ES2236206T3

ES2236206T3 - Composiciones farmaceuticas que contienen oligosacaridos y su preparacion.

Info

Publication number: ES2236206T3
Application number: ES01919561T
Authority: ES
Inventors: Pierre Mourier; Elisabeth Perrin; Christian Viskov
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 2000-03-28
Filing date: 2001-03-26
Publication date: 2005-07-16
Anticipated expiration: 2021-03-26
Also published as: FR2807043B1; IL151832A0; DE60109279D1; YU72802A; EA004768B1; HK1056564A1; HUP0300330A3; WO2001072762A1; PL357301A1; PT1272499E; SK13932002A3; CN1426419A; NO20024590D0; AU4663901A; MXPA02009455A; CA2403906A1; JP2003529570A; BR0109617A; EP1272499B1; AR034251A1

Abstract

Composición farmacéutica que contiene como principio activo un oligosacárido de fórmula: **(Fórmula)** en la que n es un número entero de 0 a 25, R1, R3, R4, R5, R6 y R8, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO3M, R2 y R7, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO3M o COCH3 y M es sodio, calcio, magnesio o potasio o una mezcla de estos oligosacáridos con la excepción de aquellos en los que n es igual a 0 y bien R1, R6 y R8 son átomos de hidrógeno, R7 representa un radical SO3M o COCH3 y M es sodio, bien R1 y R6 representan un átomo de hidrógeno, R7 representa un radical COCH3, R8 representa un radical SO3M y M es sodio, bien R6 representa un hidrógeno, R1, R7 y R8 representan un radical SO3M y M es sodio, bien R6 y R7 representan átomos de hidrógeno, R1 y R8 representan un radical SO3M y M es sodio, bien R1, R6 y R7 representan un átomo de hidrógeno, R8 representa un radical SO3M y M es sodio.

Description

Composiciones farmacéuticas que contienen oligosacáridos y su preparación.

La presente invención se refiere a las composiciones farmacéuticas que contienen como principio activo un oligosacárido de fórmula:

1

o una mezcla de estos oligosacáridos, los oligosacáridos nuevos de fórmula (I), sus mezclas y sus procesos de preparación.

En la fórmula (I) n es un número entero de 0 a 25, R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6} y R_{8}, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO_{3}M, R_{2} y R. idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO_{3}M o COCH_{3} y M es sodio, calcio, magnesio o potasio, o una mezcla de estos oligosacáridos a excepción de aquellos en los que n es igual a 0 y bien R_{1}, R_{6} y R_{8} son átomos de hidrógeno, R_{7} representa un radical SO_{3}M o COCH_{3} y M es sodio, bien R_{1} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno, R_{7} representa un radical COCH_{3}, R_{8} representa un radical SO_{3}M y M es sodio, bien R_{6} representa un hidrógeno, R_{1}, R_{7} y R_{8} representan un radical SO_{3}M y M es sodio, bien R_{6} y R_{7} representan átomos de hidrógeno R_{1} y R_{8} representan un radical SO_{3}M y M es sodio, bien R_{1}, R_{6} y R_{7} representan un átomo de hidrógeno, R_{8} representa un radical SO_{3}M y M es
sodio.

Estos oligosacáridos incluyen, por lo tanto, un número par de sacáridos.

En la fórmula (I) R_{4} y R_{6} son, preferentemente, átomos de hidrógeno.

Los oligosacáridos de fórmula (I) en los cuales n es igual a 0, y bien R_{1}, R_{6} y R_{8} representan un átomo de hidrógeno, R_{7} representa un radical SO_{3}M o COCH_{3} y M es sodio, bien R_{1} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno, R_{7} representa un radical COCH_{3}, R_{8} representa un radical SO_{3}M y M es sodio, bien R_{6} representa un átomo de hidrógeno, R_{1}, R_{7} y R_{8} representan un radical SO_{3}M y M es sodio ya están descritos por G.H. LEE y coll., J. Chromat. 212, 65-73 (1981) pero no se ha descrito ninguna propiedad farmacológica de estos productos.

Los oligosacáridos de fórmula (I) en los que n es igual a 0 y bien R_{6} y R_{7} representan átomos de hidrógeno, R_{1} y R_{8} representan un radical SO_{3}M y M es sodio, bien R_{1}, R_{6} y R_{7} representan un átomo de hidrógeno, R_{8} representa un radical SO_{3}M y M es sodio están descritos por MW McLEAN y coll., Eur. J. Biochem., 1984, 145, 607, sin ninguna indicación de actividad farmacológica.

Las composiciones farmacéuticas preferidas son las que contienen un oligosacárido de fórmula (I) en el que:

-: n es un número entero de 0 a 10 y, en particular de 0 a 6 y más especialmente de 1 a 6.

-: R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, R_{7}, R_{8} son idénticos o diferentes y representan un átomo de hidrógeno o un radical SO_{3}M y, en particular R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, R_{7}, R_{8} son radicales SO_{3}M,

-: M es sodio.

Las composiciones farmacéuticas especialmente preferidas son las que contienen un oligosacárido de fórmula (I) en el que:

-: n es igual a 0, R_{1}, R_{7} y R_{8} representan un radical SO_{3}M, R_{6} representa un átomo de hidrógeno y M es sodio,

-: n es igual a 1, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, R_{7} y R_{8}, representan un radical SO_{3}M, R_{4} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno y M es sodio,

-: n es igual a 2, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, R_{7} y R_{8}, representan un radical SO_{3}M, R_{4} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno y M es sodio,

-: n es igual a 3, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, R_{7} y R_{8}, representan un radical SO_{3}M, R_{4} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno y M es sodio,

-: n es igual a 4, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, R_{7} y R_{8}, representan un radical SO_{3}M, R_{4} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno y M es sodio.

Los oligosacáridos de fórmula (I) a excepción de aquellos en los que n es igual a 0 y bien R_{1}, R_{6} y R_{8} representan un átomo de hidrógeno, R_{7} representa un radical SO_{3}M o COCH_{3} y M es sodio, bien R_{1} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno, R_{7} representa un radical COCH_{3}, R_{8} representa un radical SO_{3}M y M es sodio, bien R_{6} representa un hidrógeno, R_{1}, R_{7} y R_{8} representan un radical SO_{3}M y M es sodio. bien R_{6}, y R_{7} representan átomos de hidrógeno, R_{1} y R_{8} representan un radical SO_{3}M y M es sodio, bien R_{1}, R_{6} y R_{7} representan un átomo de hidrógeno, R_{8} representa un radical SO_{3}M y M es sodio son nuevos y como tales forman parte de la invención.

Los oligosacáridos de fórmula (I) pueden prepararse por la acción de un borohidruro de metal alcalino o de amonio cuaternario sobre los oligosacáridos de fórmula:

2

en la que n es un número entero de 0 a 25, R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6} y R_{8}, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO_{3}M, R_{2} y R_{7}, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO_{3}M o COCH_{3} y M es sodio, calcio, magnesio o potasio.

Esta reacción se lleva a cabo en medio acuoso, a una temperatura cercana a 25ºC, a un pH comprendido entre 7 y 10 y preferentemente entre 9 y 10, durante la duración de la reacción. El mantenimiento del pH se obtiene mediante la adición de una disolución de sosa 0,5 moles/l. La reacción se para por acidificación del medio de reacción, por ejemplo mediante la adición de ácido acético hasta la obtención de un pH comprendido entre 4 y 5.

Como borohidruro de metal alcalino, se puede citar el borohidruro de litio, sodio y potasio.

Como borohidruro de amonio cuaternario, se puede citar el borohidruro de tetrabutilamonio.

Los oligosacáridos de fórmula (II) pueden obtenerse por separación mediante cromatografía en gel de una mezcla de oligosacáridos (III) obtenida por despolimerización enzimática de heparina o despolimerización básica del éster bencílico de heparina o de un éster bencílico de heparina de hemisíntesis.

