DE602005002538T2

DE602005002538T2 - Ester von hyaluronsäure mit rhein, herstellungsverfahren dafür und zusammensetzungen damit

Info

Publication number: DE602005002538T2
Application number: DE602005002538T
Authority: DE
Inventors: Antonello Pietrangelo; Valter Travagli
Original assignee: Laboratoire Medidom SA
Current assignee: Laboratoire Medidom SA
Priority date: 2004-02-26
Filing date: 2005-02-25
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2025-02-26
Also published as: CN100551932C; JP2007524753A; SI1718679T1; RU2383554C2; US7834173B2; BRPI0507622A; BRPI0507622B1; DE602005002538D1; ITMI20040347A1; UA91673C2; JP2011252153A; JP4870068B2; EP1718679A1; BRPI0507622B8; CN1914228A; IL177072A0; CA2556942C; IL177072A; PL1718679T3; HK1099032A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Ester von Hyaluronsäure (HA: hyaluronic acid) mit Rhein, genauer auf eine auf Hyaluronsäure beruhende Verbindung, in der die Alkoholgruppen der Hyaluronsäure mit Rhein verestert sind, auf ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung und auf eine pharmazeutische Zusammensetzung mit dieser Verbindung.
STAND DER TECHNIK
Rhein ist ein von Senna abgeleitetes Alkaloid, das entzündungshemmende und gewebeschützende Eigenschaften besitzt.
Rhein, dessen chemischer Name 4,5-Dihydroxy-9,10-dihydro-9,10-dioxo-2-anthracencarbonsäure ist, besitzt die folgende allgemeine Formel (I):
worin R = H.
Diese Substanz wird auf oralem Wege verabreicht, gewöhnlich als Diacetylrhein, einem Abkömmling der obigen allgemeinen Formel (I), worin jede der R-Gruppen eine Acetylgruppe ist, der eine grössere Bioverfügbarkeit besitzt und hauptsächlich für die Behandlung von Gelenkentzündungen verwendet wird.
Rhein und Diacetylrhein weisen aber beide den Nachteil auf, dass sie eine beachtliche abführende Wirkung besitzen, die sogar zu Durchfall führen kann und daher ihre Verwendung für alte oder geschwächte Patienten als nicht empfehlenswert erscheinen lässt.
Wegen der Unlöslichkeit von Rhein und Diacetylrhein in Wasser kann diese Nebenwirkung ausserdem nicht durch eine Verabreichung dieser Wirkstoffe auf parenteralem oder intraartikulärem Wege umgangen werden.
Hyaluronsäure ist ein natürliches Mucopolysaccharid, das aus abwechselnden Einheiten von D-Glucuronsäure und N-Acetylglucosamin gebildet wird, wie allgemein hierunter dargestellt:
um eine lineare Kette mit einem Molekulargewicht bis zu 13 × 10⁶ Dalton zu bilden.
Hyaluronsäure ist in allen weichen Geweben des Organismus sowie in vielen physiologischen Flüssigkeiten wie zum Beispiel der Gelenkschmiere (Synovia) und dem Glaskörper der Augen vorhanden.
Hyaluronsäure wird in seiner Säure- oder Salzform in vielen klinischen Anwendungen eingesetzt.
Insbesondere wird sie mit grossem Erfolg bei Gelenkentzündungen verwendet, wo sie durch Infiltrieren direkt in das Gelenk verabreicht wird und über einen doppelten Mechanismus wirkt: auf der einen Seite durch Verringerung der Gelenkentzündung und anf der anderen Seite durch eine Erhöhung der Viskosität der Synovia, was dem Knorpel nutzt, indem er im Ergebnis mehr geschmiert wird.
Sie kann auch in der Ophthalmologie angewendet werden, wo sie wegen ihrer Schutz- und entzündungshemmenden Eigenschaften und dank ihrer anabolisch-rekonstruktiven Wirkung auf Knorpel und Haut für Gewebereparatur eingesetzt wird.
Bekanntlich erleidet aber Hyaluronsäure einen Abbau.
Es ist berichtet worden, dass der Abbau von Hyaluronsäure durch Hydrolyse verursacht wird und von den pH-Verhältnissen sowie der Kationenkonzentration abhängt (vgl. z.B. H. Uchiyama und Mitautoren, J. Biol. Chem. 1990, 265: 7753–7759; Y. Tokita und A. Okamoto, Polym. Degr. and Stab. 1995, 48: 269–273; C. L. Hawkins und M. J. Davies, Free Rad. Biol. Med. 1998, 24: 1396–1410; J. Schiller und Mitautoren, Current Med. Chem., 2003, 10: 2123–2145).
Nach ausgedehnten Untersuchungen haben die derzeitigen Erfinder gefunden, dass Hyaluronsäure, deren Alkoholgruppen mit Rhein verestert sind, überraschend eine höhere Stabilität als Hyaluronsäure und weiter eine pharmakologische Aktivität besitzt, die gegenüber der beim getrennten Einsatz von Hyaluronsäure und Rhein beobachteten verbessert ist.
Darüber hinaus haben die derzeitigen Erfinder gefunden, dass Hyaluronsäure, deren Alkoholgruppen mit Rhein verestert sind, vorteilhaft durch lokale Verabreichung angewendet werden kann, wodurch die mit der oralen Verabreichung von Rhein verbundenen Nachteile vermieden werden.
Die vorliegende Erfindung ist auf der Grundlage dieser Ergebnisse erreicht worden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Einem ersten Aspekt zufolge bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine auf Hyaluronsäure basierende Verbindung oder eines ihrer Salze, in denen Alkoholgruppen von Hya luronsäure mit Rhein als solchem oder in derivatisierter Form verestert sind und die nicht nur eine höhere Stabilität als Hyaluronsäure besitzt, sondern auch eine pharmakologische Aktivität, die gegenüber der beim getrennten Einsatz von Hyaluronsäure und Rhein beobachteten verbessert ist, und die ferner durch lokale Verabreichung angewendet werden kann, wodurch die mit der oralen Verabreichung von Rhein verbundenen Nachteile vermieden werden.
