MXPA02009455A

MXPA02009455A - Composiciones farmaceuticas que contienen oligosacaridos y su preparacion.

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Publication number: MXPA02009455A
Application number: MXPA02009455A
Authority: MX
Inventors: Pierre Mourier
Original assignee: Aventis Pharma Sa
Priority date: 2000-03-28
Filing date: 2001-03-26
Publication date: 2003-02-12
Also published as: FR2807043B1; IL151832A0; DE60109279D1; YU72802A; EA004768B1; HK1056564A1; HUP0300330A3; WO2001072762A1; PL357301A1; PT1272499E; SK13932002A3; CN1426419A; NO20024590D0; AU4663901A; CA2403906A1; JP2003529570A; BR0109617A; EP1272499B1; AR034251A1; EP1272499A1

Abstract

La presente invencion se refiere a composiciones farmaceuticas que contienen como principio activo un oligosacarido de la formula: (ver formula I) o una mezcla de estos oligosacaridos, a los nuevos oligosacaridos de la formula (I), a sus mezclas y a sus procedimientos de preparacion.

Description

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS QUE CONTIENEN OLIGOSACARIDOS Y SU PREPARACIÓN Descripción de la Invención La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen como principio activo un oligosacárido de la fórmula: o a una mezcla de estos oligosacáridos, a los nuevos oligosacáridos de la fórmula (I), a sus mezclas y a sus procedimientos de preparación. En la fórmula (I) n es un número entero de 0 a 25, Ri, R3, R4, R5, Re y Rß idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO3M, R2 y R7, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO;3M o COCH3 y M es sodio, calcio, magnesio o potasio. Ref.142032 Estos oligosacáridos llevan así un número par de sacáridos. En la fórmula (I) R y R6 son, de preferencia, átomos de hidrógeno. Los oligosacáridos de la fórmula (I) para los cuales n es igual a 0, y ya sea Ri, R6 y R8 representan un átomo de hidrógeno, R7 representa un radical SO3M o COCH3 y M es sodio, o Ri y R6 representan un átomo de hidrógeno, R7 representa un radical COCH3, R8 representa un radical SO3M y M es sodio, o R6 representa un átomo de hidrógeno, Ri, R7 y Rs representan un radical SO3M y M es sodio, ya han sido descritos por G. H. LEE y colaboradores, J. Chro at. 212, 65-73 (1981) pero ninguna propiedad farmacológica ha sido descrita para estos productos. Los oligosacáridos de la fórmula (I) para los cuales n es igual a 0 y ya sea R6 y R? representan átomos de hidrógeno, Ri y Re representan un radical SO3M y M es sodio, o Ri, R6 y R7 representan un átomo de hidrógeno, R8 representa un radical SO3M y M es sodio, son descritos por MW McLean y colaboradores, Eur. J. Biochem., 1984, 145, 607, sin alguna indicación de actividad farmacológica. Las composiciones farmacéuticas preferidas son aquellas que contienen un oligosacárido de la fórmula (I) para la cual: n es un número entero de 0 a 10 y, en particular de 0 a 6 y aún más particularmente de 1 a 6, Ri, R2, R3, R5, R7, R8 son idénticos o diferentes y representan un átomo de hidrógeno o un radical SO3M y, en particular Rlf R2, R3, R5, R, R8 son radicales SOaM, - M es sodio.

Las composiciones farmacéuticas preferidas particularmente son aquellas que contienen un oligosacárido de la fórmula (I) para la cual: n es igual a 0, Rx, R7 y R8 representan un radical SO3M, R6 representa un átomo de hidrógeno y M es sodio, - n es igual a 1, Rx, R2, R3, R5, Ri, y R8/ representan un radical SOßM, R y R6 representan un átomo de hidrógeno y M es sodio, n es igual a 2, Rx, R2, R3, 5/ R7 y ßr representan un radical SO3M, R4 y R6 representan un átomo de hidrógeno y M es sodio, n es igual a 3, RX/ R2, R3, R5, R7 y R8 representan un radical SO3M, R4 y R6 representan un átomo de hidrógeno y M es sodio, - n es igual a 4, Rx, R2, R3, R5/ R7 y Re, representan un radical SO3M, R y R6 representan un átomo de hidrógeno y M es sodio.

Los oligosacáridos de la fórmula (I) con la excepción de aguellos para los cuales n es igual a 0 y ya sea Ri/ Re y Rs representan un átomo de hidrógeno, R7 representa un radical SO3M o COCH3 y M es sodio, o Rx y R6 representan un átomo de hidrógeno, R7 representa un radical C0CH3, R8 representa un radical SO3M y M es sodio, o R6 representa un hidrógeno, RX/ R7 y R8 representan un radical SO3M y M es sodio, o R6 y R7 representan átomos de hidrógeno, Rx y R8 representan un radical SO3M y M es sodio, o Rx, R6 y R7 representan un átomo de hidrógeno, R8 representa un radical SO3M y M es sodio, son novedosos y por lo tanto los mismos forman parte de la invención. Los oligosacáridos de la fórmula (I) pueden ser preparados por la acción de un borohidruro de metal alcalino o de amonio cuaternario sobre los oligosacáridos de la fórmula: en la cual n es un número entero de 0 a 25, Rx, R3, R4, R5 Re y R8, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO3M, R2 y R7, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO3M o COCH3 y M es sodio, calcio, magnesio o potasio. Esta reacción se efectúa en un medio acuoso, a una temperatura próxima a 25 °C, a un pH comprendido entre 7 y 10 y de preferencia entre 9 y 10, durante toda la duración de la reacción. El mantenimiento del pH es obtenido por la adición de una solución de sosa a 0.5 mol/1. La reacción es detenida por acidificación del medio de reacción, por ejemplo por la adición de ácido acético hasta la obtención de un pH comprendido entre 4 y 5. Como el borohidruro de metal alcalino, se puede citar el borohidruro de litio, de sodio y de potasio.

