JP5733760B2 - 蛍光発生分子および標的核酸検出方法 - Google Patents
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Description
[1]下記式(I’)で示される化合物:
[2]X、R1、R2及びR3が水素原子を示し、かつR4がメチル基を示す、[1]に記載の化合物。
[3][1]又は[2]に記載の化合物を含む、生体関連物質を検出するための標識試薬。
[4]核酸の標識のために用いる、[3]に記載の試薬。
[5]求核剤と組み合わせて使用される、[3]又は[4]に記載の試薬。
[6]標的核酸配列の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第一の核酸プローブであって、クマリン骨格を有し、かつ分子内に2,4−ジニトロベンゼンスルホニル基、2−シアノ−4−ニトロベンゼンスルホニル基または5−ニトロピリジン−2−イルスルホニル基を有する無蛍光性分子で標識した上記の第一の核酸プローブと、標的核酸配列の別の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第二の核酸プローブであって、求核性を有する分子で標識した上記の第二の核酸プローブとを、標的核酸配列にハイブリダイズさせる工程、及び第一の核酸プローブ中の無蛍光性分子の2,4−ジニトロベンゼンスルホニル基、2−シアノ−4−ニトロベンゼンスルホニル基または5−ニトロピリジン−2−イルスルホニル基が芳香族求核置換反応を受けることにより生成する蛍光を検出する工程を含む、標的核酸配列の検出方法。
[7]上記無蛍光性分子として、[1]又は[2]に記載の化合物を用いる、[6]に記載の方法。
[8]標的核酸配列がRNAである、[6]又は[7]に記載の方法。
[9]標的核酸配列の一塩基多型を検出する、[6]又は[7]に記載の方法。
[10]細胞内の標的核酸配列を検出することを特徴とする、[6]に記載の方法。
[1A]下記式(I)で示される化合物:
[2A]X、R1、R2及びR3が水素原子を示し、かつR4がメチル基を示す、[1A]に記載の化合物。
[3A][1A]又は[2A]に記載の化合物を含む、生体関連物質を検出するための標識試薬。
[4A]核酸の標識のために用いる、[3A]に記載の試薬。
[5A]求核剤と組み合わせて使用される、[3A]又は[4A]に記載の試薬。
[6A]標的核酸配列の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第一の核酸プローブであって、クマリン骨格を有し、かつ分子内に2,4−ジニトロベンゼンスルホニル基を有する無蛍光性分子で標識した上記の第一の核酸プローブと、標的核酸配列の別の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第二の核酸プローブであって、求核性を有する分子で標識した上記の第二の核酸プローブとを、標的核酸配列にハイブリダイズさせる工程、及び第一の核酸プローブ中の無蛍光性分子の2,4−ジニトロベンゼンスルホニル基が芳香族求核置換反応を受けることにより生成する蛍光を検出する工程を含む、標的核酸配列の検出方法。
[7A]上記無蛍光性分子として、[1A]又は[2A]に記載の化合物を用いる、[6A]に記載の方法。
[8A]標的核酸配列がRNAである、[6A]又は[7A]に記載の方法。
[9A]標的核酸配列の一塩基多型を検出する、[6A]又は[7A]に記載の方法。
[10A]細胞内の標的核酸配列を検出することを特徴とする、[6A]に記載の方法。
本発明で開発した蛍光発生分子システムは、2,4−ジニトロベンゼンスルホニル基、2−シアノ−4−ニトロベンゼンスルホニル基または5−ニトロピリジン−2−イルスルホニル基の求核剤による芳香族求核置換反応をトリガーとして、無蛍光性分子の構造変化が起こり蛍光を発する蛍光on/off型センサーシステムとして一般化できる(図1:但し、一例として2,4−ジニトロベンゼンスルホニル基の場合を示してある。)。本発明の実施例として、蛍光分子7−アミノクマリンを化学修飾し、2,4−ジニトロベンゼンスルホニル基(DNs)を導入した分子を合成した(図2)。まず、7−アミノ−4−メチル−3−クマリニル酢酸(AMCA)をエステル化した。つづいて、アミノ基をDNsで保護した。最後に、エステルを加水分解することにより、目的物である7−アミノクマリンのDNs誘導体(図2の化合物3)を得た。
