛍光発生分子を含む標識試薬、及び上記の蛍光発生分子を用いた標的核酸配列の検出方法に関する。
特定の標的核酸配列を有する核酸分子を検出するための方法としては、その標的核酸配列に相補的な塩基配列を有するプローブを用いるハイブリダイゼーション法が広く使用されている。ハイブリダイゼーション法では、標的核酸配列に相補的な塩基配列を有するプローブを用意し、そのプローブの塩基配列と相補的な塩基配列を持つ試料のみが高い選択性でハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの結果として形成されるハイブリッド体を検出するための手段としては、プローブ核酸をラジオアイソトープで標識する方法、蛍光物質で標識する方法、発光試薬を利用する方法などが挙げられる。核酸の標識に使用することができる蛍光物質としては、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５等が挙げられる。しかし、これらの蛍光物質で標識した蛍光核酸プローブは、主に蛍光剤と消光剤とを組み合わせたＦＲＥＴ型の機構を利用したものであり、蛍光の消光率が９８％程度に留まるためにバックグラウンド蛍光シグナルが高く、高感度測定が困難であった。
上記の点を解決するために、テンプレート上で化学反応により蛍光がｏｎになる蛍光化合物の開発がなされている。しかし、それら蛍光ｏｎ／ｏｆｆ型蛍光化合物（特許文献１および２）は、アジド基の還元反応により蛍光を発生するため、還元剤であるホスフィンが溶液中で酸化されやすいという問題を持つ。
ＷＯ２００８／０７５７１８ ＷＯ２００９／０３４７９０
本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、安定性が高く（即ち、長期間において活性である）、かつ高感度であり、微量の遺伝子シグナルを増幅し、観察することを可能とする、遺伝子解析用の蛍光ｏｎ／ｏｆｆ型蛍光化合物（蛍光発生分子システム）を提供することを解決すべき課題とした。さらに、本発明は、上記の蛍光ｏｎ／ｏｆｆ型蛍光化合物を用いた生体関連物質を検出するための標識試薬（ＤＮＡもしくはＲＮＡをテンプレートとした化学反応プローブ）を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、蛍光物質骨格であるクマリン骨格を有し、かつ分子内に２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基、２−シアノ−４−ニトロベンゼンスルホニル基または５−ニトロピリジン−２−イルスルホニル基を有する無蛍光性分子であって、該２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基、２−シアノ−４−ニトロベンゼンスルホニル基または５−ニトロピリジン−２−イルスルホニル基が芳香族求核置換反応を受けると蛍光を発生することを特徴とする分子を合成することに成功した。さらに、上記の無蛍光性分子で標識した第一の核酸プローブと、求核性を有する分子で標識した第二の核酸プローブとを、標的核酸配列にハイブリダイズさせることによって、第一の核酸プローブ中の無蛍光性分子の２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基、２−シアノ−４−ニトロベンゼンスルホニル基または５−ニトロピリジン−２−イルスルホニル基が芳香族求核置換反応を受け、これにより生成する蛍光を検出することによって標的核酸配列を検出できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明は以下の通りである。
［１］下記式（Ｉ’）で示される化合物：
（式中、Ｘは、水素原子又はカルボン酸の保護基を示し、Ｙは、２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基、２−シアノ−４−ニトロベンゼンスルホニル基または５−ニトロピリジン−２−イルスルホニル基を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数６から１０のアリール基、又はシアノ基を示す。）。
［２］Ｘ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が水素原子を示し、かつＲ４がメチル基を示す、［１］に記載の化合物。
［３］［１］又は［２］に記載の化合物を含む、生体関連物質を検出するための標識試薬。
［４］核酸の標識のために用いる、［３］に記載の試薬。
［５］求核剤と組み合わせて使用される、［３］又は［４］に記載の試薬。
［６］標的核酸配列の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第一の核酸プローブであって、クマリン骨格を有し、かつ分子内に２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基、２−シアノ−４−ニトロベンゼンスルホニル基または５−ニトロピリジン−２−イルスルホニル基を有する無蛍光性分子で標識した上記の第一の核酸プローブと、標的核酸配列の別の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第二の核酸プローブであって、求核性を有する分子で標識した上記の第二の核酸プローブとを、標的核酸配列にハイブリダイズさせる工程、及び第一の核酸プローブ中の無蛍光性分子の２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基、２−シアノ−４−ニトロベンゼンスルホニル基または５−ニトロピリジン−２−イルスルホニル基が芳香族求核置換反応を受けることにより生成する蛍光を検出する工程を含む、標的核酸配列の検出方法。
［７］上記無蛍光性分子として、［１］又は［２］に記載の化合物を用いる、［６］に記載の方法。
［８］標的核酸配列がＲＮＡである、［６］又は［７］に記載の方法。
［９］標的核酸配列の一塩基多型を検出する、［６］又は［７］に記載の方法。
［１０］細胞内の標的核酸配列を検出することを特徴とする、［６］に記載の方法。
本発明はまた、以下の通りである。
［１Ａ］下記式（Ｉ）で示される化合物：
（式中、Ｘは、水素原子又はカルボン酸の保護基を示し、ＤＮｓは、２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数６から１０のアリール基、又はシアノ基を示す。）。
［２Ａ］Ｘ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が水素原子を示し、かつＲ４がメチル基を示す、［１Ａ］に記載の化合物。
［３Ａ］［１Ａ］又は［２Ａ］に記載の化合物を含む、生体関連物質を検出するための標識試薬。
［４Ａ］核酸の標識のために用いる、［３Ａ］に記載の試薬。
［５Ａ］求核剤と組み合わせて使用される、［３Ａ］又は［４Ａ］に記載の試薬。
［６Ａ］標的核酸配列の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第一の核酸プローブであって、クマリン骨格を有し、かつ分子内に２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基を有する無蛍光性分子で標識した上記の第一の核酸プローブと、標的核酸配列の別の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第二の核酸プローブであって、求核性を有する分子で標識した上記の第二の核酸プローブとを、標的核酸配列にハイブリダイズさせる工程、及び第一の核酸プローブ中の無蛍光性分子の２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基が芳香族求核置換反応を受けることにより生成する蛍光を検出する工程を含む、標的核酸配列の検出方法。