Esta cromatografía se lleva a cabo en columnas rellenas de gel del tipo poliacrilamida-agarosa como el comercializado bajo la marca Ultrogel ACA202^{R} (Biosepra). Preferentemente, se utiliza una batería de columnas de gel poliacrilamida agarosa. El número de columnas utilizado se adapta en función del volumen, del gel y de los oligosacáridos a separar. La mezcla se eluye mediante una disolución que contiene un tampón fosfato y cloruro de sódico. Preferentemente, la disolución del tampón fosfato es una disolución 0,02 moles/l de NaH_{2}PO_{4}/Na_{2}HPO_{4} (pH 7) que contiene 0,1 moles/l de cloruro sódico. La detección de las diferentes fracciones se realiza mediante espectrometría UV (254 nm) e iónica (IBF). Las fracciones que se obtienen de esta manera pueden purificarse opcionalmente por ejemplo mediante cromatografía SAX (intercambio aniónico fuerte) según los métodos conocidos por los expertos en la técnica y principalmente según los métodos descritos por K.G. Rice y R.J Linhardt, Carbohydrate Research 190, 219-233 (1989), A. Lamkjaer, S.H. Hansen y P.B. Ostergaard, Carbohydrate Research, 266, 37-52 (1995) y en la patente WO90/01501 (ejemplo 2). Las fracciones se liofilizan después se desalan en una columna rellena de gel como una columna de gel Sephadex G10^{R} (Pharmacia Biochemicals).

Cuando la purificación no se realiza mediante cromatografía SAX, los liofilizados pueden purificarse opcionalmente mediante precipitación simple o fraccionada según los métodos conocidos por los expertos en la técnica y principalmente según el método descrito en la patente FR2548672. De forma general, se opera según el protocolo siguiente:

La fracción liofilizada a purificar se disuelve a 25ºC en aproximadamente diez volúmenes de agua destilada. Mediante la adición de metanol o etanol, se precipita el oligosacárido deseado controlando su enriquecimiento mediante cromatografía HPLC (Cromatografía Líquida de Alta Resolución). La adición de metanol o etanol se determina en función de la pureza y del rendimiento deseados de dicho oligosacárido. De la misma manera, esta operación puede realizarse en varias etapas sucesivas a partir de la disolución inicial de liofilizado. Para esto, se añade el agente insolubilizante (metanol o etanol) en partes pequeñas y después de cada adición se aisla el precipitado obtenido. Los precipitados preparados de esta manera se analizan mediante cromatografía HPLC. Según la pureza y el rendimiento deseados, se juntan las fracciones adecuadas del precipitado.

Según una variante de la presente invención, la fracción liofilizada a purificar puede disolverse en 10 a 200 volúmenes de agua que contienen de 0 a 30% de acetato sódico. El porcentaje de acetato sódico se ajustará previamente en función de la naturaleza del oligosacárido a tratar (función del tamaño). Mediante la adición de metanol o etanol, se precipita el oligosacárido deseado controlando su enriquecimiento mediante cromatografía HPLC (Cromatografía Líquida de Alta Resolución). La adición de metanol se determina en función de la pureza y del rendimiento deseados de dicho oligosacárido. De la misma manera, esta operación puede realizarse en varias etapas sucesivas a partir de la disolución inicial de liofilizado. Para esto, se añade el agente insolubilizante (metanol) en partes pequeñas y después de cada adición se aisla el precipitado obtenido. Los precipitados preparados de esta manera se analizan mediante cromatografía HPLC. Según la pureza y el rendimiento deseados, se juntan las fracciones adecuadas del
precipitado.

En el caso de los intermediarios de fórmula (U) en los que n = 0, 1 ó 2, es preferible partir de una mezcla (III) obtenida mediante despolimerización enzimática.

Esta despolimerización se realiza por medio de heparinasa I (EC 4.2.2.7), en una disolución tampón fosfato de pH 7, en presencia de cloruro sódico y de BSA (Albúmina de Suero Bovino), a una temperatura comprendida entre 10 y 18ºC y, preferentemente 15ºC, durante 8 a 10 días y, preferentemente, 9 días. La despolimerización se para por ejemplo mediante calentamiento del medio de reacción a 100ºC durante 2 minutos y la mezcla se recupera mediante liofilización. Es preferible utilizar 7 UI de heparinasa I para 25 g de heparina. La disolución tampón fosfato comprende generalmente 0,05 moles/l de NaH_{2}PO_{4}/Na_{2}HPO_{4} (pH 7) en presencia de 0,1 moles/l de cloruro sódico. La concentración de BSA es generalmente el 2%.

En el caso de los intermediarios de fórmula (II) en los que n = 0, 1, 2, 3 ó 4, es preferible partir de una mezcla (III) obtenida mediante despolimerización de un éster bencílico de heparina.

El éster bencílico de heparina puede prepararse según los métodos descritos en las patentes EEUU5389618, EP40144, FR2548672. La tasa de esterificación estará comprendida preferentemente entre 50 y 100%. De manera preferencial, estará comprendida entre 70 y 90%.

La despolimerización se realiza en medio acuoso, por medio de un hidróxido de metal alcalino (hidróxido de litio, sosa, potasa o hidróxido de cesio, por ejemplo) o de un hidróxido de amonio cuaternario (hidróxido de tetrabutilamonio por ejemplo), preferentemente, a una molaridad comprendida 0,1 y 0,2 moles/l, a una temperatura comprendida entre 40 y 80ºC, durante 5 a 120 minutos. En un modo preferido, se opera durante 5 a 15 minutos, a una temperatura comprendida entre 60 y 70ºC, con una disolución de hidróxido sódico 0,15 moles/l. La reacción de despolimerización se para mediante neutralización por adición de un ácido como ácido acético. Después de la adición de 10% en peso por volumen de acetato sódico, la mezcla de oligosacáridos se precipita por adición de metanol, preferentemente, 2 volúmenes por 1 volumen de medio de reacción y se filtra.

Según un aspecto preferido de la invención, la mezcla de oligosacáridos obtenida después de la despolimerización química, bajo la forma de una disolución acuosa, se enriquece mediante ultrafiltración en membranas con un umbral de corte nominal apropiado (tipo Pellicon en celulosa regenerada comercializada por Millipore); estando el tipo de membrana adaptado en función del tipo de oligosacáridos enriquecidos a recuperar. En el caso de los oligosacáridos (II) en los que n = 0, se utilizará una membrana de umbral de corte nominal 1 kDa, en el caso de los oligosacáridos (II) en los que n = 1, se utilizará una membrana 1 kDa ó 3 kDa, en el caso de los oligosacáridos (II) en los que n = 2, se utilizará una membrana 3 kDa, en el caso de los oligosacáridos (II) en los que n = 3 ó 4, se utilizará una membrana 5 kDa. Durante esta operación, el permeado se recupera y el retenido se rechaza. De esta manera, la fracción de producto enriquecida puede representar de 50 a 10% de la mezcla de oligosacáridos inicial conservando al mismo tiempo al menos 80% del oligosacárido deseado.

En el caso de los intermediarios de fórmula (II) en los que n = 0 a 25, es preferible partir de una mezcla (III) obtenida mediante despolimerización de un éster bencílico de polisacárido sulfatado de hemisíntesis. El éster bencílico de polisacárido sulfatado de hemisíntesis se prepara a partir de polisacáridos sulfatados de hemisíntesis obtenidos a partir del polisacárido K5 y según los métodos descritos en las patentes WO94/29352 y WO96/14425. Las condiciones de esterificación, de despolimerización y de recuperación son las mismas que las descritas anteriormente para el éster bencílico de heparina.

En todos los procesos precedentes, la heparina inicial puede ser de origen porcino, ovino, caprino o bovino y puede provenir de las mucosidades, pulmones o piel de los animales.

