DE69931038T2

DE69931038T2 - Neue polysaccharidderivate, verfahren zu ihrer herstellung und medizinische zusammensetzungen die diese als aktives bestandteil enthalten

Info

Publication number: DE69931038T2
Application number: DE69931038T
Authority: DE
Inventors: Seigou Usuki; Yutaka Yokohama-shi KARIYA
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1998-02-26
Filing date: 1999-02-26
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2019-02-27
Also published as: US6498246B1; EP1059304B1; DE69931038D1; WO1999043714A1; EP1059304A1; EP1059304A4

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Glycosaminoglycanderivate mit einer das Neuriten(Aus-)Wachstum unterstützenden Aktivität und einer Sialidase-inhibierenden Aktivität, ein Verfahren zur Herstellung derselben und eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend das Glycosaminoglycanderivat als Wirkstoff.
STAND DER TECHNIK
Eine neuronale Erkrankung wird durch die Wachstumsinhibition neuraler Zellen erzeugt, durch eine Induktion einer Nekrose neuraler Zellen, ausgelöst durch die Unfähigkeit der Zellen, aufgrund einer Reduktion der Zuckerzufuhr oder einer Inhibition des Energiemetabolismus in den Zellen als Ergebnis einer Ischämie oder durch Inhibition der Neurotransmission aufgrund eines Abbaus von Neurotransmittern erhalten zu bleiben. Dementsprechend wurde die Behandlung dieser Erkrankung mit dem Ziel des Erhalts des Wachstums neuraler Zellen, einer Verhinderung einer Ischämie neuraler Zellen oder eines Erhalts des Energiemetabolismus in den neuralen Zellen durchgeführt. D.h., es wird angenommen, dass die grundlegenden Maßnahmen für die Behandlung der neuronalen Erkrankung die Verabreichung neurotropher Faktoren als Substanzen mit einer Neuralzellwachstumsaktivität (z.B. Nervenwachstumsfaktor: NGF, hirnabgeleiteter neurotropher Faktor: BDNF, ziliärer neurotropher Faktor: CNTF, Fibroblastenwachstumsfaktor: FGF, usw.) von außen oder die Unterstützung der Synthese der neurotrophen Faktoren zur Verhinderung einer Ischämie der neuralen Zellen und einer Reduktion des Energiemetabolismus in den neuralen Zellen, ausgelöst durch eine überschüssige Produktion von Sorbit, gebildet durch eine Aktivität der Aldosereduktase, durch Anwendung eines Aldoseredukaseinhibitors und der Erhalt der Transmission neuraler Zellen durch Verhinderung eines Abbaus von Acetylcholin durch Verabreichung einer Acetylcholinesterase sind. Es gibt jedoch Probleme, wie eine Antigenizität aufgrund der Reinheit der zu verabreichenden Substanz, Nebenwirkungen, die durch die Inhibition der Enzymaktivität ausgelöst werden, eine Toxizität der Substanz per se, die verabreicht werden soll und ähnliches.
Es ist auch bekannt, dass Glycosaminoglycan eine Aktivität zur Beschleunigung der Neuritenwachstumsunterstützung aufweist (J. Cell Physiol, 135: 293–300 (1988)). Es ist weiterhin bekannt, dass Heparin und seine Derivate, durch Perjodatoxidations-Reduktions-Heparin und persulfatiertes Heparin eine Neuritenwachstums-unterstützende Aktivität aufweisen und für die Behandlung traumatischer, ischämischer und toxischer Neuropathie (JP-A-6-157322) effektiv sind, jedoch wurden Substanzen mit ausreichender Aktivität um diese Erkrankungen zu inhibieren, um als Medikamente angewandt zu werden, bis jetzt noch nicht erhalten.
Andererseits ist bekannt, dass Sialidase (Neuraminidase) -Inhibitoren, wie z.B. GS4104 (WO 96/26933), Zanamivir (4-Guanidino-Neu4Ac2en): WO 91/16320, WO 94/07885) und ähnliche als antivirale Mittel effektiv ist, insbesondere als Mittel zur Behandlung der Influenza.
Da Heparin und seine Derivate biologische Substanzen sind, haben sie eine niedrige Antigenizität, jedoch sind ihre Verwendung und Konzentration bei der Verwendung als Medikamente aufgrund ihrer hohen antikoagulierenden Aktivität stark begrenzt. Wenn Heparin dem lebenden Körper verabreicht wird, wird allgemein eine Blutungsaktivität aufgrund der hohen antikoagulierenden Aktivität zu einem ernsten Problem. Dementsprechend wird eine neue Substanz mit einer niedrigen antikoagulierenden Aktivität und einer verstärkten die Neuropathie verbessernden Wirkung erwartet.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Um diese Probleme zu lösen haben die vorliegenden Erfinder intensive Studien mit dem Ziel durchgeführt, eine Substanz mit einer niedrigen antikoagulierenden Aktivität auf Blut und einer ausgezeichneten die Neuropathie verbessernden Wirkung zu erhalten und haben als Ergebnis ihrer Mühen festgestellt, dass Glycosaminoglycanderivate mit einer spezifizierten Struktur eine hohe Neuritenwachstums-unterstützende Aktivität aufweisen, nämlich eine die Neuropathie verbessernde Aktivität und haben die vorliegende Erfindung dadurch vervollständigt, dass bestätigt wurde, dass die antikoagulierende Aktivität dieser Substanz deutlicher reduziert ist als bei Heparin. D.h. es wurde festgestellt, dass neue Glycosaminoglycanderivate mit einer sich wiederholenden Einheitsstruktur von zwei Sacchariden von Hexosamin und Hexuronsäure als Grundgerüststruktur, worin eine Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen der Hexuronsäure an den 2- und 3-Stellungen als konstituierendes Monosaccharid teilweise gespalten ist und mindestens ein Teil der ungespaltenen Hexuronsäure keine Sulfatgruppe an der 2-Stellung aufweist, eine niedrige antikoagulierende Aktivität und eine ausgezeichnete ein Neuritenwachstum-unterstützende Aktivität aufweist. Eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einer ausgezeichneten Wirkung zur Verbesserung der Neuropathie unter Verwendung dieser Eigenschaften kann bereitgestellt werden. Zusätzlich haben die gegenwärtigen Erfinder, basierend auf der Tatsache, dass eine Sialidaseaktivität erhöht ist und Gangliosid, bekanntlich in bezug zu dem Erhalt und der Beschleunigung der neurotrophen Faktoraktivität stehend, auf der Zellmembran reduziert ist, wenn ein Zelltod und eine Rückbildung von Neuriten auftreten, weitere Untersuchungen durchgeführt und festgestellt, dass das neue Glycosaminoglycanderivat eine starke Sialidaseinhibierende Aktivität aufweist, um einen Sialidaseinhibitor bereitzustellen unter Verwendung dieser inhibierenden Aktivität der Glycosaminoglycanderivate.
Die erste Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft neue Glycosaminoglycanderivate mit den folgenden Eigenschaften (a), (b) und (c) und umfassend mindestens eine Struktur, wie dargestellt durch die allgemeine Formel (1), beschrieben in (d) pro Molekül einer Grundgerüststruktur, die durch eine sich wiederholende Einheitsstruktur aus Hexosamin und Hexuronsäure gebildet wird:

(a) Mol% von 2-Deoxy-2-sulfamino-4-O-(4-deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronsäure)-6-O-sulfo-D-glucose (hiernach auch bezeichnet als "ΔDiHS-tri(U,6,N)S"), von 0 bis 10%, mol% von 2-Deoxy-2-sulfamino-4-O-(4-deoxy-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronsäure)-6-O-sulfo-D-glucose (hiernach auch bezeichnet als "ΔDiHS-di(6,N)S") von 95 bis 70% und mol% von 2-Deoxy-2-sulfamino-4-O-(4-deoxy-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronsäure)-D-glucose (hiernach auch bezeichnet als "ΔDiHS-NS") von 5 bis 20% in einer Disaccharidzusammensetzung, erhalten durch eine Disaccharidanalyse durch Kombination eines Abbaus durch ein Glycosaminoglycanabbauenzym mit einer Analyse mit Hochleistungsflüssigchromatographie,
(b) eine aktivierte Teilthromboplastinzeit (APTT), gemessen durch Zugabe zu Standardblutplasma mit einer Endkonzentration von 3 μg/ml von 50 Sekunden oder weniger,
(c) ein gewichtsgemitteltes Molekulargewicht von 9.000 bis 13.000 Da (Dalton) und
(d) allgemeine Formel (1):
(worin R¹ H oder SO₃H repräsentiert und R² repräsentiert COCH₃ oder SO₃H).

Die zweite Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines neuen Glycosaminoglycanderivats mit den Eigenschaften (a), (b) und (c) und der in (d) definierten spezifizierten Struktur, umfassend die folgenden Schritte (i) und (ii) wie unten beschrieben; und die dritte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Glycosaminoglycanderivat als Wirkstoff:

(i) ein Schritt, wobei ein sulfatisiertes Glycosaminoglycan mit einer sich wiederholenden Einheitsstruktur von Hexosamin und Hexuronsäure als Grundgerüst einer Spaltungsbehandlung unterzogen wird, um zwischen nur den Kohlenstoffatomen an 2- und 3-Position von mindestens einem Teil der Hexuronsäure ohne Sulfatgruppe an der 2-Position im Grundgerüst zu spalten und
(ii) ein Schritt, wobei eine Desulfatationsbehandlung an dem Produkt von Schritt (i) durch ein Desulfatationsverfahren, das dazu in der Lage ist, spezifisch die Sulfatgruppe an der 2-Position der Hexuronsäure zu entfernen durchgeführt wird, um 90% oder mehr der Sulfatgruppen der gesamten Hexuronsäure mit einer Sulfatgruppe an der 2-Position zu desulfatisieren.