Einem zweiten Aspekt zufolge bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung der Verbindung oder eines ihrer Salze gemäss dem ersten Aspekt, das umfasst, Säurechlorid von Rhein als solchem oder in derivatisierter Form mit Hyaluronsäure umzusetzen.
Einem dritten Aspekt zufolge bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die Verbindung oder eines ihrer Salze gemäss dem ersten Aspekt, kombiniert mit geeigneten Vehikeln und/oder Verdünnungsmitteln umfasst.
Weiteren Aspekten zufolge bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein medizinisches Erzeugnis oder eine medizinische Vorrichtung zur humanen oder veterinären Anwendung, die durch eine Zusammensetzung gemäss dem dritten Aspekt gebildet werden, und auf die Verwendung einer Verbindung oder eines ihrer Salze gemäss dem ersten Aspekt zur Zubereitung eines Medikaments für die Behandlung von entzündlichen Krankheiten oder für Gewebereparatur oder für die Herstellung von Biomaterialien.
Weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden in der folgenden eingehenden Beschreibung klar werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum von Rhein, das durch Verseifung der HA-Re-Verbindung der vorliegenden Erfindung gewonnen wurde.
2 zeigt das IR-Spektrum von Rhein, das durch Verseifung der HA-Re-Verbindung der vorliegenden Erfindung gewonnen wurde.
3 zeigt die HPLC-MS-Analyse von Rhein, das durch Verseifung der HA-Re-Verbindung der vorliegenden Erfindung gewonnen wurde.
4 gibt die Ergebnisse wieder, die in RT-PCR-Versuchen gewonnen wurden, in denen die Wirkung von Hyaluronsäure bei der pharmakologischen Konzentration mit der Wirkung der HA-Re-Verbindung der Erfindung bei den gleichen Konzentrationen verglichen wurde.
5 berichtet die Ergebnisse, die in RT-PCR-Versuchen gewonnen wurden, in denen die Wirkung von Rhein bei der pharmakologischen Dosis mit der Wirkung einer ähnlichen Dosis der HA-Re-Verbindung der vorliegenden Erfindung verglichen wurde.
6 zeigt das ¹³C-NMR-Spektrum einer HA-Re-Verbindung gemäss der vorliegenden Erfindung.
7 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum einer HA-Re-Verbindung gemäss der vorliegenden Erfindung.
EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird nunmehr detaillierter beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt eine auf Hyaluronsäure basierende Verbindung oder eines ihrer Salze zur Verfügung, in denen Alkoholgruppen von Hyaluronsäure mit Rhein als solchem oder in derivatisierter Form verestert sind.
In der vorliegenden Beschreibung wird die Verbindung der vorliegenden Erfindung auch als „HA-Re-Verbindung" bezeichnet.
Es muss vermerkt werden, dass in der vorliegenden Beschreibung und den vorliegenden Ansprüchen der Ausdruck „Rhein" Rhein als solches oder in einer derivatisierten Form bedeutet.
Salze der HA-Re-Verbindung gemäss der vorliegenden Erfindung sind u.a. bevorzugt pharmazeutisch annehmbare Salze, z.B. ein Natriumsalz, ein Kaliumsalz, ein Magnesiumsalz, ein Calciumsalz oder andere herkömmliche, pharmazeutisch annehmbare Salze, stärker bevorzugt das Natriumsalz.
Gemäss der vorliegenden Erfindung schliesst der Ausdruck „derivatisierte Form" von Rhein einen beliebigen Abkömmling von Rhein ein, der in vivo pharmakologisch aktiv ist und in dem die Säuregruppe von Rhein zur Bildung der Esterbindung mit den Hydroxylgruppen von Hyaluronsäure verfügbar ist.
Der Vorzug wird Abkömmlingen von Rhein gegeben, die das Anthrachinon in vivo verfügbar machen.
Beispiele von Rhein in der derivatisierten Form gemäss vorliegender Erfindung sind u.a. Rhein, wie es durch die folgende Formel dargestellt wird:
worin R unabhängig eine beliebige geeignete Schutzgruppe für Hydroxy ist, bevorzugt eine Acylgruppe, zum Beispiel eine Acetyl-, Propionyl-, Butyryl- oder Pivaloylgruppe, ohne auf diese beschränkt zu sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt Rhein in derivatisierter Form vor und ist stärker bevorzugt Diacetylrhein.
Der vorliegenden Erfindung zufolge verestert Rhein bevorzugt zumindest 5 % der veresterbaren Alkoholgruppen der Hyaluronsäure, stärker bevorzugt zwischen 5 und 50 %, noch stärker bevorzugt zwischen 5 und 20 %.
Besondere Bevorzugung wird einer Verbindung gegeben, in der Rhein 10 % der veresterbaren Alkoholgruppen der Hyaluronsäure verestert.
Die HA-Re-Verbindung kann mit einem erfindungsgemässen Verfahren hergestellt werden, das umfasst, Säurechlorid von Rhein mit Hyaluronsäure umzusetzen, bevorzugt in einer solchen Menge, dass das Prozentverhältnis zwischen den Millimolen des Säurechlorids von Rhein und den Milliequivalenten der veresterbaren Alkoholeinheiten von Hyaluronsäure grösser als 5 % ist, stärker bevorzugt zwischen 5 % und 50 %, noch stärker bevorzugt zwischen 5 % und 20 % und gemäss einer besonders bevorzugten Ausführungsform 10 % beträgt.
Im ausgewählten Verfahren ist die Auswahl von Lösungsmitteln gebührend berücksichtigt worden, die von der Annehmbarkeit ihrer Rückstände abhängt (ICH – Internationale Konferenz zur Harmonisierung technischer Anforderungen für die Registrierung von pharmazeutischen Produkten zur Anwendung am Menschen).
Bevorzugt umfasst das oben erwähnte Verfahren gemäss vorliegender Erfindung die folgenden Schritte:

a) Herstellen einer Aufschlämmung von Hyaluronsäure in einem aprotischen, nicht polaren Lösungsmittel,
b) Hinzufügen des Säurechlorids von Rhein, aufgelöst in einer minimalen Menge eines aprotischen, nicht polaren Lösungsmittels und eines Wasserstoffionenakzeptors,
c) Weiterrühren der Mischung unter Rückfluss während einer Zeit, die dafür genügt, die Veresterungsreaktion ablaufen zu lassen, und
d) Abdampfen des Lösungsmittels.