Preferentemente, se utiliza una heparina de mucosidad porcina, ovina o de pulmones de buey y más preferentemente de mucosidad porcina o de pulmón de buey.

Los oligosacáridos de fórmula (I) presentan propiedades antiinflamatorias y pueden por lo tanto utilizarse en la prevención o tratamiento de enfermedades ligadas a un proceso inflamatorio que implica la producción de sustancias citotóxicas como monóxido de nitrógeno (NO) en el que la forma inducible se libera principalmente por los neutrófilos o los macrófagos cuando éstos migran y son activados a nivel tisular. La migración, la activación y la adhesión de los neutrófilos se producen a nivel de las zonas tisulares isquemizadas a continuación de una oclusión o un espasmo de una arteria que vasculariza ese tejido. Estas isquemias pueden producirse a nivel cerebral (accidente vascular cerebral), bien a nivel del miocardio (infarto de miocardio), bien a nivel de los miembros inferiores (isquemias llamadas periféricas). Los oligosacáridos de fórmula (I) pueden utilizarse por lo tanto en la prevención y/o tratamiento de enfermedades neurodegenerativas en las que la inflamación cerebral juega un papel deletéreo que puede conducir a la muerte entre las que se pueden citar isquemias cerebrales, isquemias cardiacas (infarto de miocardio), isquemias periféricas, traumatismos del sistema nervioso central y principalmente traumatismos craneales, espinales y cráneo-espinales, esclerosis en placas, dolores neuropáticos y neuropatías periféricas, enfermedades de motoneuronas en la esclerosis lateral amiotrófica, atrofia espinal progresiva, atrofia muscular infantil y esclerosis lateral primaria, neuro-sida, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y Corea de Huntington y determinadas formas de osteoartritis principalmente con localización articular.

La actividad antiinflamatoria de estos productos está demostrada in vivo en el ensayo de producción de NOx (nitrito y nitrato) inducida por un lipopolisacárido (LPS) proveniente de E. coli según el protocolo descrito por M. YAMASHITA y coll., Eur. J. Pharmacol, 338, 2, 151-158 (1997) o J.E. SHELLITO y coll. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 13, 1, 45-53 (1995).

Se inyecta a ratones CDI machos (Charles River, 25-35g), a T0 por vía intravenosa bolo 0,5 mg/kg del oligosacárido, a T+15 minutos, por vía subcutánea 1 ó 2 mg/kg del oligosacárido. A T+30 minutos, se administraron 100 mg/kg de lipopolisacárido (LPS) proveniente de E. coli (Sigma L3129, serotipo 0127:B8). A T+3 horas se inyectan de nuevo por vía subcutánea 1 ó 2 mg/kg del oligosacárido. A T+5 horas 30 minutos, se recupera una muestra de sangre mediante punción en el ojo y se determinan las concentraciones de NOx (nitrito y nitrato) en el plasma mediante el método colorimétrico de Griess después de reducción de nitrato en nitrito por la nitrato reductasa de la manera siguiente: 12 ml de la muestra de plasma se mezclan con 88 ml de agua desionizada y se incuban en oscuridad 1 hora a temperatura ambiente con 40 ml de tampón fosfato (0,31 M, pH 7,5). 20 ml de (\beta-NADPH (dinucleótido fosfato de nicotinamida y adenina reducido) (0,86mM), 20 ml de FDA (dinucleótido de flavina y adenina) (0,11 mM) y 20 ml de nitrato reductasa (2U/ml) (Boehringer Mannheim). Se añaden 10 ml de ZnSO_{4} (1M) para precipitar las proteínas y después de mezclar, las muestras se centrifugan a 20.000g durante 5 minutos. Finalmente, se incuban 50 ml del sobrenadante 10 minutos a temperatura ambiente con 100 ml del reactivo de Griess (sulfanilamida al 1% en una mezcla ácido fosfórico/naftietilendiamina 0,1% en agua desionizada (V/V)). Se leen las densidades ópticas a 540 nm con un espectrofotómetro de microplacas; determinándose cada punto 2 veces. Se utilizan KNO_{3} y NaNO_{2} como estándar en el método colorimétrico.

En este ensayo, los oligosacáridos según la invención inhiben la formación de NOx más del 50%.

Por otro lado, los oligosacáridos de fórmula (I) incrementan la supervivencia y el crecimiento de las motoneuronas y son, por lo tanto, especialmente útiles en la prevención y/o tratamiento de enfermedades motoneuronales tales como esclerosis lateral amiotrófica, atrofia espinal progresiva, atrofia muscular infantil, esclerosis lateral primaria.

Se sabe que los cultivos de motoneuronas mueren por apoptosis si se realizan en ausencia de soporte trófico (BDNF, NT5 por ejemplo). Se ha visto que los oligosacáridos según la invención permiten la supervivencia y el crecimiento de las motoneuronas. Esta actividad se ha ensayado en co-cultivos de astrocitos y de motoneuronas sin factor neurotrófico según el protocolo siguiente:

Cultivos enriquecidos en motoneuronas

Los cultivos enriquecidos en motoneuronas se preparan utilizando el método de centrifugación descrito por R.L. SCHNAAR y A.E. SCHAFFNER, J. Neurosci., 1, 204-217 (1981) y modificado por W. CAMU y C.E. HENDERSON. J. Neurosci. Methods, 44, 59-70 (1992). Las médulas espinales de embriones de rata E15 se diseccionan estérilmente y se quitan las fibras espinales dorsales. Después se cortan y se incuban 15 minutos a 37ºC en PBS (tampón fosfato salino: NaCl 137 mM, KCl 2,68 mM, Na_{2}HPO_{4} 6,45 mM, KH_{2}PO_{4} 1,47 mM) al que se añade 0.05% de tripsina. La disociación de las células se completa por trituración con el extremo de una pipeta de 1 ml en el medio de cultivo al que se añade 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA) y 0,1 mg/ml de ADNasa. La suspensión de células se extiende en una banda de metrizamida 6,5% peso/volumen en medio L15 (comercializado por Gibco BRL) y se centrifuga a 500 g durante 15 minutos. La banda de la interfase que contiene las motoneuronas se recupera, se diluye en medio L15 y se incuba 45 minutos a temperatura ambiente en los frascos de cultivo recubiertos previamente con anti-IgG de ratón y de sobrenadante de hibridoma MC192 (Chandler CE y coll., J. Biol. Chem., 259, 6882 (1984). Las células suspendidas se lavan con medio L15 y las motoneuronas se eluyen bajo agitación suave con sobrenadante de hibridoma MC192. Las motoneuronas se distribuyen a una densidad de 650 células en 24 mm en los frascos de cultivo sobre las monocapas de astrocitos en medio L15 al que se ha añadido bicarbonato sódico (22mM), coalbúmina (0,1 mg/ml), putrescina (0,1 mM), insulina (5 \mug/ml), selenito sódico (31 nM), glucosa (20 mM), progesterona (21 nM), penicilina (100 UI/ml) y estreptomicina (100 ug/ml). Los cultivos se mantienen a 37ºC en una atmósfera humidificada con 5% de CO_{2}.