(1)3’末端をPS修飾したプローブ(PSプローブ)を用いた場合:標的DNA配列および合成したプローブを図5に示した。標的配列特異的なシグナル発生を確認するため、1つのミスマッチ塩基を含む標的配列の存在下、および標的配列が存在しない条件でも、蛍光シグナルの経時変化を測定し比較した。その結果、本プローブ(DNs−AMCAプローブ)は、標的配列(23S−C:配列番号2)が存在すると、蛍光シグナルが顕著に増大した。一方、1つのミスマッチ塩基を含む標的配列(23S−T:配列番号3)の存在下、および標的配列非存在下では、蛍光シグナルの増加はほとんど観察されなかった(図6)。そのため、本プローブが標的核酸配列特異的に蛍光シグナルを発生することが明らかとなった。
(2)3’末端をMBA修飾したプローブ(MBAプローブ)を用いた場合:標的DNA配列および合成したプローブを図7に示した。標的配列特異的なシグナル発生を確認するため、標的配列が存在しない条件でも、蛍光シグナルの経時変化を測定し比較した。その結果、本プローブ(DNs−AMCAプローブ)は、標的配列(23S−C:配列番号2)が存在すると、蛍光シグナルが顕著に増大した。一方、標的配列非存在下では、蛍光シグナルの増加はほとんど観察されなかった(図8)。そのため、本プローブが標的核酸配列特異的に蛍光シグナルを発生することが明らかとなった。また、その反応効率は、PSプローブを用いた場合と比較して大きく改善することが明らかとなった。
標的DNA配列および合成したプローブを図9に示した。標的配列特異的なシグナル発生を確認するため、1つのミスマッチ塩基を含む標的配列の存在下、および標的配列が存在しない条件でも、蛍光シグナルの経時変化を測定し比較した。その結果、本プローブ(CNS−AMCAプローブ)は、標的配列(23S−C:配列番号2)が存在すると、蛍光シグナルが顕著に増大した。一方、1つのミスマッチ塩基を含む標的配列(23S−T:配列番号3、23S−A:配列番号4、23S−G:配列番号5)の存在下、および標的配列非存在下では、蛍光シグナルの増加はほとんど観察されなかった(図10)。そのため、本プローブが標的核酸配列特異的に蛍光シグナルを発生することが明らかとなった。
標的DNA配列および合成したプローブを図12に示した。標的配列特異的なシグナル発生を確認するため、標的配列が存在しない条件でも、蛍光シグナルの経時変化を測定し比較した。また、DNs−AMCAプローブおよびCNS−AMCAプローブとも比較した。その結果、本プローブ(NPS−AMCAプローブ)は、DNs−AMCAプローブおよびCNS−AMCAプローブと同様に、標的配列(23S−C:配列番号2)が存在すると、蛍光シグナルが顕著に増大した。一方、標的配列非存在下では、蛍光シグナルの増加はほとんど観察されなかった(図13)。そのため、本プローブが標的核酸配列特異的に蛍光シグナルを発生することが明らかとなった。
1H−NMRスペクトルは、内部標準としてテトラメチルシランを用いて日本電子社製JNM−Excalibur270もしくはJNM−AL300で測定し、全δ値をppmで示した。
13C−NMRスペクトルは、内部標準としてテトラメチルシランを用いて日本電子社製JNM−Excalibur270もしくはJNM−AL300で測定し、全δ値をppmで示した。
ESI質量分析は、日本電子社製JMS−T100LCで測定した。
HR−ESI質量分析は、日本電子社製JMS−T100LCで測定した。
MALDI−TOF質量分析は、ブルカーダルトニクス社製microflexで測定した。
混合溶媒において示した数値は、特に断らない限り各溶媒の容積混合比である。
(1)メチル 7−アミノ−4−メチルクマリン−3−アセテート(図2の化合物1)の合成