Beispiele von aprotischen, nicht polaren Lösungsmitteln, die im Schritt (a) verwendet werden können, sind u.a. Cyclohexan, Tetrahydrofuran, Toluol, Dichlormethan, n-Hexan, stärker bevorzugt Cyclohexan.
Das aprotische, nicht polare Lösungsmittel, das verwendet werden kann, um das Säurechlorid von Rhein aufzulösen, ist nicht beschränkt, sollte aber vorzugsweise gleich wie das im Schritt (a) verwendete gewählt werden.
Beispiele des Wasserstoffionenakzeptors, der im Schritt (b) hinzugefügt werden kann, sind u.a. Pyridin, Triethylamin, stärker bevorzugt Et₃N;
Die Zeit, während der die Reaktion unter Rückfluss belassen wird, ist nicht beschränkt, sollte aber bevorzugt wenigstens 20 Stunden betragen.
Hyaluronsäure, die zur Herstellung der HA-Re-Verbindung gemäss vorliegender Erfindung verwendet werden kann, hat bevorzugt ein Molekulargewicht von 500 000 bis 3 000 000 Da, stärker bevorzugt um 600 000 Da.
Das Molekulargewicht von Hyaluronsäure kann in herkömmlicher Weise bestimmt werden, zum Beispiel durch Gelpermeationschromatographie (GPC).
Hyaluronsäure, die für die Herstellung der HA-Re-Verbindung gemäss vorliegender Erfindung verwendet wird, kann im Handel verfügbar sein (z.B. von Fidia Farmaceutici SpA, Abano Terme PD) oder zum Beispiel durch Extraktion von Hahnenkämmen, durch eine Fermentierung von Bakterien, die eine Schleimschicht tragen, oder auf andere herkömmliche Weise hergestellt werden (siehe Proteoglycan Protocols [Proteoglykan-Protokolle], R. V. Iozzo, Hrsg., Humana Press, Totowa NJ 2001).
Das Säurechlorid von Rhein, das im Verfahren zur Herstellung der HA-Re-Verbindung gemäss vorliegender Erfindung verwendet werden kann, kann durch ein Verfahren gewonnen werden, das die folgenden Schritte umfasst:

a') Herstellen einer Aufschlämmung von Rhein in einem aprotischen, nicht polaren Lösungsmittel;
b') Hinzufügen einer solchen Menge von SOCl₂, dass ein molares Verhältnis von mehr als 10 zwischen SOCl₂ und Rhein erhalten wird;
c') Weiterrühren des Reaktionsgemisches in inerter Atmosphäre unter Rückfluss während einer Zeit, die für die Bildung des Rhein-Säurechlorids genügt; und
d') Entfernen des Lösungsmittels und des Überschusses an nicht umgesetztem SOCl₂ durch Destillation.

Beispiele von aprotischen, nicht polaren Lösungsmitteln, die im Schritt (a') verwendet werden können, sind u.a. Cyclohexan, Tetrahydrofuran, Toluol, Dichiormethan, n-Hexan, bevorzugt ein chloriertes Lösungsmittel und stärker bevorzugt CH₂Cl₂.
Die Zeit, während der die Reaktion im Schritt (c') unter Rückfluss belassen wird, ist nicht beschränkt, sollte aber bevorzugt wenigstens drei Stunden betragen.
Rhein als solches oder in derivatisierter Form, das im Schritt (a') für die Herstellung des Säurechlorids von Rhein verwendet wird, kann im Handel verfügbar sein (z.B. von Aldrich) oder nach herkömmlichen Verfahren synthetisiert werden (siehe H. Nawa und Mitautoren, J. Org. Chem. 1961, 26: 979–981 und darin angeführte Literatur; C. W. Smith und Mitautoren, Tetrahedron Lett. 1993, 34: 7447–7450; P. T. Gallagher und Mitautoren, Tetrahedron Lett. 1994, 35: 289–292).
Einer besonders bevorzugten Anwendung zufolge wird die HA-Re-Verbindung der vorliegenden Erfindung, die mit dem Verfahren gemäss vorliegender Erfindung gewonnen wird, gereinigt.
Diese Reinigung erfolgt bevorzugt unter Verwendung einer Dialysemembran.
In diesem Fall wird, wie in den folgenden Beispielen beschrieben werden wird, bevorzugt und den Herstelleranweisungen folgend die Dialysemembran verwendet, die im Handel unter dem Handelsnamen „Slide-A-Lyzer 3.5K" (Pierce, Rockford IL USA) erhältlich ist.
Wie schon oben diskutiert, hat die HA-Re-Verbindung der vorliegenden Erfindung eine vorteilhaft hohe Stabilität, indem sie bei einer Temperatur von 4 °C ± 0,5 °C in wässriger Lösung, bevorzugt auf pH 7,4 gepuffert, wie zum Beispiel in einer phosphat-gepufferten Salzlösung, die nach der 11. Auflage des Offiziellen Italienischen Arzneibuches hergestellt wird, während mindestens 36 Monaten stabil ist.
Die HA-Re-Verbindung gemäss vorliegender Erfindung besitzt entzündungshemmende, heilende, rekonstruktive und anabolische Eigenschaften für Haut und Knorpel.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher ebenfalls auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine HA-Re-Verbindung gemäss der vorliegenden Erfindung in Kombination mit geeigneten Vehikeln und/oder Verdünnungsmitteln umfasst.
Insbesondere kann die pharmazeutische Zusammensetzung gemäss vorliegender Erfindung eine medizinische Vorrichtung und/oder ein medizinisches Produkt zur humanen und veterinären Anwendung sein.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäss vorliegender Erfindung besitzt bevorzugt eine Formulierung, die für lokoregionale Verabreichung geeignet ist.
Eine besonders bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung gemäss vorliegender Erfindung ist eine Zusammensetzung, die für eine Anwendung vermittels intraartikulärer Infiltration, vermittels ophthalmischer Verabreichung, zum Beispiel Augentropfen und ophthalmischen Salben, und vermittels topischer Verabreichung geeignet ist.