［７Ａ］上記無蛍光性分子として、［１Ａ］又は［２Ａ］に記載の化合物を用いる、［６Ａ］に記載の方法。
［８Ａ］標的核酸配列がＲＮＡである、［６Ａ］又は［７Ａ］に記載の方法。
［９Ａ］標的核酸配列の一塩基多型を検出する、［６Ａ］又は［７Ａ］に記載の方法。
［１０Ａ］細胞内の標的核酸配列を検出することを特徴とする、［６Ａ］に記載の方法。
本発明によれば、２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基、２−シアノ−４−ニトロベンゼンスルホニル基または５−ニトロピリジン−２−イルスルホニル基の求核剤による芳香族求核置換反応をトリガーとする蛍光発生分子システムが提供される。さらに本発明によれば、この蛍光発生分子システムを応用して、生体関連物質を検出するための標識試薬が提供される。本発明の標識試薬は、標的ＤＮＡあるいは、ＲＮＡ分子に結合して、化学反応を起こすことにより蛍光を発することができるようになる。本発明の化合物は、高いシグナル・バックグラウンド比を持つため、高感度遺伝子検出が可能になるとともに、細胞内、生体内での遺伝子検出イメージングが可能となる。さらに本発明は、他の試薬や酵素を用いる必要がないため、簡便・安価であり、試験管内のみではなく、細胞内あるいは生体内での遺伝子検出が可能となる。さらに、本発明の標識試薬は、安定性が高く（長期間活性）かつ高感度であり、微量の遺伝子シグナルを増幅し、観察することが可能である。
図１は、２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基の芳香族求核置換反応をトリガーとして、無蛍光性分子の構造変化が起こり蛍光を発する、本発明の蛍光ｏｆｆ／ｏｎ型センサーシステムを示す。 図２は、７−アミノクマリンのＤＮｓ誘導体の有機合成スキームを示す。 図３は、本発明のＤＮｓ誘導体の蛍光量子収率の測定結果を示す。 図４は、本発明の標識試薬（化学反応プローブ）と各種求核剤との反応の初期速度の測定結果を示す。 図５は、ＤＮＡテンプレート上での反応で用いたテンプレートおよびプローブの配列を示す（ＰＳプローブおよびＤＮｓ−ＡＭＣＡプローブを用いた場合）。 図６は、ＤＮＡテンプレート上での反応の蛍光測定の結果を示す（ＰＳプローブおよびＤＮｓ−ＡＭＣＡプローブを用いた場合）。 図７は、ＤＮＡテンプレート上での反応で用いたテンプレートおよびプローブの配列を示す（ＭＢＡプローブおよびＤＮｓ−ＡＭＣＡプローブを用いた場合）。 図８は、ＤＮＡテンプレート上での反応の蛍光測定の結果を示す（ＭＢＡプローブおよびＤＮｓ−ＡＭＣＡプローブを用いた場合）。 図９は、ＤＮＡテンプレート上での反応で用いたテンプレートおよびプローブの配列を示す（ＭＢＡプローブおよびＣＮＳ−ＡＭＣＡプローブを用いた場合）。 図１０は、ＤＮＡテンプレート上での反応の蛍光測定の結果を示す（ＭＢＡプローブおよびＣＮＳ−ＡＭＣＡプローブを用いた場合）。 図１１は、種々の当量のテンプレートを用いた反応回転数（ＴＯ）の測定の結果を示す。 図１２は、ＤＮＡテンプレート上での反応で用いたテンプレートおよびプローブの配列を示す（ＭＢＡプローブおよび各種ＡＭＣＡプローブを用いた場合）。 図１３は、ＤＮＡテンプレート上での反応の蛍光測定の結果を示す（ＭＢＡプローブおよび各種ＡＭＣＡプローブを用いた場合）。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明で開発した蛍光発生分子システムは、２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基、２−シアノ−４−ニトロベンゼンスルホニル基または５−ニトロピリジン−２−イルスルホニル基の求核剤による芳香族求核置換反応をトリガーとして、無蛍光性分子の構造変化が起こり蛍光を発する蛍光ｏｎ／ｏｆｆ型センサーシステムとして一般化できる（図１：但し、一例として２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基の場合を示してある。）。本発明の実施例として、蛍光分子７−アミノクマリンを化学修飾し、２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基（ＤＮｓ）を導入した分子を合成した（図２）。まず、７−アミノ−４−メチル−３−クマリニル酢酸（ＡＭＣＡ）をエステル化した。つづいて、アミノ基をＤＮｓで保護した。最後に、エステルを加水分解することにより、目的物である７−アミノクマリンのＤＮｓ誘導体（図２の化合物３）を得た。
この７−アミノクマリンのＤＮｓ誘導体（図２の化合物３）の蛍光特性を解析した。７−アミノ−４−メチル−３−クマリニル酢酸（ＡＭＣＡ）およびＤＮｓ誘導体（図２の化合物３）の蛍光量子収率を測定した（図３）。その結果、ＡＭＣＡは蛍光性であったのに対し、ＤＮｓ誘導体（図２の化合物３）は無蛍光性であった。
さらに、上記で合成した蛍光発生分子システムであるＤＮｓ誘導体（図２の化合物３）を核酸鎖に導入して、遺伝子検出用化学反応プローブを開発した。本発明で開発したＤＮＡプローブは、標的ＤＮＡあるいはＲＮＡ上に標的配列特異的に結合し、化学反応（芳香族求核置換反応）し、初めて高い強度の蛍光を発する（図１）。この蛍光シグナルの有無や強度を指標にすることによって、核酸配列を区別又は検出することができる。本反応は、他の試薬や酵素を必要とせず、プローブを検出サンプルに加えるのみで測定できる。
本発明のプローブについて、各種求核剤との反応性を検討した。求核置換反応の初期速度を図４に示す。その結果、１級のホスフォロチオエート基を有するＰＳ Ｃ１２−ｄＴとの反応性が高く、さらに４−ＭＢＡ（ｐＫａ＝５．８）との反応性が最も高い（ｋａｐｐがＰＳ Ｃ１２−ｄＴと比較して約３．７倍）ことが明らかとなった。なお、図４中、Ｃｙｓはシステイン、ＤＴＴはジチオスレイトール、２−ＭＥは２−メルカプトエタノール、４−ＭＢＡは４−メルカプト安息香酸、ＰＳ−ｄＴはチミジン ３’−ホスフォロチオエート、およびＰＳ Ｃ１２−ｄＴはチミジン ３’−Ｏ−（１２−（ホスフォリルオキシ）ドデシル Ｏ，Ｓ−ジハイドロゲンホスフォロチオエート）を示す。
本発明のプローブを用いて、大腸菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の検出実験を行った。
（１）３’末端をＰＳ修飾したプローブ（ＰＳプローブ）を用いた場合：標的ＤＮＡ配列および合成したプローブを図５に示した。標的配列特異的なシグナル発生を確認するため、１つのミスマッチ塩基を含む標的配列の存在下、および標的配列が存在しない条件でも、蛍光シグナルの経時変化を測定し比較した。その結果、本プローブ（ＤＮｓ−ＡＭＣＡプローブ）は、標的配列（２３Ｓ−Ｃ：配列番号２）が存在すると、蛍光シグナルが顕著に増大した。一方、１つのミスマッチ塩基を含む標的配列（２３Ｓ−Ｔ：配列番号３）の存在下、および標的配列非存在下では、蛍光シグナルの増加はほとんど観察されなかった（図６）。そのため、本プローブが標的核酸配列特異的に蛍光シグナルを発生することが明らかとなった。
（２）３’末端をＭＢＡ修飾したプローブ（ＭＢＡプローブ）を用いた場合：標的ＤＮＡ配列および合成したプローブを図７に示した。標的配列特異的なシグナル発生を確認するため、標的配列が存在しない条件でも、蛍光シグナルの経時変化を測定し比較した。その結果、本プローブ（ＤＮｓ−ＡＭＣＡプローブ）は、標的配列（２３Ｓ−Ｃ：配列番号２）が存在すると、蛍光シグナルが顕著に増大した。一方、標的配列非存在下では、蛍光シグナルの増加はほとんど観察されなかった（図８）。そのため、本プローブが標的核酸配列特異的に蛍光シグナルを発生することが明らかとなった。また、その反応効率は、ＰＳプローブを用いた場合と比較して大きく改善することが明らかとなった。