Cultivo de astrocitos de médula espinal

Los astrocitos se obtienen a partir de embriones de ratas según el método de R.P. SANETO Y J. DE VELLIS, en Neurochemistry, a practical approach (A.J. TURNER y H.S. St JOHN) IRL Press, Oxford-Washington DC, p27-63 (1987) ligeramente modificado. Las médulas espinales se diseccionan estérilmente, se quitan las meninges y los ganglios dorsales. De cinco a diez médulas espinales se transfieren a PBS (tampón fosfato salino: NaCl 137 mM, Kcl 2,68 mM, Na_{2}HPO_{4} 6,45 mM, KH_{2}PO_{4} 1,47 mM) y se cortan antes de incubación a 37ºC durante 25 minutos en PBS al que se ha añadido 0,25% de tripsina. El tratamiento enzimático se para mediante la adición de 10 ml de medio Dubelcco-Eagle modificado (DMEM) al que se ha añadido 10% de suero fetal de ternera (FCS) y las células se recogen por centrifugación. Se realiza otra etapa de disociación mecánica utilizando el extremo de una pipeta de 1 ml. Las células se distribuyen a una densidad de 1,5x10^{6} células por 25 cm^{2} de medio de cultivo en DMEM con 10% de FCS. Después de 2 días in vitro los cultivos se alimentan cada día a lo largo de la duración del estudio. Cuando se obtiene una monocapa visible de células, los cultivos se agitan 48 horas a 250 rpm y, al día siguiente, las monocapas se tratan con citosina arabinósido (10^{-5} M) durante 48 horas. Las monocapas de astrocitos se amplifican después a una densidad de cinco en 35 mm sobre placas de cultivo para los frascos de cultivo de 25 cm^{2} del comienzo del estudio.

Los cultivos de astrocitos espinales se componen de más del 98% de células inmunorreactivas frente a la proteína glial fibrilar ácida (GFAP).

Las monocapas de astrocitos se exponen bien a PBS sólo (control) bien al producto a ensayar en disolución en PBS durante 24 horas a la concentración de 0,1 ng/ml a 10 ng/ml. Las monocapas de astrocitos se lavan después con DMEM y se mantienen 2 horas con medio de cultivo o se añaden las motoneuronas. Dos horas después de la alimentación y durante 2 ó 3 días, se añade al medio de cultivo el vehículo o el producto a ensayar.

Identificación inmunoquímica de las motoneuronas

Las células se fijan en 4% de paraformaldehido y 0,1% de glutaraldehido en PBS (pH 7,4 a 4ºC durante 15 minutos). Después los cultivos se lavan y los sitios no específicos se bloquean con 2% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS y 0,1% de Triton X100R. Estos cultivos se incuban sucesivamente con los anticuerpos de p75^{LNGRF} (artículo de Chandler citado anteriormente), una noche a 4ºC y con suero de cabra biotinilado 1/125 Gibco) y estreptavidinperoxidasa (1/200, Gibco) durante 60 minutos. Los anticuerpos se visualizan utilizando la reacción DAB/peróxido de hidrógeno.

Contaje de las células y Análisis estadístico

Las células inmunorreactivas para el receptor de neutrofina con actividad escasa p75Ingfr y que exhiben neuritas más largas que los diámetros de 4 células se consideran como motoneuronas viables. El número de motoneuronas se evalúa mediante el contaje de las células marcadas en una superficie de 0,825 cm^{2} bajo microscopio con aumento de 200 veces. Los valores se expresan como número de motoneuronas por cm^{2} o porcentaje del número de motoneuronas presente en los cultivos mantenidos en ausencia de factor trófico respecto al control. Los experimentos se realizan al menos 3 veces.

Los análisis estadísticos se realizan utilizando el test de Student (t-test).

En el caso de los pretratamientos con los oligosacáridos de la presente invención, el número de motoneuronas que crecen sobre la monocapa de astrocitos se incrementa de 20 a 50%.

Los ejemplos siguientes son representativos de la preparación de los oligosacáridos de fórmula (I) y de los intermediarios.

En estos ejemplos los significados de las abreviaturas son los siguientes:

\DeltaIs:: (ácido 4-desoxi-2-O-sulfo-\alpha-L-treo-hex-enopiranosilurónico)-(1-4)-2-desoxi-2-sulfoamino-6-O-sulfo-\alpha-D-glucopiranosa, sal de tetrasodio o bien \DeltaUAp2S-(1-4)-a-D-GlcNp2S6S

Is:: (ácido 2-sulfo-\alpha-L-idopiranosilurónico)-(1\rightarrow4)-2-desoxi-2-sulfoamino-6-O-sulfo-\alpha-D-glucopiranosa, sal de tetrasodio (ácido 2-sulfo-\alpha-L-idopiranosilurónico)-(1\rightarrow4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-\alpha-D-glucopiranosa, sal de tetrasodio o bien a \alpha-L-IdoAp2S-(1\rightarrow4)-\alpha-D-GlcNp2S6S

IIs:: (ácido \alpha-L-idopiranosilurónico)-(1\rightarrow4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-\alpha-D-glucopiranosa, sal de trisodio o bien \alpha-L-IdoAp-(1\rightarrow4)-\alpha-D-GlcNp2S6S

IIIs:: (ácido 2-sulfo-\alpha-L-idopiranosilurónico)-(1\rightarrow4)-2-desoxi-2-sulfoamino-\alpha-D-glucopiranosa, sal de trisodio o bien \alpha-L-IdoAp2S-(1\rightarrow4)-\alpha-D-GlcNp2S

IdoAp:: ácido idopiranosilurónico

GlcNp:: 2-amino-2-desoxi-glucopiranosa

\DeltaUap:: ácido 4-desoxi-\alpha-L-treo-hex-enopiranosilurónico

s:: sulfato.

Ejemplos de preparación de las mezclas intermedias de fórmula (II) Ejemplo A Preparación de los oligosacáridos de fórmula (II) en los que n = 0, 1 y 2 mediante despolimerización enzimática y separación

Disolver 25 g de heparina en 250 ml de una disolución tampón fosfato que contiene 0,05 moles/l NaH_{2}PO_{4}/Na_{2}
HPO_{4} (pH = 7), 0,2 moles/l de cloruro sódico y 2% de BSA (Albúmina de Suero Bovino). Se introducen en la mezcla 7 UI de heparinasa I (EC 4.2.2.2.7) y la disolución obtenida se enfría a 15ºC después se mantiene a esta temperatura durante la duración de la reacción de despolimerización. El progreso de la reacción se sigue mediante la toma espaciada de alicuotas y su análisis mediante cromatografía de permeación en gel. Al cabo de 9 días, la reacción enzimática se para calentando el medio de reacción a 100ºC durante dos minutos. Después la mezcla enfriada se liofiliza. De esta manera se obtiene una mezcla de oligosacáridos (III).

La mezcla de oligosacáridos (III) obtenida se cromatografía según el método siguiente: la cromatografía se realiza en columnas rellenas con gel de poliacrilamida-agarosa conocido bajo el nombre de Ultrogel ACA 202 y la mezcla se eluye con una disolución que contiene un tampón fosfato (0,02 moles/l NaH_{2}PO_{4}/Na_{2}HPO_{4}) pH = 7 y 0,1 moles/l de cloruro sódico. La detección se realiza con espectrometría UV (254 nm) e iónica (IBF). Los productos pueden purificarse opcionalmente mediante cromatografía SAX (intercambio aniónico fuerte) o mediante precipitación fraccionada según el método descrito en la patente FR 2548672. Las fracciones del producto recuperadas se liofilizan después se desalan en una columna rellena con gel sephadex G10R (Pharmacia Biochemicals).

Con este método, se obtienen 3 g de disacárido \DeltaIs, 1.100 mg de una mezcla de hexasacáridos que contiene típicamente 55% del derivado \DeltaIs-Is-Is, 35% de \DeltaIs-Is-IIs y 10% de \DeltaIs-Is-IIIs. Esta última mezcla puede purificarse según los métodos conocidos por los expertos en la técnica con el fin de separar cada uno de los constituyentes o utilizarla tal cual para la transformación en derivados reducidos de fórmula (I).