Bevorzugt liegt die Zusammensetzung der Erfindung in Gestalt einer wässrigen Dispersion vor.
Diese Dispersion liegt bevorzugt in einer Pufferlösung mit einem physiologischen pH-Wert vor, stärker bevorzugt einem pH-Wert von 7,4, zum Beispiel einer phosphat-ge pufferten Salzlösung, die nach der 11. Auflage des Offiziellen Italienischen Arzneibuches hergestellt wird.
Einer besonders bevorzugten Anwendung zufolge liegt in der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung die HA-Re-Verbindung oder eines ihrer Salze gemäss vorliegender Erfindung in einer Konzentration vor, die von 0,5 % bis 2 % (Gew./Vol.) reicht, bevorzugt in einer Konzentration von 1 % (Gew./Vol.).
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der HA-Re-Verbindung oder eines ihrer Salze gemäss vorliegender Erfindung zur Zubereitung eines Medikaments zur Behandlung von entzündlichen Krankheiten, darunter bevorzugt entzündlichen Krankheiten der Gelenke, insbesondere Osteoarthritis und rheumatoider Arthritis.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung der HA-Re-Verbindung oder eines ihrer Salze gemäss vorliegender Erfindung zur Herstellung eines Medikaments für die Gewebereparatur, worin das Gewebe Knorpel oder Haut ist.
Ausserdem kann die HA-Re-Verbindung oder eines ihrer Salze gemäss vorliegender Erfindung zur Herstellung von Biomaterialien verwendet werden, zum Beispiel Gazen zur Behandlung von Wunden und Verbrennungen sowie Matrizen für Zellwachstum zur Anwendung in der Behandlung von Verbrennungen und in der Implantologie.
Die vorliegende Erfindung wird besser durch die folgenden Versuchsbeispiele wie auch die Figuren veranschaulicht.
BEISPIELE
Beispiel 1
Herstellung des Säurechlorids von Rhein
Rhein (zur Verfügung gestellt von Aldrich) (21,5 mg; 0,075 mmol) wurde in einem 50-ml-Rundkolben vorgelegt, und CH₂Cl₂ (15 ml) wurde hinzugefügt. Die Aufschlämmung nahm eine orangene Farbe an. Dann wurde der Aufschlämmung SOCl₂ (0,5 ml; 6,9 mmol) zugesetzt. Die Reaktion erfolgte unter Rühren am Rückfluss (50 °C) in einer inerten Atmosphäre (N₂). Das Reaktionsgemisch wurde während drei Stunden am Rückfluss belassen, und die Lösung nahm eine klare orange-gelbe Farbe an. Um das CH₂Cl₂ und den Überschuss an nicht umgesetztem SOCl₂ zu entfernen, wurde Toluol (etwa 5 ml) hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei 500 mm Hg – entsprechend 6,6 × 10⁴ Pa – mindestens viermal destilliert, um 23 mg des rohen Säurechlorids von Rhein zu erhalten (quantitative Ausbeute). Das Produkt wurde durch TLC, Ethylacetat identifiziert.
Beispiel 2
Herstellung der HA-Re-Verbindung
Hyaluronsäure (zur Verfügung gestellt von Fidia Farmaceutici SpA, Abano Terme PD, durchschnittliches Molekulargewicht etwa 600 000 Da) (277,3 mg; 4,6 × 10^–4 mmol, entsprechend 0,75 meq veresterbarer primärer Alkoholeinheiten) wurde in Cyclohexan (20 ml) aufgeschlämmt. Rhein-Säurechlorid, wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt (21,5 mg; 0,075 mmol) und in einer minimalen Menge von CH₂Cl₂ aufgelöst, wurde hinzugefügt. Dann wurde Et₃N (3 ml) hinzugefügt. Die Aufschlämmung nahm eine rote Farbe an. Die Reaktion erfolgte unter Rühren am Rückfluss (70 °C) in einer inerten Atmosphäre (N₂). Nach kurzer Zeit nahm die Aufschlämmung eine rot-orangene Farbe an, die nach etwa drei Stunden dunkler wurde. Nach 20 Stunden wurde die Reaktion angehalten, und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck (650 mm Hg, entsprechend 8,7 × 10⁴ Pa) zur Trockne abgedampft, was die HA-Re-Verbindung in Gestalt eines klaren, gelben Niederschlages ergab.
Beispiel 3
Reinigung der HA-Re-Verbindung
a) Herstellung des Musters
Eine phosphat-gepufferte Salzlösung (5 ml) von pH 7,4 wurde der HA-Re-Verbindung (0,1019 g) zugesetzt, die wie in Beispiel 2 beschrieben gewonnen worden war. Ein Zwei-Phasen-System wurde erhalten, und die Lösung nahm eine orange-gelbe Farbe an, während der Rückstand durch eine Masse von gelb-brauner Farbe und gelatineartiger Konsistenz dargestellt wurde. Nach einer Wartezeit von wenigstens 24 Stunden wurde ein zähflüssiges, kolloidales System von brauner Farbe erhalten.
b) Reinigung
Eine Dialysemembran „Slide-A-Lyzer^® 3.5K" (Pierce, Rockford IL USA) wurde in geeigneter Weise mit phosphat-gepufferter Salzlösung von pH 7,4 gewässert. Nach Herstellerangaben wurde eine geeignete Menge der zu reinigenden HA-Re-Verbindung eingeführt. Dialyse wurde während zwei Stunden gegen einen Phosphatpuffer von pH 7,4 ausgeführt (nach nur 20 Minuten schien die Pufferlösung etwas gelb gefärbt zu sein). Die Operation wurde mindestens dreimal wiederholt, bis die Pufferlösung farblos blieb, was die Abwesenheit von Absorption im sichtbaren Bereich des Spektrums bewies. Die gereinigte HA-Re-Verbindung wurde durch Dialyse aus der Membran zurückgewonnen. Die Reinheit der so gewonnenen HA-Re-Verbindung betrug 99,8 %.