また、本発明の実施例として、７−アミノクマリンのＤＮｓ誘導体と同様にして、７−アミノクマリンの２−シアノ−４−ニトロベンゼンスルホニル（ＣＮＳ）誘導体を得た。さらに、上記ＤＮｓ誘導体と同様にして、蛍光発生分子システムであるこのＣＮＳ誘導体を核酸鎖に導入して、遺伝子検出用化学反応プローブを開発した。
この本発明のプローブを用いて、大腸菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の検出実験を行った。
標的ＤＮＡ配列および合成したプローブを図９に示した。標的配列特異的なシグナル発生を確認するため、１つのミスマッチ塩基を含む標的配列の存在下、および標的配列が存在しない条件でも、蛍光シグナルの経時変化を測定し比較した。その結果、本プローブ（ＣＮＳ−ＡＭＣＡプローブ）は、標的配列（２３Ｓ−Ｃ：配列番号２）が存在すると、蛍光シグナルが顕著に増大した。一方、１つのミスマッチ塩基を含む標的配列（２３Ｓ−Ｔ：配列番号３、２３Ｓ−Ａ：配列番号４、２３Ｓ−Ｇ：配列番号５）の存在下、および標的配列非存在下では、蛍光シグナルの増加はほとんど観察されなかった（図１０）。そのため、本プローブが標的核酸配列特異的に蛍光シグナルを発生することが明らかとなった。
また、本プローブ（ＣＮＳ−ＡＭＣＡプローブ）を用いて、種々の当量の標的配列（２３Ｓ−Ｃ：配列番号２）存在下での反応回転数（ＴＯ）の測定を行った。その結果、本プローブは、０．５ｐＭ（０．６ｆｍｏｌ）の標的配列の存在下、１５０４．６ＴＯの非常に高い反応回転数を示した（図１１）。
さらに、本発明の実施例として、７−アミノクマリンのＤＮｓ誘導体と同様にして、７−アミノクマリンの５−ニトロピリジン−２−イルスルホニル（ＮＰＳ）誘導体を得た。さらに、上記ＤＮｓ誘導体と同様にして、蛍光発生分子システムであるこのＮＰＳ誘導体を核酸鎖に導入して、遺伝子検出用化学反応プローブを開発した。
この本発明のプローブを用いて、大腸菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の検出実験を行った。
標的ＤＮＡ配列および合成したプローブを図１２に示した。標的配列特異的なシグナル発生を確認するため、標的配列が存在しない条件でも、蛍光シグナルの経時変化を測定し比較した。また、ＤＮｓ−ＡＭＣＡプローブおよびＣＮＳ−ＡＭＣＡプローブとも比較した。その結果、本プローブ（ＮＰＳ−ＡＭＣＡプローブ）は、ＤＮｓ−ＡＭＣＡプローブおよびＣＮＳ−ＡＭＣＡプローブと同様に、標的配列（２３Ｓ−Ｃ：配列番号２）が存在すると、蛍光シグナルが顕著に増大した。一方、標的配列非存在下では、蛍光シグナルの増加はほとんど観察されなかった（図１３）。そのため、本プローブが標的核酸配列特異的に蛍光シグナルを発生することが明らかとなった。
本発明の化合物（蛍光発生分子）は、下記式（Ｉ’）で示される化合物である。
（式中、Ｘは、水素原子又はカルボン酸の保護基を示し、Ｙは、２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基、２−シアノ−４−ニトロベンゼンスルホニル基または５−ニトロピリジン−２−イルスルホニル基を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数６から１０のアリール基、又はシアノ基を示す。）
本発明の化合物（蛍光発生分子）はまた、下記式（Ｉ）で示される化合物である。
（式中、Ｘは、水素原子又はカルボン酸の保護基を示し、ＤＮｓは、２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数６から１０のアリール基、又はシアノ基を示す。）
Ｘが示すカルボン酸の保護基の種類は特に限定されないが、炭素数１から６のアルキル基、スクシンイミジル基、アジド基、パラニトロフェニル基、ハロゲンなどの脱離能を有する官能基を挙げることができる。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が示すハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子を挙げることができる。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が示す炭素数１から６のアルキル基としては、直鎖又は分岐鎖の何れでもよく、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などを挙げることができる。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が示す炭素数１から６のアルコキシ基としては、直鎖又は分岐鎖の何れでもよく、具体的にはメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基などを挙げることができる。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が示す炭素数６から１０のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基などを挙げることができる。
式（Ｉ）で示される化合物としては、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３がそれぞれ独立に、水素原子、フッ素原子、塩素原子、又はメチル基、Ｒ４が水素原子、水酸基、又はメチル基、Ｘが水素原子、炭素数１から６のアルキル基、スクシンイミジル基、又はパラニトロフェニル基を示す化合物が好ましい。
式（Ｉ）で示される化合物としては、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が水素原子を示し、かつＲ４がメチル基を示す化合物が最も好ましい。
本発明によれば、標的核酸配列の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第一の核酸プローブであって、クマリン骨格を有し、かつ分子内に２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基、２−シアノ−４−ニトロベンゼンスルホニル基または５−ニトロピリジン−２−イルスルホニル基を有する無蛍光性分子で標識した上記の第一の核酸プローブと、標的核酸配列の別の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第二の核酸プローブであって、求核性を有する分子で標識した上記の第二の核酸プローブとを、標的核酸配列にハイブリダイズさせ、これにより第一の核酸プローブ中の無蛍光性分子の２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基、２−シアノ−４−ニトロベンゼンスルホニル基または５−ニトロピリジン−２−イルスルホニル基が芳香族求核置換反応を受け、生成する蛍光を検出することによって標的核酸配列を検出することができる。
本発明で用いる第一の核酸プローブは、クマリン骨格を有し、かつ分子内に２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基、２−シアノ−４−ニトロベンゼンスルホニル基または５−ニトロピリジン−２−イルスルホニル基を有する無蛍光性分子で標識されている。
