DE69918523T2

DE69918523T2 - Neues glycosaminoglycan und dieses enthaltendes arzneimittel

Info

Publication number: DE69918523T2
Application number: DE69918523T
Authority: DE
Inventors: Yutaka Yokohama-shi KARIYA; Ryo Fushimi-ku TAKANO; Kaeko Fushimi-ku KAMEI; Saburo Takatsuki-shi HARA; Junichi Higashimurayama-shi Onaya; Yusuke Hori
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1998-07-31
Filing date: 1999-08-02
Publication date: 2005-07-28
Anticipated expiration: 2019-08-03
Also published as: AU4933099A; EP1022289A4; EP1022289A1; KR20010030803A; ATE270677T1; CA2305619A1; JP5189137B2; JP2010235956A; CA2305619C; DE69918523D1; WO2000006608A1; CN1286699A; EP1022289B1; US6492503B1; JP4575595B2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Sulfatgruppen aufweisendes Glycosaminoglycan, in dem im Wesentlichen die gesamten Sulfatgruppen entfernt sind, die an den 6-Positionen der Glucosaminreste gebunden sind, die das Glycosaminoglycan darstellen, und die Entfernung von anderen Sulfatgruppen auf ein Minimum gebracht ist, und Pharmazeutika, die das Glycosaminoglycan als einen Wirkstoff enthalten, und des Weiteren ein Verfahren zum Herstellen des Glycosaminoglycans.
Stand der Technik
Heparin ist eines der Glycosaminoglycane, die eine Backbone-Struktur aufweisen, die aus einer sich wiederholenden Struktur einer Disaccharid-Einheit zusammengesetzt ist, die aus einem Uronsäure (Iduronsäure (IdoA) oder Glucuronsäure (GlcA)) -Rest und einem Glucosamin (GlcN) -Rest zusammengesetzt ist. Heparin ist eines der Glycosaminoglycane, in denen die Hydroxylgruppe an der 2-Position des Uronsäurerests und die Hydroxylgruppe an der 6-Position und die Aminogruppe an der 2-Position des Glucosaminrests jedes einem gewissen Sulfatierungsgrad unterzogen sind. Da Heparin eine Antithorombin III (im Folgenden auch als „ATIII" bezeichnet) -Bindungsstelle (FEBS Lett. (1980) 117, 203-206) aufweist, und an ATIII bindet, um die Wirkung des Thrombins zu inhibieren, und dabei eine antikoagulierende Wirkung hervorruft, ist Heparin lange als ein pharmazeutisches Mittel, wie z.B. als ein Antikoagulans zur Verbesserung der Ergebnisse der Dialysebehandlung und dergleichen, umfangreich verwendet worden. Es wurde kürzlich noch entdeckt, dass Heparin mit unterschiedlichen physiologisch aktiven Faktoren interagiert. Heparin interagiert z.B. mit einer Lipoproteinlipase (J. Biol. Chem. (1981) 256, 12893-12898) und weist eine Affinität zu dem basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor auf (J. Cell Biol. (1990) 111, 1651-1659).
Unter solch einer Gegebenheit ist die Aufmerksamkeit auf die Domänstrukturen innerhalb des Heparins fokussiert worden, die an der Bindung zwischen Heparin und spezifischen Zell-Wachstumsfaktoren oder Zytokinen beteiligt sind. Überdies ist eine erhebliche Forschung durchgeführt worden, die chemischen Modifikationen betreffen, die durch eine Desulfatierung eines Heparins dargestellt sind, und auf die Reduzierung der antikoagulierenden Wirkung infolge der Gegenwart der ATIII-Bindungsstelle zielen, um dadurch die Interaktion mit den physiologisch aktiven Faktoren zu steigern, (J. Carbohydr. Chem. (1993) 12, 507-521; Carbohydr. Res. (1989) 193, 165-172; Carbohydr. Res. (1976) 46, 87-95; WO 95/30424, etc.).