Como borohidruro de amonio cuaternario, se puede citar el borohidruro de tetrabutilamonio. Los oligosacáridos de la fórmula (II) pueden ser obtenidos por separación por cromatografía sobre un gel de una mezcla de oligosacáridos (III) obtenida por despolimerización enzimática de la heparina o despolimerización básica del éster bencílico de la heparina o de un éster bencílico de heparina de semisíntesis . Esta cromatografía se efectúa sobre columnas rellenas de gel del tipo de poliacrila ida-agarosa tales como aquellas comercializadas bajo la marca Ultrogel ACA202R (Biosepra) . De preferencia, se utiliza una batería de columnas de gel de poliacrilamida agarosa. El número de colonias utilizadas está adaptada en función del volumen, del gel y de los oligosacáridos que se van a separar. La mezcla es eluída por una solución que contiene un amortiguador de fosfato y cloruro de sodio. De preferencia, la solución de amortiguador de fosfato es una solución al 0.02 mol/1 de NaH2P04/Na2HP04 (pH 7) que contiene 0.1 mol/1 de cloruro de sodio. La detección de las diferentes fracciones es realizada por espectrometría de UV (254 nm) e iónica (IBF) . Las fracciones así obtenidas pueden ser purificadas en seguida eventualmente por ejemplo por cromatografía SAX (intercambio aniónico fuerte) según los métodos conocidos por el experto en el arte y especialmente según los métodos descritos por K.G. Rice y R.J. Linhardt, Carbohydrate Research 190, 219-233 (1989), A. Larn jaer, S.H. Hansen y P.B. Ostergaard, Carbohydrate Research, 266, 37-52 (1995) y en la patente WO90/01501 (ejemplo 2) . Las fracciones son liofilizadas en seguida luego desaladas sobre una columna rellena de gel tal como una columna de gel Sephadex G10R (Pharmacia Biochemicals) . Cuando la purificación no es realizada por cromatografía SAX, los liofilizados pueden ser purificados eventualmente por precipitación simple o fraccionada según los métodos conocidos por el experto en el arte y especialmente según el método descrito en la patente FR2548672. De manera general, se opera según el protocolo siguiente. La fracción liofilizada que se va a purificar se disuelve a 25 °C aproximadamente en diez volúmenes de agua destilada. Por adición de metanol o etanol, se hace precipitar el oligosacárido deseado controlando su enriquecimiento por cromatografía CLAR (Cromatografía Líquida de Alta Resolución) . La adición de metanol o etanol es determinada en función de la pureza y el rendimiento deseado de dicho oligosacárido. De la misma manera, esta operación puede ser realizada en varias etapas sucesivas a partir de la solución inicial del liofilizado. Para esto, se reagrega el agente insolubilizante (metanol o etanol) en porciones pequeñas y se aisla después de cada adición el precipitado obtenido. Los precipitados así preparados son analizados por cromatografía CLAR. Según la pureza y el rendimiento deseado, se reúnen las fracciones adecuadas del precipitado. Según una variante de la presente invención, la fracción liofilizada que se va a purificar puede ser disuelta en 10 a 200 volúmenes de agua que contiene 0 a 30 % de acetato de sodio. El porcentaje de acetato de sodio será ajustado previamente en función de la naturaleza del oligosacárido que se va a tratar (en función del tamaño) . Para la adición del metanol, se hace precipitar el oligosacárido deseado controlando su enriquecimiento por cromatografía CLAR (Cromatografía Líquida de Alta Resolución) . La adición de metanol es determinada en función de la pureza y del rendimiento deseado de dicho oligosacárido. Así mismo, esta operación puede ser realizada en varias etapas sucesivas a partir de la solución inicial del liofilizado. Para esto, se reagrega el agente insolubilizante (metanol) en porciones pequeñas y se aisla después cada adición el precipitado obtenido. Los precipitados así preparados son analizados por cromatografía CLAR. Según la pureza y el rendimiento deseado, se reúnen las fracciones adecuadas del precipitado. Para los compuestos intermedios de la fórmula (II) para los cuales n = 0, 1 o 2, es preferible partir de una mezcla (III) obtenida por despolimerización enzimática. Esta despolimerización se efectúa por medio de heparinasa I (EC 4.2.2.7), dentro de una solución amortiguadora de fosfato de pH7, en la presencia de cloruro de sodio y de BSA (Albúmina del Suero de Bovino) , a una temperatura comprendida entre 10 y 18 °C y, de preferencia 15 °C, durante 8 a 10 días y, de preferencia, 9 días. La despolimerización es detenida por ejemplo por calentamiento del medio de reacción a 100 °C durante 2 minutos y la mezcla es recuperada por liofilización. Es preferible utilizar 7 Ul de heparinasa I por 25 g de heparina. La solución amortiguadora de fosfato comprende generalmente 0.05 mol/1 de NaH2P04/Na2HP04 (pH 7) en la presencia de 0.1 mol/1 de cloruro de sodio. La concentración de BSA es generalmente de 2%. Para los compuestos intermedios de la fórmula (II) para los cuales n = 0, 1, 2, 3 o 4, es preferible partir de un mezcla (III) obtenida por despolimerización de un éster bencílico de heparina. El éster bencílico de heparina puede ser preparado según los métodos descritos en las patentes US5389618, EP40144, FR2548672. La tasa de esterificación estará comprendida de preferencia entre 50 y 100 %. De manera preferente, la misma estará comprendida entre 70 y 90%. La despolimerización se efectúa en un medio acuoso, por medio de un hidróxido de metal alcalino (hidróxido de litio, sosa, potasa o hidróxido de cesio por ejemplo) o de un hidróxido de amonio cuaternario (hidróxido de tetrabutilamonio por ejemplo), de preferencia, a una molaridad comprendida entre 0.1 y 0.2 mol/1, a una temperatura comprendida entre 40 y 80 °C, durante 5 a 120 minutos. En un modo preferido, se opera durante 5 a 15 minutos, a una temperatura comprendida entre 60 y 70 °C, con una solución de hidróxido de sodio 0.15 mol/1. La reacción de despolimerización es detenida por neutralización por adición de un ácido tal como el ácido acético. Después de la adición del 10% en peso por volumen de acetato de sodio, la mezcla de oligosacáridos es precipitada por la adición de metanol, de preferencia, 2 volúmenes para 1 volumen del medio de reacción y se filtra. Según un aspecto preferido de la invención, la mezcla de oligosacáridos obtenida después de la despolimerización química, bajo la forma de una solución acuosa, es enriquecida por ultrafiltración sobre membranas con un umbral de corte nominal apropiado (tipo Pellicon de celulosa regenerada, comercializadas por Millipore) ; el tipo de membrana es adaptado en función del tipo de oligosacáridos enriquecidos que se van a recuperar. Para los oligosacáridos (II) para los cuales n = 0, se utilizará una membrana de umbral de corte normal de 1 kDa, para los oligosacáridos (II) para los cuales n = 1, se utilizará una membrana de 1 kDa o 3 kDa, para los oligosacáridos (II) para los cuales n = 2, se utilizará una membrana de 3 kDa, para los oligosacáridos (II) para los cuales n = 3 o 4, se utilizará una membrana de 5 kDa. En el transcurso de esta operación, el material permeado es recuperado y el material retenido desechado. Así, la fracción del producto enriquecido puede representar de 50 a 10% de la mezcla de oligosacáridos inicial conservando al menos 80% del oligosacárido deseado. Para los compuestos intermedios de la fórmula (II) para los cuales n = 0 a 25, es preferible partir de una mezcla (III) obtenida por despolimerización de un éster bencílico del polisacárido sulfatado de la se isíntesis . El éster bencílico del polisacárido sulfato de la semisíntesis es preparado a partir de los polisacáridos sulfatados de la semisíntesis obtenidos a partir del polisacárido K5 y según los métodos descritos en las patentes W094/29352 y W096/14425. Las condiciones de esterificación, de despolimerización y de recuperación son las mismas que aquellas descritas precedentemente para el éster bencílico de heparina . En todos los procedimientos precedentes, la heparina inicial puede ser de origen porcino, ovino, caprino o bovino y puede provenir de las mucosidades, los pulmones o la piel de los animales. De preferencia, se utiliza una heparina de la mucosidad de porcino, ovino o de los pulmones de la vaca, y aún más preferentemente de la mucosidad de porcino o de los pulmones de la vaca. Los oligosacáridos de la fórmula (I) presentan propiedades anti-inflamatorias y pueden ser utilizados así para la prevención o el tratamiento de enfermedades relacionadas con un proceso inflamatorio que implican la producción de substancias citotóxicas tales como el óxido nítrico (NO) cuya forma inducible es liberada especialmente por los neutrófilos o los macrófagos en el momento en que los mismos migran y son activados al nivel de un tejido. La migración, activación y adhesión de los neutrófilos se producen al nivel de las zonas de los tejidos con isquemia en seguida de una oclusión o de un espasmo de una arteria que vasculariza este tejido. Estas isquemias^ pueden producirse ya sea al nivel cerebral (accidente vascular cerebral) , o al nivel del miocardio (infarto al miocardio) , o al nivel de las membranas inferiores (esquemias llamadas periféricas) . Los oligosacáridos de la fórmula (I) pueden ser utilizados así para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas para las cuales la inflamación cerebral desempeña un papel perjudicial que puede conducir a la muerte, entre las cuales se pueden citar las isquemias cerebrales, las isquemias cardiacas (infarto al miocardio) , las isquemias periféricas, los traumatismos del sistema nervioso central y especialmente los traumatismos craneanos, espinales y cráneo-espinales, la esclerosis de las placas, los dolores neuropáticos y las neuropatías periféricas, las enfermedades de las motoneuronas como la esclerosis lateral amiotrófica, la atrofia espinal progresiva, la atrofia muscular infantil y la esclerosis lateral primaria, el neuro-sida, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la Corea de Huntington y ciertas formas de osteoartritis especialmente de localización articular. La actividad anti-inflamatoria de estos productos es demostrada in vivo en la prueba de producción de NOx (nitrito y nitrato) inducida por un lipopolisacárido (LPS) que proviene de E. Coli según el protocolo descrito por M.