Beispiel 4
Analyse der gewonnenen HA-Re-Verbindung der vorliegenden Erfindung
1. Prüfung mit einem UV-VIS-Spektrophotometer
Die Konzentration von Rhein in der gereinigten HA-Re-Verbindung, die wie in Beispiel 3 beschrieben gewonnen worden war, wurde durch eine spektrophotometrische Ablesung bei 430 nm auf der Basis der „robusten" Eichung im Bereich von 10^–5 bis 10^–3 (R² = 0,9999) ausgewertet. Diese Wellenlänge wurde gewählt, da Hyaluronsäure im UV-Bereich absorbiert, was somit die quantitative Bestimmung von Rhein erschwert. Auf der Grundlage der spektrophotometrischen Ablesung wurde die Ausbeute der Veresterungsreaktion bezüglich Rhein zu 58 % gefunden.
In Anbetracht des Beispiels 2 wurde die Menge von Rhein, das in der Reaktion verwendet wurde, so gewählt, dass maximal 10 % der veresterbaren primären Alkoholgruppen von Hyaluronsäure verestert werden. Da die Ausbeute der Veresterungsreaktion bezüglich Rhein zu 58 % gefunden worden war, kann abgeschätzt werden, dass 5,8 % der veresterbaren Alkoholgruppen von Hyaluronsäure verestert worden waren.
2) ¹H-NMR-Analyse
Ein ¹H-NMR-Spektrum der in Beispiel 2 gewonnenen HA-Re-Verbindung wurde mit einem Varian VRX300-Spektrometer in deuterierter Pufferlösung aufgenommen. Es gab aber Probleme bei der Interpretation dieses Spektrums, da der Prozentsatz von Rhein, der mit der Hyaluronsäure reagiert, es nicht ermöglichte, den aromatischen Ring zu identifizieren. Unter Berücksichtigung der schlechten Löslichkeit von Rhein in einer wässrigen Umgebung und in Anbetracht dessen, dass die Veresterung eine umkehrbare Reaktion ist, wurde daher eine Verseifung, d.h. basische Hydrolyse, ausgeführt, um das Rhein aus der HA-Re-Verbindung zu erhalten. Die gewonnene Verseifungsverbindung fiel aus. Ein ¹H-NMR-Spektrum der so gewonnenen Verseifungsverbindung wurde mit dem Varian VRX-300-Spektrometer in Dimethylsulfoxid (DMSO) aufgenommen. Das erhaltene Spektrum, das in 1 gezeigt ist, fiel vollständig mit dem von Rhein zusammen.
3. IR-Analyse
Ein IR-Spektrum der aus der Verseifung der HA-Re-Verbindung der vorliegenden Erfindung gewonnenen Verbindung wurde (mit dem Spectrum BX FTIR-System von Perkin Elmer) in Nujol aufgenommen. Wie in 2 gezeigt, fällt das gewonnene Spektrum mit dem von reinem Rhein zusammen.
4. HPLC-MS
Eine HPLC-MS-Analyse der aus der Verseifung der HA-Re-Verbindung der vorliegenden Erfindung gewonnenen Verbindung wurde (mit der Ausrüstung Agilent 1100, LC/MSC-Serie) bei einer Durchflussrate von 0,8 ml/min ausgeführt, indem als bewegliche Phase eine 80:20-Mischung von Methanol und Wasser, die 2,5 % Ameisensäure enthielt, verwendet wurde. Aus 3 ist ersichtlich, dass die Masse der Verbindung der Masse von Rhein entspricht.
Beispiel 5
Bewertung der technologischen Eigenschaften der HA-Re-Verbindung der Erfindung
1. Bewertung der hydrolytischen Stabilität
Die HA-Re-Verbindung der Erfindung, die im Beispiel 2 erhalten, aber nicht durch Dialyse gereinigt worden war, wurde im trockenen Zustand während mehr als sechs Monaten in Fläschchen bei Umgebungstemperatur (22 °C) im Dunklen aufbewahrt. Dieses Muster wurde dann durch Dialyse gereinigt, wie in Beispiel 3 beschrieben, und die Konzentration von Rhein wurde mit einem UV-VIS-Spektrophotometer bestimmt. Die Konzentration wurde gleich der für das gerade synthetisierte Produkt gefunden. Die Versuchsergebnisse zeigen daher, dass im trockenen Zustand kein Abbau beobachtet wurde. Ausserdem wurde die HA-Re-Verbindung der Erfindung, die wie im Beispiel 2 beschrieben hergestellt und wie im Beispiel 3 beschrieben durch Dialyse gereinigt worden war, während sechs Monaten in Fläschchen in einer 2-prozentigen Lösung in Phosphatpuffer von pH 7,4 bei einer Temperatur von 4 °C im Dunklen aufbewahrt. Fremdkörper wurden im Muster gefunden, weil nicht sterile Materialien und keine Konservierungsmittel verwendet worden waren. Das Muster wurde noch einmal mit dem gleichen Verfahren, wie in Beispiel 3 beschrieben, einer Dialyse unterworfen, und zwar während mindestens vier Tagen. Durch eine UV-VIS-Prüfung konnte kein in die für die Dialyse verwendeten, verschiedenen Pufferlösungen freigesetztes Rhein gefunden werden. In diesem Falle erwies sich die Verbindung daher ebenfalls als chemisch stabil, da keine Freisetzung von Rhein aus der HA-Re-Verbindung gefunden wurde, wenigstens wie mit derzeitigen analytischen Verfahren nachweisbar. Daher wurde selbst in Lösung kein hydrolytischer Abbau beobachtet.
Die gewonnenen Ergebnisse erlauben die Feststellung, dass die erfindungsgemässe HA-Re-Verbindung unter gekühlten Bedingungen (bei 4 °C ± 0,5 °C) in wässriger Lösung während mindestens 24 Monaten stabil ist. Diese Feststellung ergibt sich aus der Abwesenheit jeglichen merklichen hydrolytischen Abbaus.