Im Hinblick auf die zuvor genannte Desulfatierung des Heparins ist der Fokus in der jüngsten Vergangenheit auf die Entfernung der Sulfatgruppe, die an der Hydroxylgruppe an der 6-Position des Glucosaminrests in dem Heparin gebunden ist (6-Desulfatierung), gerichtet worden. Als Desulfatierungsverfahren können die Verfahren unter Verwendung einer Solvolyse (WO 95/30424) und das Verfahren unter Verwendung eines silylierenden Reagenz (WO 96/01278, Carbohydrate Letters (1998), 3 (1), 71-77) genannt werden.
Mit dem erstgenannten Verfahren, einhergehend mit der Entfernung der Sulfatgruppe, die an der Hydroxylgruppe an der 6-Position des Glycosaminrests in dem Heparinmolekül gebunden ist (6-O-Sulfatgruppe), werden auch die an der Hydroxylgruppe an der 2-Position des Uronsäurerests gebundene Sulfatgruppe (2-O-Sulfatgruppe) und die an der Aminogruppe an der 2-Position des Glucosaminrests gebundenen Sulfatgruppe (N-Sulfatgruppe) entfernt. Auf diese Weise gehen im Verlauf unter Verwendung des erstgenannten Verfahrens, um die 6-O-Sulfatgruppen im Wesentlichen zu entfernen, fast die gesamten N-Sulfatgruppen der Glucosaminreste und die 2-O-Sulfatgruppen der Uronsäurereste verloren. Während die Aminogruppe an der 2-Position des Glucosaminrests des auf diese Weise modifizierten Heparins resulfatiert werden kann, ist die re-Sulfatierung an der 2-Position des Uronsäurerests ohne eine Sulfatierung der 6-Position des Glucosaminrests schwierig.
Das letztere Verfahren ist dadurch besser als das erstgenannte Verfahren, da es eine spezifischere Entfernung der 6-O-Sulfatgruppe des Glucsosaminrests ermöglicht. Bei dem mit dem letzteren Verfahren (WO 96/01278) auf diese Weise erhaltenen modifizierten Heparin ist jedoch die mit dem enzymatischen Disaccharid-Analyseverfahren bestimmte effektive Disaccharid-Ausbeute niedrig, was bedeutet, dass dort bei dem Verfahren noch ein Problem in der Weise vorliegt, insofern die strukturelle Identifizierung dafür für pharmazeutische Applikationen nicht ausreichend sein kann. Während darüber hinaus die antikoagulierende Wirkung des modifizierten Heparins stark reduziert ist, ist sie nicht abwesend, und es ist nicht möglich gewesen, ein modifiziertes Heparin zu erhalten, in dem die antikoagulierende Aktivität wesentlich eliminiert worden ist. Die WO 96/01278 offenbart ein Verfahren für die spezifische und komplette 6-O-Desulfatierung eines Heparins durch Behandlung eines Pyridiniumsalzes des Heparins mit N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamid in Pyridin bei 110°C, aber offenbart nicht die enzymatische Verdaubarkeit des resultierenden Heparin-Derivats.
Da Heparin oder Fragmente davon Affinitäten zu verschiedenen physiologisch aktiven Substanzen aufweisen und die Affinitäten eng mit den Funktionen von solchen Substanzen verwandt sind, sind intensive Studien für die Suche und Entwicklung von Arzneistoffen gemacht worden, die Heparin oder modifiziertes Heparin verwenden. Trotz dieser Anstrengungen sind sie jedoch bis jetzt nur als ein Blut-Antikoagulations-Mittel effektiv in pharmazeutischen Applikationen verwendet worden.
Das heißt, dass es bei der Fokussierung auf die Verwendung von Heparin für Applikationen außer als ein Antikoagulans notwendig ist, dessen antikoagulierenden und hämorrhagischen Wirkungen zu eliminieren und im Hinblick auf dessen Verwendung als eine pharmazeutische Substanz, hat es seine „strukturelle Identifikation als eine Substanz" zu ermöglichen. Im Hinblick auf diese Probleme müssen weitere Verbesserungen gemacht werden, und es ist erwünscht worden, diese bestehenden Probleme zu lösen und die Affinitäten des Heparins für physiologisch aktive Substanzen zu verwenden, um Arzneimittel bereitzustellen, die sicher und nützlich sind.