YAMASHITA y colaboradores, Eur. J. Pharmacol, 338, 2, 151-158 (1997) o J.E. SHELLITO y colaboradores, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 13, 1, 45-53 (1995).

Se inyectan en ratones CD1 machos (Charles River, 25-35 g) , a TO por la vía intravenosa del bolo 0.5 mg/kg del oligosacárido, a T+15 minutos, por la vía subcutánea, 1 o 2 mg/kg del oligosacárido. A T+30 minutos, se administran 100 mg/kg de lipopolisacárido (LPS) que proviene de E. Coli (Sigma L3129, serotipo 0127:B8). A T+3 horas se inyectan de nuevo por la vía subcutánea 1 o 2 mg/kg del oligosacárido. A T+5 horas 30 minutos, una muestra de sangre es recuperada por punción del ojo y las concentraciones en NOx (nitrito y nitrato) en el plasma son determinadas con el método colorimétrico de Griess después de la reducción del nitrato en nitrito por la nitrato reductasa de la siguiente manera: 12 ml de la muestra del plasma son mezclados con 88 ml de agua desionizada e incubados en la oscuridad 1 hora a temperatura ambiente con 40 ml de amortiguador de fosfato (0.31 M, pH 7.5), 20 ml de ß-NADPH (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido) (0.86 M) , 20 ml de FDA (flavina adenina dinucleótido) (0.11 mM) y 20 ml de nitrato reductasa (2U/ml) (Boehringer Mannheim) . 10 ml de ZnS04 (1 M) son agregados para precipitar las proteínas y después de la mezcla, las muestras son centrifugadas a 20 OOOg durante 5 minutos. Finalmente, 50 ml del sobrenadante son incubados 10 minutos a temperatura ambiente con 100 ml del reactivo de Griess (sulfanilamida al 1 % en una mezcla de ácido fosfórico/naftiletilendiamina 0.1% en agua desionizada (v/v) ) . Las densidades ópticas son observadas a 540 nm con un espectrofotómetro de microplacas; cada punto es determinado 2 veces. KNO3 y NaN02 son utilizados como el estándar para el método colorimétrico. En esta prueba, los oligosacáridos según la invención inhiben más del 50% de la formación de NOx. Por otra parte, los oligosacáridos de la fórmula (I) aumentar la supervivencia y el crecimiento de las motoneuronas y así son particularmente útiles en la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades motoneuronales tales como la esclerosis lateral amiotrófica, la atrofia espinal progresiva, la atrofia muscular infantil, la esclerosis lateral primaria. Ya se sabe que los cultivos de motoneuronas mueren por apoptosis si ellos son efectuados en la ausencia de soporte trófico (BDNF, NT5 por ejemplo) . Ahora se ha encontrado que los oligosacáridos según la invención permiten la supervivencia y el crecimiento de las motoneuronas. Esta actividad ha sido probada sobre los co-cultivos de astrocitos y motoneuronas privadas del factor neurotrófico según el siguiente protocolo: CULTIVOS ENRIQUECIDOS EN MOTONEURONAS: Los cultivos enriquecidos en motoneuronas son preparados utilizando el método de centrifugación descrito por R.L. SCHNAAR y A.E. SCHAFFNER, J. Neurosci., 1, 204-217 (1981) y modificado por W. CAMU y CE. HENDERSON, J. Neurosci. Methods, 44, 59-70 (1992). Las médulas espinales de embriones de la rata E15 son disecadas de manera estéril y desprovistas de las cuerdas espinales dorsales. Las mismas son cortadas e incubadas en seguida 15 minutos a 37 °C en PBS (solución salada amortiguada con fosfato : NaCl 137 mM, KCl 2.68 M, Na2HP04 6.45 M, KH2P04 1.47 mM) al cual se ha agregado 0.05% de tripsina. La disociación de las células es complementada por trituración con la extremidad de una pipeta de 1 ml en el medio de cultivo adicionado con 0.1% de albúmina del suero de bovino (BSA) y de 0.1 mg/ml de ADNasa.

La suspensión de células es expuesta sobre una banda de metrizamida al 6.5% peso/volumen en el medio L15 (comercializado por Gibco BRL) y centrifugado a 500 g durante minutos. La banda de la interfase que contiene las motoneuronas es recuperada, diluida en el medio L15 e incubada 45 minutos a temperatura ambiente en cajas de cultivo previamente revestidas con anti-IigG del ratón y del sobrenada ente de hibridoma MCI92 (Chandler CE y colaboradores, J. Biol. Chem., 259, 6882 (1984). Las células suspendidas son lavadas con el medio L15 y las motoneuronas son eluídas bajo agitación reducida con el sobrenadante del hibridoma MCI92. Las motoneuronas son extendidas a una densidad de 650 células por 24 mm en las cajas de cultivo sobre las monocapas de astrocitos en el medio L15 al cual se ha agregado bicarbonato de sodio (22 mM) , coalbúmina (0.1 mg/ml), putrescina (0.1 mM) , insulina (5 µg/ml), selenita de sodio (31 nM) , glucosa (20 mM) , progesterona 21 nM) , penicilina (100 Ul/ml) y estreptomicina (100 ug/ml) . Los cultivos son mantenidos a 37 °C en una atmósfera humedecida al 5% de C02.

CULTIVO DE ASTROCITOS DE LA MEDULA ESPINAL: Los astrocitos son obtenidos a partir de embriones de ratas según el método de R.P. SANETO y J. DE VELLIS, en Neurochemistry, a practical approach (A. J. TURNER y H.S. St JOH?) IRL Press, Oxford-Washington DC, p27-63 (1987) ligeramente modificado. Las médulas espinales son disecadas de manera estéril, se les retiran las meninges y los glanglios dorsales. Cinco de cada diez médulas espinales son transferidas en PBS (solución salada amortiguada con fosfato : ?aCl 137 mM, KCl 2.68 mM, ?a2HP04 6.45 mM, KH2P04 1.47 mM) y cortados antes de la incubación a 37 °C durante 25 minutos en PBS al cual se ha agregado 0.25% de tripsina. El tratamiento enzimático es detenido por la adición de 10 ml del medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) al cual se ha agregado 10% de suero de bovino fetal (FCSL y las células son colectadas por centrifugación. Otra etapa de disociación mecánica es efectuada utilizando la extremidad de una pipeta de 1 ml. Las células son expuestas a una densidad de 1.5 x 106 células por 25 cm2 del medio de cultivo en DMEM al 10% de FCS . Después de 2 días in vitro los cultivos son alimentados diariamente a todo lo largo de la duración del estudio. Cuando una monocapa visible de células es obtenida, los cultivos son agitados 48 horas a 250 rpm y, el día siguiente, las monocapas son tratadas con citosina arabinosida (10~5 M) durante 48 horas. Las monocapas de astrocitos son amplificadas en seguida a una densidad de cinco para 35 mm sobre las placas del cultivo para los recipientes de cultivo de 25 cm2 en el inicio del estudio. Los cultivos de astrocitos espinales están compuestos cuando mucho del 98% de células inmunoreactivas para la proteína glial fibrilar acida (GAFP) . Las monocapas de astrocitos son expuestas ya sea al PBS solo (testigo) o al producto que se va a probar en solución en PBS durante 24 horas a la concentración de 0.1 ng/ml a 10 ng ng/ml. Las monocapas de astrocitos son lavadas en seguida con DMEM y mantenidas 2 horas con el medio de cultivo en donde las motoneuronas son agregadas . Dos horas después de la alimentación y durante 2 o 3 horas, el vehículo o el producto que se va a probar todavía es agregado al medio de cultivo.