Ejemplo B Preparación de los oligosacáridos de fórmula (II) en los que n = 0, 1, 2, 3 ó 4 mediante despolimerización del éster bencílico de heparina y separación a - Preparación del éster bencílico de heparina

El éster bencílico de heparina se prepara según el ejemplo 3 de la patente de EEUU 5.389.618.

b - Despolimerización

Disolver 100 g de éster bencílico de heparina en 1,9 l de agua desmineralizada. La mezcla se lleva a 60ºC bajo agitación. Después de la obtención de una disolución homogénea, se introducen de una sola vez aproximadamente 35 ml de una disolución de hidróxido sódico al 23%. Después de 10 minutos de reacción, la disolución se enfría y se neutraliza con 80 ml de una disolución de ácido acético aproximadamente 2 N. A esta disolución, se añade 10% en peso/volumen de acetato sódico. La mezcla de oligosacáridos se precipita mediante la adición de aproximadamente 2 volúmenes de metanol. El precipitado se aisla mediante filtración, se lava con metanol dos veces después se seca bajo presión reducida a 50ºC. Después de secar, se obtienen 73,8 g de una mezcla de oligosacáridos (II).

c - Enriquecimiento en oligosacárido en el que n = 1

Disolver 30 g de la mezcla de oligosacáridos obtenida anteriormente en aproximadamente 35 volúmenes de agua. Esta disolución se ultrafiltra en membrana 3 kDa (Pellicon). Cuando han salido 600 ml de permeado, se diluye el retenido con 500 ml de agua. Se prosigue la operación hasta la salida de 450 ml suplementarios de permeado. Las dos fracciones de permeado se juntan después se concentran a sequedad bajo presión reducida. Se obtienen 6,1 g de un sólido blanco amarillento. El análisis del sólido mediante cromatografía de permeación en gel indica que contiene aproximadamente 30% de oligosacárido de fórmula (II) en el que n = 1.

d - Fraccionamiento de las mezclas de oligosacáridos ultrafiltradas

La mezcla enriquecida se fracciona en columnas rellenas con gel de poliacrilamida-agarosa conocido bajo el nombre de Ultrogel ACA 202 (se utilizan 4 columnas de un diámetro de 10 cm y de una altura de 50 cm). 5 g de la mezcla enriquecida mediante ultrafiltración se disuelven en 25 ml de agua y después se eluyen mediante una disolución de 0,2 moles/l de cloruro sódico a la velocidad de 5 ml/min. Se recogen en la base de la columna fracciones de 25 ml. La detección de los productos se realiza con espectrometría UV (254 nm) e iónica (IBF). Las fracciones del producto en el que n = 1 se recuperan, se liofilizan después se desalan en una columna rellena de gel Sephadex G10. Después de la liofilización, se obtiene 1 g de tetrasacárido que contiene típicamente 70% del derivado \DeltaIs-Is de fórmula II (R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, R_{7}, R_{8} = SO_{3}Na; R_{4}, R_{6} = H y M = Na). El derivado \DeltaIs-Is puede purificarse opcionalmente mediante cromatografía SAX (intercambio aniónico fuerte) o según un aspecto preferente mediante precipitación fraccionada según el método descrito en la patente FR 2548672 y la variante descrita en la presente invención.

Ejemplos de preparación de los oligosacáridos de fórmula (I) Ejemplo 1

En un reactor se introduce una disolución a 25ºC de 300 mg de un oligosacárido de fórmula (II) en la que n es igual a 0, R_{1}, R_{7} y R_{8} representan un radical SO_{3}M, R_{6} representa un átomo de hidrógeno y M es sodio, en 2 ml de agua. Bajo agitación, se añaden de una vez 212 mg de borohidruro de sodio. El pH se ajusta entre 9 y 10 mediante la adición de una disolución de hidróxido sódico 0,5 moles/l. Después de 12 horas, se añade de manera progresiva ácido acético hasta la obtención de un pH comprendido entre 4 y 5. La mezcla se agita 1 hora después se reajusta el pH a 6,7 mediante la adición de sosa 0,5 moles/l. La mezcla se concentra entonces a sequedad a 50ºC bajo presión reducida. El concentrado se dispersa bajo agitación magnética en 10 ml de metanol. Después de una noche de sedimentación, la suspensión se filtra con una membrana Whatman GF/B. El sólido del filtro se disuelve haciendo pasar 2 partes de 10 ml de agua destilada. Esta disolución se concentra entonces a sequedad a 50ºC bajo presión reducida. Se obtienen 580 g de un sólido blanco. El sólido se dispersa bajo agitación magnética en 15 ml de metanol. Después de 30 minutos de agitación, la suspensión se filtra con una membrana Whatman GF/B. El resto se disuelve haciendo pasar 2 partes de 10 ml de agua destilada. La disolución obtenida se concentra a sequedad a 50ºC bajo presión reducida. De esta manera se obtienen 250 mg de un oligosacárido de fórmula (I) en el que n es igual a 0, R_{1}, R_{7} y R_{8} representan un radical SO_{3}M, R_{6} representa un átomo de hidrógeno y M es sodio, bajo la forma de una mezcla de diastereoisómeros. Se observa que I a II son los azúcares que constituyen los disacáridos, estando en I el resto reducido y II el resto ácido urónico insaturado [(ácido 4-desoxi-2-O-sulfo-\alpha-L-treo-hex-4-enopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-D-glucitol, sal de tetrasodio); (ácido 4-desoxi-2-O-sulfo-\alpha-L-treo-hex-4-enopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-D-manitol, sal de tetrasodio): Espectro de protones en D_{2}O, 600MHz, T=305K, \delta en ppm: 3,38 (1H, m, H-2^{(I)}), 3,70 y 3,75 (1H cada uno, respectivamente dd, J=6 y 12Hz y dd, J=5 yt 12Hz, 2H- 1^{(I)}), 3,86 (1H, t, J=5Hz, H-3^{(I)}), 4,13 (1H, dd, J=8 y 11Hz, H-6^{(I)}), 4,18 (1H, m, H-4^{(I)}), 4,25 (2H, m, H-6^{(I)} y H-3^{(II)}), 4,35 (1H, m, H-5^{(I)}), 4,65 (1H, m, H-2^{(II)}), 5,67 (1H, s, H-1^{(II)}), 6,00 (1H, d, J=5Hz, H-4^{(II)})].

Ejemplo 2

En un reactor se introduce una disolución a 25ºC de 60 mg de un oligosacárido de fórmula (II) en la que n es igual a 1, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, R_{7} y R_{8} representan un radical SO_{3}M, R_{4} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno y M es sodio, en 1,2 ml de agua. Bajo agitación, se añaden de una vez 18 mg de borohidruro de sodio. El pH se ajusta entre 9 y 10 mediante la adición de una disolución de hidróxido sódico 0,5 moles/l. Después de 12 horas, se añade de manera progresiva ácido acético hasta la obtención de un pH comprendido entre 4 y 5. La mezcla se agita 1 hora después se añaden 5 ml de metanol. La suspensión se filtra con una membrana Whatman GF/B y el sólido recuperado se lava dos veces con 0,5 ml de metanol. Después de secar, se obtienen 42 mg de un oligosacárido de fórmula (I) en el que n es igual a 1, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, R_{7} y R_{8} representan un radical SO_{3}M, R_{4} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno y M es sodio, bajo la forma de una mezcla de diastereoisómeros. Se observa que I a IV son los azúcares que constituyen los tetrasacáridos, estando en I el resto reducido y IV el resto de ácido urónico insaturado [(ácido 4-desoxi-2-O-sulfo-\alpha-L-treo-hex-4-enopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow4)-ácido 2-O-sulfo-\alpha-Lidopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-2-sulfoamino-6-O-sulfo-D-glucitol, sal de octasodio); (ácido 4-desoxi-2-O-sulfo-\alpha-L-treo-hex-4-enopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow4)-ácido 2-O-sulfo-\alpha-L-idopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-D-manitol, sal de octasodio): Espectro de protones en D_{2}O, 400MHz, T=298K, \delta en ppm: 3,25 (1H, dd, J=10 y 3Hz, H-2^{(III)}), 3,37 (1H, m, H-2^{(I)}), 3,59 (1H, m, H-3^{(III)}), 3,75 (2H, m, 2H-1^{(I)}), 3,79 (1H, t, J=9Hz, H-4^{(III)}), 3,86 (1H, m, H-3^{(I)}), entre 4,05 y 4,40 (10H, masivo, H-4^{(I)}/ H-5^{(I)}/2H-6^{(I)}, H-2^{(II)}/H-3^{(II)}/H-4^{(II)}), 2H-6^{(III)}, H-3^{(IV)}), 4,58 (1H, m, H-2^{(IV)}), 4,60 (1H, m, H-5^{(II)}), 5,27 (1H, d, J=4Hz, H 1^{(II)}), 5,42 (1H, d, J=4Hz, H-1^{(III)}), 5,47 (1H, d, J=2Hz, H-1^{(IV)}), 5,95 (1H, d, J=5Hz, H-4^{(IV)})].