Offenbarung der Erfindung
Als ein Ergebnis der gewissenhaften Studien, die auf eine Lösung der obigen Probleme abzielen, gelang es den vorliegenden Erfindern unter Verwendung eines spezifischen Verfahrens eine Desulfatierung eines Glycosaminoglycans, wie z.B. eines Heparins, das Sulfatgruppen aufweist, durchzuführen, und eine Herstellung eines neuen Glycosaminoglycans, in dem seine antikoagulierenden und hämorrhagischen Aktivitäten wesentlich eliminiert wurden, während seine biologisch vorteilhaften Effekte für lebende Körper, wie z.B. seine Affinitäten für physiologisch aktive Substanzen erhalten wurden und die unidentifizierbaren Strukturen merklich in dem Umfang reduziert wurden, dass die „strukturelle Identifizierung der Substanz" leicht erreicht werden kann, was im Hinblick auf die pharmazeutischen Applikationen wichtig ist. Auf diese Weise ist die vorliegende Erfindung vollendet worden.
Es wurde speziell bestätigt, dass ein Glycosaminoglycan, das durch Unterziehen eines Sulfatgruppen aufweisenden Glycosaminoglycans einer Hitzebehandlung bei 100°C oder höher in Pyridin in der Gegenwart eines silylierenden Mittels und N-Methyl-N-(Trimethylsilyl)-Trifluoracetatmid (im Weiteren auch als „MTSTFA" bezeichnet), um die gesamten 6-O-Sulfatgruppen der Glucosaminreste wesentlich zu entfernen, gefolgt vom Verdampfen des Pyridins aus der Reaktionsmischung, einer Zugabe von Wasser und einer Konzentrierung unter reduziertem Druck, erhalten wird, höchst effektiv in der Förderung der Heilung von Hautwunden und der Behandlung von diabetischen Hautgeschwüren war, und eine Fructose-1,6-bis-phosphat-Aldolase inhibitorische Aktivität aufwies, und das dessen antikoagulierenden und hämorrhagischen Aktivitäten verschwunden waren.
Es wurde des Weiteren bestätigt, dass es möglich ist, die Struktur des mit dem obigen Verfahren hergestellten Glycosaminoglycans leicht unter Verwendung eines enzymatischen Disaccharid-Analyseverfahrens, das sich Glycosaminoglycan abbauende Enzymen zu Nutze macht, aufgrund der guten Verdaubarkeit des Glycosaminoglycans mit den Glycosaminoglycan abbauenden Enzymen genau zu spezifizieren. Dieses steht im Gegensatz zu der vorherigen Schwierigkeit bei der Identifizierung von Strukturen von modifizierten Heparinen, die durch Unterziehen von verschiedenen Arten von chemischen Behandlungen modifiziert worden sind. Die Verwendung des Glycosaminoglycans, dessen Struktur auf diese Weise wie bei Pharmazeutika identifiziert werden kann, macht es möglich, Pharmazeutika bereitzustellen, die höchst sicher und nützlich sind.
Des Weiteren haben die vorliegenden Erfinder herausgefunden, dass das Glycosaminoglycan eine hohe Affinität zur Fructose-1,6-bis-phosphat-Aldolase hatte, ein Schlüsselenzym in dem glycolytischen Stoffwechsel, und konnte als ein starker Inhibitor für dieses Enzym verwendet werden. Auf diese Weise ist es möglich geworden, einen neuen Fruktose-1,6-bis-phosphat-Aldolase-Inhibitor bereitzustellen.
Das bedeutet, dass die vorliegende Erfindung folgendes bereitstellt.