AUSFÜHRUNGSFORMEN ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird weiter im Detail im folgenden beschrieben.
SUBSTANZ DER ERFINDUNG:
Wie oben beschrieben, ist die Substanz der vorliegenden Erfindung ein neues Glycosaminoglycanderivat, das die Eigenschaften (a), (b) und (c) aufweist und außerdem die bestimmte in (d) definierte Struktur.
Die hier verwendete Bezeichnung "Hexosamin" bedeutet ein Monosaccharid, worin die 2-Position der Hexose eine Aminogruppe, eine Acetylaminogruppe oder eine Sulfaminogruppe aufweist und die 6-Position-Hydroxylgruppe optional sulfatiert ist, die Bezeichnung "Hexuronsäure" bedeutet ein Monosaccharid, worin das Kohlenstoffatom an 6-Position der Hexose eine Carboxylgruppe bildet und die Hydroxylgruppe an 2-Position optional sulfatiert ist, die Bezeichnung "Glycosaminoglycan" bedeutet ein Polysaccharid, das eine Struktur aufweist, die durch sich wiederholende Einheiten von Hexosamin und Hexuronsäure als Grundgerüststruktur gebildet wird und die Bezeichnung "sulfatiertes Glycosaminoglycan" bedeutet ein Mitglied der Glycosaminoglycane, das ein Hexosamin oder Hexuronsäure mit einer Sulfatgruppe als konstituierendes Monosaccharid aufweist und ist ein Polysaccharid, das mindestens eine Hexuronsäure ohne Sulfatgruppe an 2-Position als konstituierendes Monosaccharid aufweist.
Die Disaccharidzusammensetzung (a) des Glycosaminoglycanderivats wird auch aus den Werten berechnet, die durch ein Disaccharidanalyseverfahren gemessen werden, das später im Testverfahren 1 der Beispiele beschrieben wird und das gewichtsgemittelte Molekulargewicht (c) ist ein Wert, der durch ein Molekulargewichtsmessverfahren gemessen wird, das im Testverfahren 2 der Beispiele beschrieben wird. Außerdem ist der APTT von (b) ein Wert, der durch ein APTT-Messverfahren, wie beschrieben im Testverfahren 4 der Beispiele, gemessen wird.
Die in (a) definierte Disaccharidzusammensetzung zeigt ein Verhältnis von jedem ungesättigten Disaccharid mit einer bestimmten Struktur, berechnet durch Definition der Gesamtmenge der ungesättigten Disaccharide, repräsentiert durch die folgende allgemeine Formel (7) als 100% (Gesamt-mol% von 2-Acetamido-2-deoxy-4-O-(4-deoxy-α-L-threo-hexenopyranosyluronsäure)-D-glucose (hiernach auch bezeichnet als "ΔDiHS-OS"), 2-Acetamido-2-deoxy-4-O-(4-deoxy-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronsäure)-6-O-sulfo-D-glucose (hiernach auch bezeichnet als "ΔDiHS-6S"), 2-Deoxy-2-sulfamino-4-O-(4-deoxy-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronsäure)-D-glucose (hiernach auch bezeichnet als "ΔDiHS-NS"), 2-Acetamido-2-deoxy-4-O-(4-deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronsäure)-D-glucose (hiernach auch bezeichnet als "ΔDiHS-US"), 2-Deoxy-2-sulfamino-4-O-(4-deoxy-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronsäure)-6-O-sulfo-D-glucose (hiernach auch bezeichnet als "ΔDiHS-di(6,N)S"), 2-Deoxy-2-sulfamino-4-O-(4-deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronsäure)-D-glucose (hiernach auch bezeichnet als "ΔDiHS-di(U,N)S"), 2-Acetamido-2-deoxy-4-O-(4-deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronsäure)-6-O-sulfo-D-glucose (hiernach auch bezeichnet als "ΔDiHS-di(U,6)S") und 2-Deoxy-2-sulfamino-4-O-(4-deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronsäure)-6-O-sulfo-D-glucose (ΔDiHS-tri(U,6,N)S), identifizierbar durch die Disaccharidanalyse, wie beschrieben in Testverfahren 1, worin ein Enzymverdau und eine Hochleistungsflüssigchromatographie in Kombination verwendet werden und der Wert reflektiert die Position und Anzahl der Sulfatgruppen des Glycosaminoglycanderivats vor dem Enzymverdau.
TABELLE 1
Die durch die obigen Abkürzungen dargestellten Strukturen können auch wie folgt dargestellt werden:
ΔDiHS-OS: ΔHexA1→4GlcNAc, ΔDiHS-6S: ΔHexA1→4GlcNAc(6S), ΔDiHS-NS: ΔHexA1→4GlcNS, ΔDiHS-US: ΔHexA(2S)1→4GlcNAc, ΔDiHS-di(6,N)S: ΔHexA1→4GlcNS(6S), ΔDiHS-di(U,N)S: ΔHexA(2S)1→4GlcNS, ΔDiHS-di(U,6)S: ΔHexA(2S)1→4GlcNAc(6S) und ΔDiHS-tri(U,6,N)S: ΔHexA(2S)1→4GlcNS(6S).
In den obigen Formeln bedeutet ΔHexA eine ungesättigte Hexuronsäure, GlcNAc bedeutet N-Acetylglucosamin, GlcNS bedeutet N-sulfatiertes Glucosamin und der Teil in Klammern zeigt die Bindungsposition der Sulfatgruppe.
Das ungesättigte Disaccharid mit der Struktur der allgemeinen Formel (7), gebildet im Disaccharidanalyseverfahren, wird aus einer Grundgerüststruktur (A)–(B) in der allgemeine Formel (2) gebildet, worin die Hexuronsäure der allgemeinen Formel (3) oder (4) und das Hexosamin der allgemeinen Formel (6), die die Grundgerüststruktur von Glycosaminoglycan bilden, und analysiert werden sollen, aneinander gebunden sind.
Die Glycosaminoglycanderivate der vorliegenden Erfindung sind neue Polysaccharide mit bestimmten physikalischen Eigenschafen, die von Glycosaminoglycan abstammen, werden jedoch zur besseren Übersichtlichkeit als Glycosaminoglycanderivate beschrieben.
Die Glycosaminoglycanderivate der vorliegenden Erfindung sind sulfatierte Polysaccharide, worin in der Disaccharidzusammensetzung, berechnet aus den Werten, gemessen durch die Disaccharidanalyse, wie beschrieben in Testverfahren 1, die mol% von ΔDiHS-tri(U,6,N)S 0 bis 10 beträgt, vorzugsweise 0 bis 5% und noch bevorzugter 2 bis 4%, die mol% von ΔDiHS-di(6,N)S bei 95 bis 70%, vorzugsweise 90 bis 80% und besonders bevorzugt 82 bis 87 liegen, die mol% von ΔDiHS-NS bei 5 bis 20%, vorzugsweise 10 bis 15% und noch bevorzugter 11 bis 14% liegen und das gewichtsgemittelte Molekulargewicht als Wert, gemessen durch das Molekulargewichtsmessverfahren, wie beschrieben in Testverfahren 2, 9.000 bis 13.000 Da und noch bevorzugter 10.000 bis 12.000 Da beträgt.
Außerdem sind die Glycosaminoglycanderivate der vorliegenden Erfindung Glycosaminoglycanderivate, die eine Struktur aufweisen, die durch eine sich wiederholende Einheit aus Hexosamin und Hexuronsäure als Grundgerüststruktur gebildet wird. Beispiele für das Hexosamin beinhalten Glycosamin, Galactosamin und Mannosamin und Glucosamin wird bevorzugt. Es wird bevorzugt, dass eine oder beide Aminogruppen und die Hydroxylgruppe an der 6-Position von Hexosamin sulfatiert sind, nämlich N-sulfatiert und/oder 6-O-sulfatiert, obwohl es kein Hindernis ist, wenn die Hexosamingruppe keine Sulfatgruppe hat. Beispiele für die Hexuronsäure beinhalten D-Glucuronsäure, L-Iduronsäure und ähnliches. Es wird bevorzugt, dass ein Teil der Hexuronsäure zwischen den Kohlenstoffatomen an der 2- und 3-Stellung gespalten ist, vorzugsweise ist der gespaltene Bereich nach einer oxidativen Spaltungsreaktion reduziert und dass ein Teil oder der gesamte Bereich der Hydroxylgruppe an der 2-Stellung der ungespaltenen Hexuronsäure nicht mit einer Sulfatgruppe substituiert ist. Zusätzlich liegt eine oder mehr der Struktureinheiten, repräsentiert durch die allgemeine Formel (1), worin die gespaltene Hexuronsäure an Hexosamin in der sich wiederholenden Einheit der Grundgerüststruktur gebunden ist in einem Molekül des Glycosaminoglycanderivats vor.
Außerdem haben die Glycosaminoglycanderivate der vorliegenden Erfindung die Eigenschaft, dass eine aktivierte Teilthromboplastinzeit (APTT), gemessen durch Zugabe zu Standardblutplasma mit einer Endkonzentration von 3 μg/ml 50 Sekunden oder weniger beträgt. Die Glycosaminoglycanderivate der vorliegenden Erfindung haben eine solche Eigenschaft, die durch die folgende allgemeine Formel (2) repräsentiert werden kann: HO-((A)-(B))_n-H (2)
In dieser Formel repräsentiert (A) einen Glucoronsäurerest, repräsentiert durch die folgende allgemeine Formel (3), einen Iduronsäurerest, repräsentiert durch die folgende allgemeine Formel (4) oder einen gespaltenen Hexuronsäurerest, repräsentiert durch die folgende allgemeine Formel (5):
und (B) repräsentiert ein Hexosaminderivatrest, repräsentiert durch die folgende allgemeinen Formel (6):
In den allgemeinen Formeln (3) bis (6) bedeuten R¹ und R³ jeweils unabhängig H oder SO₃H und R² bedeutet unabhängig COCH₃ oder SO₃H.
Außerdem liegt ein Hexosaminrest, repräsentiert durch die allgemeine Formel (6), worin mindestens einer von R¹ und R² SO₃H ist in dem Molekül des Glycosaminoglycanderivats der vorliegenden Erfindung, repräsentiert durch die allgemeine Formel (2), vor.
Zusätzlich ist in der allgemeinen Formel (2) n eine ganze Zahl, die 15 ≤ n ≤ 40, vorzugsweise 20 ≤ n ≤ 30 entspricht und mindestens eins von (A) ist ein Rest der allgemeinen Formel (5).
Die Glycosaminoglycanderivate der vorliegenden Erfindung (hiernach auch bezeichnet als "erfinderische Substanzen") sind nicht besonders begrenzt, so lang sie Derivate einer Zuckerkette unter Verwendung von Hexosamin und Hexuronsäure als Grundgerüststruktur sind und eine Sulfatgruppe aufweisen und so lange sie den Eigenschaften von (a) bis (d) entsprechen. Derivate von Heperansulfat oder Heparin, insbesondere Derivate von Heparin werden jedoch bevorzugt. Die erfinderischen Substanzen haben eine Struktur, worin ein Teil der Hexuronsäure zwischen den Kohlenstoffatomen an 2- und 3-Stellung gespalten ist. Außerdem beträgt das Sulfatierungsverhältnis der Hydroxylgruppe an 2-Stellung der ungespaltenen Hexuronsäure als Konstituent der erfinderischen Substanzen weniger als 10%, vorzugsweise weniger als 5%. Die Glycosaminoglycanderivate der vorliegenden Erfindung können durch die allgemeine Formel (2) repräsentiert werden, worin n 15 ≤ n ≤ 40, vorzugsweise 20 ≤ n ≤ 30 ist, sie sind also Polysaccharide mit 30 bis 80 Zuckerresten, vorzugsweise 40 bis 60 Zuckerresten. Da zusätzlich die antikoagulierende Aktivität der Substanzen niedrig ist, wird es bevorzugt, dass die aktivierte Teilthromboplastinzeit (APTT) gemessen durch ihre Zugabe zu einer Standardblutplasmaprobe, genommen von einer gesunden Person mit einer Endkonzentration von 3 μg/ml 50 Sekunden oder weniger beträgt.
Bei dem Neuritenwachstums-unterstützenden Aktivitätstest, wie beschrieben in den Beispielen, worin primäre Kulturzellen des zerebralen Kortex von Wistar-Ratten verwendet werden wird es bevorzugt, dass die Glycosaminoglycanderivate der erfinderischen Substanzen eine 1,5-mal oder höhere Aktivität aufweisen als im Fall von Standardheparin, wenn die Kultivierung durch Zugabe der Substanzen mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml bis 10 μg/ml durchgeführt wird.
Zusätzlich wird es bevorzugt, dass die erfinderischen Substanzen eine deutlich stärkere Sialidaseinhibitionsaktivität, insbesondere eine Influenzavirus-Sialidaseinhibitionsaktivität aufweisen als bekannte Sialidaseinhibitoren und als Standardheparin, wenn dies durch das in den Beispielen beschriebene Verfahren gemessen wird.
PRODUKTIONSVERFAHREN DER ERFINDUNG
Das Produktionsverfahren der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Erzeugung von Glycosaminoglycanderivaten mit einer sich wiederholenden Einheitsstruktur von Hexosamin und Hexuronsäure als Grundgerüststruktur, worin ein Teil der Hexuronsäure zwischen den Kohlenstoffatomen an der 2- und 3-Position gespalten ist, vorzugsweise ist die gespaltene Region nach Spaltung durch eine oxidative Spaltungsreaktion reduziert und der größere Teil der Sulfatgruppe in 2-Position der ungespaltenen Hexuronsäure ist desulfatiert, das die folgenden Schritt (i) und (ii) umfasst:

(i) ein Glycosaminoglycan mit einer sich wiederholenden Einheitsstruktur von Hexosamin und Hexuronsäure als Grundgerüst wird einer Spaltungsbehandlung unterzogen, um zwischen nur den Kohlenstoffatomen an 2- und 3-Position von mindestens einem Teil der Hexuronsäure ohne Sulfatgruppe an der 2-Position im Grundgerüst zu spalten und
(ii) Durchführen einer Desulfatationsbehandlung an dem Produkt von Schritt (i) durch ein Desulfatationsverfahren, das dazu in der Lage ist, spezifisch die Sulfatgruppe an der 2-Position der Hexuronsäure zu entfernen, um 90% oder mehr der Sulfatgruppen der gesamten Hexuronsäure mit einer Sulfatgruppe an der 2-Position zu desulfatisieren.

1. SULFATIERTES GLYCOSAMINGLYCAN (MATERIAL)
Das in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete Glycosaminoglycan ist ein Polysaccharid mit einer sich wiederholenden Einheitsstruktur von Hexosamin und Hexuronsäure als Grundgerüststruktur und enthaltend mindestens eine Hexuronsäure mit keiner Sulfatgruppe an der 2-Position als konstituierendes Monosaccharid. Bevorzugte Beispiele für das Glycosaminoglycan beinhalten Heparin, Heparansulfat und ähnliche und Heparin wird besonders bevorzugt, da das Sulfatierungsverhältnis der Hydroxylgruppe an der 2-Position von Hexuronsäure hoch ist und da die Spaltung von Hexuronsäure im folgenden Schritt (i) in geeigneter Weise kontrolliert werden kann.
2. SCHRITT (i): SPALTUNGSBEHANDLUNG DER HEXURONSÄURE
Die in Schritt (i) des Verfahrens der vorliegenden Erfindung beschriebene "Spaltungsbehandlung" ist nicht besonders begrenzt, so lang es sich um eine Behandlung handelt um spezifisch nur zwischen den Kohlenstoffatomen an 2- und 3-Stellung der Hexuronsäure ohne Sulfatgruppe an der 2-Stellung unter den konstituierenden Monosacchariden mit sulfatierten Glycosaminoglycan zu spalten. Beispiele hierfür beinhalten eine Oxidations-Reduktions-Behandlung. Diese Oxidations- Reduktions-Behandlung wird durchgeführt, indem zwischen den Kohlenstoffatomen an 2- und 3-Stellung der spezifizierten Hexuronsäure durch eine Oxidationsreaktion unter Verwendung eines Oxidationsmittels gespalten wird, um ein oxidativ gespaltenes Reaktionsprodukt zu erhalten und dann durch Reduktion der in der gespaltenen Region der Hexuronsäure gebildeten Aldehydgruppen durch eine Reduktionsreaktionsbehandlung. Das Oxidationsmittel ist nicht besonders begrenzt, so lange es sich um eine Substanz handelt, die die Aufgabe dieser Reaktion erzielen kann. Beispiele hierfür beinhalten ein Perjodat, Wasserstoffperoxid und ein Perjodat wird besonders bevorzugt. Beispiele für das Perjodat beinhalten Perjodsäurealkalimetallsalze, wie z.B. Natriumperjodat, Kaliumperjodat und ähnliche und Natriumperjodat wird bevorzugt.
Wenn eine Oxidations-Reduktions-Reaktionsbehandlung als Spaltungsbehandlung durchgeführt wird, wird die Oxidationsreaktion beispielsweise in einer Lösung, enthaltend Natriumperjodat mit einer Konzentration von 0,01 bis 0,3 M, vorzugsweise 0,05 bis 0,2 M und das sulfatierte Glycosaminoglycan in einer Konzentration von 0,5 bis 10%, vorzugsweise 1 bis 7% bei einem pH von 3 bis 7, vorzugsweise 4 bis 5 und eine Behandlungstemperatur von 0 bis 37°C, vorzugsweise 0 bis 10°C, noch bevorzugter 4°C für mindestens 1 Tag, vorzugsweise 3 Tage, durchgeführt. Nach der Oxidationsreaktion wird überschüssiges Natriumperjodat durch eine reduzierende Reaktion durch Zugabe von 100 bis 500 mM Ethylenglycol oder Glycerin abgebaut. Danach kann ein oxidatives Spaltungsreaktionsprodukt von Hexuronsäure erhalten werden, indem eine Dialyse durchgeführt wird, durch weitere Verwendung eines Gefriertrocknens oder eines Ethanolpräzipiationsverfahrens, je nach Bedarf.
Danach wird die Oxidations-Reduktions-Reaktionsbehandlungs von Hexuronsäure durch weitere Reduktion der in der gespaltenen Region der Hexuronsäure durch die Perjodsäureoxidation gebildeten Aldehydgruppen vervollständigt. Die Reduktion von Aldehydgruppen kann unter Verwendung eines Reduktionsmittels, wie z.B. Alkalimetallborhydrid oder Lithiumaluminiumhydrid durchgeführt werden und das Reduktionsmittel ist vorzugsweise ein Alkalimetallborhydrid, besonders bevorzugt Natriumborhydrid. Wenn Natriumborhydrid als Reduktionsmittel verwendet wird, wird es bevorzugt die Reaktion beispielsweise in einer Lösung mit einem pH von 8,5 bis 9,5, enthaltend 0,1 bis 0,5 M, vorzugsweise 0,2 M Natriumborhydrid und 1 bis 20%, vorzugsweise 5 bis 10% des oxidativen Spaltungsreaktionsprodukts (G/V) bei 4°C für 3 Stunden durchzuführen. Es wird bevorzugt ein Natriumsalz des Perjodsäure-Oxidations-Reduktions-Reaktionsprodukts durch weiteren Abbau von überschüssigem Natriumborhydrid durch Einstellung der Reaktionslösung auf einen pH von 4 bis 5 und dann Beendigung der Reduktionsreaktion durch Dialyse gegen destilliertes Wasser zu erhalten.
Insbesondere wenn Heparin als Material verwendet wird, wird es bevorzugt die Spaltungsbehandlung durch eine Oxidations-Reduktions-Reaktionsbehandlung unter Verwendung von Perjodat und Alkalimetallborhydrid durchzuführen und ein Perjodsäure-Oxidations-Reduktions-Heparin wird durch diese Behandlung als Perjodsäure-Oxidations-Reduktionsprodukt von Heparin erhalten.
Das Hexuronsäurespaltungsprodukt von dem durch die Behandlung um spezifisch Hexuronsäure unter den konstituierenden Monosacchariden des sulfatierten Glycosaminoglycans zu spalten, erhaltenen sulfatierten Glycosaminoglycans wird dem darauffolgenden Schritt (ii) unterzogen, worin die Sulfatgruppe an 2-Stellung von mindestens einem Teil der Hexuronsäure desulfatiert wird.
3. SCHRITT (ii): DESULFATIERUNGSBEHANDLUNG
Die im Schritt (ii) des Verfahrens der vorliegenden Erfindung beschriebene "Desulfatationsbehandlung" kann ohne besondere Begrenzung durchgeführt werden, so lange es sich um eine Behandlung (selektive Desulfatationsbehandlung) handelt, bei der die Sulfatgruppe an 2-Stellung der Hexuronsäure mit einer Sulfatgruppe an 2-Stellung selektiv desulfatiert wird, was das "Hexuronsäurespaltungsprodukt von sulfatiertem Glycosaminoglycan", gebildet in Schritt (i), bildet. Wenn eine vollständige Desulfatierung gewünscht wird, wird es bevorzugt ein Verfahren zu verwenden, das unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird, nämlich ein Verfahren durch Hydrolysereaktion, insbesondere ein Verfahren, das einen Schritt beinhaltet, worin das in Schritt (i) erhaltene Hexuronsäurespaltungsprodukt von sulfatiertem Glycosaminoglycan in einer wässrigen Lösung eines Alkalimetallhydroxids, wie z.B. Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder ähnlichem gelöst wird oder in einer wässrigen Lösung eines Erdalkalimetallhydroxids, wie z.B. Magnesiumhydroxid, Calciumhydroxid oder ähnlichem, vorzugsweise einer wässrigen Alkalimetallhydroxidlösung, besonders bevorzugt einer wässrigen Natriumhydroxidlösung, und die resultierende Lösung wird direkt eingefroren, um ein Gefriertrocknen durchzuführen.
Spezifisch wird eine Lösung des Hexuronsäurespaltungsprodukts von Glycosaminoglycan durch Lösen des Hexuronsäurespaltungsprodukts von Glycosaminoglycan in einer wässrigen Alkalimetallhydroxidlösung oder wässrigen Erdalkalimetalllösung mit einer Konzentration von 0,0125 bis 0,2 N, vorzugsweise unter Eiskühlung (0°C) bis Raumtemperatur (24°C) durchgeführt und dann wird die resultierende Lösung gefriergetrocknet. Danach wird es bevorzugt, dass das gefriergetrocknete Produkt wieder in einer wässrigen Alkalimetalllhydroxidlösung oder einer wässrigen Erdalkalimetalllösung (0,0125 bis 0,2 N) zu einer Konzentration von 1 bis 2,5 M, vorzugsweise 2 M gelöst wird und die resultierende Lösung wird auf einen pH von 8 bis 10 mit einer Säure, vorzugsweise einer schwachen Säure, noch bevorzugter einer Carbonsäure, wie z.B. Essigsäure oder ähnlichem eingestellt und direkt darauffolgend einer Dialyse gegen destilliertes Wasser für mindestens 1 Tag, vorzugsweise 2 Tage, gefolgt von einem Gefriertrocknen oder einer Ethanolausfällung unterzogen.
Das Desulfatieren des Hexuronsäurespaltungsprodukts von sulfatiertem Glycosaminoglycan wird derartig durchgeführt, dass allgemein 70% oder mehr, vorzugsweise 90% oder mehr, noch bevorzugter 95% oder mehr der Sulfatgruppen an 2-Position der ungespaltenen Hexuronsäure entfernt werden.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird, wenn die Teildesulfatierungsbehandlung unter Verwendung des in Schritt (i) erhaltenen Perjodsäure-Oxidations-Reduktions-Heparins von Heparin als dem sulfatiertem Glycosaminoglycan durchgeführt wird, das teilweise 2-O-desulfatierte Perjodsäure-Oxidations-Reduktions-Heparin der vorliegenden Erfindung erhalten.
Eine schematische Illustration der Reaktionsschritte für die Erzeugung des Glycosaminoglycanderivats der vorliegenden Erfindung aus Heparin als Ausgangsmaterial durch die Spaltungsbehandlung von Schritt (i) und die Desulfatierungsbehandlung von Schritt (ii) ist in 1 dargestellt. In der Zeichnung ist (a) eine schematische Darstellung von Heparin, (b) ist ein Reaktionsprodukt, worin Aldehydgruppen durch die oxidative Spaltungsreaktion von Hexuronsäure gebildet werden, (c) ist ein Reduktionsreaktions-behandeltes Produkt, erhalten durch die Reduktionsreaktionsbehandlung der Aldehydgruppen von (b) und (d) ist ein Glycosaminoglycanderivat der vorliegenden Erfindung, worin die 2-O-Sulfatgruppe selektiv desulfatiert wurde.