本発明で用いる第二の核酸プローブは、求核性を有する分子で標識されている。本発明で用いることができる求核性を有する分子（求核剤）としては、メルカプト基を有する化合物、望ましくはメルカプト基のｐＫａ値が７以下である化合物が挙げられ、具体的には、メルカプト基を有する化合物としては、システイン、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール、４−メルカプト安息香酸、チミジン ３’−ホスフォロチオエート、チミジン ３’−Ｏ−（１２−（ホスフォリルオキシ）ドデシル Ｏ，Ｓ−ジハイドロゲンホスフォロチオエート）などが挙げられる。
本発明において、第一の核酸プローブは、標的核酸配列の一部の領域と相補的な核酸配列を有し、第二の核酸プローブは、標的核酸配列の別の一部の領域と相補的な核酸配列を有する。ここで、第一の核酸プローブと第二の核酸プローブがそれぞれ認識する標的核酸配列の領域は、上記の両プローブが標的核酸配列にハイブリダイズした際に、第一の核酸プローブ中の無蛍光性分子の２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基、２−シアノ−４−ニトロベンゼンスルホニル基または５−ニトロピリジン−２−イルスルホニル基が、第二の核酸プローブ中の求核性を有する分子により芳香族求核置換反応を受けるという条件を満たす限りは、任意に設定することができる。第一の核酸プローブと第二の核酸プローブがそれぞれ認識する標的核酸配列の領域は、上記条件を満たすためには、隣接または近接していることが一般的には好ましい。第一の核酸プローブと第二の核酸プローブがそれぞれ認識する標的核酸配列の領域は、１から１０００塩基程度のスペースを介して近接していることが好ましく、１から１００塩基程度のスペースを介して近接していることがより好ましく、１から１０塩基程度のスペースを介して近接していることが最も好ましい。
本発明において、第一の核酸プローブの長さは、特に限定されないが、その核酸配列の塩基数が、好ましくは５〜１００であり、より好ましくは５〜５０であり、最も好ましくは５〜２５である。また、第二の核酸プローブの長さは、特に限定されないが、その核酸配列の塩基数が、好ましくは５〜１００であり、より好ましくは５〜５０であり、最も好ましくは５〜２５である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、内部標準としてテトラメチルシランを用いて日本電子社製ＪＮＭ−Ｅｘｃａｌｉｂｕｒ２７０もしくはＪＮＭ−ＡＬ３００で測定し、全δ値をｐｐｍで示した。
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、内部標準としてテトラメチルシランを用いて日本電子社製ＪＮＭ−Ｅｘｃａｌｉｂｕｒ２７０もしくはＪＮＭ−ＡＬ３００で測定し、全δ値をｐｐｍで示した。
ＥＳＩ質量分析は、日本電子社製ＪＭＳ−Ｔ１００ＬＣで測定した。
ＨＲ−ＥＳＩ質量分析は、日本電子社製ＪＭＳ−Ｔ１００ＬＣで測定した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析は、ブルカーダルトニクス社製ｍｉｃｒｏｆｌｅｘで測定した。
混合溶媒において示した数値は、特に断らない限り各溶媒の容積混合比である。
実施例１：７−アミノクマリンのＤＮｓ誘導体の有機合成（図２を参照）
（１）メチル ７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセテート（図２の化合物１）の合成
７−アミノ−４−メチル−３−クマリニル酢酸（４３．１ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（４０ｍｌ）に溶解した。Ｈ２ＳＯ４（５滴）を加えた後、反応液を１２０℃に加熱し撹拌した。４時間後、原料の消失を確認し、反応液を室温に戻した。反応液を１／３にまで濃縮した後に飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を加え中和した。ＢｕＯＨで抽出を行い、有機層を濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：へキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：２）にて精製し、目的化合物を得た（３４．４ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ，７５％）。
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) :δ7.47-7.45(1H, d, J= 8.0 Hz, Ar), 6.58-6.56(1H, dd, J= 8.0 Hz, Ar), 6.40(1H, ds, Ar), 6.06(2H, s, NH2), 3.59(2H, s, CH2CO), 3.30(3H, s, CH3), 2.27(3H, s, CH3); 13C-NMR (99.5 MHz, DMSO-d6) :δ170.91, 161.24, 153.99, 152.52, 149.94, 126.39, 112.00, 111.32, 108.88, 98.23, 51.63, 32.10, 14.70; HR-ESI-MS m/z: Calcd for C13H13NNaO4 +([M+Na]+) 270.0737, Found 270.0745.
（２）メチル ７−（２，４−ジニトロベンゼンスルホンアミド）−４−メチルクマリン−３−アセテート（図２の化合物２）の合成
化合物１（２９．６ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）をピリジン／ＣＨ２Ｃｌ２（＝１：１，１．２ｍｌ）に溶解した。反応液を氷冷し、ＤＮｓＣｌ（５２．５ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ，１．６当量）を加え撹拌した。４時間後、ＤＮｓＣｌ（３２．０ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ，１．０当量）を追加した。４時間後、反応液をＣＨＣｌ３で希釈し、Ｈ２Ｏと分液した。有機層を濃縮し、残渣をＰＬＣ（１％酢酸を含むヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：２）にて精製し、目的化合物を得た（３３．６ｍｇ，０．０７ｍｍｏｌ，５６％）。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) :δ8.51(1H, ds, Ar), 8.38-8.35(1H, dd, J= 12.0, 4.0 Hz, Ar), 8.19-0.17(1H, d, J= 8.0 Hz, Ar), 7.52-7.50(1H, d, J= 8.0 Hz, Ar), 7.01-6.98(1H, dd, J= 12.0, 4.0 Hz, Ar), 6.95(1H, ds, Ar), 3.58(2H, s, CH2CO), 2.27(3H, s, CH3), 1.19(3H, s, CH3); 13C-NMR (99.5 MHz, CD3OD) :δ172.82, 163.68, 154.51, 151.50, 151.02, 150.00, 133.37, 127.17, 127.03, 124.46, 120.96, 120.39, 119.39, 117.70, 116.30, 108.47, 52.64, 33.38, 15.23; HR-ESI-MS m/z: Calcd for C19H14N3O10S-([M-H]-) 476.0405, Found 476.0415.