IDENTIFICACIÓN INMUNOQUIMICA DE LAS MOTONEURONAS Las células son fijadas en 4% de paraformaldehído y 0.1 % de glutaraldehído en PBS (pH 7.4 a 4 °C durante 15 minutos) . Los cultivos son lavados en seguida y los sitios no específicos bloqueados con 2 % de albúmina del suero de bovino (BSA) en PBS y 0.1 % de Tritón X100R. Estos cultivos son incubados sucesivamente con anticuerpos de p75LNGRF (artículo de Chandler citado precedentemente) , una noche a 4 °C y con suero de cabra biotinilado 1/125 Gibco) y estreptavidenperoxidasa (1/200, Gibco) durante 60 minutos. Los anticuerpos son visualizados utilizando la reacción de DAB/peróxido de hidrógeno.

CONTEO DE LAS CÉLULAS Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO Las células inmunorreactivas para el receptor de neutrofina de actividad reducida p75lngrf y que exhiben las neuritas más largas que los diámetros de 4 células son consideradas como motoneuronas viables. El número de motoneuronas es evaluado por conteo de las células marcadas en una superficie de 0.825 cm2 bajo el microscopio con aumento de 200 veces. Los valores son expresados como un número de motoneuronas por cm2 o un porcentaje del número de motoneuronas presentes en los cultivos mantenidos en la ausencia del factor trófico comparado con el control. Los experimentos son realizados al menos 3 veces . Los análisis estadísticos son efectuados utilizando la prueba de Student (prueba t) . Para el pretratamiento con los oligosacáridos de la presente invención, el número de motoneuronas que crecen sobre la monocapa de los astrocitos es aumentada de 20 a 50%. Los siguientes ejemplos son representativos de la preparación de los oligosacáridos de la fórmula (I) y de los compuestos intermedios . En estos ejemplos los significados de las abreviaturas son los siguientes: ?ls : (ácido 4-desoxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hex-enopiranosilurónico) - (1-^4) -2-desoxi-2-sulfoamino-6-0-sulfo-a-D-glucopiranosa, sal de tetrasodio o bien ?UAp2S- (1-^4) -a-D-GlcNp2S6S Is (ácido 2-sulfo-a-L-idopiranosilurónico) - (1-^4) -2-desoxi-2-sulfoamino-6-0-sulfo-a-D-glucopiranosa, sal de tetrasodio (ácido 2-sulfo-a-L-idopiranosilurónico) - (l- 4) -2-desoxi-6-0-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glucopirañosa, sal de tetrasodio o bien a-L-IdoAp2S- (l->4) -a-D-GlcNp2S6S lis (ácido a-L-idopiranosilurónico) - (1-^4) -2-desoxi-6- O-sulfoamino-a-D-glucopiranosa, sal de trisodio o bien a-L-IdoAp- (l- 4) -a-D-GlcNp2S6S IIIs (ácido 2-sulfo-a-L-idopiranosilurónico) - (1-^4) -2-desoxi-2-sulfoamino-a-D-glucopiranosa, sal de trisodio o bien -L-IdoAp2S- (l-»4) -a-D-GlcNp2S IdoAp ácido idopiranosilurónico GlcNp 2-amino-2-desoxi-glucopiranosa ?UaP ácido 4-desoxi-a-L-treo-hex-enopirano- silurónico sulfato, EJEMPLOS DE PREPARACIÓN DE LAS MEZCLAS INTERMEDIARIAS DE LA FORMULA (II) EJEMPLO A - preparación de los oligosacáridos de la fórmula (II) para los cuales n = 0, 1 y 2 para la despolimerización enzimática y separación Se disuelven 25 g de heparina en 250 ml de una solución amortiguadora de fosfato que contiene 0.05 mol/1 de NaH2P04/Na2HP0 (pH = 7), 0.2 mol/1 de cloruro de sodio y 2 % de BSA (Albúmina de Suero de Bovino) . Se introducen en la mezcla 7 Ul de heparinasa I (EC 4.2.2.2.7) y la solución obtenida es enfriada a 15 °C luego mantenida a esta temperatura durante toda la duración de la reacción de despolimerización. El avance de la reacción es seguido por extracciones escalonadas de alícuotas y analizadas por cromatografía sobre la permeación de gel . .Alrededor de los 9 días, la reacción enzimática es detenida calentando el medio de reacción a 100 °C durante dos minutos. La mezcla enfriada es liofilizada en seguida. Se obtiene así una mezcla de oligosacáridos (III) . La mezcla de oligosacáridos (III) obtenida se somete a cromatografía en seguida según el siguiente método. La cromatografía se efectúa sobre columnas rellenas con gel de poliacrilamida-agarosa conocido bajo la denominación Ultrogel ACÁ 202 y la mezcla es eluída por una solución que contiene un amortiguador de fosfato (0.02 mol/l de Na2HP04/NaH2P04) pH = 7 y 0.1 mol/1 de .cloruro de sodio. La detección es realizada en espectrometría UV (254 nm) e iónica (IBF) . Los productos pueden ser purificados eventualmente por cromatografía SAX (intercambio aniónico fuerte) o por precipitación fraccionada según el método descrito en la patente FR 2548672. Las fracciones del producto recuperado son liofilizadas luego desaladas sobre una columna rellena de gel sephadex G10R (Pharmacia Biochemicals) . Por este método, se obtienen 3 g de disacárido ?ls, 1100 mg de una mezcla de hexasacárido que contiene típicamente 55 % del derivado ?ls-Is-Is, 35 % de ?ls-Is-IIs y 10 % de ?ls-Is-IIIs. Esta última mezcla puede ser purificada según los métodos conocidos por el experto en el arte para separar cada uno de los constituyentes o utilizándola tal cual para la transformación en derivados reducidos de la fórmula (I) .

EJEMPLO B - preparación de los oligosacáridos de la fórmula (II) para los cuales n=0, 1, 2, 3 o 4 por despolimerización del éster bencílico de heparina y separación a - Preparación del éster bencílico de heparina El éster bencílico de heparina es preparado según el ejemplo 3 de la patente US 5,389,618. b - Despolimerización Se disuelven 100 g del éster bencílico de la heparina en 1.9 1 de agua desmineralizada. La mezcla es llevada a 60 °C bajo agitación. Después de la obtención de una solución homogénea, se introducen en una sola vez aproximadamente 35 ml de una solución de hidróxido de sodio al 23 %. Después de 10 minutos de reacción, la solución es enfriada en seguida y neutralizada con 80 ml de una solución de ácido acético aproximadamente 2 N. A esta solución, se agrega 10 % en peso/volumen de acetato de sodio. La mezcla de oligosacáridos es precipitada por la adición de aproximadamente 2 volúmenes de metanol. El precipitado es aislado por filtración, se lava con metanol dos veces luego se seca bajo presión reducida a 50 °C. Después del secado, se •*r obtienen 73.8 g de una mezcla de oligosacáridos (II) . c Enriquecimiento del oligosacárido para el cual n 1 Se disuelven 30 g de la mezcla de oligosacáridos obtenida precedentemente en aproximadamente 35 volúmenes de agua. Esta solución es ultrafiltrada sobre una membrana de 3 kDa (Pellicon) . Cuando 600 ml del material permeado han sido trasegados, se diluye el material retenido con 500 ml de agua. La operación es proseguida hasta un trasiego de 450 ml de los materiales per eados suplementarios. Las dos fracciones del material permeado son reunidas luego concentradas a sequedad bajo presión reducida. Se obtienen 6.1 g de un sólido blanco amarillento. El análisis del sólido por cromatografía de permeación sobre gel indica que el mismo contiene aproximadamente 30% de oligosacárido de la fórmula (II) para el cual n=l . d - Fraccionamiento de las mezclas de oligosacáridos ultrafutrados La mezcla enriquecida es fraccionada sobre las columnas rellenas con el gel de poliacrilamida-agarosa conocidas bajo la denominación Ultrogel AC 202 (se utilizan 4 columnas en serie de un diámetro de 10 cm y de una altura de 50 cm) . 5 g de la mezcla enriquecida por ultrafiltración son disueltos en 25 ml de agua luego eluídos por una solución de 0.2 mol/1 de cloruro de sodio a la velocidad de 5 ml/min. Se recogen en la parte baja de la columna fracciones de 25 ml . La detección de los productos es realizada en espectrometría UV (254 nm) e iónica (IBF) . Las fracciones del producto para el cual n = 1 son recuperadas, liofilizadas luego desaladas sobre una columna rellena de gel Sephadex G10. Después de la liofilización, se obtiene 1 g de tetrasacárido que contiene típicamente 70 % del derivado ?ls-Is de la fórmula II (Rx, R2, R3, Rs, Ri, Re = S03Na; R4, R6 = H y M = Na) . El derivado ?ls-Is puede ser purificado eventualmente por cromatografía SAX (intercambio aniónico fuerte) o según un aspecto preferido por precipitación fraccionada según el método descrito en la patente FR 2548672 y la variante descrita en la presente invención.