Ejemplo 3

En un reactor se introduce una disolución a 25ºC de 100 mg de un oligosacárido de fórmula (II) en la que n es igual a 2, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, R_{7} y R_{8} representan un radical SO_{3}M, R_{4} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno y M es sodio, en 2 ml de agua. Bajo agitación, se añaden de una vez 20 mg de borohidruro de sodio. El pH se ajusta entre 9 y 10 mediante la adición de una disolución de hidróxido sódico 0,5 moles/l. Después de 12 horas, se añade de manera progresiva ácido acético hasta la obtención de un pH comprendido entre 4 y 5. La mezcla se agita 1 hora después se reajusta el pH a 6,7 mediante la adición de sosa 0,5 moles/l. La mezcla se diluye con agua destilada en una cantidad suficiente como para obtener 20 ml. Se añaden 2,5 g de acetato sódico y se añaden 3 volúmenes de metanol. La suspensión se filtra con una membrana Whatman GF/B y el sólido recuperado se lava dos veces con 2 ml de metanol. Después de secar, se obtienen 61 mg de un oligosacárido de fórmula (I) en el que n es igual a 2, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, R_{7} y R_{8} representan un radical SO_{3}M, R_{4} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno y M es sodio, bajo la forma de una mezcla de diastereoisómeros. Se observa que I a VI son los azúcares que constituyen los hexasacáridos, estando en I el resto reducido y VI el resto ácido urónico insaturado. [(ácido 4-desoxi-2-O-sulfo-\alpha-L-treo-hex-4-enopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-2-sulfoamino-6-O-sulfo-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow4)-ácido 2-O-sulfo-\alpha-L-idopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-2-sulfoamino-6-O-sulfo-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow4)-ácido 2-O-sulfo-\alpha-L-idopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-2-sulfoamino-6-O-sulfo-D-glucitol, sal de dodecasodio); (ácido 4-desoxi-2-O-sulfo-\alpha-L-treo-hex-4-enopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow4)-ácido 2-O-sulfo-\alpha-L-idopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow4)-ácido 2-O-sulfo-\alpha-L-idopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-D-manitol, sal de dodecasodio): Espectro de protones en D_{2}O, 600MHz, T=305K, \delta en ppm: 3,25 (2H, m, H-2^{(III)} y (V)),3,38 (1H, m, H-2^{(I)}), 3,61 (2H, t, J=10Hz, H-3^{(III) y (V)}),entre 3,70 y 3,83 (4H, masivo, 2H-1^{(I)} y H-4^{(III) y (V)}),3,86 (1H, t, J=5Hz, H-3^{(I)}), 4,00 (2H, m, H-5^{(III) y (V)}),4,07 (1H, m, H-4^{(IV)}), 4,08 (1H, m, H-4^{(I)}), entre 4,10 y 4,45 (13H, masivo, H-5^{(I)}/2H-6^{(I)}, H-2^{(II)}/H-3^{(II)}/H-4^{(II)}, 2H-6^{(III)}, H-2^{(IV)}/H-3^{(IV)}, 2H-6^{(V)}, H 3^{(VI)}), 4,60 (1H, s, H-2^{(VI)}), 4,62 (1H, s, H-5^{(II)}), 4,78 (1H, s, H-5^{(IV)}), 5,17 (1H, s, H-1^{(IV)}), 5,28 (1H, d, J=4Hz, H-1^{(II)}), 5,38 (1H, d, J=3Hz, H-1^{(V)}), 5,44 (1H, d, J=3Hz, H-1^{(III)}), 5,47 (1H, d, J=2Hz, H-1^{(VI)}), 5,96 (1H, d, J=5Hz, H-4^{(VI)})].

Ejemplo 4

En un reactor se introduce una disolución a 25ºC de 100 mg de un oligosacárido de fórmula (II) en la que n es igual a 3, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, R_{7} y R_{8} representanun radical SO_{3}M, R_{4} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno y M es sodio, en 2 ml de agua. Bajo agitación, se añaden en dos veces 30 mg de borohidruro de sodio. El pH se ajusta entre 9 y 10 mediante la adición de una disolución de hidróxido sódico 0,5 moles/l. Después de 12 horas, se añade de manera progresiva ácido acético hasta la obtención de un pH comprendido entre 4 y 5. La mezcla se agita 1 hora después se reajusta el pH a 6,7 mediante la adición de sosa 0,5 moles/l. La mezcla se diluye con agua destilada en una cantidad suficiente como para obtener 20 ml. Se añaden 2 g de acetato sódico y se añaden 3 volúmenes de metanol. La suspensión se filtra con una membrana Whatman GF/B y el sólido recuperado se lava dos veces con 1 ml de metanol. Después de secar, se obtienen 68 mg de un sólido blanco. Después de control con HPLC (Cromatografía Líquida de Alta Presión), el producto no estaba totalmente reducido, y se repitieron de forma completa todas las operaciones anteriores. Después de secar, se obtienen 45 mg de un oligosacárido de fórmula (I) en el que n es igual a 3, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, R_{7} y R_{8} representan un radical SO_{3}M, R_{4} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno y M es sodio, bajo la forma de una mezcla de diastereoisómeros. Se observa que I a VIII son los azúcares que constituyen los octasacáridos, estando en I el resto reducido y VIII el resto de ácido urónico insaturado, [(ácido 4-desoxi-2-O-sulfo-\alpha-L-treo-hex-4-enopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow4)-ácido 2-O-sulfo-\alpha-L-idopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-2-sulfoamino-6-O-sulfo-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow4)-ácido 2-O-sulfo-\alpha-L-idopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow4)-ácido 2-O-sulfo-\alpha-L-idopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-D-glucitol, sal de hexadecasodio); (ácido 4-desoxi-2-O-sulfo-\alpha-L-treo-hex-4-enopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow4)-ácido 2-O-sulfo-\alpha-L-idopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow4)-ácido 2-O-sulfo-\alpha-L-idopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow4)-ácido 2-O-sulfo-\alpha-L-idopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-D-manitol, sal de hexadecasodio): Espectro de protones en D_{2}O, 600MHz, T=305K, \delta en ppm: 3,25 (3H, m, H-2^{(III)}, H-2^{(V)}, H-2^{(VII)}), 3,38 (1H, m, H-2^{(I)}), 3,61 (3H, m, H-3^{(III)}, H-3^{(V)}, H-3^{(VII)}), entre3,70 y 3,83 (5H, masivo, 2H-1^{(I)} y H-4^{(III)}, H-4^{(V)}, H-4^{(VII)}), 3,86 (1H, t, J=5Hz, H-3^{(I)}), 4,00 (3H, m, H-55^{(III)}, H 5^{(V)}, H-5^{(VII)}, 4,08 (3H, m, H-4^{(I)}, H-4^{(IV)}, H-4^{(VI)}, entre 4,10 y 4,45 (17H, masivo, H-5^{(I)}/2H-6^{(I)}, H-2^{(II)}/H-3^{(II)}/H-4^{(II)}, 2H 6^{(III)}, H-2^{(IV)}/H-3^{(IV)}, 2H-6^{(V)}, H-2^{(VI)}/H-3^{(VI)}, 2H-6^{(VII)}, H-3^{(VIII)}), 4,59 (1H, s, H-2^{(VIII)}), 4,62 (1H, s, H-5^{(II)}), 4,78 (2H, s, H-5^{(IV)}, H-5^{(VI)}), 5,17 (2H, s, H-1^{(IV)}, H-1^{(VI)}), 5,28 (1H, d, J=4Hz, H-1^{(II)}), 5,38 (2H, m, H-1^{(V)}, H-1^{(VII)}, 5,44 (1H, d, J=3Hz, H-1^{(III)}), 5,47 (1H, s, H-1^{(VIII)}), 5,96 (1H, d, J=5Hz, H-4^{(VIII)})].