（３）７−（２，４−ジニトロベンゼンスルホンアミド）−４−メチル−３−クマリニル酢酸（図２の化合物３）の合成
化合物２（４３．５ｍｇ，０．０９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４．５ｍｌ）に溶解した。反応液を氷冷し、０．１６Ｍ ＬｉＯＨ水溶液（４．５ｍｌ）をゆっくりと加え、氷冷下、撹拌した。１．５時間後、反応液を室温に戻した。２時間後、原料の消失を確認した。反応液を氷冷し、５％ ＨＣｌを加え反応液を酸性にした。ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：１％酢酸を含むＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝２０：１）にて精製し、目的化合物を得た（４１．８ｍｇ，０．０９ｍｍｏｌ，９９％）。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) :δ8.72-8.71(1H, ds, J=2.0 Hz, Ar), 8.53-8.50(1H, dd, J= 11.2, 2.4 Hz, Ar), 8.32-8.29(1H, d, J= 8.8 Hz, Ar), 7.73-7.71(1H, d, J= 8.8 Hz, Ar), 7.24-7.21(1H, dd, J= 11.2, 2.4 Hz, Ar), 7.20(1H, s, Ar), 3.67(2H, s, CH2CO), 2.38(3H, s, CH3); 13C-NMR (99.5 MHz, CD3OD) :δ173.92, 163.04, 154.22, 151.92, 150.63, 149.81, 140.58, 138.05, 134.05, 127.78, 127.74, 121.68, 120.68, 118.68, 118.02, 108.82, 33.51, 15.30; HR-ESI-MS m/z: Calcd for C18H13N3O10S-([M-H]-) 476.0405, Found 476.0415.
実施例２：オリゴヌクレオチドの合成
全てのオリゴヌクレオチドは、０．２μＭスケールのカラムを用いて、一般的なホスホロアミダイト法に基づいて、ＤＮＡ自動合成機（Ｈ−８−ＳＥ；Ｇｅｎｅ Ｗｏｒｌｄ）で合成した。塩基の脱保護およびＣＰＧ担体からの切り出しは、アンモニア水中で、５５℃、４時間インキュベートすることにより行った。オリゴヌクレオチドの精製は、逆相カラム（ＭｉｃｒｏＰｕｒｅ ＩＩ；Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にて行い、ＵＶ吸光度を測定することにより濃度を決定した。
実施例３：蛍光量子収率の測定（図３を参照）
測定は、７−アミノ−４−メチル−３−クマリニル酢酸（ＡＭＣＡ）および７−（２，４−ジニトロフェニルスルホンアミド）−４−メチル−３−クマリニル酢酸（化合物３）について、蛍光分光光度計（ＦＰ−６５００；ＪＡＳＣＯ）を用い、０．１Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ １０）中で行った。各化合物は、３７５ｎｍで励起した。量子収率は、４−メチルウンベリフェロン（０．６３）を標準として用いて決定した。
実施例４：５’−ＤＮｓ保護ＡＭＣＡ−結合オリゴヌクレオチド（ＤＮｓ−ＡＭＣＡプローブ）の合成
ＤＮｓ保護ＡＭＣＡの付加は、５’−アミノ修飾オリゴと反応させることにより行った。ＤＭＦ溶液中、ＤＮｓ誘導体（化合物３；０．２Ｍ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．２Ｍ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ；０．２Ｍ）を１１時間反応させることにより、ＤＮｓ−ＡＭＣＡ ＮＨＳエステルを得た。５’−アミノ修飾オリゴの合成には、５’−アミノ修飾剤５（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いた。反応は、１６ｍＭのＤＮｓ−ＡＭＣＡ ＮＨＳエステル（ＤＭＦ中）、５０ｍＭの四ホウ酸ナトリウム緩衝液、２００μＭの５’−アミノ修飾オリゴ溶液を含む混合液を、室温で３時間激しく撹拌することにより行った（反応液中のＤＭＦ濃度は４６％）。反応産物をエタノール沈殿で回収したのち、逆相ＨＰＬＣ（グラジエント条件：０−５０％ アセトニトリル／５０ｍＭ 酢酸トリエチルアンモニウム）にて精製を行った。また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により目的の産物が得られていることを確認した。ＤＮｓ−ＡＭＣＡプローブ：Calcd for C155H177N42O63P8S 3915.2, Found 3929.0.
実施例５：３’−ホスフォロチオエートＣ１２−結合オリゴヌクレオチド（ＰＳプローブ）の合成
３’−ホスフォロチオエートＣ１２オリゴの合成は、３’−ホスフェートＣＰＧにスペーサーＣ１２ ＣＥホスフォルアミダイト（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いてスペーサーＣ１２をカップリングしたのち、硫化剤（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ）でホスフォロチオエート化することにより行った。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により目的の産物が得られていることを確認した。ＰＳプローブ：Calcd for C81H114N24O49P8S 2486.5, Found 2487.6.
実施例６：安息香酸，４−メルカプト−２，５−ジオキソ−１−ピロリジニルエステル（ＭＢＡ−ＮＨＳエステル）の合成
ｐ−メルカプト安息香酸（８１．３ｍｇ，０．５３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５．３ｍｌ）に溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ；７４．０ｍｇ，０．０６ｍｍｏｌ，１．５当量）、ＤＣＣ（１４０．０ｍｇ，０．０６ｍｍｏｌ，１．５当量）を加え攪拌した。６時間後、反応液をろ過し、尿素を除去した。有機層を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：１）にて精製し、目的化合物ＭＢＡ−ＮＨＳエステルを得た（７０．４ｍｇ）。
ESI-MS m/z: Calcd for C11H8NO4S-([M-H]-) 250.25846, Found 249.908.