Um die Möglichkeit auszuschliessen, dass ein hydrolytischer Abbau von Hyaluronsäure während der Veresterungsreaktion mit Rhein auftritt, wurde darüber hinaus ein Blindversuch mit dieser Reaktion ausgeführt. Insbesondere wurden die gleichen Bedingungen wie in der Reaktion der Bindung des Rheins an Hyaluronsäure benutzt, aber in Abwesenheit von Rhein. Insbesondere wurde Hyaluronsäure (100 mg) zu einer Mischung von Cyclohexan (10 ml), Dichlormethan (1 ml) und Triethylamin (1 ml) hinzugefügt, und die Reaktion erfolgte während 24 Stunden am Rückfluss (70 °C) in einer inerten Atmosphäre (N₂). Nachdem diese Zeit abgelaufen war, wurden die Reaktionslösungsmittel in einer Stickstoffatmosphäre entfernt. Die gewonnene Verbindung war in Wasser viel weniger löslich als Hyaluronsäure im nativen Zustand und nach 24-stündiger Dispergierung durch eine nicht bestimmbare Viskosität gekennzeichnet. Dies bedeutet, dass eine Depolymerisation ausgeschlossen werden kann, da dies zu Wasserlöslichkeit und somit zu einer Verringerung der Viskosität geführt haben würde.
Schliesslich wurde die hydrolytische Stabilität der gereinigten HA-Re-Verbindung der Erfindung, wie in Beispiel 3 gewonnen, in der Sterilisierung geprüft. Wie oben diskutiert, war gefunden worden, dass Fremdkörper in den Mustern der Verbindung der Erfindung auftreten, wenn nicht steriles Material und keine Konservierungsmittel verwendet werden. Insbesondere wurde eine 1-prozentige Lösung der HA-Re-Verbindung der Erfindung, die mit einer Dialysemembran gereinigt worden war, in einer phosphat-gepufferten Salzlösung bei pH 7,4 hergestellt. In Anbetracht der experimentellen Beweise, die zeigen, dass Hyaluronsäure ein hitzeempfindliches Molekül ist (Biomaterials 2002, 23: 4503–4513), wurde das so gewonnene Muster während 20 Minuten in einem Autoklaven bei 121 °C mit gesättigtem Dampf unter Druck sterilisiert. Das Muster wurde dann nochmals einer Dialyse in einer Dialysemembran unterworfen, um das etwaige Vorhandensein von Rhein in der dialysierten Flüssigkeit auszuwerten; keine Spur von Rhein wurde gefunden. Diese Ergebnisse lassen die Schlussfolgerung zu, dass das Muster gegenüber Heisssterilisierung hydrolytisch stabil ist.
2. Analyse der rheologischen Eigenschaften und der Spritzengängigkeit
Die Spritzengängigkeit der HA-Re-Verbindung der Erfindung wurde im Vergleich zu der von Hyaluronsäure von hohem und von niedrigem Molekulargewicht analysiert.
Insbesondere wurden die folgenden drei Muster hergestellt:

a) eine 1-%ige Lösung (Gew./Vol.) von hochmolekularer Hyaluronsäure (durchschnittliches Molekulargewicht etwa 1 200 000) in phosphat-gepufferter Salzlösung von pH 7,4;
b) eine 1-%ige Lösung (Gew./Vol.) von niedermolekularer Hyaluronsäure (durchschnittliches Molekulargewicht etwa 600 000) in phosphat-gepufferter Salzlösung von pH 7,4;
c) eine 1-%ige Lösung (Gew./Vol.) der HA-Re-Verbindung der Erfindung in phosphatgepufferter Salzlösung von pH 7,4.

Die Viskosität der Muster wurde dann mit einem Gerät VISCOMATE Modell VM-10A (Glasgefäss: 3 ml; ohne Rühren; Temperatur 20 ± 0,2 °C) gemessen, wobei die folgenden Werte erhalten wurden:

a) η = 78,4 mPa·s
b) η = 64,8 mPa·s
c) η = 47,9 mPa·s

Die gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass die HA-Re-Verbindung der Erfindung eine bessere Spritzengängigkeit als hochmolekulare wie auch niedermolekulare Hyaluronsäure im nativen Zustand hat, und zwar deshalb, weil eine 1-%ige Lösung (Gew./Vol.) der HA-Re-Verbindung der Erfindung eine geringere Viskosität als eine 1-%ige Lösung (Gew./Vol.) der niedermolekularen Hyaluronsäure hat, die wiederum eine geringere Viskosität als eine 1-%ige Lösung (Gew./Vol.) der hochmolekularen Hyaluronsäure hat.
Die beobachtete Verringerung der Viskosität, zusammengenommen mit dem Beweis, dass nach der Veresterungsreaktion keine Depolymerisation der Hyaluronsäure erfolgt ist, kann der kovalenten Wechselwirkung zwischen Rhein und Hyaluronsäure zugeschrieben werden.
Beispiel 6
Bewertung der pharmakologischen Aktivität der HA-Re-Verbindung der Erfindung in vitro Normale Knorpelbiopsien wurden von fünf Individuen (drei männlich, zwei weiblich, Durchschnittsalter 59,3 ± 5,1 Jahre) während Hüft- bzw. Oberschenkeloperationen im Ergebnis eines traumatisches Bruches gewonnen. Die für die Untersuchung ausgewählten Subjekte wiesen keine biochemischen oder klinischen Anzeichen für entzündliche oder Gelenkerkrankungen auf und hatten sowohl auf der makroskopischen als auch auf der mikroskopischen Ebene normalen Knorpel. Knorpel wurde unter sterilen Bedingungen gewonnen und sofort auf Knorpelzellenisolierung verarbeitet. Die Muster wurden zunächst von allen anhaftenden Muskel-, Binde- bzw. subchondralen Knochengeweben befreit, dann zu Fragmenten von 1 bis 3 mm³ zerkleinert und in phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS: phosphate-buffered saline) von pH 7,2 gespült. Einzelne Knorpelzellen wurden dann durch wiederholte enzymatische Aufschlüsse von 60 bis 75 Minuten bei 37 °C mit 0,25 % Trypsin, 400 E/ml Kollagenase I, 1000 E/ml Kollagenase II und 1 mg/ml Hyaluronidase freigesetzt. Die Zellen wurden vereinigt, ausgiebig in PBS gewaschen und mit hoher Dichte in 35-mm-Platten ausgesät (45 × 10³ Zellen/cm²). Das Kulturmedium war Coons modifiziertes Hams F12-Medium, ergänzt mit 10 % FCS (Mascia Brunelli, Mailand, Italien). Die Bewahrung des Knorpelzellen-Phänotyps wurde durch den Nachweis von Kollagen des Typs II nach Pepsinaufschluss des Kulturüberstandes abgeschätzt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch den Trypanblau-Ausschlusstest ausgewertet. Die Verdoppelung der Zellen wurde in regelmässigen Abständen durch Trypsinierung der Kultur und Quantifizierung der Zellenzahl bestimmt. Die Stimulationsversuche wurden ausgeführt, wenn die primären Kulturen Konfluenz erreichten (Passage 0). Die Zellen wurden dann während zwei Tagen in Gegenwart von Ascorbinsäure (50 μg/ml) kultiviert und danach während 20 Stunden in Abwesenheit oder in Gegenwart von (rh)IL-1β (5 ng/ml) inkubiert, und zwar mit bzw. ohne Zusatz verschiedener Konzentrationen von Hyaluronsäure (HA), der Verbindung der Erfindung (HA-Re) oder von Rhein.