Ejemplo 5

En un reactor se introduce una disolución a 25ºC de 65 mg de un oligosacárido de fórmula (II) en la que n es igual a 4, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, R_{7} y R_{8} representan un radical SO_{3}M, R_{4} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno y M es sodio, en 1,2 ml de agua. Bajo agitación, se añaden de una vez 18 mg de borohidruro de sodio. El pH se ajusta entre 9 y 10 mediante la adición de una disolución de hidróxido sódico 0,5 moles/l. Después de 12 horas, se añade de manera progresiva ácido acético hasta la obtención de un pH comprendido entre 4 y 5. La mezcla se agita 1 hora después se reajusta el pH a 6,7 mediante la adición de sosa 0,5 moles/l. La mezcla se diluye con 3 ml de una disolución acuosa de acetato sódico 10% y se añaden 3 volúmenes de metanol (12 ml). La suspensión se filtra y el sólido recuperado se lava con 3 ml de metanol. Después de secar, se obtienen 54 mg de un oligosacárido de fórmula (I) en el que n es igual a 4, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, R7 y R_{8} representan un radical SO_{3}M, R_{4} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno y M es sodio, bajo la forma de una mezcla de diastereoisómeros. Se observa que I a X son los azúcares que constituyen los decasacáridos, estando en I el resto reducido y X el resto de ácido urónico insaturado. [(ácido 4-desoxi-2-O-sulfo-\alpha-L-treo-hex-4-enopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-2-sulfoamino-6-O-sulfo-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow4)-ácido 2-O-sulfo-\alpha-L-idopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow4)-ácido 2-O-sulfo-\alpha-L-idopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow4)-ácido 2-O-sulfo-\alpha-L-idopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow4)-ácido 2-O-sulfo-\alpha-L-idopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-D-glucitol, sal de eicosodio); (ácido 4-desoxi-2-O-sulfo-\alpha-L-treo-hex-4-enopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow4)-ácido 2-O-sulfo-\alpha-L-idopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow4)-ácido 2-O-sulfo-\alpha-L-idopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow4)-ácido 2-O-sulfo-\alpha-L-idopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow4)-ácido 2-O-sulfo-\alpha-L-idopiranosilurónico-(1\rightarrow4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2-sulfoamino-D-manitol, sal de eicosodio): Espectro de protones en D_{2}O, 600MHz, T=303K, \delta en ppm: 3,23 (4H, m, H-2^{(III)}, H-2^{(V)},
H-2^{(VII)}, H-2^{(IX)}), 3,35 (1H, m, H2^{(I)}), 3,59 (4H, m, H-3^{(III)}, H 3^{(V)}, H-3^{(VII)}, H-3^{(IX)}), entre 3,65 y 3,80 (6H, m), 3,85 (1H, m, H-3^{(I)}), entre 3,90 y 4,40 (29H, m), 4,57 (1H, m, H-2^{(X)}), 4,59 (1H, m, H-5^{(II)}), 4,75 (3H, m, H-5^{(IV)}, H-5^{(VI)}, H-5^{(VIII)}), 5,15 (3H, m, H-1^{(IV)}, H-1^{(VI)}, H-1^{(VIII)}), 5,25 (1H, m, H-1^{(II)}), 5,37 (3H, m, H-1^{(V)}, H-1^{(VII)}, H-1^{(IX)}), 5,42 (1H, m, H-1^{(III)}), 5,45 (1H, m, H-1^{(X)}), 5,93 (1H, d, J=5Hz, H-4^{(X)}).

Los medicamentos según la invención comprenden como principio activo al menos un oligosacárido de fórmula (I) o una mezcla de oligosacáridos de fórmula (I), bajo la forma de una composición en la que está asociado a cualquier otro producto compatible desde un punto de vista farmacéutico, que puede ser inerte o activo desde un punto de vista fisiológico. Los medicamentos según la invención pueden utilizarse por vía intravenosa, subcutánea, oral, rectal, tópica o pulmonar (inhalación).

Las composiciones estériles para la administración intravenosa o subcutánea, son generalmente disoluciones acuosas. Estas composiciones pueden igualmente contener adyuvantes, en particular agentes humectantes, isotonizantes, emulsionantes, dispersantes y estabilizantes. La esterilización puede realizarse de muchas maneras, por ejemplo, por filtración aseptizante, incorporando a la composición agentes esterilizantes, por irradiación. Igualmente, pueden prepararse bajo la forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse en el momento de ser utilizadas en agua estéril o en cualquier otro medio estéril inyectable.

Como composiciones sólidas para administración oral, pueden utilizarse comprimidos, píldoras, polvos (cápsulas de gelatina, sellos) o gránulos. En estas composiciones, el principio activo se mezcla con uno o varios diluyentes inertes, tales como almidón celulosa, sacarosa, lactosa o sílice, bajo corriente de argón. Estas composiciones también pueden comprender sustancias distintas de los diluyentes, por ejemplo uno o varios lubricantes tales como estearato de magnesio o talco, un agente que favorece la absorción oral, un colorante, recubrimiento (grageas).

Como composiciones líquidas para administración oral, se pueden utilizar disoluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes y elixires aceptables desde un punto de vista farmacéutico que contienen diluyentes inertes tales como agua, etanol, glicerol, aceites vegetales o aceite de parafina. Estas composiciones pueden comprender sustancias distintas de los diluyentes, por ejemplo productos humectantes, edulcorantes, espesantes, aromatizantes o estabilizantes.

Las composiciones para la administración rectal son supositorios o cápsulas rectales que contienen, además del producto activo, excipientes tales como manteca de cacao, glicéridos semisintéticos o polietilenglicoles.

Las composiciones para la administración tópica pueden ser por ejemplo cremas, lociones, colirios, colutorios, gotas nasales o aerosoles.

Las dosis dependen del efecto buscado, de la duración del tratamiento y de la vía de administración utilizada; están comprendidas generalmente entre 0,5 mg y 10 mg por kg por día por vía subcutánea es decir 3 a 60 mg por día para un adulto de 60 kg.

De manera general, el médico determinará la posología apropiada en función de la edad, peso y de cualquier otro factor propio del sujeto a tratar.

La invención también se refiere a la utilización de los oligosacáridos según la invención para la preparación de un medicamento útil en la prevención o tratamiento de enfermedades ligadas a un proceso inflamatorio que implica la producción de óxido de nitrito (NO) o útil para la supervivencia y crecimiento de las motoneuronas.

La invención es especialmente ventajosa para la utilización de los oligosacáridos de fórmula (I) en la preparación de medicamentos útiles en la prevención y tratamiento de isquemias cerebrales, cardiacas o vasculares periféricas, osteoartritis, traumatismos del sistema nervioso central, traumatismos craneales, espinales y cráneo-espinales, esclerosis en placas, dolores neuropáticos y neuropatías periféricas, enfermedades de motoneurona, esclerosis lateral amiotrófica, neuro-sida, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y Corea de Huntington.