EJEMPLOS DE PREPARACIÓN DE LOS OLIGOSACARIDOS DE LA FORMULA (I) EJEMPLO 1 En un reactor se introduce una solución a 25 °C de 300 mg de un oligosacárido de la fórmula (II) en la cual n es igual a 0, Rx, R7 y R8 representan un radical SO3M, R6 representa un átomo de hidrógeno y M es sodio, en 2 ml de agua. Bajo agitación, se agregan de una sola vez 212 mg de borohidruro de sodio. El pH es ajustado entonces entre 9 y 10 por la adición de una solución de hidróxido de sodio a 0.5 mol/1. Después de 12 horas, se agrega de manera progresiva el ácido acético hasta la obtención de un pH comprendido entre 4 y 5. La mezcla es agitada 1 hora luego se reajusta el pH a 6.7 por la adición de sosa a 0.5 mol/1. La mezcla es concentrada entonces a sequedad a 50 °C bajo presión reducida. El concentrado es dispersado bajo agitación magnética en 10 ml de metanol. Después de .una noche de sedimentación, la suspensión es filtrada sobre una membrana Whatman GF/B. El sólido sobre el filtro- es disuelto por el paso de 2 porciones de 10 ml de agua destilada. Esta solución es concentrada entonces a sequedad a 50 °C bajo presión reducida. Se obtienen 580 mg de un sólido blanco. El sólido es dispersado en seguida bajo agitación magnética en 15 ml de metanol. Después de 30 minutos de agitación, la suspensión es filtrada sobre una membrana Whatman GF/B. La torta es disuelta por el paso de 2 porciones de 10 ml de agua destilada. La solución obtenida es concentrada a sequedad a 50 °C bajo presión reducida. Se obtienen así 250 mg de un oligosacárido de la fórmula (I) para la cual n es igual a 0, Rx, R7 y R8 representan un radical SO3M, R6 representa un átomo de hidrógeno y M es sodio, bajo la forma de una mezcla de diastereoisómeros . Se observan de I a II los azúcares constitutivos de los disacáridos, I siendo el residuo reducido y II el residuo ácido urónico insaturado [ (ácido 4-desoxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hex-4-enopiranosilurónico) - (l->4) -2-desoxi-6-0-sulfo-2-sulfoamino-D-glucitol, sal de tetrasodio) ; ácido 4-desoxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hex-4-enopiranosilurónico) - (l->4) -2-desoxi-6-0-sulfo-2-sulfoamino-D-manitol, sal de tetrasodio) : Espectro del protón en D20, 600MHz, T=305K, d en ppm: 3.38 (ÍH, m H-2(I)), 3.70 y 3.75 (ÍH cada uno, respectivamente dd, J=6 y 12Hz y dd, J=5 y 12Hz, 2H-la)), 3.86 (ÍH, t, J = 5Hz, H-3(I)), 4.13 (ÍH, dd, J = 8 y 11Hz, H-6CI), 4.18 (1H, m, H-4U)), 4.25 (2H, m, H-6(I)) y H-3íri!), 4.35 (ÍH, m, H-5(I!), 4.65 (ÍH, m, H-2(II)), 5.67 (ÍH, s, H-1(II)), 6.00 ( 1?L, d, J = 5Hz, H-4,II,)j.

EJEMPLO 2 En un reactor se introduce una solución a 25 °C de 60 mg de un oligosacárido de la fórmula (II) en la cual n es igual a 1, Rx, R2, R3, R5, R7 y Rs representan un radical SO3M, R4 y R6 representan un átomo de hidrógeno y M es sodio, en 1.2 ml de agua. Bajo agitación, se agregan de una vez 18 mg de borohidruro de sodio. El pH es ajustado entonces entre 9 y 10 por la adición de una solución de hidróxido de sodio a 0.5 mol/1. Después de 12 horas, se agrega de manera progresiva el ácido acético hasta la obtención de un pH comprendido entre 4 y 5. La mezcla es agitada 1 hora luego se agregan 5 ml de metanol. La suspensión es filtrada sobre una membrana Whatman GF/B y el sólido recuperado es enjuagado 2 veces con 0.5 ml de metanol. Después del secado, se obtienen 42 mg de un oligosacárido de la fórmula (I) para la cual n es igual a 1, Ri, R2, R3, R5, 7 y Rs representan un radical SO3M, R4 y R6 representan un átomo de hidrógeno y M es sodio, bajo la forma de una mezcla de diastereoisómeros. Se observan de I a IV los azúcares constitutivos de los tetrasacáridos, I siendo el residuo reducido y IV el residuo ácido urónico insaturado [ (ácido 4-desoxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hex-4-enopiranosilurónico) - (l->4) -2-desoxi-6-0-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glucopiranosil- (1-^4) -ácido 2-O-sulfo-a-L- idopiranosilurónico- (1"^4) -2-desoxi-2-sulfoamino-6-0-sulfo-D-glucitol, sal de octasodio) ; (ácido 4-desoxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hex-4-enopiranosilurónico) - (l- 4) -2-desoxi-6-0-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glucopiranosil- (1-^4) -ácido 2-O-sulfo-a-L-idopiranosilurónico - (1-^4) -2-desoxi-6-0-sulfo-2-sulfoamino-D-manitol, sal de octasodio) : Espectro del protón en D20, 400MHz, T=298K, 8 en ppm: 3.25 (ÍH, dd, J=10 y 3Hz, H-2(III)), 3.37 (ÍH, m, H-2m), 3.59 (ÍH, m, H-3(III)), 3.75 (2H, m, 2H-1(I!), 3.79 (ÍH, t, J = 9Hz, H-4(III)), 3.86 (ÍH, , H-3(I!), entre 4.05 y 4.40 (10H, masivo, H-4(I)/H-5tI)/2H-6(I), H-2(II)/H-3!II)/H-4frI)) , 2H-6t?ri), H-3CIV!), 4.58 (lH/m, H-2(IV)), 4.60 (1H, m, H-5(II)), 5.27 (ÍH, d, J = 4Hz, H-1(II)), 5.42 (ÍH, d, J = 4Hz, H-1CIII)), 5.47 (1H, d, J = 2Hz, H-1(IV)), 5.95 (1H, d, J = 5Hz, H-4CIV!) ] .