ZUSAMMENSETZUNG 1 DER ERFINDUNG:
Die Zusammensetzung 1 der vorliegenden Erfindung ist ein Therapeutikum für neurologische Störungen, umfassend als Wirkstoff die erfinderische Substanz, ein Glycosaminoglycanderivat oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
Die Glycosaminoglycanderivate mit Neuritenwachstums-unterstützender Aktivität sind als pharmazeutische Zusammensetzung unter Verwendung der Aktivität nützlich, wie z.B. als Behandlungsmittel für eine neuronale Erkrankung für z.B. zentralnervöse Erkrankungen (z.B. Alzheimer, ischämische Demenz, usw.) oder periphere Nervenerkrankungen (z.B. Diabetesneuropathie, alkoholische Neuropathie, amyotrophe Lateralsklerose (ALS), periphere Nervenschäden, ausgelöst durch eine Verletzung oder Nebenwirkungen eines Medikaments, das Guillain-Barre-Syndrom, usw.).
Die Glycosaminoglycanderivate der vorliegenden Erfindung, die der Wirkstoff der Zusammensetzung 1 der vorliegenden Erfindung sind, können auch als Therapeutika oder präventive Mittel als Nervenfunktionsreduktionsinhibitor verwendet werden, da sie eine Reduktion der Nervenfunktionen verhindern können, begleitet von einer Nervendegeneration durch Inhibition der Aktivität der Sialidase, um Zellmembran-Gangliosid abzubauen, was an einem Erhalt des Überlebens von neuralen Zellen, der synaptischen Funktion und der Axonfunktion beteiligt ist.
ZUSAMMENSETZUNG 2 DER ERFINDUNG:
Die Zusammensetzung 2 der vorliegenden Erfindung ist ein Sialidaseinhibitor, der als Wirkstoff die erfinderische Substanz, ein Glycosaminoglycanderivat oder eine pharmazeutisch annehmbares Salz davon, umfasst.
Die Glycosaminoglycanderivate mit Sialidase-inhibierender Aktivität als erfinderische Substanzen können als Sialidaseinhibitor unter Verwendung dieser Aktivität verwendet werden. Da sie das Wachstum von Viren durch Inhibition der viralen Sialidase inhibieren können, können sie als anti-virale Mittel, insbesondere als Anti-Influenza-Heilmittel verwendet werden. Insbesondere zeigen die erfinderischen Substanzen sehr viel deutlicher ausgezeichnete Sialidaseinhibitionsaktivitäten als die als Influenzaheilmittel verwendeten bekannten Sialinsäurederivate.
Die Bezeichnung "Heilmittel", wie hier verwendet, beinhaltet nicht nur Arzneimittel für eine Verbesserung des Zustands von Patienten zu einem normalen Zustand hin und Arzneimittel für die Abschwächung der Erkrankung, sondern auch ein Konzept von "Arzneimitteln zur Prävention" zur Verhinderung von Infektionen mit der Erkrankung und Ansteckung mit derselben.
Beispiele für die pharmazeutisch annehmbaren Salze der Glycosaminoglycanderivate, die als Wirkstoff der Zusammensetzungen 1 und 2 der vorliegenden Erfindung verwendet werden, beinhalten pharmazeutisch annehmbare Salze unter den Aminsalzen, quaternären Ammoniumsalzen, Alkalimetallsalzen und Erdalkalimetallsalzen. Spezifische Beispiele beinhalten Natriumsalze, Kaliumsalze, Calciumsalze, Magnesiumsalze und ähnliche und Natriumsalze und Kaliumsalze als Alkalimetallsalze werden bevorzugt und Natriumsalze werden noch mehr bevorzugt, z.B. im Hinblick auf die Affinität für den lebenden Körper.
Die Glycosaminoglycanderivate der vorliegenden Erfindung zeigen die Eigenschaft, dass sie eine niedrigere antikoagulierende Aktivität als Standardheparin aufweisen. Bei besonders wünschenswerten Glycosaminoglycanderivaten wird es besonders bevorzugt, dass der APTT-Wert 50 Sekunden oder weniger annimmt, wenn er gemäß dem in Testbeispiel 4 beschriebenen Verfahren gemessen wird, das später beschrieben wird, indem die Konzentration in der Messlösung (Endkonzentration) auf 3 μg/ml eingestellt wird. Auch im Hinblick auf die Glycosaminoglycanderivate (die erfinderischen Substanzen), die in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung als pharmazeutische Zusammensetzung verwendet werden, wird es bevorzugt, dass mindestens eine von der Thrombinzeit (hiernach bezeichnet als "TT"), berechnet durch ein TT-Messverfahren, das später beschrieben wird, und der APTT-Aktivität, berechnet durch das APTT-Messverfahren, 5% oder weniger im Vergleich zu Standardheparin wird. Sogar noch mehr bevorzugt ist eine Substanz mit einer relativ niedrigen TT-Aktivität, worin die TT- und die APTT-Aktivität beide 3% oder weniger im Vergleich mit Standardheparin aufweisen und beide diese Aktivitäten eine Beziehung von 0 ≤ TT-Aktivität/APTT-Aktivität ≤ 0,5 haben, da eine niedrige Blutungsaktivität erwartet werden kann, wenn solches in einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet wird.
Die Bezeichnung "Standardheparin", wie hier verwendet, bedeutet eine Substanz, die zu dem in den Beispielen beschriebenen Standardheparin identisch ist.
Wenn eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend die erfinderische Substanz als Wirkstoff, dem lebenden Körper verabreicht wird, kann Dosierungsform und Verabreichungsweg optional als Reaktion auf Eigenschaften und Schwere der zu behandelnden Erkrankung gewählt werden. Z.B. kann sie sicher parenteral oder oral einem Warmblüter verabreicht werden (z.B. einem Menschen, Maus, Ratte, Hamster, Kaninchen, Hund, Katze, Pferd, usw.) so wie sie ist oder als pharmazeutische Zusammensetzungspräparationen zusammen mit anderen pharmazeutisch annehmbaren Additiven, wie Trägern, Füllstoffen, Verdünnungsmitteln und ähnlichen (z.B. Injektionen, Suppositorien, Tabletten, Kapseln, Lösungen, Salben, Gels, usw.).
Betreffend die Verabreichungsform des Therapeutikums für neuronale Erkrankungen wird die parenterale Verabreichung bevorzugt, Injektionen können als eine Dosierungsform zitiert werden, die für diese Verabreichungsform geeignet ist und intravenöse Injektionen oder Tropfinfusionen können beispielhaft als bevorzugte Weise des Verabreichungsverfahrens genannt werden, obwohl dies nicht darauf begrenzt ist.
Im Hinblick auf die Verabreichungsform des Influenzaheilmittels können alle oralen und parenteralen Verabreichungsformen optional gewählt werden. Beispiele für eine Dosierungsform, die für die orale Verabreichung geeignet ist, beinhalten Pulver, Körner, Tabletten, Kapseln, Aerosols und Sprays und Lösungen können als Dosierungsform beispielhaft genannt werden, die für eine parenterale Verabreichung geeignet sind. Zusätzlich werden als Dosierungsform für ein Influenzheilmittel, insbesondere für die Prävention, Lösungen, die durch orale Verabreichung verwendet werden, ebenfalls bevorzugt und die Verabreichung der Lösungen unter Verwendung eines Sprays oder ähnlichem kann als bevorzugtes Verfahren zitiert werden, obwohl dies nicht darauf begrenzt ist.
Eine Formulierungsmenge und eine Dosis des Glycosaminoglycanderivats als Wirkstoff der Präparation ist nicht besonders begrenzt, da sie abhängig von z.B. dem Verabreichungsverfahren, der Verabreichungsform und dem Verwendungszweck der Präparation und illustrativen Symptomen und dem Körpergewicht jedes Patienten individuell gewählt werden sollten, jedoch kann für den Fall einer intravenösen Injektion eine Menge von ungefähr 100 μg/kg bis 100 mg/kg pro Tag beispielsweise als Menge der Glycosaminoglycanderivate, die einem Patienten verabreicht werden, genannt werden. Im Hinblick auf die Verabreichungshäufigkeit der Präparation ist einmal täglich möglich und sie kann auch durch Teilung der täglichen Dosis in 2 bis 4 oder mehr Dosierungen pro Tag verteilt gegeben werden. Es ist auch möglich sie kontinuierlich, z.B. durch einen Tropf zu verabreichen.
In diesem Zusammenhang zeigten die Glycosaminoglycanderivate als Wirkstoff der pharmazeutischen Zusammensetzung keine Toxizität auf die Zellen in den folgenden Beispielen. Es ist bekannt, dass der LD₅₀-Wert von Heparin durch einen akuten Toxizitätstest bei Mäusen (männlich und weiblich) 5.00 mg/kg oder mehr bei oraler Verabreichung, 2.500 mg/kg oder mehr bei subkutaner oder intraperitonealer Verabreichung und ungefähr 1.000 ml/kg bei intravenöser Injektion beträgt. Da die Glycosaminoglycanderivate als Wirkstoff der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine deutlich niedrigere APTT-Aktivität und TT-Aktivität bei jeweils weniger als 3% im Vergleich mit Standardheparin zeigen, stützt diese Tatsache auch die hohe Sicherheit der Glycosaminoglycanderivate (der erfinderischen Substanzen), die der Wirkstoff der pharmazeutischen Zusammensetzung sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Ansicht, die ein Beispiel der Herstellungsschritte der Glycosaminoglycanderivate der vorliegenden Erfindung darstellt.
2 ist eine Elutions-Chart-Grafik von Standardheparin (a) und der erfinderischen Substanz (b) durch HPLC.
3 ist eine Grafik, die die Veränderungen in der Neuritenwachstum-unterstützenden Aktivität durch Konzentrationen von Standardheparin, der erfinderischen Substanz und einem Perjodsäure-Oxidations-Reduktions-Heparin in einem Medium darstellt. In der Zeichnung ist die Neuritenwachstums-unterstützende Aktivität (%) als Ordinate und die Konzentration im Medium (μg/ml) als Abszisse aufgetragen.