実施例７：３’−ＭＢＡ−結合オリゴヌクレオチド（ＭＢＡプローブ）の合成
ＭＢＡ基の付加は、３’−アミノ修飾オリゴと反応させることにより行った。３’−アミノ修飾オリゴの合成には、３’−アミノ修飾剤Ｃ３ ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いた。反応は、８ｍＭのＭＢＡ−ＮＨＳエステル（ＤＭＦ中）、５０ｍＭの四ホウ酸ナトリウム緩衝液、２００μＭの３’−アミノ修飾オリゴ溶液を含む混合液を、室温で１晩撹拌することにより行った（反応液中のＤＭＦ濃度は４６％）。反応産物をエタノール沈殿で回収したのち、逆相ＨＰＬＣ（グラジエント条件：０−６０％ アセトニトリル／５０ｍＭ 酢酸トリエチルアンモニウム）にて精製を行った。また、ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析により目的の産物が得られていることを確認した。ＭＢＡプローブ：Calcd for C79H101N24O47P7S 2400.4, Found 2400.9.
実施例８：ＤＮｓ−ＡＭＣＡプローブと各種求核剤との反応（図４を参照）
測定は、５００ｎＭ ＤＮｓ−ＡＭＣＡプローブと５００μＭ 求核剤とをバッファー中（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＭｇＣｌ２，ｐＨ ７．２）、３７℃で反応させることにより行った。蛍光シグナルは、蛍光分光光度計（ＦＰ−６５００；ＪＡＳＣＯ）を用いて解析し、励起波長は３７５ｎｍ、蛍光波長は４５０ｎｍとした。反応の初期速度は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを用いてｌｎ［ＤＮｓ−ＡＭＣＡプローブ］ｔ／［ＤＮｓ−ＡＭＣＡプローブ］０と時間をそれぞれプロットし、得られた直線の傾きより初期速度（ｋａｐｐ）を計算した。［ＤＮｓ−ＡＭＣＡプローブ］０は未反応時のＤＮｓ−ＡＭＣＡプローブの濃度、［ＤＮｓ−ＡＭＣＡプローブ］ｔは反応時間ごとのＤＮｓ−ＡＭＣＡプローブ濃度、［ｐｒｏｄｕｃｔ］ｔは脱ＤＮｓされたプローブ濃度を示す。［ＤＮｓ−ＡＭＣＡプローブ］ｔ＝［ＤＮｓ−ＡＭＣＡプローブ］０−［ｐｒｏｄｕｃｔ］ｔより求め、［ｐｒｏｄｕｃｔ］ｔは蛍光の検量線より求めた。
実施例９：ＤＮＡテンプレート上での反応および蛍光測定（ＰＳプローブおよびＤＮｓ−ＡＭＣＡプローブを用いた場合；図５および６を参照）
ＤＮＡテンプレート上での反応は、それぞれ５００ｎＭのＤＮＡテンプレート、ＤＮｓ−ＡＭＣＡプローブ、ＰＳプローブをバッファー中（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＭｇＣｌ２，ｐＨ ７．２）において、３７℃で反応させることにより行った。蛍光シグナルは、蛍光分光光度計（ＦＰ−６５００；ＪＡＳＣＯ）を用いて解析した。励起波長は３７５ｎｍ、蛍光波長は４５０ｎｍとした。
実施例１０：ＤＮＡテンプレート上での反応および蛍光測定（ＭＢＡプローブおよびＤＮｓ−ＡＭＣＡプローブを用いた場合；図７および８を参照）
ＤＮＡテンプレート上での反応は、それぞれ１００ｎＭのＤＮＡテンプレート、ＤＮｓ−ＡＭＣＡプローブ、ＭＢＡプローブをバッファー中（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．０２５％ ＰＥＧ，１ｕｇ／ｍｌ Ｃａｌｆ ＤＮＡ，ｐＨ ７．２）において、３７℃で反応させることにより行った。蛍光シグナルは、蛍光分光光度計（ＦＰ−６５００；ＪＡＳＣＯ）を用いて解析した。励起波長は３７５ｎｍ、蛍光波長は４５０ｎｍとした。
実施例１１：７−アミノクマリンのＣＮＳ誘導体の有機合成
（１）メチル ７−（２−シアノ−４−ニトロベンゼンスルホンアミド）−４−メチルクマリン−３−アセテート（２ａ）の合成
実施例１（１）で合成したメチル ７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセテート（図２の化合物１）（３４．０ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）をピリジン／ＣＨ２Ｃｌ２（１．４ｍｌ，１：１）に溶解し、氷冷下、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍｌ）に溶解させた塩化２−シアノ−４−ニトロベンゼンスルホニル（塩化ＣＮＳ；６３．８ｍｇ，０．２６ｍｍｏｌ，１．９当量）を加え撹拌した。翌日、ＴＬＣにて原料の消失を確認した後に反応液をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液およびＨ２Ｏと分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：１％酢酸を含むヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：１）で精製した（化合物２ａ：３２．０ｍｇ，０．０７ｍｍｏｌ，５１％）。
1H-NMR (300MHz, DMSO-d6) :δ11.80(1H, s, SO2-NH), 8.93-8.93(1H, ds, J= 2.4Hz, ArSO2), 8.69-8.65(1H, dd, J= 2.1, 8.7 Hz, ArSO2), 8.38-8.35(1H, d, J= 8.7 Hz, ArSO2), 7.79-7.76(1H, d, J= 8.4 Hz, Ar), 7.17-7.13(1H, dd, J= 1.8, 8.4 Hz, Ar), 7.12(1H, s, Ar), 3.67(2H, s, CH2), 3.61(3H, s, OCH3), 2.35(3H, s, CH3); 13C-NMR (75.5 MHz, DMSO-d6) :δ 170.39, 160.28, 152.27, 149.79, 148.96, 145.48, 139.23, 131.34, 131.16, 129.07, 127.15, 118.08, 116.35, 115.75, 114.07, 110.66, 106.16, 51.90, 14.98; ESI-MS: (M-H)-calcd. 456.06, found 455.98.
（２）７−（２−シアノ−４−ニトロベンゼンスルホンアミド）−４−メチル−３−クマリニル酢酸（３ａ）の合成
化合物２ａをＴＨＦ（３．５ｍｌ）に溶解し、氷冷下、Ｈ２Ｏ（３．５ｍｌ）に溶解させた水酸化リチウム・一水和物（２２．２ｍｇ，０．５３ｍｍｏｌ，７．６当量）を加え撹拌した。３０分後、反応液を室温に戻しさらに撹拌した。３時間後、ＴＬＣにて原料の消失を確認した後に５％ ＨＣｌを加え反応液を酸性にした。ＣＨＣｌ３で抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：１％酢酸を含むＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝２０：１）で精製した（化合物３ａ：２９．６ｍｇ，０．０７ｍｍｏｌ，９５％）。
1H-NMR (300MHz, DMSO-d6) :δ12.20(1H, br, OH), 11.77(1H, s, SO2-NH), 8.92-8.92(1H, ds, J= 2.4 Hz, ArSO2), 8.68-8.64(1H, dd, J= 2.1, 8.4 Hz, ArSO2), 8.36-8.33(1H, d, J= 9.0 Hz, ArSO2), 7.78-7.75(1H, d, J= 8.7 Hz, Ar), 7.16-7.10(2H, m, Ar), 3.56(2H, s, CH2), 2.34(3H, s, CH3); 13C-NMR (75.5 MHz, DMSO-d6) :δ171.34, 160.39, 152.26, 149.80, 148.51, 145.47, 139.10, 131.35, 131.15, 129.08, 127.07, 118.75, 116.49, 115.80, 114.09, 110.64, 106.22, 32.74, 14.96; ESI-MS: (M-H)-calcd. 456.06, found 455.98.