Es ist berichtet worden, dass Hyaluronsäure wie auch Rhein wegen ihrer Fähigkeit, die Aktivität von Metall-Proteinasen (MMP), die am Knorpelabbau beteiligt sind, zu inhibieren, günstige Auswirkungen bei Osteoarthritis besitzen.
Wir führten Echtzeit-PCR-Assays durch, um die Wirkung verschiedener Verbindungen auf MMP-Expression in menschlichen Knorpelzellen zu untersuchen. Gesamt-RNA wurde aus den kultivierten menschlichen Knorpelzellen nach Herstelleranweisungen mit Trizol (Gibco BRL) extrahiert. Stränge von cDNA wurden mit 1 μg Gesamt-RNA unter Verwendung eines SuperScript First-Strand-Synthesesystems (Gibco BRL) synthetisiert. Die Primer waren wie folgt:
MMP-1 (Kollagenase), Sense: 5'-CTGAAGGTGATGAAGCAGCC-3';
Antisense: 5'-AGTCCAAGAGAATGGCCGAG-3 (Fragmentgrösse 428 Basenpaare);
MMP-3 (Stromelysin), Sense: 5'-CCTCTGATGGCCCAGAATTGA-3',
Antisense: 5'-GAAATTGGCCACTCCCTGGGT-3' (Fragmentgrösse 440 Basenpaare);
Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH),
Sense: 5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3';
Antisense: 5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCA (Fragmentgrösse 598 Basenpaare).
Die Amplifizierung erfolgte bei 60 bis 64 °C mit 45 Zyklen in einem iCycler Thermal Cycler (Bio-Rad Hercules, CA), und die Daten wurden mit iCycler iQ Optical System-Software analysiert. Die relative Expression in jedem Muster wurde mit einem mathematischen Verfahren berechnet, das auf den Echtzeit-PCR-Effizienzen beruht und GAPDH-mRNA als Referenz verwendet. Alle Muster wurden im Triplikat untersucht. Nach 45 Amplifizierungszyklen wurden die Zyklen-Schwellenwerte automatisch berechnet, und die Femtogramm Ausgangs-cDNA wurden aus einer Standardkurve berechnet, die einen Bereich von vier Grössenordnungen abdeckte. Sowohl die MMP- als auch die GAPDH-Standardkurven reichten von 1 bis 1000 Femtogramm je 25-μl-Reaktion. Die Verhältnisse der MMP zur GAPDH-Anfangsmenge wurden berechnet. Statistische Unterschiede zwischen den Ergebnissen für verschiedene Versuchsvariablen und relevante Kontrollen wurden mit dem Student-t-Test analysiert.
In 4 und 5 werden die in den RT-PCR-Versuchen gewonnenen Ergebnisse aufgeführt.
Alle Muster wurden im Triplikat untersucht. In jedem Versuch wurde die Veränderung der MMP-mRNA-Expression als x-fache Erhöhung im Vergleich zu der Expression von unbehandelten Zellen ausgedrückt. Mittlere und Standardabweichung von drei Versuchen werden gezeigt. Der gepaarte Student-t-Test wurde verwendet, um die Signifikanz der Auswirkungen der verschiedenen Behandlungen zu ermitteln. Statistische Unterschiede zwischen behandelten und Kontrollgruppen werden ebenfalls angeführt:
* = p < 0,01; ** = p < 0,001 (Student-t-Test).
Die IL-1-Behandlung führte zu einem dramatischen Anstieg der Expression von MMP-1 wie auch von MMP-3, was mit Literaturdaten übereinstimmt. In den in 4 angeführten Versuchen haben wir die Wirkung von HA bei der in der Literatur üblicherweise angeführten pharmakologischen Konzentration (1 mg/ml) mit der Wirkung von HA-Re (der Verbindung der Erfindung) bei den gleichen Konzentrationen (1 mg/ml) verglichen. Ähnliche Ergebnisse wurden über einen Bereich von 0,1 bis 1,5 HA-Konzentrationen erhalten. Die Einwirkung von HA bei der pharmakologischen Dosis (1 mg/ml) auf menschliche Knorpelzellen führte zu einer signifikanten Verhinderung der Induktion von MMP1 und MMP2 durch IL1 (4A und 4B). Überraschend ergaben ähnliche Dosen der HA-Re-Verbindung der Erfindung eine noch dramatischere Schutzwirkung, indem die MMP-Expression trotz der IL1-Exposition zum Basisniveau zurückgebracht wurde. In 5 werden die Ergebnisse von Versuchen angeführt, in denen die Wirkung von Rhein bei der pharmakologischen Dosis (10 μM) mit der Wirkung einer ähnlichen Dosis von HA-Re verglichen wurde. Es erweist sich wiederum, dass die HA-Re-Verbindung der Erfindung in einer Down-Regulation von IL1-induzierter MMP-Expression potenter als Re allein ist.
Beispiel 7
Eine zusätzliche Synthese von HA-Re gemäss vorliegender Erfindung wurde wie in Beispiel 2 ausgeführt, ausser dass 20 mg Hyaluronsäure und 23 mg Rhein-Säurechlorid verwendet wurden, was den stöchiometrischen Konzentrationen von Rhein und Hyaluronsäure auf der Grundlage der primären Alkoholgruppen der Hyaluronsäure entspricht.