4 ist eine Grafik, die Veränderungen in APTT und TT durch verschiedene Konzentrationen von Standardheparin und der erfinderischen Substanz darstellt. In der Zeichnung ist die Koagulationszeit (Sekunden) als Ordinate und die Endkonzentration (μg/ml) als Abszisse aufgetragen.
5 ist eine HPLC-Elutions-Chart-Grafik durch die Disaccharidanalyse einer ungesättigten Disaccharid-Standardprobe (a), von Standardheparin (b) und der erfinderischen Substanz (c).
6 zeigt den Einfluss der erfinderischen Substanz auf die neurale Zelltod-inhibierende Aktivität. In der Zeichnung ist das Verhältnis von geheilten Zellen (%) als Ordinate und die Endkonzentration (μg/ml) als Abszisse aufgetragen.
7 zeigt den Einfluss von Standardheparin und der erfinderischen Substanz auf die Sialidaseaktivität. In der Zeichnung ist die Sialidaseaktivität (%) als Ordinate aufgetragen.
8 zeigt den Einfluss der erfinderischen Substanz und NeuAc2en auf die Sialidaseaktivität. In der Zeichnung ist die Sialidaseaktivität (%) als Ordinate und die Endkonzentration (μg/ml) als Abszisse aufgetragen.
BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird illustrativ unter Bezugnahme auf die Beispiele beschrieben, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht auf die folgenden Beispiele begrenzt, so lang dies nicht ihren Umfang überschreitet.
In diesem Fall sind die Testverfahren in den Beispielen die folgenden.
TESTVERFAHREN 1
DISACCHARIDANALYSE DURCH ENZYMVERDAU:
Die Analyse der Position der Sulfatgruppe an der erfinderischen Substanz und Standardheparin wurde auf die folgende Weise durchgeführt. D.h., jedes Glycosaminoglycan wurde einem Enzymverdau unterzogen und die so gebildeten ungesättigten Disaccharide (allgemeine Formel (7)) wurden durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) (siehe "2.8 Structural analysis by a combination of glycosaminoglycan hydrolyzing enzymes with HPLC" beschrieben auf S. 49–62 in New Biochemical Experiment Course 3, Saccharide II (veröffentlicht von Tokyo Kagaku Dojin, 1991)) analysiert. Durch Berechnung eines Peakbereichs von jedem ungesättigten Disaccharid wurde jeder Peakbereich, basierend auf dem Gesamtbereich als Prozentsatz ausgedrückt.
(1) VERDAU DES STANDARDHEPARINS UND DER ERFINDERISCHEN SUBSTANZ MIT ABBAUENDEN ENZYMEN
Sie wurden mit abbauenden Enzymen durch das in New Biochemical Experiment Course 3, Saccharide II, S. 53–59 beschriebene Verfahren verdaut. In 220 μl von 20 mM Natriumacetat (pH 7,0), enthaltend 2 mM Calciumacetat, wurde 1,0 mg von jeweils dem Standardheparin und der erfinderischen Substanz gelöst und 20 mU Heparitinase, 20 mU Heparitinase I und II wurden der Lösung zugefügt, um die Reaktion bei 37°C für 2 Stunden durchzuführen.
(2) HPLC-ANALYSE
Unter Verwendung von HPLC (Modell 852, Irika), wurden 50 μl der Lösung nach Enzymverdau des Standardheparins oder der erfinderischen Substanz analysiert. Eine Ionenaustauschsäule (CarboPac PA-1 Säule, 4,0 mm × 250 mm, hergestellt von Dionex) wurde verwendet und die Absorption wurde bei 232 nm abgelesen. Ungesättigter Disaccahridstandard (hergestellt von Seikagaku Corporation) wurde als Standard verwendet (Yamada et al., J. Biol. Chem., 270, 8696–8706 (1995)) und die Analyse wurde mit einer Flussrate von 1 ml/min gemäß einem Verfahren durchgeführt, worin ein Lithiumchlorid-Gradientensystem (50 mM → 2,5 M) verwendet wurde (Kariya et al., Comp. Biochem. Physiol., 103B, 473 (1992)).
TESTVERFAHREN 2
MOLEKULARGEWICHTSMESSUNG:
Durch eine Gelfiltration unter Verwendung von HPLC wurden 5 μl einer 1%igen Lösung des Standardheparins oder der erfinderischen Substanz analysiert. TSK-Gel-(G4000 + G3000 + G2500) PWX (7,8 mm × 20 cm, hergestellt von Tosoh) wurde als Säule verwendet und die Entwicklung wurde mit 0,2 N Natriumchlorid bei 40°C und einer Flussrate von 0,6 ml/min durchgeführt. Ein Differentialrefraktometer (AID-2A, hergestellt von Shimadzu) wurde für den Nachweis verwendet. Das gewichtsgemittelte Molekulargewicht, wie dargestellt in Tabelle 1, wurde unter Verwendung einer Standardmolekulargewichtspräparation von Heparin als Kontrolle berechnet (Kaneda et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 220, 108–112 (1996)).
TESTVERFAHREN 3
MESSUNG DER NEURITEN-WACHSTUMGS-UNTERSTÜTZENDEN AKTIVITÄT:
Ein Fötus wurde aseptisch aus einer Wistar-Ratte am 17. Tag der Schwangerschaft ausgeschnitten (käuflich erworben von Japan SLC). Das Gehirn wurde von dem Fötus ausgeschnitten und der zerebrale Kortex wurde durch Entfernung von Cerebellum, Mittelgehirn, Zwischengehirn und Meninges in einem nicht-sulfatierten DMEM-Medium (hergestellt durch Lösen von 500 mg wasserfreiem CaCl₂, 0,25 mg von Fe(NO)₃/9H₂O, 1.000 mg KCl, 193,3 mg MgCl₂, 9,250 mg NaHCO₃, 312,5 mg NaH₂PO₄/H₂O, 37,5 mg Phenol rot, 275 mg Natriumpyruvat, 100 ml MEM-Aminosäure (Nr. 11130-051, hergestellt von Gibco), 75 mg von L-Glycin, 1.460 mg von L-Glutamin, 105 mg von L-Serin, 100 ml von MEM-Vitaminlösung (Nr. 11120-052, hergestellt von Gibco), 15.150 mg von NaCl und 11.250 mg D-Glucose in 2,5 l sterilisiertem destilliertem Wasser und Einstellung der Lösung auf pH 7,2) erhalten.
Zerebrale Cortices, erhalten von 10 Tieren wurden schließlich 100-mal längs als auch quer mit einem Sicherheitsrasierer auf einer 60 mm Schale geschnitten und die zerebralen Kortexschnitte wurden zweimal mit 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) vermischt und auf 50 ml Falcon-Röhrchen verteilt, wozu darauffolgend 11 ml des nicht-sulfatierten DMEM-Mediums zugefügt wurde. Während durch leichtes Schütteln einheitlich suspendiert wurde, wurde dieses in 0,5 ml Teilen in Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen (Grundbereich 2 cm²) verteilt, die mit 0,1% Polyethylenimin beschichtet worden war. Zwei Stunden nach Beginn der Kultivierung wurden 100 μl jeder Probe entnommen und 50 μl PBS, enthaltend die jeweilige zu testende Substanz, mit 10-facher Konzentration der Endkonzentration und 50 μl einer 400 μM-Chlorsäure/nicht-sulfatiertes DMEM-Medium wurden zugefügt. Nach zwei Tagen einer Kultivierung bei 37°C unter 5% CO₂ wurden 500 μl von 1% Glutaraldehyd/PBS vorsichtig überschichtet, um 20 Minuten einer Fixierung bei Raumtemperatur durchzuführen. Nach Entfernung des Überstands durch Sog, wurden 0,5 ml PBS langsam überschichtet und dann direkt durch Sog entfernt. Ein 20%-Giemsalösung/Kaliumphosphatpuffer wurde überschichtet und man lies dies 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Nach Entfernung des Überstands durch Sog, wurden 0,5 ml PBS zugefügt. Unter einem Lichtmikroskop bei 40-facher Vergrößerung wurden diejenigen gezählt die eine Neuriten-Wachstumsunterstützung unter 100 zerebralen Cortexzellenmassen mit einer Größe von 50 bis 200 μm zeigten und im gesamten visuellen Feld existierten und ihr Verhältnis (%) wurde berechnet.
TESTVERFAHREN 4
MESSUNG VON APTT UND TT:
Für die Messung von APTT wurde Blut der unteren Rattenaorta durch 3,2% Zitronensäure 1/10 Volumen gesammelt und bei 1.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert und 100 μl des so erhaltenen Blutplasmas und 100 μl jeder Probe, jeweils mit unterschiedlichen Konzentrationen wurden in einen Messbecher gegeben und bei 37°C 1 Minute inkubiert. Daraufhin wurden 100 μl Actin (Handelsname, Yoshitomi Pharmaceutical), das im vorhinein bei 37°C inkubiert worden war, zugefügt und die Inkubation wurde für weitere 2 Minuten fortgesetzt. Als nächstes wurden 100 μl einer 0,02 M CaCl₂-Lösung, die im vorhinein bei 37°C inkubiert worden war, zugefügt und die Zeitspanne von diesem Punkt bis zur Erzeugung einer Koagulation wurde unter Verwendung eines automatischen Blutkoagulations-Messapparats (KC-10A: hergestellt von Amelung) gemessen. Außerdem wurde in Tabelle 2 die Endkonzentration von jeweils der erfinderischen Substanz und Standardheparin im Medium erhalten, wodurch der APTT-Wert 100 Sekunden wird, um die Konzentration von Standardheparin als Prozentzahl, basierend auf der Konzentration der erfinderischen Substanz, zu berechnen und der Wert (%) wurde als APTT-Aktivität der erfinderischen Substanz verwendet.
Für die Messung von TT wurden 100 μl des Blutplasmas und 100 μl jeder Probe mit unterschiedlichen Konzentrationen in einen Messbecher gegeben und bei 37°C 1 Minute inkubiert. Daraufhin wurden 100 μl Thrombin (10 U/ml), das im vorhinein bei 37°C inkubiert worden war, zugefügt und die Zeitspanne von diesem Punkt bis zur Erzeugung der Koagulation wurde unter Verwendung des automatischen Blutkoagulations-Messapparats gemessen. In Tabelle 2 wurde die Endkonzentration von jeweils der erfinderischen Substanz und Standardheparin in dem Medium, wodurch der TT-Wert 100 Sekunden wurde, erhalten, um die Konzentration von Standardheparin als Prozentsatz, basierend auf der Konzentration der erfinderischen Substanz, zu berechnen und dieser Wert (%) wurde als TT-Aktivität der erfinderischen Substanz verwendet.
STANDHARDHEPARIN IN DIESER BESCHREIBUNG:
Eine Heparinpräparation mit den folgenden physikalischen Eigenschaften wurde als Standardheparin verwendet.