7−アミノ−4−メチル−3−クマリニル酢酸(43.1mg,0.18mmol)をMeOH(40ml)に溶解した。H2SO4(5滴)を加えた後、反応液を120℃に加熱し撹拌した。4時間後、原料の消失を確認し、反応液を室温に戻した。反応液を1/3にまで濃縮した後に飽和NaHCO3水溶液を加え中和した。BuOHで抽出を行い、有機層を濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出液:へキサン:EtOAc=1:2)にて精製し、目的化合物を得た(34.4mg,0.14mmol,75%)。
化合物1(29.6mg,0.12mmol)をピリジン/CH2Cl2(=1:1,1.2ml)に溶解した。反応液を氷冷し、DNsCl(52.5mg,0.20mmol,1.6当量)を加え撹拌した。4時間後、DNsCl(32.0mg,0.12mmol,1.0当量)を追加した。4時間後、反応液をCHCl3で希釈し、H2Oと分液した。有機層を濃縮し、残渣をPLC(1%酢酸を含むヘキサン:EtOAc=1:2)にて精製し、目的化合物を得た(33.6mg,0.07mmol,56%)。
化合物2(43.5mg,0.09mmol)をTHF(4.5ml)に溶解した。反応液を氷冷し、0.16M LiOH水溶液(4.5ml)をゆっくりと加え、氷冷下、撹拌した。1.5時間後、反応液を室温に戻した。2時間後、原料の消失を確認した。反応液を氷冷し、5% HClを加え反応液を酸性にした。EtOAcで抽出した。有機層を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出液:1%酢酸を含むCHCl3:MeOH=20:1)にて精製し、目的化合物を得た(41.8mg,0.09mmol,99%)。
全てのオリゴヌクレオチドは、0.2μMスケールのカラムを用いて、一般的なホスホロアミダイト法に基づいて、DNA自動合成機(H−8−SE;Gene World)で合成した。塩基の脱保護およびCPG担体からの切り出しは、アンモニア水中で、55℃、4時間インキュベートすることにより行った。オリゴヌクレオチドの精製は、逆相カラム(MicroPure II;Biosearch Technologies)にて行い、UV吸光度を測定することにより濃度を決定した。
測定は、7−アミノ−4−メチル−3−クマリニル酢酸(AMCA)および7−(2,4−ジニトロフェニルスルホンアミド)−4−メチル−3−クマリニル酢酸(化合物3)について、蛍光分光光度計(FP−6500;JASCO)を用い、0.1M リン酸バッファー(pH 10)中で行った。各化合物は、375nmで励起した。量子収率は、4−メチルウンベリフェロン(0.63)を標準として用いて決定した。
DNs保護AMCAの付加は、5’−アミノ修飾オリゴと反応させることにより行った。DMF溶液中、DNs誘導体(化合物3;0.2M)、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(0.2M)およびN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS;0.2M)を11時間反応させることにより、DNs−AMCA NHSエステルを得た。5’−アミノ修飾オリゴの合成には、5’−アミノ修飾剤5(Glen Research)を用いた。反応は、16mMのDNs−AMCA NHSエステル(DMF中)、50mMの四ホウ酸ナトリウム緩衝液、200μMの5’−アミノ修飾オリゴ溶液を含む混合液を、室温で3時間激しく撹拌することにより行った(反応液中のDMF濃度は46%)。反応産物をエタノール沈殿で回収したのち、逆相HPLC(グラジエント条件:0−50% アセトニトリル/50mM 酢酸トリエチルアンモニウム)にて精製を行った。また、MALDI−TOF質量分析により目的の産物が得られていることを確認した。DNs−AMCAプローブ:Calcd for C155H177N42O63P8S 3915.2, Found 3929.0.