La invención también se refiere al método de prevención y/o tratamiento de enfermedades ligadas a un proceso inflamatorio que implica la producción de sustancias citotóxicas tales como el óxido de nitrito (NO) y enfermedades ligadas a la supervivencia y crecimiento de las motoneuronas. Los oligosacáridos de fórmula (I) pueden utilizarse por lo tanto en la prevención y/o tratamiento de enfermedades neurodegenerativas en las que la inflamación cerebral juega un papel deletéreo que puede conducir a la muerte entre las que se pueden citar isquemias cerebrales, isquemias cardíacas (infarto de miocardio), isquemias periféricas, traumatismos del sistema nervioso central y principalmente traumatismos craneales, espinales y cráneo-espinales, esclerosis en placas, dolores neuropáticos y neuropatías periféricas, enfermedades de motoneuronas como la esclerosis lateral amiotrófica, atrofia espinal progresiva, atrofia muscular infantil y esclerosis lateral primaria, neuro-sida, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y Corea de Huntington y determinadas formas de osteoartritis principalmente con localización articular.

La presente invención se refiere también al método de prevención y/o tratamiento de enfermedades motoneuronales tales como la esclerosis lateral amiotrófica, atrofia espinal progresiva, atrofia muscular infantil y esclerosis lateral primaria,

Claims

1. Composición farmacéutica que contiene como principio activo un oligosacárido de fórmula:

3

: en la que n es un número entero de 0 a 25, R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6} y R_{8}, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO_{3}M, R_{2} y R_{7}, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO_{3}M o COCH_{3} y M es sodio, calcio, magnesio o potasio o una mezcla de estos oligosacáridos con la excepción de aquellos en los que n es igual a 0 y bien R_{1}, R_{6} y R_{8} son átomos de hidrógeno, R_{7} representa un radical SO_{3}M o COCH_{3} y M es sodio, bien R_{1} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno, R_{7} representa un radical COCH_{3}, R_{8} representa un radical SO_{3}M y M es sodio, bien R_{6} representa un hidrógeno, R_{1}, R_{7} y R_{8} representan un radical SO_{3}M y M es sodio, bien R_{6} y R_{7} representan átomos de hidrógeno, R_{1} y R_{8} representan un radical SO_{3}M y M es sodio, bien R_{1}, R_{6} y R_{7} representan un átomo de hidrógeno, R_{8} representa un radical SO_{3}M y M es sodio.

2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, que contiene un oligosacárido de fórmula (I) en el que R_{4} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno o una mezcla de estos oligosacáridos.

3. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que contiene un oligosacárido de fórmula (I) en el que n es un número entero de 0 a 10, una mezcla de estos oligosacáridos.

4. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que contiene un oligosacárido de fórmula (I) en el que n es un número entero de 0 a 6, una mezcla de estos oligosacáridos.

5. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que contiene un oligosacárido de fórmula (I) en el que n es un número entero de 1 a 6, una mezcla de estos oligosacáridos.

6. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, que contiene un oligosacárido de fórmula (I) en el que n es igual a 1, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, R_{7} y R_{8}, representan un radical SO_{3}M, R_{4} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno y M es sodio.

7. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, que contiene un oligosacárido de fórmula (I) en el que n es igual a 2, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, R_{7} y R_{8}, representan un radical SO_{3}M, R_{4} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno y M es sodio.

8. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, que contiene un oligosacárido de fórmula (I) en el que n es igual a 3, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, R_{7} y R_{8}, representan un radical SO_{3}M, R_{4} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno y M es sodio.

9. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, que contiene un oligosacárido de fórmula (I) en el que n es igual a 4, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, R_{7} y R_{8}, representan un radical SO_{3}M, R_{4} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno y M es sodio.

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10. Oligosacárido de fórmula:

4

: en la que n es un número entero de 0 a 25, R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6} y R_{8}, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO_{3}M, R_{2} y R_{7}, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO_{3}M o COCH_{3} y M es sodio, calcio, magnesio o potasio con la excepción de aquellos en los que n es igual a 0 y bien R_{1}, R_{6} y R_{8} son átomos de hidrógeno, R_{7} representa un radical SO_{3}M o COCH_{3} y M es sodio, bien R_{1} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno, R_{7} representa un radical COCH_{3}, R_{8} representa un radical SO_{3}M y M es sodio, bien R_{6} representa un hidrógeno, R_{1}, R_{7} y R_{8} representan un radical SO_{3}M y M es sodio, bien R_{6} y R_{7} representan átomos de hidrógeno, R_{1} y R_{8} representan un radical SO_{3}M y M es sodio, bien R_{1}, R_{6} y R_{7} representan un átomo de hidrógeno, R_{8} representa un radical SO_{3}M y M es sodio.

11. Oligosacárido de fórmula (I) según la reivindicación 10, en el que R_{4} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno.

12. Oligosacárido de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, en el que n es un número entero de 0 a 10.

13. Oligosacárido de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, en el que n es un número entero de 0 a 6.

14. Oligosacárido de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, en el que n es un número entero de 1 a 6.

15. Oligosacárido de fórmula (I) según la reivindicación 10, en el que n es igual a 1, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, R_{7} y R_{8}, representan un radical SO_{3}M, R_{4} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno y M es sodio.

16. Oligosacárido de fórmula (I) según la reivindicación 10, en el que n es igual a 2, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, R_{7} y R_{8}, representan un radical SO_{3}M, R_{4} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno y M es sodio.

17. Oligosacárido de fórmula (I) según la reivindicación 10, en el que n es igual a 3, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, R_{7} y R_{8}, representan un radical SO_{3}M, R_{4} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno y M es sodio.

18. Oligosacárido de fórmula (I) según la reivindicación 10, en el que n es igual a 4, R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{5}, R_{7} y R_{8}, representan un radical SO_{3}M, R_{4} y R_{6} representan un átomo de hidrógeno y M es sodio.

19. Proceso de preparación de los oligosacáridos de fórmula (I) según la reivindicación 10, caracterizado porque se hace reaccionar un borohidruro de metal alcalino o de amonio cuaternario con los oligosacáridos de fórmula:

5

: en la que n es un número entero de 0 a 25, R_{1}, R_{3}, R_{4} y R_{5}, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO_{3}M, R_{2} y R_{6}, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO_{3}M o COCH_{3} y M es sodio, calcio, magnesio o potasio y el aislamiento de los oligosacáridos.

20. Proceso según la reivindicación 19, caracterizado porque la reacción se efectúa en medio acuoso, a una temperatura cercana a 25ºC y a un pH de 7 a 10.

21. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 19 y 20, caracterizado porque el pH de la reacción es de 9 a 10.

22. Proceso según las reivindicaciones 19 y 20, caracterizado porque el borohidruro de metal alcalino o de amonio cuaternario es borohidruro de litio, sodio, potasio o tetrabutilamonio.

23. Utilización de los oligosacáridos de fórmula:

6

: en la que n es un número entero de 0 a 25, R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6} y R_{8}, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO_{3}M, R_{2} y R_{7}, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO_{3}M o COCH_{3} y M es sodio, calcio, magnesio o potasio o una mezcla de estos oligosacáridos para la preparación de un medicamento útil en la prevención o tratamiento de enfermedades ligadas a un proceso inflamatorio que implica la producción de óxido de nitrito (NO).

24. Utilización de los oligosacáridos de fórmula (I) según la reivindicación 23, para la preparación de medicamentos útiles en la prevención y tratamiento de isquemias cerebrales, cardiacas o vasculares periféricas, osteoartritis, traumatismos del sistema nervioso central, traumatismos craneales, espinales y cráneo-espinales, esclerosis en placas, dolores neuropáticos y neuropatías periféricas, enfermedades de motoneurona, esclerosis lateral amiotrófica, neuro-sida, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y Corea de Huntington.

25. Utilización de los oligosacáridos de fórmula (I)

7

: en la que n es un número entero de 0 a 25, R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6} y R_{8}, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO_{3}M, R_{2} y R_{7}, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO_{3}M o COCH_{3} y M es sodio, calcio, magnesio o potasio o una mezcla de estos oligosacáridos para la preparación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de enfermedades ligadas a la supervivencia y el crecimiento de las motoneuronas.