(1) Wie in Tabelle 3 dargestellt, war die Disaccharidzusammensetzung von Standardheparin, berechnet aus Werten, gemessen durch das Disaccharidanalyseverfahren, wie beschrieben in Testverfahren 1, wie folgt: ΔDiHS-OS: 4,1%, ΔDiHS-NS: 3,4%, ΔDiHS-6S: 3,7%, ΔDiHS-US: 2,6%, ΔDiHS-di(6,N)S: 12,7%, ΔDiHS-di(U,N)S: 7,6%, ΔDiHS-di(U,6)S: 1,7% und ΔDiHS-tri(U,6,N)S: 64,2% und dieses Ergebnis zeigt, dass keine Sulfatgruppe an der 2-Position der 23,9% Uronsäure vorliegt (alle Prozentwerte zeigen mol%-Verhältnisse an).
(2) Die anti-koagulierende Aktivität liegt bei 160 IU/mg.
(3) Das gewichtsgemittelte Molekulargewicht liegt bei 11.000 bis 14.000 Da.

BEISPIEL 1 (PRODUKTIONSBEISPIEL)
1. Teilspaltungsbehandlung von Hexuronsäure durch Perjodsäure-Oxidations-Reduktion von Standardheparin
In Gegenwart von Natriumperjodat wurden 1,3 g eines Heparinnatriumsalzes (gewichtsgemitteltes Molekulargewicht: 13.700 Da, Lot Nr. 4021, hergestellt von Syntex: Standardheparin) oxidiert. D.h., diese Oxidationsreaktion wurde in einer Lösung mit pH 5, enthaltend 50 ml 0,05 N Natriumperjodat und 50 mM Natriumacetat durch Oxidationsbehandlung des Heparinnatriumsalzes bei 4°C für 3 Tage durchgeführt. Nach der Oxidationsbehandlung wurde überschüssige Perjodsäure durch Zugabe von Glycerin auf eine Endkonzentration von 250 mM durch Reduktion abgebaut und die resultierende Lösung wurde gegen destilliertes Wasser für 2 Tage dialysiert und dann gefriergetrocknet, um 1,2 g von Perjodsäure oxidiertem Heparin zu erhalten. Im Hinblick auf die durch die Bildung von Perjodsäure oxidiertem Heparin erzeugten Aldehydgruppen wurden 1,2 g des oxidierten Heparins in 30 ml einer 0,2 N Natriumborhydridlösung, pH 9, gelöst, enthaltend 0,25 N Natriumbicarbonat und 3 Stunden einer Reaktion bei 4°C unterworfen, wodurch die Aldehydgruppen des Perjodsäure oxidierten Heparins reduziert wurden. Überschüssiges Natriumborhydrid wurde durch Einstellung der Reaktionslösung auf einen pH von 5 mit Eisessigsäure abgebaut und indem man die Lösung bei Raumtemperatur 30 Minuten stehen ließ und die resultierende Lösung wurde wiederum auf einen pH von 9 mit 5 N Natriumhydroxid eingestellt, gegen destilliertes Wasser für 2 Tage dialysiert und dann gefriergetrocknet, um 1,1 g eines Natriumsalzes eines Perjodsäure-Oxidations-Reduktions-Heparins zu erhalten.
2. Teilweise 2-O-Desulfatierung von Perjodsäure-Oxidations-Reduktions-Heparin
In 20 ml einer 0,05 N wässrigen Natriumhydroxidlösung wurden 1,1 g des in Schritt 1 erhaltenen Perjodsäure-Oxidations-Reduktions-Heparin-Natriumsalzes gelöst und die Lösung ließ man 20 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Diese Lösung wurde gefriergetrocknet, um die Sulfatgruppe an 2-Position selektiv zu desulfatieren, dann wurde das gefriergetrocknete Pulver in 10 ml einer 1 N wässrigen Natriumhydroxidlösung gelöst, auf einen pH von 9 mit 20%iger Essigsäurelösung eingestellt und dies ließ man dann 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Daraufhin wurde diese Mischung gegen destilliertes Wasser für 2 Tage dialysiert und wiederum gefriergetrocknet, um 0,8 g eines Natriumsalzes von desulfatiertem Perjodsäure-Oxidations-Reduktions-Heparin zu erhalten (selektiv 2-O-desulfatiertes Perjodsäure-Oxidations-Reduktions-Heparin).
Ein gewichtsgemitteltes Molekulargewicht der erfinderischen Substanz wurde durch HPLC gemäß dem Testverfahren gemessen und die Ergebnisse sind in 2 und Tabelle 1 dargestellt.
TABELLE 1
3. Messung der Neuriten-Wachstums-unterstützenden Aktivität, APTT und TT
Die Neuritenwachstums-unterstützende Aktivität von jeweils dem Standardheparin, wie dargestellt in Tabelle 1, der in Schritt 2 erhaltenen erfinderischen Substanz und dem in Schritt 1 erhaltenen Perjodsäure-Oxidations-Reduktions-Heparin wurden durch das Testverfahren 1 überprüft und die Ergebnisse sind in 3 dargestellt. Im Ergebnis wurde ein scharfer Anstieg der Neuritenwachstums-unterstützenden Aktivität beobachtet, wenn 10 μg/ml der erfinderischen Substanz zugefügt wurden. APTT und TT von jeweils dem Standardheparin und der erfinderischen Substanz wurden auch durch die oben beschriebenen Verfahren überprüft und die Ergebnisse sind in 4 dargestellt. Außerdem wurde die APTT- und die TT-Aktivität durch Testverfahren 4 berechnet und die TT-Aktivität/APTT-Aktivität wurde berechnet. Zusätzlich wurde APTT durch Testverfahren 4 gemessen, indem die Endkonzentration von Standardheparin und der erfinderischen Substanz auf 3 μg/ml eingestellt wurden. Die Ergebnisse dieser Messungen an Standardheparin und der erfinderischen Substanz sind in Tabelle 2 dargestellt.
TABELLE 2
Es ist bekannt, dass eine Substanz mit einer niedrigeren TT- als APTT-Aktivität eine niedrige anti-koagulierende Aktivität zeigt, wenn sie als Medikament verabreicht wird und daher eine hohe Sicherheit aufweist, und es zeigte sich, dass die erfinderische Substanz eine solche Substanz ist.
Zusätzlich wurde eine Diasaccharidanalyse der so erhaltenen erfinderischen Substanz durch das Testverfahren 1 durchgeführt und die Ergebnisse sind in 5 dargestellt. Die Disaccharidzusammensetzung wurde aus den gemessenen Werten berechnet und die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.
TABELLE 3
4. Messung der neuralen Zelltod-inhibierenden Aktivität
Die Zelltod-Inhibitionsaktivität der erfinderischen Substanz auf motorische neurale Zellen wurde gemessen.
D.h., eine Kultivierung wurde durch Zugabe von 0,09 ml serumfreiem DMEM-Medium, enthaltend 1 × 105 NSC-34-Zellen (erhalten von Dr. Cashman (Toronto Universität): ein von motorischen Maus-Neuronen abstammender kultivierter Zellstamm) zu einer Multiplatte mit 96 Vertiefungen, die im vorhinein mit 0,1% Polyethylenimin behandelt worden war, durchgeführt. Zwei Stunden nach der Kultivierung wurden 10 μl einer wässrigen 100, 1.000 oder 10.000 μg/ml Lösung der erfinderischen Substanz den jeweiligen Vertiefungen zugefügt (die Endkonzentration im Medium ist 10, 100 oder 1.000 μg/ml). Daraufhin wurde die Kultivierung für 46 Stunden fortgesetzt und die Zahl der überlebenden Zellen wurde durch das MTT-Verfahren unter Verwendung eines Hämocytometers gemessen. Durch Vergleich mit der Zahl der überlebenden Zellen nach 2 Stunden der Kultivierung wurde die Zahl toter Zellen nach 48 Stunden der Kultivierung einer Kontrolle, wozu die erfinderische Substanz nicht zugefügt worden war, als 100% definiert und das Verhältnis der Differenz zu der Zahl der toten Zellen, wenn die erfinderische Substanz zugefügt wurde (die Zahl der Zellen, die vor dem Zelltod bewahrt wurden) wurde als Prozentsatz berechnet (6).