3’−ホスフォロチオエートC12オリゴの合成は、3’−ホスフェートCPGにスペーサーC12 CEホスフォルアミダイト(Glen research)を用いてスペーサーC12をカップリングしたのち、硫化剤(Glen research)でホスフォロチオエート化することにより行った。MALDI−TOF質量分析により目的の産物が得られていることを確認した。PSプローブ:Calcd for C81H114N24O49P8S 2486.5, Found 2487.6.
p−メルカプト安息香酸(81.3mg,0.53mmol)をDMF(5.3ml)に溶解した。N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS;74.0mg,0.06mmol,1.5当量)、DCC(140.0mg,0.06mmol,1.5当量)を加え攪拌した。6時間後、反応液をろ過し、尿素を除去した。有機層を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出液:ヘキサン:EtOAc=1:1)にて精製し、目的化合物MBA−NHSエステルを得た(70.4mg)。
ESI-MS m/z: Calcd for C11H8NO4S-([M-H]-) 250.25846, Found 249.908.
MBA基の付加は、3’−アミノ修飾オリゴと反応させることにより行った。3’−アミノ修飾オリゴの合成には、3’−アミノ修飾剤C3 CPG(Glen Research)を用いた。反応は、8mMのMBA−NHSエステル(DMF中)、50mMの四ホウ酸ナトリウム緩衝液、200μMの3’−アミノ修飾オリゴ溶液を含む混合液を、室温で1晩撹拌することにより行った(反応液中のDMF濃度は46%)。反応産物をエタノール沈殿で回収したのち、逆相HPLC(グラジエント条件:0−60% アセトニトリル/50mM 酢酸トリエチルアンモニウム)にて精製を行った。また、ESI−TOF質量分析により目的の産物が得られていることを確認した。MBAプローブ:Calcd for C79H101N24O47P7S 2400.4, Found 2400.9.
測定は、500nM DNs−AMCAプローブと500μM 求核剤とをバッファー中(20mM Tris−HCl,100mM MgCl2,pH 7.2)、37℃で反応させることにより行った。蛍光シグナルは、蛍光分光光度計(FP−6500;JASCO)を用いて解析し、励起波長は375nm、蛍光波長は450nmとした。反応の初期速度は、Microsoft Excelを用いてln[DNs−AMCAプローブ]t/[DNs−AMCAプローブ]0と時間をそれぞれプロットし、得られた直線の傾きより初期速度(kapp)を計算した。[DNs−AMCAプローブ]0は未反応時のDNs−AMCAプローブの濃度、[DNs−AMCAプローブ]tは反応時間ごとのDNs−AMCAプローブ濃度、[product]tは脱DNsされたプローブ濃度を示す。[DNs−AMCAプローブ]t=[DNs−AMCAプローブ]0−[product]tより求め、[product]tは蛍光の検量線より求めた。
DNAテンプレート上での反応は、それぞれ500nMのDNAテンプレート、DNs−AMCAプローブ、PSプローブをバッファー中(20mM Tris−HCl,100mM MgCl2,pH 7.2)において、37℃で反応させることにより行った。蛍光シグナルは、蛍光分光光度計(FP−6500;JASCO)を用いて解析した。励起波長は375nm、蛍光波長は450nmとした。
DNAテンプレート上での反応は、それぞれ100nMのDNAテンプレート、DNs−AMCAプローブ、MBAプローブをバッファー中(20mM Tris−HCl,10mM MgCl2,0.025% PEG,1ug/ml Calf DNA,pH 7.2)において、37℃で反応させることにより行った。蛍光シグナルは、蛍光分光光度計(FP−6500;JASCO)を用いて解析した。励起波長は375nm、蛍光波長は450nmとした。
実施例1(1)で合成したメチル 7−アミノ−4−メチルクマリン−3−アセテート(図2の化合物1)(34.0mg,0.14mmol)をピリジン/CH2Cl2(1.4ml,1:1)に溶解し、氷冷下、CH2Cl2(0.5ml)に溶解させた塩化2−シアノ−4−ニトロベンゼンスルホニル(塩化CNS;63.8mg,0.26mmol,1.9当量)を加え撹拌した。翌日、TLCにて原料の消失を確認した後に反応液をEtOAcで希釈し、飽和NaHCO3水溶液およびH2Oと分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥させた。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出液:1%酢酸を含むヘキサン:EtOAc=1:1)で精製した(化合物2a:32.0mg,0.07mmol,51%)。
1H-NMR (300MHz, DMSO-d6) :δ11.80(1H, s, SO2-NH), 8.93-8.93(1H, ds, J= 2.4Hz, ArSO2), 8.69-8.65(1H, dd, J= 2.1, 8.7 Hz, ArSO2), 8.38-8.35(1H, d, J= 8.7 Hz, ArSO2), 7.79-7.76(1H, d, J= 8.4 Hz, Ar), 7.17-7.13(1H, dd, J= 1.8, 8.4 Hz, Ar), 7.12(1H, s, Ar), 3.67(2H, s, CH2), 3.61(3H, s, OCH3), 2.35(3H, s, CH3); 13C-NMR (75.5 MHz, DMSO-d6) :δ 170.39, 160.28, 152.27, 149.79, 148.96, 145.48, 139.23, 131.34, 131.16, 129.07, 127.15, 118.08, 116.35, 115.75, 114.07, 110.66, 106.16, 51.90, 14.98; ESI-MS: (M-H)-calcd. 456.06, found 455.98.