EJEMPLO 3 En un reactor se introduce una solución a 25 °C de 100 mg de un oligosacárido de la fórmula (II) en la cual n es igual a 2, Rx, R2, R3, R5, R7 y R8 representan un radical SO3M, R y R6 representan un átomo de hidrógeno y M es sodio, en 2 ml de agua. Bajo agitación, se agregan de una vez 20 mg de borohidruro de sodio. El pH es ajustado entonces entre 9 y 10 por la adición de una solución de hidróxido de sodio a 0.5 mol/1. Después de 12 horas, se agrega de manera progresiva el ácido acético hasta la obtención de un pH comprendido entre 4 y 5. La mezcla es agitada 1 hora luego se reajusta el pH a 6.7 por la adición de sosa a 0.5 mol/1. La mezcla es diluida entonces con agua destilada en una cantidad suficiente para obtener 20 ml. Se agregan 2.5 g de acetato de sodio y se vacían 3 volúmenes de metanol. La suspensión es filtrada sobre una membrana Whatman GF/B y el sólido recuperado es enjuagado 2 veces con 2 ml de metanol. Después del secado, se obtienen 61 mg de un oligosacárido de la fórmula (I) para la cual n es igual a 2, Rx, R2, R3, Rs, R7 y Rs representan un radical SO3M, R y R6 representan un átomo de hidrógeno y M es sodio, bajo la forma de una mezcla de diastereoisómeros. Se observan de I a VI los azúcares constitutivos de los hexasacáridos, I siendo el residuo reducido y VI el residuo de ácido urónico insaturado [ (ácido 4-desoxi-2-0-sulfo- -L-treo-hex-4-enopiranosilurónico) -(1-^4)- 2-desoxi-2-sulfoamino-6-O-sulfo-a-D-glucopiranosil- (1-^4) -ácido 2-0-sulfo-a-L-idopiranosilurónico- (1-^-4) -2-desoxi-2-sulfoamino-6-O-sulfo-a-D-glucopiranosil- (1~ 4) -ácido 2-O-sulfo-a-L-idopiranosilurónico- (1-^4) -2-desoxi-2-sulfoamino-6-0-sulfo-D-glucitol, sal de dodecasodio) ; (ácido 4-desoxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hex-4-enopiranosilurónico) -(1-^4)- 2-desoxi-6-0- sulfo-2-sulfoamino-a-D-glucopiranosil- (1-^4) -ácido 2-0-sulfo-a-L-idopiranosilurónico -d?-4)- 2-desoxi6-0-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glucopiranosil- (1-^4) -ácido 2-0-sulfo-a-L-idopiranosilurónico- (1-^4) -2-desoxi-6-0-sulfo-2-sulfoamino-D-manitol, sal de dodecasodio) : Espectro del protón en D20, 600MHz, T=305K, 6 en ppm: 3.25 (2H, m, H-2(III! y !v! ) , 3.38 (ÍH, m, H-2(I))/ 3.61 (2H, t, J = 10Hz, H-3(III) y (V) ) , entre 3.70 y 3.83 (4H, masivo, 2H-1(I> y H-4(III) y (V) ) , 3.86 (ÍH, t, J = 5Hz, H-3m), 4.00 (2H, m, H-5(III) ? !V) ) , 4.07 (ÍH, m, H-4(IV)), 4.08 (ÍH, m, H-4(I)), entre 4.10 y 4.45 (13H, masivo, H-5(I,/2H-6(I) , H-2(II)/H-3(II!/H-4!II!), 2H-6(III), H-2(IV)/H-3(IV), 2H-6(V>, H-3(VI1), 4.60 (ÍH, s, H-2(VI)), 4.62 (ÍH, s, H-5(II)), 4.78 (ÍH, s, H-5(IV!), 5.17 (ÍH, s, H-1ÍIV)), 5.28 (ÍH, d, J = 4Hz, H-1(II)), 5.38 (1H, d, J = 3Hz, H-l(v)), 5.44 (ÍH, d, J = 3Hz, H-1(III)), 5.47 (ÍH, d, J = 2Hz, H-l'^'), 5.96 (ÍH, d, J = 5Hz, H-4(VI))].

EJEMPLO 4 En un reactor se introduce una solución a 25 °C de 100 mg de un oligosacárido de la fórmula (II) en la cual n es igual a 3, Rx, R2, R3, R5, R7 y R8 representan un radical SO3M, R^ y R6 representan un átomo de hidrógeno y M es sodio, en 2 ml de agua. Bajo agitación, se agregan en dos veces 30 mg de borohidruro de sodio. El pH es ajustado entonces entre 9 y 10 por la adición de una solución de hidróxido de sodio a 0.5 mol/1. Después de 12 horas, se agrega de manera progresiva el ácido acético hasta la obtención de un pH comprendido entre 4 y 5. La mezcla es agitada 1 hora luego se reajusta el pH a 6.7 por la adición de sosa a 0.5 mol/1. La mezcla es diluida entonces con agua destilada en una cantidad suficiente para obtener 20 ml. Se agregan 2 g de acetato de sodio y se vacían 3 volúmenes de metanol. La suspensión es filtrada sobre una membrana Whatman GF/B y el sólido recuperado es enjuagado 2 veces con 1 ml de metanol. Después del secado, se obtienen 68 mg de un sólido blanco. Después del control por CLAR (Cromatografía Líquida de Alta Resolución) , el producto que no está totalmente reducido, se renueva de manera completa en todas las operaciones precedentes. Después del secado, se obtienen 45 mg de un oligosacárido de la fórmula (I) para la cual n es igual a 3, Rx, R2, R3, R5, R7 y Rs representan un radical SO3M, R4 y R6 representan un átomo de hidrógeno y M es sodio, bajo la forma de una mezcla de diastereoisómeros. Se observan de I a VIII los azúcares constitutivos de los hexasacáridos, I siendo el residuo reducido y VIII el residuo de ácido nrónico insaturado [ (ácido 4-desoxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hex-4-enopiranosilurónico) -(1-^4)- 2-desoxi-6-0-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glucopiranosil- (1-^4) - ácido 2-O-sulfo-a-L-idopiranosilurónico -(l->4)- 2-desoxi-2-sulfoamino-6-0-sulfo- a-D-glucopiranosil- (1~>4) - ácido 2-0-sulfo-a-L-idopiranosilurónico -(.1-^4)- 2-desoxi6-0-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glucopiranosil- (1-^4) -, ácido 2- -sulfo-a-L-idopiranosilurónico- (l- 4) -2-desoxi-6-0-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glucitol, sal de hexadecasodio) ; (ácido 4-desoxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hex-4-enopiranosilurónico -(1-^-4)- 2-desoxi-6-0-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glucopiranosil- (1-^4) - ácido 2-0-sulfo-a-L-idopiranosilurónico -(l->4)- 2-desoxi-6-0-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glucopiranosil- (l->4) - ácido 2-0-sulfo-a-L-idopiranosilurónico -(l->4)- 2-desoxi-6-0-sulfo-2-sulfoamino -a-D-glucopiranosil- (l- 4) - ácido 2-O-sulfo-a-L-idopiranosilurónico- (1-^4) -2-desoxi-6-?-sulfo-2-sulfoamino-D-manitol, sal de hexadecasodio) ; Espectro del protón en D20, 600MHz, T=305K, d en ppm: 3.25 (3H, m, H-2tIII), H-2(V), H-2(VII)), 3.38 (1H, m, H-2(I)), 3.61 (3H, m, H-3(III), H-3ÍV), H-3ÍVII)), entre 3.70 y 3.83 (5H, masivo, 2H-1(I> y H-4!III), H-4(V), H-4(VII)), 3.86 (ÍH, t, J = 5Hz, H-3(I)), 4.00 (3H, m, H-5(III), H-5(V!, H-5(VII)), 4.08 (3H, m, H-4(I), H-4(I ), H-4t I)), entre 4.10 y 4.45 (17H, masivo, H-5(I)/2H-6(I) , H-2(II)/H-3(II!/H-4(II> , 2H-6(III), H-2tIV)/H-3(I ), 2H-6(V), H-2 (VI) /H-3(VI) , 2H-6(VII), H-3ÍVIII), 4.59 (ÍH, s, H-2(VIII>), 4.62 (ÍH, s, H-5(II)), 4.78 (2H, s, H-5(pp, H-5(VI!)/ 5.17 (2H, s, H-1(IV), H-1(VI>), 5.28 (ÍH, d, J = 4Hz, H-1(II))/ 5.38 (2H, m, H-1(V), H-1(VII))/ 5.44 (1H, d, J = 3Hz, H-1(III)), 5.47 (1H, s, H-1(VIII)), 5.96 (ÍH, d, J = 5Hz, H-4(VI111)].