Im Ergebnis wurde eine Aktivität, den Zelltod deutlich zu inhibieren und dadurch die Zellen zu retten, in den Systemen beobachtet, worin 100 und 1.000 μg/ml der wässrigen Lösung der erfinderischen Substanz zugefügt worden waren. Da die Zahl der Zellen, die zu einem Zelltod führte, wenn eine 100 μg/ml wässrige Lösung zugefügt wurde, ungefähr die Hälfte der Zahl für den Fall von Standardheparin betrug zeigte sich, dass ungefähr die Hälfte der Zahl von Zellen vor dem Zelltod bewahrt wird. Zusätzlich wurde eine Neuritenwachstums-unterstützende Aktivität bei den überlebenden Zellen ähnlich wie im Fall der vom Zentralnervensystem abstammenden Zellen beobachtet.
5. Messung der Sialidaseinhibitionsaktivität
Die Sialidaseinhibitionsaktivität wurde an Standardheparin, der erfinderischen Substanz und einem bekannten Sialidaseinhibitor NeuAc2en (2-Deoxy-2,3-dehydro-N-acetylneuraminsäure) gemessen.
5.1. Präparation des Substrats
In ein 15 ml Glasrohr wurde 1 mg GM2-Gangliosid (hergestellt von IATRON) gegeben und durch Zugabe von 0,8 ml destilliertem Wasser gelöst, gefolgt von einer Beschallung. Zu der resultierenden Lösung wurde 0,1 ml einer PdCl₂-Lösung (eine Überstandfraktion, erhalten durch Zugabe von PdCl₂ zu destilliertem Wasser auf eine Konzentration von 25 mg/ml, gefolgt von Beschallung für 30 Minuten und dann Zentrifugation der Mischung bei 2.000 × g) zugefügt, gefolgt von Rühren. Nach Zugabe von 0,1 ml 1 N NaOH und 40 μl NaB³H₄ (hergestellt von NEN: 100 mCi/mmol, 1 M NaOH), gefolgt von Rühren, wurde die Atmosphäre in dem Röhrchen durch Stickstoffgas ersetzt und dann wurde die Mischung bei Raumtemperatur 24 Stunden gerührt, mit einem Abschaber NaBH₄ mit einem Mikrospachtel vermischt und wiederum bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt. Daraufhin wurde die Reaktion durch graduelle Zugabe von ungefähr 0,6 ml 1 M Essigsäure beendet und die Reaktionslösung wurde auf eine Minisäule von AG50W-X8 (hergestellt von Bio-Rad: 3 ml Harz, angeschwollen mit Methanol) aufgebracht und vollständig mit 10 ml Methanol eluiert. Durch Trocknen des so eluierten Substrats mit Stickstoffgas wurde das Substrat [³H]GM2 hergestellt.
5.2 Messung der Sialidaseaktivität
Das Substrat [³H]GM2 (15 nmol), wie hergestellt in Schritt 5.1, wurde mit 1% Triton X-100 (10 μl), 0,1 M Natriumacetat/Essigsäurepuffer (40 μl), einem Homogenat von NSC-34-Zellen (einem Sialidase-exprimierenden von motorischen Neuronen abstammenden kultivierten Zellstamm (10 μl, 100 μg Protein), 10 μl destilliertem Wasser und 10 μl einer wässrigen Lösung der erfinderischen Substanz oder Standardheparin (10 μg/ml) vermischt und die Mischung bei 37°C 1 Stunde inkubiert. Nach der Inkubation wurde dies mit 5 ml destilliertem Wasser vermischt, auf eine Sep-pak C18 Cartridge-Säule (hergestellt von Waters) gegeben und mit Methanol (3 ml) eluiert und dann mit Chloroform : Methanol (1 : 1 (V/V), 3 ml). Das Eluat wurde auf eine DEAE-Sephadex A-25-Säule (hergestellt von Pharmacia: 1 ml Harz, angeschwollen mit Methanol) gegeben und mit Chloroform : Methanol (1 : 1 (V/V), 3 ml) eluiert und dann wurde das Eluat getrocknet, um die Radioaktivität durch einen Flüssigszintillationszähler zu messen und zu vergleichen. Die Radioaktivität einer Kontrolle, wozu 10 μl destilliertes Wasser anstelle von Standardheparin, oder erfinderischer Substanz zugegeben wurde, wurde als 100% definiert (7).
Als Ergebnis zeigte sich, dass die erfinderische Substanz eine stärkere Aktivität zur Inhibition der Sialidase zeigt, die Gangliosid abbaut als Standardheparin, was so anzeigt, dass sie für Erkrankungen verwendet werden kann, die von einer erhöhten Sialidaseaktivität und/oder reduziertem Gangliosid begleitet werden.
Zusätzlich wurde die Sialidaseaktivität auf dieselbe Weise wie bei dem obigen Messverfahren gemessen, wobei 10 μl einer wässrigen Lösung der erfinderischen Substanz (10, 100 oder 1.000 μg/ml) oder NeuAc2en (10, 100 oder 1.000 μg/ml) anstelle von 10 μl einer 10 μg/ml wässrigen Lösung der erfinderischen Substanz oder von Standardheparin verwendet wurden (8).
Als Ergebnis zeigte sich, dass die erfinderische Substanz eine stärkere Silaidaseinhibitionsaktivität als NeuAc2en aufweist.
BEISPIEL 2 (PRÄPARATIONSBEISPIEL)
(1) INJEKTIONEN
Die in Beispiel 1 erzeugte erfinderische Substanz (30 mg/ml) wurde in einer 5%igen wässrigen Mannitlösung auf eine Endkonzentration von 5 mg/ml gelöst und die Lösung wurde einer aseptischen Filtration unterzogen und dann in 2 ml-Portionen in Ampullen zur Erzeugung von Injektionen verteilt.
(2) SPRAY
Die in Beispiel 1 erzeugte erfinderische Substanz (30 mg/ml) wurde in PBS auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml gelöst und die Lösung einer aseptischen Filtration unterzogen und dann in 20 ml-Portionen in sterilisierte Spray-Behälter zur Erzeugung von Sprays verpackt.
(3) TABLETTEN
Eine 100 mg-Portion einer gefriergetrockneten Präparation der erfinderischen Substanz wurde mit 670 mg Lactose, 150 mg Kartoffelstärke, 60 mg kristalliner Zellulose und 50 mg weichem Kieselsäureanhydrid vermischt und eine Lösung durch Lösen von 30 mg Hydroxypropylcellulose in Methanol (Hydroxypropylcellulose 10 Gew.%) wurde der Mischung zugefügt und einer Knetgranulierung unterzogen. Als nächstes wurde dies in granuläre Form durch Extrusion durch ein 0,8 mm Mesh-Sieb gebracht, getrocknet, mit 15 mg Magnesiumstearat vermischt und dann einem Kompressionsformen zur Erzeugung von 200 mg Tabletten unterzogen.
(4) KAPSELN
100 mg einer gefriergetrockneten Präparation der erfinderischen Substanz, 150 mg Kartoffelstärke, 50 mg weiches Kieselsäureanhydrid, 10 mg Magnesiumstearat und 765 mg Lactose wurden einheitlich vermischt und die Mischung in 200 mg-Portionen in harte Kapseln zur Erzeugung von Kapseln verpackt.
(5) SALBEN
100 mg einer gefriergetrockneten Präparation der erfinderischen Substanz, 4 g Mineralöl, 8 g Petroleumgelee, 60 mg eines gemischten Methyl/Propylparabens, 1 g nicht-ionisches Tensid und 30 g gereinigtes Wasser wurden einheitlich vermischt und die Mischung wurde in Behälter zur Erzeugung von Salben verpackt.
GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT
Da die neuen Glycosaminoglycanderivate der vorliegenden Erfindung eine niedrige anti-koagulierende Aktivität und eine ausgezeichnete, das Neuriten-Wachstum unterstützende Aktivität aufweisen, kann eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend diese Substanz als Wirkstoff bereitgestellt werden und ist nützlich für neurologische Störungen, z.B. des zentralen Nervensystems, der peripheren Nerven, usw. Da außerdem die neuen Glycosaminoglycanderivate der vorliegenden Erfindung eine starke Sialidaseinhibitionsaktivität aufweisen kann ein antivirales Mittel, umfassend diese Substanz als Wirkstoff, bereitgestellt werden.