化合物2aをTHF(3.5ml)に溶解し、氷冷下、H2O(3.5ml)に溶解させた水酸化リチウム・一水和物(22.2mg,0.53mmol,7.6当量)を加え撹拌した。30分後、反応液を室温に戻しさらに撹拌した。3時間後、TLCにて原料の消失を確認した後に5% HClを加え反応液を酸性にした。CHCl3で抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥させた。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出液:1%酢酸を含むCHCl3:MeOH=20:1)で精製した(化合物3a:29.6mg,0.07mmol,95%)。
1H-NMR (300MHz, DMSO-d6) :δ12.20(1H, br, OH), 11.77(1H, s, SO2-NH), 8.92-8.92(1H, ds, J= 2.4 Hz, ArSO2), 8.68-8.64(1H, dd, J= 2.1, 8.4 Hz, ArSO2), 8.36-8.33(1H, d, J= 9.0 Hz, ArSO2), 7.78-7.75(1H, d, J= 8.7 Hz, Ar), 7.16-7.10(2H, m, Ar), 3.56(2H, s, CH2), 2.34(3H, s, CH3); 13C-NMR (75.5 MHz, DMSO-d6) :δ171.34, 160.39, 152.26, 149.80, 148.51, 145.47, 139.10, 131.35, 131.15, 129.08, 127.07, 118.75, 116.49, 115.80, 114.09, 110.64, 106.22, 32.74, 14.96; ESI-MS: (M-H)-calcd. 456.06, found 455.98.
CNS保護AMCAの付加は、5’−アミノ修飾オリゴと反応させることにより行った。DMF溶液中、CNS誘導体3a(0.2M)、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(0.2M)およびN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS;0.2M)を11時間反応させることにより、CNS−AMCA NHSエステルを得た。5’−アミノ修飾オリゴの合成には、5’−アミノ修飾剤5(Glen Research)を用いた。反応は、16mMのCNS−AMCA NHSエステル(DMF中)、50mMの四ホウ酸ナトリウム緩衝液、200μMの5’−アミノ修飾オリゴ溶液を含む混合液を、室温で3時間激しく撹拌することにより行った(反応液中のDMF濃度は46%)。反応産物をエタノール沈殿で回収したのち、逆相HPLC(グラジエント条件:0−50% アセトニトリル/50mM 酢酸トリエチルアンモニウム)にて精製を行った。また、MALDI−TOF質量分析により目的の産物が得られていることを確認した。CNS−AMCAプローブ:Calcd for C102H126N26O60P8S 2954.5, Found 2939.4.