1. Ein Glycosaminoglycan, das eine Backbone-Struktur, die ein sich wiederholendes Disaccharid umfasst, das einen Uronsäurerest und einen Glucosaminrest trägt, und Sulfatgruppen aufweist, wobei im Wesentlichen keine Sulfatgruppe, die an der Hydroxylgruppe an der 6-Position des Glucosaminrestes in der Backbone-Struktur gebunden ist, nachgewiesen wird, wobei dies durch ein chemisches Disaccharid-Analyseverfahren bestimmt wird, in welchem das Glycosaminoglycan mit salpetriger Säure zerlegt, mit para-Nitrophenylhydrazin reagiert und mittels einer Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie analysiert wird und der molare Prozentanteil eines Uronsäurerestes, der eine Sulfatgruppe an der 2-Position aufweist, nicht weniger als 45% relativ zu den gesamten Uronsäureresten ist, wobei der molare Prozentanteil aus einer Disaccharid-Zusammensetzung berechnet wird, die mittels eines enzymatischen Disaccharid-Analyseverfahrens erhalten wird, in welchem das Glycosaminoglycan mit Glycosaminoglycan abbauenden Enzymen verdaut und mittels einer Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie analysiert wird.
2. Ein Glycosaminoglycan, das eine Backbone-Struktur aufweist, die ein sich wiederholendes Disaccharid umfasst, das einen Uronsäurerest und einen Glucosaminrest trägt, und Sulfatgruppen aufweist, wobei in einer durch eine enzymatische Disaccharid-Analyse erhaltenen Disaccharid-Zusammensetzung des Glycosaminoglycans, in welchem das Glycosaminoglycan mit Glycosaminoglycan abbauenden Enzymen verdaut und mittels einer Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie analysiert wird, der Gesamtanteil der 2-Acetamid-2-deoxy-4-O-(4-deoxy-α-L-threo-hex-4-enopyranosyl-uronsäure)-6-O-Sulfo-D-glucose, der 2-Deoxy-2-sulfamin-4-O-(4-deoxy-α-L-threo-hex-4-enopyranosyl-uronsäure)-6-O-sulfo-D-glucose, der 2-Acetamid-2-deoxy-4-O-(4-deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyl-uronsäure)-6-O-sulfo-D-glucose und der 2-Deoxy-2-sulfamin-4-O-(4-deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyl-uronsäure)-6-O-sulfo-D-glucose nicht mehr als 10 Molprozent ist, und die 2-Deoxy-2-sulfamin-4-O-(4-deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyrano- syluron-säure)-6-O-sulfo-D-glucose nicht mehr als 1,5 Molprozent beträgt, und eine effektive Disaccharid-Ausbeute nicht weniger als 60% beträgt.
3. Das Glycosaminoglycan nach dem Punkt 2, wobei in der durch das enzymatische Disaccharid-Analyseverfahren erhaltenen Disaccharid-Zusammensetzung der Gesamtanteil der 2-Acetamid-2-deoxy-4-O-(4-deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyl-uronsäure)-D-glucose, der 2-Deoxy-2-sulfamin-4-O-(4-deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyl-uronsäure)-D-glucose, der 2-Acetamid-2-deoxy-4-O-(4-deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyl-uronsäure)-6-O-sulfo-D-glucose und der 2-Deoxy-2-sulfamin-4-O-(4-deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyl-uronsäure)-6-O-sulfo-D-glucose nicht weniger als 45 Molprozent ist.
4. Das Glycosaminoglycan nach einem der Punkte 1 bis 3, wobei in einer ¹³C-kernmagnetischen Resonanz-Spektrometrie-Analyse des Glycosaminoglycans unter Verwendung einer 5%-igen Lösung des Glycosaminoglycans in Deuteriumoxid und von Natrium-3-(trimethylsilyl)-propionat als ein Standard im Wesentlichen kein Peak von 66,5 bis 67,5 ppm nachgewiesen wird und die Signalintensitäten bei etwa 100 ppm und 102 ppm höher als die Signalintensität bei etwa 98,3 ppm sind.