Claims

Glycosaminoglycanderivat oder ein Salz davon, umfassend: 0 bis 10 mol% 2-Deoxy-2-sulfamino-4-O-(4-deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronsäure)-6-O-sulfo-D-glucose; 95 bis 70 mol% 2-Deoxy-2-sulfamino-4-O-(4-deoxy-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronsäure)-6-O-sulfo-D-glucose; und 5 bis 20 mol% 2-Deoxy-2-sulfamino-4-O-(4-deoxy-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronsäure)-D-glucose, in einer Disaccharidzusammensetzung, erhalten durch eine Disaccharidanalyse durch eine Kombination eines Abbaus durch ein Glycosaminoglycanabbauenzym mit der Analyse durch Hochleistungsflüssigchromatographie, wobei das Derivat eine aktivierte Teilthromboplastinzeit (APTT), gemessen durch Zugabe zu Standardblutplasma bei einer Endkonzentration von 3 μg/ml von 50 Sekunden oder weniger aufweist und wobei das Derivat ein gewichtsgemitteltes Molekulargewicht von 9000 bis 13000 Da (Dalton) aufweist, wobei jedes Molekül des Derivats mindestens einen Bestandteil umfasst, dargestellt durch die allgemeine Formel (1) in einem Grundgerüst, gebildet durch eine sich wiederholende Einheitsstruktur von Hexosamin und Hexuronsäure; worin die allgemeine Formel (1) repräsentiert wird durch:
(worin R¹ H oder SO₃H repräsentiert und R² repräsentiert COCH₃ oder SO₃H).
Glycosaminoglycanderivat gemäß Anspruch 1 mit einer Struktur der allgemeinen Formel (2) oder ein Salz davon, worin die allgemeine Formel (2) repräsentiert wird durch: HO-((A)-(B))_n-H (2)worin (A) ein Glucoronsäurerest der allgemeinen Formel (3) ist, ein Iduronsäurerest der allgemeinen Formel (4) oder ein gespaltener Hexuronsäurerest der allgemeinen Formel (5)

und (B) ein Hexosaminderivatrest der allgemeinen Formel (6) ist:
worin in den allgemeinen Formeln (3) bis (6) R¹ und R³ jeweils unabhängig H oder SO₃H bedeuten und R² ist COCH₃ oder SO₃H und in der allgemeinen Formel (2) ist n eine ganze Zahl, die 15 ≤ n ≤ 40 entspricht, und mindestens einer von (A) ist ein Rest der allgemeinen Formel (5).
Glycosaminoglycanderivat gemäß Anspruch 1 oder 2 oder ein Salz davon mit mindestens einem gespaltenen Hexuronsäurerest, repräsentiert durch die oben beschriebene allgemeine Formel (5), wobei das Derivat durch ein Verfahren erhältlich ist, umfassend die folgenden Schritte (i) und (ii): (i) ein sulfatisiertes Glycosaminoglycan mit einer sich wiederholenden Einheitsstruktur von Hexosamin und Hexuronsäure als Grundgerüst wird einer Spaltungsbehandlung unterzogen, um zwischen nur den Kohlenstoffatomen an 2- und 3-Postion von mindestens einem Teil der Hexuronsäure ohne Sulfatgruppe an der 2-Position im Grundgerüst zu spalten und (ii) Durchführen einer Desulfatationsbehandlung an dem Produkt von Schritt (i) durch ein Desulfatationsverfahren, das dazu in der Lage ist, spezifisch die Sulfatgruppe an der 2-Position der Hexuronsäure zu entfernen, um 90% oder mehr der Sulfatgruppen der gesamten Hexuronsäure mit einer Sulfatgruppe an der 2-Position zu desulfatisieren.
Glycosaminoglycanderivat gemäß Anspruch 3 oder ein Salz davon, worin das sulfatisierte Glycosaminoglycan mit einer sich wiederholenden Einheitsstruktur von Hexosamin und Hexuronsäure als Grundgerüststruktur Heparin ist.
Glycosaminoglycanderivat gemäß Anspruch 3 oder 4 oder ein Salz davon, wobei die Spaltungsbehandlung von Schritt (i) das Durchführen einer oxidativen Spaltungsreaktion unter Verwendung eines Perjodats umfasst.
Glycosaminoglycanderivat gemäß Anspruch 5 oder ein Salz davon, worin Schritt (i) weiterhin die Reduktion des oxidativen Spaltungsreaktionsprodukts umfasst.
Glycosaminoglycanderivat gemäß einem der Ansprüche 3–6 oder ein Salz davon, wobei das Desulfatationsverfahren in Schritt (ii) eine Hydrolysereaktion unter Verwendung eines Alkalimetallhydroxids oder eines Erdalkalimetallhydroxids ist.
Glycosaminoglycanderivat gemäß einem der vorstehenden Ansprüche oder ein Salz davon, worin ein Medium, umfassend das Glycosaminoglycanderivat in einer Endkonzentration von 1 bis 10 μg/ml eine Neuriten- Auswuchs-unterstützende Aktivität von mindestens dem 1,5-fachen von derjenigen eines Mediums aufweist, umfassend ein Heparinnatriumsalz mit einem gewichtsgemittelten Molekulargewicht von 13700 Da im selben Konzentrationsbereich wie das Medium, enthaltend das Glycosaminoglycanderivat, wobei die Neuriten-Auswuchs-unterstützende Aktivität gemessen wird, wenn primäre Kulturzellen des Wistar-Ratten-Zerebralcortex in Kontakt mit jedem der Medien gebracht werden.
Glycosaminoglycanderivat gemäß einem der vorstehenden Ansprüche oder ein Salz davon zur Verwendung als aktive therapeutische Substanz.
Glycosaminoglycanderivat gemäß Anspruch 9 oder ein Salz davon zur Verwendung bei der Behandlung einer neuronalen Erkrankung.
Glycosaminoglycanderivat gemäß Anspruch 10 oder ein Salz davon zur Verwendung bei der Behandlung einer Erkrankung des zentralen Nervensystems oder einer Erkrankung der peripheren Nerven.
Verwendung eines Glycosaminoglycanderivats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung neuronaler Erkrankungen.
Verwendung eine Glycosaminoglycanderivats gemäß einem der Ansprüche 1–8 zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Erkrankungen, die eine Sialidaseinhibition benötigen.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Glycosaminoglycanderivat gemäß einem der Ansprüche 1–8 oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon als Wirkstoff.
Sialidaseinhibitor, umfassend ein Glycosaminoglycanderivat gemäß einem der Ansprüche 1–8 oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon als Wirkstoff.
Sialidaseinhibitor gemäß Anspruch 15, der die Influenzavirus-Sialidase inhibiert.
Sialidaseinhibitor gemäß Anspruch 15, wobei es sich um ein Therapeutikum für Influenza handelt.
Verfahren zur Erzeugung eines Glycosaminoglycanderivats mit einer sich wiederholenden Einheitsstruktur aus Hexosamin und Hexuronsäure als Grundgerüststruktur, worin ein Teil der Hexuronsäure zwischen den Kohlenstoffatomen an 2- und 3-Position gespalten ist, umfassend die folgenden Schritte: (i) Durchführung einer Spaltungsreaktion an einem sulfatisierten Glycosaminoglycan mit einer sich wiederholenden Einheitsstruktur von Hexosamin und Hexuronsäure als Grundgerüststruktur, um nur zwischen den Kohlenstoffatomen der 2- und 3-Position von mindestens einem Teil der Hexuronsäure ohne Sulfatgruppe an 2-Position in der Grundgerüststruktur zu spalten, und (ii) Durchführung einer Desulfatationsbehandlung an dem Produkt von Schritt (i) durch ein Desulfatationsverfahren, das spezifisch die Sulfatgruppe an 2-Position der Hexuronsäure entfernen kann, um 90% oder mehr der Sulfatgruppen der Gesamthexuronsäure mit einer Sulfatgruppe an 2-Position zu desulfatisieren.
Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei das sulfatisierte Glycosaminoglycan mit einer sich wiederholenden Einheitsstruktur von Hexosamin und Hexuronsäure als Grundgerüststruktur Heparin ist.
Verfahren gemäß Anspruch 18 oder 19, wobei die Spaltungsbehandlung von Schritt (i) das Durchführen einer oxidativen Spaltungsreaktion unter Verwendung eines Perjodats umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 20, worin Schritt (i) weiterhin die Reduktion des oxidativen Spaltungsreaktionsprodukts umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei das Desulfatationsverfahren der Sulfatgruppe an 2-Position der Hexuronsäure in Schritt (ii) eine Hydrolysereaktion unter Verwendung eines Alkalimetallhydroxids oder eines Erdalkalimetallhydroxids ist.