EJEMPLO 5 En un reactor se introduce una solución a 25 °C de 65 mg de un oligosacárido de la fórmula (II) en la cual n es igual a 4, Rx, R2, R3, R5, R7 y R8 representan un radical SO3M, Ri y R6 representan un átomo de hidrógeno y M es sodio, en 1.2 ml de agua. Bajo agitación, se agregan en una vez 18 mg de borohidruro de sodio. El pH es ajustado entonces entre 9 y 10 por la adición de una solución de hidróxido de sodio a 0.5 mol/1. Después de 12 horas, se agrega de manera progresiva el ácido acético hasta la obtención de un pH comprendido entre 4 y 5. La mezcla es agitada 1 hora luego se reajusta el pH a 6.7 por la adición de sosa a 0.5 mol/1. La mezcla es diluida entonces con 3 ml de una solución acuosa de acetato de sodio al 10% y se vacían 3 volúmenes de metanol (12 ml) . La suspensión es filtrada y el sólido recuperado es enjuagado con 3 ml de metanol. Después del secado, se obtienen 54 mg de un oligosacárido de la fórmula (I) para la cual n es igual a 4, Ri, R2, R3, Rs, R7 y Rs representan un radical SO3M, R y R6 representan un átomo de hidrógeno y M es sodio, bajo la forma de una mezcla de diastereoisómeros. Se observan de I a X los azúcares constitutivos de los decasacáridos, I siendo el residuo reducido y X el residuo de ácido urónico insaturado [ (ácido 4-desoxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hex-4-enopiranosilurónico) -(l->4)- 2-desoxi-2-sulfoamino-6-0-sulfo-a-D-glucopiranosil- (1-^4) - ácido 2-O-sulfo-a-L-idopiranosilurónico -(l- 4)- 2-desoxi-6-0-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glucopiranosil- (l- 4) - ácido 2-0-sulfo-a-L-idopiranosilurónico -(l- 4)- 2-desoxi-6-0-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glucopiranosil- (l- 4) -, ácido 2-0-sulfo-a-L-idopiranosilurónico -(l->4)- 2-desoxi6-0-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glucopiranosil- (1-^4) - ácido 2-O-sulfo-a-L-idopiranosilurónico- (l- 4) -2-desoxi-6-0-sulfo-2-sulfoamino-D-glucitol, sal de eicosodio) ; (ácido 4-desoxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hex-4-enopiranosilurónico -(l- 4)- 2-desoxi-6-0-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glucopiranosil- (l--4) - ácido 2-O-sulfo-a-L-idopiranosilurónico -(l->4)- 2-desoxi-6-0-sulfo-2-sulfoamino-a-D-glucopiranosil- (1-^4) - ácido 2-O-sulfo-a-L-ídopiranosilurónico -(l- 4)- 2-desoxi-6-0-sulfo-2-sulfoamino -a-D-glucopiranosil- (1-^4) - ácido 2-O-sulfo-a-L-idopiranosilurónico -(l- 4)- 2-desoxi-6-0-sulfo-2-sulfoamino -a-D-glucopiranosil- (1-^4) - ácido 2-O-sulfo-a-L-idopiranosilurónico- (1-^4) -2-desoxi-6-0-sulfo-2-sulfoamino-D- manitol, sal de eicosodio) ; Espectro del protón en D20, 600MHz, T=303K, d en ppm: 3.23 (4H, m, H-2(III), H-2ÍV), H-2(VII!, H-2ÍIX), 3.35 (1H, m, H2(I)), 3.59 (4H, m, H-3(III>, H-3(V), H-3ÍVII), H-3(IX)), entre 3.65 y 3.80 (6H, m) , 3.85 (ÍH, m, H-3(I)), entre 3.90 y 4.40 (29H, m) , 4.57 (1H, m, H-2ÍX)), 4.59 (ÍH, m, H-5!II)), 4.75 (3H, , H-5(IV), H-5ÍVI), H-5( III)), 5.15 (3H, , H-1ÍIV), H-1(VI), H-1( III)), 5.25 (ÍH, m, H-1(II)), 5.37 (3H, m, H-lívl, H-1(VII), H-ltIX!), 5.42 (ÍH, m, H-1(III!), 5.45 (1H, m, H-1ÍX!), 5.93 (ÍH, d, J = 5Hz, H-4(X)).

Los medicamentos según la invención comprenden como el principio activo al menos un oligosacárido de la fórmula (I) o una mezcla de oligosacáridos de la fórmula (I) , bajo la forma de una composición en la cual la misma está asociada con cualquier otro producto farmacéuticamente compatible, que puede ser inerte o fisiológicamente activo. Los medicamentos según la invención pueden ser empleados por la vía intravenosa, subcutánea, oral, rectal, tópica o pulmonar (inhalación) . Las composiciones estériles para administración intravenosa o subcutánea, son generalmente soluciones acuosas. Estas composiciones pueden contener igualmente adyuvantes, en particular agentes emolientes, isotonantes, emulsificantes, dispersantes o estabilizantes. La esterilización se puede hacer de varias maneras, por ejemplo por filtración aseptizante, incorporando a la composición agentes esterilizantes, por irradiación. Los mismos pueden ser preparados igualmente bajo la forma de composiciones sólidas estériles que pueden ser disueltas en el momento del empleo en agua estéril o cualquier otro medio estéril inyectable. Como composiciones sólidas para administración oral, se pueden utilizar comprimidos, pildoras, polvos (cápsulas de gelatina, tabletas) o granulos. En estas composiciones, el principio activo es mezclado con uno o varios diluyentes inertes, tales como el almidón, celulosa, sacarosa, lactosa o sílice, bajo una corriente de argón. Estas composiciones pueden comprender igualmente substancias diferentes que los diluyentes, por ejemplo uno o varios lubricantes tales como el estearato de magnesio o el talco, un agente favorecedor de la absorción oral, un colorante, un recubrimiento (grageas) o un barniz. Como composiciones líquidas para administración oral, se pueden utilizar soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes y elíxires farmacéuticamente aceptables que contienen diluyentes inertes tales como el agua, etanol, glicerol, aceites vegetales o aceite de parafina. Estas composiciones pueden comprender substancias diferentes gue los diluyentes, por ejemplo productos emolientes, edulcorantes, espesantes, aromatizantes o estabilizantes. Las composiciones para administración rectal son los supositorios o las cápsulas rectales que contienen, además del producto activo, excipientes tales como la manteca de cacao, glicéridos semisintéticos o polietilenglicoles. Las composiciones para administración tópica pueden ser por ejemplo cremas, lociones, colirios, colutorios, gotas nasales o aerosoles. Las dosis dependen del efecto buscado, de la duración del tratamiento y de la vía de administración utilizada; las mismas están comprendidas generalmente entre 0.5 mg y 10 mg por kg por día por la vía subcutánea o 3 a 60 mg por día para un adulto de 60 kg. De manera general, el médico determinará la posología apropiada en función de la edad, del peso y de todos los otros factores propios del sujeto a tratar. La invención se refiere igualmente a la utilización de los oligosacáridos según la invención para la preparación de un medicamento útil para la prevención o el tratamiento de enfermedades relacionadas con un proceso inflamatorio que implica la producción de óxido nítrico _ (NO) o que es útil para la supervivencia y el crecimiento de motoneuronas .

La invención es particularmente ventajosa para la utilización de oligosacáridos de la fórmula (I) para la preparación de medicamentos útiles para la prevención y el tratamiento de isquemias cerebrales, cardiacas o vasculares periféricas, osteoartritis, traumatismos del sistema nervioso central, traumatismos craneanos, espinales y cráneo-espinales, esclerosis de las placas, dolores neuropáticos y neuropatías periféricas, enfermedades de las motoneuronas, esclerosis lateral amiotrófica, neuro-sida, enfermedad de .Alzheimer, enfermedad de Parkinson y Corea de Huntington. La invención se refiere igualmente al método de prevención y/o el tratamiento de enfermedades relacionadas con un proceso inflamatorio que implica la producción de substancias citotóxicas tales como el óxido nítrico (NO) y las enfermedades relacionadas con la supervivencia y el crecimiento de las motoneuronas. Los oligosacáridos de la fórmula (I) pueden ser utilizados así para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas para las cuales la inflamación cerebral desempeña un papel perjudicial que puede conducir a la muerte, entre las cuales se pueden citar las isquemias cerebrales, isquemias cardiacas (infarto al miocardio) , isquemias periféricas, traumatismos del sistema nervioso central y especialmente traumatismos craneanos, espinales y cráneo-espinales, esclerosis de las placas, dolores neuropáticos y neuropatías periféricas, las enfermedades de las motoneuronas como la esclerosis lateral amiotrófica, atrofia espinal progresiva, atrofia muscular infantil y esclerosis lateral primaria, neuro-sida, enfermedad de .Alzhe.im.er, enfermedad de Parkinson y Corea de Huntington y ciertas formas de osteoartritis especialmente de localización articular. La presente invención se refiere también al método de prevención y/o tratamiento de las enfermedades de las neuronas motoras tales como la esclerosis lateral amiotrófica, atrofia espinal progresiva, atrofia muscular infantil y esclerosis lateral primaria.

Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reiv-indicaciones . 1. Una composición farmacéutica, caracterizada porque contiene como principio activo un oligosacárido de la fórmula: caracterizada porque n es un número entero de 0 a 25, RX R3, R4, R5, Re y ß/ idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO3M, R2 y R7, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SÜ3M o COCH3 y M es sodio, calcio, magnesio o potasio o una mezcla de estos oligosacáridos.
2. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque contiene un oligosacárido de la fórmula (I) para la cual R4 y R6 representan un átomo de hidrógeno o una mezcla de estos oligosacáridos .
3. La composición farmacéutica de conformidad con una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque contiene un oligosacárido de la fórmula (I) para la cual n es un número entero de 0 o 10, una mezcla de estos oligosacáridos .
4. La composición farmacéutica de conformidad con una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque contiene un oligosacárido de la fórmula (I) para la cual n es un número entero de 0 o 6, una mezcla de estos oligosacáridos .
5. La composición farmacéutica de conformidad con una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque contiene un oligosacárido de la fórmula (I) para la cual n es un número entero de 1 o 6, una mezcla de estos oligosacáridos .
6. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque contiene un oligosacárido de la fórmula (I) para la cual n es igual a 0, Ri, R7 y R8 representan un radical SO3M, R¿ representa un átomo de hidrógeno y M es sodio.
7. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque contiene un oligosacárido de la fórmula (I) para la cual n es igual a 1, Ri, R2, R3, R5, R7 y R8, representan un radical SO3M, R4 y R6 representan un átomo de hidrógeno y M es sodio.
8. La composición farmacéutica de conformidad con la reiVaindicación 1, caracterizada porque contiene un oligosacárido de la fórmula (I) para la cual n es igual a 2, Ri, R2, R3, Rs, 7 y Rßr representan un radical SO3M, Rx, R4 y R6 representan un átomo de hidrógeno y M es sodio.
9. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque contiene un oligosacárido de la fórmula (I) para la cual n es igual a 3, Ri, R2, R3, R5, R7 y Rß/ representan un radical SO3M, R4 y R6 representan un átomo de hidrógeno y M es sodio .
10. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque contiene un oligosacárido de la fórmula (I) para la cual n es igual a 4, Ri, R2, 3 Rs, R7 y Rs, representan un radical SO3M, R4 y R6 representan un átomo de hidrógeno y M es sodio.
11. El oligosacárido de la fórmula: caracterizada porque n es un número entero de 0 a 25, Rx, R3, R4, R5, R6 y Re, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO3M, R2 y R7, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO3M o COCH3 y M es sodio, calcio, magnesio o potasio, con la excepción de aquellos para los cuales n es igual a 0 y ya sea Rx, R6 y R8 son átomos de hidrógeno, R7 representa un radical SO3M o COCH3 y M es sodio, o Rx y R6 representan un átomo de hidrógeno, R7 representa un radical COCH3, R8 representa un radical SO3M y M es sodio, o R6 representa un hidrógeno, Rx, R7 y Re representan un radical SO3M y M es sodio, o R6 y R7 representan átomos de hidrógeno, Rx y R8 representan un radical SO3M y M es sodio, o RX/ R6 y R7 representan un átomo de hidrógeno, Rs representa un radical SO3M y M es sodio.
12. El oligosacárido de la fórmula (I) de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque R4 y R6 representan un átomo de hidrógeno. .
13. El oligosacárido de la fórmula (I) de conformidad con una de las reivindicaciones 11 o 12, caracterizado porque n es un número entero de 0 a 10.
14. El oligosacárido de la fórmula (I) de conformidad con una de las reivindicaciones 11 o 12, caracterizado porque n es un número entero de 0 a 6.
15. El oligosacárido de la fórmula (I) de conformidad con una de las reivindicaciones 11 o 12, caracterizado porque n es un número entero de 1 a 6.
16. El oligosacárido de la fórmula (I) de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque n es igual a 0, Rx, R7 y R8 representan un radical SO3M, R6 representa un átomo de hidrógeno y M es sodio.
17. El oligosacárido de la fórmula (I) de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque n es igual a 1, Rx, R2, R3, R5, R7 y R8, representan un radical SO3M, R4 y R6 representan un átomo de hidrógeno y M es sodio.
18. El oligosacárido de la fórmula (I) de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque n es igual a 2, Rx, R2, R3, R5, R7 y Rs, representan un radical SO3M, R4 y R6 representan un átomo de hidrógeno y M es sodio.
19. El oligosacárido de la fórmula (I) de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque n es igual a 3, Rx, R2, R3, Rs 7 y s representan un radical SO3M, R4 y R6 representan un átomo de hidrógeno y M es sodio.
20. El oligosacárido de la fórmula (I) de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque n es igual a 4, Rx, R2, R3, R5, R7 y R8, representan un radical SO3M, R4 y R6 representan un átomo de hidrógeno y M es sodio.
21. Un procedimiento de preparación de los oligosacáridos de la fórmula (I) de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque se hace reaccionar un borohidruro de metal alcalino o de amonio cuaternario sobre los oligosacáridos de la fórmula: en la cual n es un número entero de 0 a_25, Rx, R3, R4 y R5, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO3M, R2 y R6, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SÜ3M o COCH3 y M es sodio, calcio, magnesio o potasio y se aislan los oligosacáridos.
22. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque se efectúa la reacción en un medio acuoso, a una temperatura próxima a 25 °C y a un pH de 7 a 10.
23. El procedimiento de conformidad con una de las reivindicaciones 21 y 22, caracterizado porque el pH de la reacción es de 9 a 10.
24. El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado porque el borohidruro de metal alcalino o de amonio cuaternario es el borohidruro de litio, de sodio, de potasio o de tetrabutilamonio.
25. La utilización de los oligosacáridos de la fórmula: en la cual n es un número entero de 0 a 25, Rx, R3, R4, Rs, e y R8, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO3M, R2 y R7, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO3M o COCH3 y M es sodio, calcio, magnesio o potasio o una mezcla de estos oligosacáridos para la preparación de un medicamento útil para la prevención o el tratamiento de enfermedades relacionadas con un proceso inflamatorio que implica la producción de óxido nítrico (NO) .
26. La utilización de los oligosacáridos de la fórmula (I) de conformidad con la reivindicación 25 para la preparación de medicamentos útiles para la prevención y el tratamiento de isquemias cerebrales, cardiacas o vasculares periféricas, osteoartritis, traumatismos del sistema nervioso central, traumatismos craneanos, espinales y cráneo-espinales, esclerosis de las placas, dolores neuropáticos y neuropatías periféricas, enfermedades de las motoneuronas, esclerosis lateral amiotrófica, neuro-sida, enfermedad de .Alzheimer, enfermedad de Parkinson y Corea de Huntington.
27. La utilización de los oligosacáridos de la fórmula (I) en la cual n es un número entero de 0 a 25, Rx, R3, R4, R5, R6 y R8, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO3M, R2 y R7, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO3M o C0CH3 y M es sodio, calcio, magnesio o potasio o una mezcla de estos oligosacáridos, para la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades relacionadas con la supervivencia y el crecimiento de las motoneuronas.