DNAテンプレート上での反応は、それぞれ50nMの各種DNAテンプレート、CNS−AMCAプローブ、MBAプローブをバッファー中(20mM Tris−HCl,100mM MgCl2,pH 7.2)において、室温で反応させることにより行った。蛍光シグナルは、蛍光分光光度計(FP−6500;JASCO)を用いて解析した。励起波長は375nm、蛍光波長は450nmとした。
TOの測定は、50nM(CNS−AMCAプローブに対して1当量)、5nM(CNS−AMCAプローブに対して10−1当量)、500pM(CNS−AMCAプローブに対して10−2当量)、50pM(CNS−AMCAプローブに対して10−3当量)、5pM(CNS−AMCAプローブに対して10−4当量)および0.5pM(CNS−AMCAプローブに対して10−5当量)の各種濃度のDNAテンプレート(23S−C:5’−CTAACGTCCGTCGTGAAGAGGGAAACAACCCAGACCGCCAGCTAAGGTCCCA−3’(配列番号2))、50nMのCNS−AMCAプローブ(3’−TCCCTTTG−CNS−AMCA−5’)、50nMのMBAプローブ(3’−MBA−TTGGGTC−5’)をバッファー中(20mM Tris−HCl,100mM MgCl2,pH 7.2)において、室温で反応させることにより行った。蛍光シグナルは、蛍光分光光度計(FP−6500;JASCO)を用いて解析した。励起波長は375nm、蛍光波長は450nmとして、4時間測定した。4時間後のそれぞれの蛍光シグナルから、脱CNSされたCNS−AMCAプローブの物質量を求め、それをテンプレートの物質量で除することにより、反応回転数(TO)を求めた。
実施例1(1)で合成したメチル 7−アミノ−4−メチルクマリン−3−アセテート(図2の化合物1)(34.1mg,0.14mmol)をピリジン/CH2Cl2(1.4ml,1:1)に溶解し、氷冷下、CH2Cl2(0.5ml)に溶解させた塩化2−(5−ニトロピリジル)スルホニル(塩化NPS;55.9mg,0.25mmol,1.8当量)を加え撹拌した。翌日、TLCにて原料の消失を確認した後に反応液をEtOAcで希釈し、飽和NaHCO3水溶液およびH2Oと分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥させた。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出液:1%酢酸を含むヘキサン:EtOAc=1:1)で精製した(化合物2b:34.2mg,0.08mmol,57%)。
1H-NMR (300MHz, DMSO-d6) :δ11.52(1H, s, SO2-NH), 9.47(1H, s, PySO2), 8.85-8.81(1H, dd, J= 2.7, 9.0 Hz, PySO2), 8.36-8.34(1H, d, J= 8.7 Hz, PySO2), 7.75-7.73(1H, d, J= 8.4 Hz, Ar), 7.21-7.18(1H, d, J= 8.7 Hz, Ar), 7.17-7.16(1H, ds, J= 1.8 Hz, Ar), 3.66(2H, s, CH2), 3.61(3H, s, OCH3), 2.34(3H, s, CH3); 13C-NMR (75.5 MHz, DMSO-d6) :δ 170.41, 160.34, 159.63, 152.23, 149.00, 145.93, 145.81, 140.20, 134.80, 126.88, 123.34, 117.73, 115.85, 115.39, 105.57, 51.87, 32.43, 14.94; ESI-MS: (M-H)-calcd. 432.06, found 431.98.
化合物2bをTHF(4ml)に溶解し、氷冷下、H2O(4ml)に溶解させた水酸化リチウム・一水和物(24.4mg,0.58mmol,7.4当量)を加え撹拌した。30分後、反応液を室温に戻しさらに撹拌した。3時間後、TLCにて原料の消失を確認した後に5% HClを加え反応液を酸性にした。CHCl3で抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥させた。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出液:1%酢酸を含むCHCl3:MeOH=20:1)で精製した(化合物3b:29.9mg,0.07mmol,90%)。
1H-NMR (300MHz, DMSO-d6) :δ12.25(1H, br, OH), 11.45(1H, s, SO2-NH), 9.47-9.46(1H, ds, J= 2.4 Hz, PySO2), 8.84-8.80(1H, dd, J= 2.7, 8.4 Hz, PySO2), 8.35-8.32(1H, d, J= 8.4 Hz, PySO2), 7.75-7.72(1H, d, J= 8.7 Hz, Ar), 7.20-7.15(2H, m, Ar), 3.56(2H, s, CH2), 2.32(3H, s, CH3); 13C-NMR (75.5 MHz, DMSO-d6) :δ 171.37, 160.45, 159.60, 152.21, 148.56, 145.94, 145.82, 140.06, 134.80, 126.80, 123.35, 118.39, 115.98, 115.40, 105.59, 32.71, 14.92; ESI-MS: (M-H)- calcd. 418.04, found 417.96.