実施例１２：５’−ＣＮＳ保護ＡＭＣＡ−結合オリゴヌクレオチド（ＣＮＳ−ＡＭＣＡプローブ）の合成
ＣＮＳ保護ＡＭＣＡの付加は、５’−アミノ修飾オリゴと反応させることにより行った。ＤＭＦ溶液中、ＣＮＳ誘導体３ａ（０．２Ｍ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．２Ｍ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ；０．２Ｍ）を１１時間反応させることにより、ＣＮＳ−ＡＭＣＡ ＮＨＳエステルを得た。５’−アミノ修飾オリゴの合成には、５’−アミノ修飾剤５（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いた。反応は、１６ｍＭのＣＮＳ−ＡＭＣＡ ＮＨＳエステル（ＤＭＦ中）、５０ｍＭの四ホウ酸ナトリウム緩衝液、２００μＭの５’−アミノ修飾オリゴ溶液を含む混合液を、室温で３時間激しく撹拌することにより行った（反応液中のＤＭＦ濃度は４６％）。反応産物をエタノール沈殿で回収したのち、逆相ＨＰＬＣ（グラジエント条件：０−５０％ アセトニトリル／５０ｍＭ 酢酸トリエチルアンモニウム）にて精製を行った。また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により目的の産物が得られていることを確認した。ＣＮＳ−ＡＭＣＡプローブ：Calcd for C102H126N26O60P8S 2954.5, Found 2939.4.
実施例１３：ＤＮＡテンプレート上での反応および蛍光測定（ＭＢＡプローブおよびＣＮＳ−ＡＭＣＡプローブを用いた場合；図９および１０を参照）
ＤＮＡテンプレート上での反応は、それぞれ５０ｎＭの各種ＤＮＡテンプレート、ＣＮＳ−ＡＭＣＡプローブ、ＭＢＡプローブをバッファー中（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＭｇＣｌ２，ｐＨ ７．２）において、室温で反応させることにより行った。蛍光シグナルは、蛍光分光光度計（ＦＰ−６５００；ＪＡＳＣＯ）を用いて解析した。励起波長は３７５ｎｍ、蛍光波長は４５０ｎｍとした。
実施例１４：種々の当量のテンプレートを用いた反応回転数（ＴＯ）の測定（図１１を参照）
ＴＯの測定は、５０ｎＭ（ＣＮＳ−ＡＭＣＡプローブに対して１当量）、５ｎＭ（ＣＮＳ−ＡＭＣＡプローブに対して１０−１当量）、５００ｐＭ（ＣＮＳ−ＡＭＣＡプローブに対して１０−２当量）、５０ｐＭ（ＣＮＳ−ＡＭＣＡプローブに対して１０−３当量）、５ｐＭ（ＣＮＳ−ＡＭＣＡプローブに対して１０−４当量）および０．５ｐＭ（ＣＮＳ−ＡＭＣＡプローブに対して１０−５当量）の各種濃度のＤＮＡテンプレート（２３Ｓ−Ｃ：５’−ＣＴＡＡＣＧＴＣＣＧＴＣＧＴＧＡＡＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＡＧＣＴＡＡＧＧＴＣＣＣＡ−３’（配列番号２））、５０ｎＭのＣＮＳ−ＡＭＣＡプローブ（３’−ＴＣＣＣＴＴＴＧ−ＣＮＳ−ＡＭＣＡ−５’）、５０ｎＭのＭＢＡプローブ（３’−ＭＢＡ−ＴＴＧＧＧＴＣ−５’）をバッファー中（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＭｇＣｌ２，ｐＨ ７．２）において、室温で反応させることにより行った。蛍光シグナルは、蛍光分光光度計（ＦＰ−６５００；ＪＡＳＣＯ）を用いて解析した。励起波長は３７５ｎｍ、蛍光波長は４５０ｎｍとして、４時間測定した。４時間後のそれぞれの蛍光シグナルから、脱ＣＮＳされたＣＮＳ−ＡＭＣＡプローブの物質量を求め、それをテンプレートの物質量で除することにより、反応回転数（ＴＯ）を求めた。
実施例１５：７−アミノクマリンのＮＰＳ誘導体の有機合成
（１）メチル ７−（５−ニトロピリジルスルホンアミド）−４−メチルクマリン−３−アセテート（２ｂ）の合成
実施例１（１）で合成したメチル ７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセテート（図２の化合物１）（３４．１ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）をピリジン／ＣＨ２Ｃｌ２（１．４ｍｌ，１：１）に溶解し、氷冷下、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍｌ）に溶解させた塩化２−（５−ニトロピリジル）スルホニル（塩化ＮＰＳ；５５．９ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ，１．８当量）を加え撹拌した。翌日、ＴＬＣにて原料の消失を確認した後に反応液をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液およびＨ２Ｏと分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：１％酢酸を含むヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：１）で精製した（化合物２ｂ：３４．２ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ，５７％）。
1H-NMR (300MHz, DMSO-d6) :δ11.52(1H, s, SO2-NH), 9.47(1H, s, PySO2), 8.85-8.81(1H, dd, J= 2.7, 9.0 Hz, PySO2), 8.36-8.34(1H, d, J= 8.7 Hz, PySO2), 7.75-7.73(1H, d, J= 8.4 Hz, Ar), 7.21-7.18(1H, d, J= 8.7 Hz, Ar), 7.17-7.16(1H, ds, J= 1.8 Hz, Ar), 3.66(2H, s, CH2), 3.61(3H, s, OCH3), 2.34(3H, s, CH3); 13C-NMR (75.5 MHz, DMSO-d6) :δ 170.41, 160.34, 159.63, 152.23, 149.00, 145.93, 145.81, 140.20, 134.80, 126.88, 123.34, 117.73, 115.85, 115.39, 105.57, 51.87, 32.43, 14.94; ESI-MS: (M-H)-calcd. 432.06, found 431.98.