6 zeigt das ¹³C-NMR-Spektrum der so gewonnenen HA-Re-Verbindung gemäss vorliegender Erfindung, in dem ein charakteristischer Peak bei 175 ppm, der für Esterfunktionen spezifisch ist, deutlich erscheint.
7 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum der so gewonnenen HA-Re-Verbindung der vorliegenden Erfindung, in dem charakteristische Peaks zwischen 7 und 8 ppm, die für aromatische Ringe von Rhein spezifisch sind, deutlich erscheinen.
Aus diesen beiden NMR-Spektren geht daher deutlich hervor, dass in der HA-Re-Verbindung gemäss vorliegender Erfindung Rhein die Alkoholgruppen von Hyaluronsäure verestert.

Claims

Auf Hyaluronsäure basierende Verbindung oder eines ihrer Salze, in denen die Alkoholgruppen der Hyaluronsäure mit Rhein als solchem oder in derivatisierter Form verestert sind.
Verbindung gemäss Anspruch 1, in der Rhein mindestens 5 % der veresterbaren Alkoholgruppen der Hyaluronsäure verestert.
Verbindung gemäss Anspruch 2, in der Rhein zwischen 5 % und 50 % der veresterbaren Alkoholgruppen der Hyaluronsäure verestert.
Verbindung gemäss Anspruch 3, in der Rhein zwischen 5 % und 20 % der veresterbaren Alkoholgruppen der Hyaluronsäure verestert.
Verbindung gemäss Anspruch 4, in der Rhein 10 % der veresterbaren Alkoholgruppen der Hyaluronsäure verestert.
Natriumsalz der Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung oder eines ihrer Salze nach einem der Ansprüche 1 bis 6, das eine Umsetzung des Säurechlorids von Rhein als solchem oder in einer derivatisierten Form mit Hyaluronsäure umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, bei dem das Säurechlorid von Rhein und die Hyaluronsäure in einer solchen Menge vorliegen, dass das Prozentverhältnis zwischen den Millimolen des Säurechlorids von Rhein und den Milliequivalenten der veresterbaren Alkoholeinheiten der Hyaluronsäure mindestens 5 % beträgt.
Verfahren nach Anspruch 8, in dem das Prozentverhältnis von 5 % bis 50 % reicht.
Verfahren nach Anspruch 9, in dem das Prozentverhältnis von 5 % bis 20 % reicht.
Verfahren nach Anspruch 10, in dem das Prozentverhältnis 10 % beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, das die folgenden Schritte umfasst: a) Herstellen einer Aufschlämmung von Hyaluronsäure in einem aprotischen, nicht polaren Lösungsmittel; b) Hinzufügen des Säurechlorids von Rhein, in einem aprotischen, nicht polaren Lösungsmittel aufgelöst, und eines Wasserstoffionenakzeptors; c) Weiterrühren der Mischung unter Rückfluss während einer Zeit, die dafür genügt, die Veresterungsreaktion ablaufen zu lassen; und d) Abdampfen des Lösungsmittels.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem das aprotische, nicht polare Lösungsmittel des Schrittes (a) Cyclohexan ist.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, bei dem der Wasserstoffionenakzeptor im Schritt (b) NEt₃ ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, bei dem im Schritt (c) die Reaktion während mindestens 20 Stunden am Rückfluss belassen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 15, bei dem das Säurechlorid von Rhein mittels eines Verfahrens gewonnen wird, das die folgenden Schritte umfasst: a') Herstellen einer Aufschlämmung von Rhein in einem aprotischen, nicht polaren Lösungsmittel; b') Hinzufügen einer solchen Menge von SOCl₂, dass ein molares Verhältnis zwischen SOCl₂ und Rhein von mehr als 10 erhalten wird; c') Weiterrühren der Reaktion am Rückfluss in einer inerten Atmosphäre während einer Zeit, die für die Bildung des Säurechlorids von Rhein genügt; und d') Entfernen des Lösungsmittels und des Überschusses von nicht umgesetztem SOCl₂ durch Destillation.
Verfahren nach Anspruch 16, bei dem das aprotische, nicht polare Lösungsmittel des Schrittes (a') ein chloriertes Lösungsmittel ist.
Verfahren nach Anspruch 17, bei dem das chlorierte Lösungsmittel CH₂Cl₂ ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, bei dem im Schritt (c') die Reaktion während mindestens drei Stunden am Rückfluss belassen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 19, das weiter einen abschliessenden Reinigungsschritt umfasst.
Verfahren nach Anspruch 20, bei dem der Reinigungsschritt unter Verwendung einer Dialysemembran ausgeführt wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die Verbindung oder eines ihrer Salze nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in Kombination mit geeigneten Vehikeln und/oder Verdünnungsmitteln umfassend.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22, die eine für lokoregionale Verabreichung geeignete Formulierung besitzt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 23, die für eine Verabreichung mittels intraartikulärer Infiltration geeignet ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 23, die für eine ophthalmische Verabreichung geeignet ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 23, die für eine topische Verabreichung geeignet ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22 bis 26 in Gestalt einer wässrigen Dispersion.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 27, in der die Dispersion in einer Pufferlösung mit einem pH von 7,4 vorliegt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 27 oder 28, in der die Verbindung in einer Konzentration vorliegt, die von 0,1 % bis 2 % (Gew./Vol.) reicht.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 29, in der die Verbindung in einer Konzentration von 1 % (Gew./Vol.) vorliegt.
Medizinisches Produkt zur humanen oder veterinären Anwendung, aus einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22 bis 30 gebildet.
Medizinische Vorrichtung zur humanen oder veterinären Anwendung, aus einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22 bis 30 gebildet.
Verwendung einer Verbindung oder eines ihrer Salze nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von entzündlichen Krankheiten.
Verwendung nach Anspruch 33, bei der die entzündlichen Krankheiten entzündliche Gelenkerkrankungen sind.
Verwendung einer Verbindung oder eines ihrer Salze nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Medikaments für die Gewebereparatur, bei der das Gewebe Knorpel oder Haut ist.
Verwendung einer Verbindung oder eines ihrer Salze nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung von Biomaterialien.