NPS保護AMCAの付加は、5’−アミノ修飾オリゴと反応させることにより行った。DMF溶液中、NPS誘導体3b(0.2M)、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(0.2M)およびN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS;0.2M)を11時間反応させることにより、NPS−AMCA NHSエステルを得た。5’−アミノ修飾オリゴの合成には、5’−アミノ修飾剤5(Glen Research)を用いた。反応は、16mMのNPS−AMCA NHSエステル(DMF中)、50mMの四ホウ酸ナトリウム緩衝液、200μMの5’−アミノ修飾オリゴ溶液を含む混合液を、室温で3時間激しく撹拌することにより行った(反応液中のDMF濃度は46%)。反応産物をエタノール沈殿で回収したのち、逆相HPLC(グラジエント条件:0−50% アセトニトリル/50mM 酢酸トリエチルアンモニウム)にて精製を行った。また、MALDI−TOF質量分析により目的の産物が得られていることを確認した。NPS−AMCAプローブ:Calcd for C100H126N26O60P8S 2930.5, Found 2913.8.
DNAテンプレート上での反応は、それぞれ50nMのDNAテンプレート、各種AMCAプローブ、MBAプローブをバッファー中(20mM Tris−HCl,100mM MgCl2,pH 7.2)において、室温で反応させることにより行った。蛍光シグナルは、蛍光分光光度計(FP−6500;JASCO)を用いて解析した。励起波長は375nm、蛍光波長は450nmとした。
Claims (9)
- 下記式(I’)で示される化合物:
(式中、Xは、水素原子又はカルボキシル基の保護基を示し、Yは、2,4−ジニトロベンゼンスルホニル基、2−シアノ−4−ニトロベンゼンスルホニル基または5−ニトロピリジン−2−イルスルホニル基を示し、R1、R2、R3及びR4はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数1から6のアルキル基、炭素数1から6のアルコキシ基、炭素数6から10のアリール基、又はシアノ基を示す。)。 - X、R1、R2及びR3が水素原子を示し、かつR4がメチル基を示す、請求項1に記載の化合物。
- 請求項1又は2に記載の化合物を含む、生体関連物質を検出するための標識試薬。
- 核酸の標識のために用いる、請求項3に記載の試薬。
- 求核剤と組み合わせて使用される、請求項3又は4に記載の試薬。
- 標的核酸配列の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第一の核酸プローブであって、クマリン骨格を有し、かつ分子内に2,4−ジニトロベンゼンスルホニル基、2−シアノ−4−ニトロベンゼンスルホニル基または5−ニトロピリジン−2−イルスルホニル基を有する無蛍光性分子で標識した上記の第一の核酸プローブと、標的核酸配列の別の一部の領域と相補的な核酸配列を有する第二の核酸プローブであって、求核性を有する分子で標識した上記の第二の核酸プローブとを、標的核酸配列にハイブリダイズさせる工程、及び第一の核酸プローブ中の無蛍光性分子の2,4−ジニトロベンゼンスルホニル基、2−シアノ−4−ニトロベンゼンスルホニル基または5−ニトロピリジン−2−イルスルホニル基が芳香族求核置換反応を受けることにより生成する蛍光を検出する工程を含み、ここで、該無蛍光性分子として、請求項1又は2に記載の化合物を用いる、標的核酸配列の検出方法。
- 標的核酸配列がRNAである、請求項6に記載の方法。
- 標的核酸配列の一塩基多型を検出する、請求項6に記載の方法。
- 細胞内の標的核酸配列を検出することを特徴とする、請求項6に記載の方法。
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