（２）７−（５−ニトロピリジルスルホンアミド）−４−メチル−３−クマリニル酢酸（３ｂ）の合成
化合物２ｂをＴＨＦ（４ｍｌ）に溶解し、氷冷下、Ｈ２Ｏ（４ｍｌ）に溶解させた水酸化リチウム・一水和物（２４．４ｍｇ，０．５８ｍｍｏｌ，７．４当量）を加え撹拌した。３０分後、反応液を室温に戻しさらに撹拌した。３時間後、ＴＬＣにて原料の消失を確認した後に５％ ＨＣｌを加え反応液を酸性にした。ＣＨＣｌ３で抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：１％酢酸を含むＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝２０：１）で精製した（化合物３ｂ：２９．９ｍｇ，０．０７ｍｍｏｌ，９０％）。
1H-NMR (300MHz, DMSO-d6) :δ12.25(1H, br, OH), 11.45(1H, s, SO2-NH), 9.47-9.46(1H, ds, J= 2.4 Hz, PySO2), 8.84-8.80(1H, dd, J= 2.7, 8.4 Hz, PySO2), 8.35-8.32(1H, d, J= 8.4 Hz, PySO2), 7.75-7.72(1H, d, J= 8.7 Hz, Ar), 7.20-7.15(2H, m, Ar), 3.56(2H, s, CH2), 2.32(3H, s, CH3); 13C-NMR (75.5 MHz, DMSO-d6) :δ 171.37, 160.45, 159.60, 152.21, 148.56, 145.94, 145.82, 140.06, 134.80, 126.80, 123.35, 118.39, 115.98, 115.40, 105.59, 32.71, 14.92; ESI-MS: (M-H)- calcd. 418.04, found 417.96.
実施例１６：５’−ＮＰＳ保護ＡＭＣＡ−結合オリゴヌクレオチド（ＮＰＳ−ＡＭＣＡプローブ）の合成
ＮＰＳ保護ＡＭＣＡの付加は、５’−アミノ修飾オリゴと反応させることにより行った。ＤＭＦ溶液中、ＮＰＳ誘導体３ｂ（０．２Ｍ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．２Ｍ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ；０．２Ｍ）を１１時間反応させることにより、ＮＰＳ−ＡＭＣＡ ＮＨＳエステルを得た。５’−アミノ修飾オリゴの合成には、５’−アミノ修飾剤５（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いた。反応は、１６ｍＭのＮＰＳ−ＡＭＣＡ ＮＨＳエステル（ＤＭＦ中）、５０ｍＭの四ホウ酸ナトリウム緩衝液、２００μＭの５’−アミノ修飾オリゴ溶液を含む混合液を、室温で３時間激しく撹拌することにより行った（反応液中のＤＭＦ濃度は４６％）。反応産物をエタノール沈殿で回収したのち、逆相ＨＰＬＣ（グラジエント条件：０−５０％ アセトニトリル／５０ｍＭ 酢酸トリエチルアンモニウム）にて精製を行った。また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により目的の産物が得られていることを確認した。ＮＰＳ−ＡＭＣＡプローブ：Calcd for C100H126N26O60P8S 2930.5, Found 2913.8.
実施例１７：ＤＮＡテンプレート上での反応および蛍光測定（ＭＢＡプローブおよび各種ＡＭＣＡプローブを用いた場合；図１２および１３を参照）
ＤＮＡテンプレート上での反応は、それぞれ５０ｎＭのＤＮＡテンプレート、各種ＡＭＣＡプローブ、ＭＢＡプローブをバッファー中（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＭｇＣｌ２，ｐＨ ７．２）において、室温で反応させることにより行った。蛍光シグナルは、蛍光分光光度計（ＦＰ−６５００；ＪＡＳＣＯ）を用いて解析した。励起波長は３７５ｎｍ、蛍光波長は４５０ｎｍとした。
本発明の標識試薬は、標的ＤＮＡあるいは、ＲＮＡ分子に結合して、化学反応を起こすことにより蛍光を発することができるようになる。本発明の化合物は、高いシグナル・バックグラウンド比を持つため、高感度遺伝子検出が可能になるとともに、細胞内、生体内での遺伝子検出イメージングが可能となる。さらに本発明は、他の試薬や酵素を用いる必要がないため、簡便・安価であり、試験管内のみではなく、細胞内あるいは生体内での遺伝子検出が可能となる。さらに、本発明の標識試薬は、安定性が高く（長期間活性）かつ高感度であり、微量の遺伝子シグナルを増幅し、観察することが可能である。
本出願は、日本で出願された特願２００９−２２９８６６を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含される。

Claims (9)

  1. 下記式（Ｉ’）で示される化合物：

    （式中、Ｘは、水素原子又はカルボキシル基の保護基を示し、Ｙは、２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基、２−シアノ−４−ニトロベンゼンスルホニル基または５−ニトロピリジン−２−イルスルホニル基を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数６から１０のアリール基、又はシアノ基を示す。）。
  2. Ｘ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が水素原子を示し、かつＲ４がメチル基を示す、請求項１に記載の化合物。
  3. 請求項１又は２に記載の化合物を含む、生体関連物質を検出するための標識試薬。
  4. 核酸の標識のために用いる、請求項３に記載の試薬。
  5. 求核剤と組み合わせて使用される、請求項３又は４に記載の試薬。
  6. 標的核酸配列の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第一の核酸プローブであって、クマリン骨格を有し、かつ分子内に２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基、２−シアノ−４−ニトロベンゼンスルホニル基または５−ニトロピリジン−２−イルスルホニル基を有する無蛍光性分子で標識した上記の第一の核酸プローブと、標的核酸配列の別の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第二の核酸プローブであって、求核性を有する分子で標識した上記の第二の核酸プローブとを、標的核酸配列にハイブリダイズさせる工程、及び第一の核酸プローブ中の無蛍光性分子の２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基、２−シアノ−４−ニトロベンゼンスルホニル基または５−ニトロピリジン−２−イルスルホニル基が芳香族求核置換反応を受けることにより生成する蛍光を検出する工程を含み、ここで、該無蛍光性分子として、請求項１又は２に記載の化合物を用いる、標的核酸配列の検出方法。
  7. 標的核酸配列がＲＮＡである、請求項６に記載の方法。
  8. 標的核酸配列の一塩基多型を検出する、請求項６に記載の方法。
  9. 細胞内の標的核酸配列を検出することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
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