5. Ein Fructose-1,6-bis-phosphat-Aldolase-Inhibitor, der das in einem der Punkte 1 bis 4 definierte Glycosaminoglycan (im Folgenden auch als „das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung" bezeichnet) als einen Wirkstoff enhält.
6. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung als einen Wirkstoff enthält.
7. Die pharmazeutische Zusammensetzung nach dem Punkt 6, die ein Mittel zur Behandlung von Gewebsverletzungen und Geschwüren ist.
8. Die pharmazeutische Zusammensetzung nach dem Punkt 6, die ein Mittel zur Behandlung von Hauterkrankungen ist.
9. Die pharmazeutische Zusammensetzung nach dem Punkt 8, wobei das Mittel zur Behandlung von Hauterkrankungen ein Mittel zur Förderung der Heilung von Hautwunden oder ein Mittel zur Behandlung von Hautgeschwüren ist.
10. Ein Verfahren zur Herstellung des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Erhitzen eines Pyridin löslichen Salzes des Glycosaminoglycans, das eine Backbone-Struktur aufweist, die ein sich wiederholendes Disaccharid umfasst, das einen Uronsäurerest und einen Glucosaminrest trägt, und Sulfatgruppen aufweist, in Pyridin bei einer Temperatur von nicht weniger als 100°C in der Anwesenheit von MTSTFA für eine Zeitdauer, die lang genug ist, dass im Wesentlichen keine Sulfatgruppe, die an der Hydroxylgruppe an der 6-Position des Glycosaminrestes gebunden ist, nachweisbar sein sollte, wobei dies durch ein chemisches Disaccharid-Analyseverfahren bestimmt wird, in welchem das Glycosaminoglycan mit salpetriger Säure zerlegt, mit para-Nitrophenylhydrazin reagiert und mittels einer Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie analysiert wird, (b) Verdampfen des Pyridins aus der in dem Schritt (a) erhaltenen Reaktionsmischung, und (c) Zugabe von Wasser zu der in dem Schritt (b) erhaltenen Reaktionsmischung und dann Platzieren der Mischung unter vermindertem Druck bei einer Normaltemperatur.

Ausführungen der vorliegenden Erfindung werden nun beschrieben werden.
In der vorliegenden Erfindung ist das „Glycosaminoglycan, das eine Backbone-Struktur, die ein sich wiederholendes Disaccharid umfasst, das einen Uronsäurerest und einen Glycosaminrest trägt, und Sulfatgruppen aufweist" ein Glycosaminoglycan, das Sulfatgruppen zwischen den Glycosaminoglycanen aufweist, die eine Heparinstruktur einer sich wiederholenden Struktur von einem Uronsäurerest und einem Glucosaminrest aufweist, und Heparin, Heparansulfat und sulfatierte Hyaluronsäure enthält. Der „Glucosaminrest" enthält auch jene, die eine acetylierte Aminogruppe und eine sulfatierte Aminogruppe aufweisen.
1. Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist dort ein Glycosaminoglycan bereitgestellt, das eine Backbone-Struktur aufweist, die ein sich wiederholendes Disaccharid umfasst, das einen Uronsäurerest und einen Glucosaminrest trägt, und Sulfatgruppen aufweist, wobei im Wesentlichen keine Sulfatgruppe, die an der Hydroxylgruppe an der 6-Position des Glucosaminrests in der Backbone-Struktur gebunden ist, nachgewiesen wird, wobei dies durch ein chemisches Disaccharid-Analyseverfahren bestimmt wird, in welchem das Glycosaminoglycan mit salpetriger Säure zerlegt, mit Para-Nitrophenylhydrazin (auch als PNP-Hydrazin bezeichnet) reagiert und mittels einer Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (im Folgenden auch als „HPLC" abgekürzt) analysiert wird, und der molare Prozentanteil eines Uronsäurerests, der eine Sulfatgruppe an der 2-Position aufweist, nicht weniger als 45% relativ zu den gesamten Uronsäureresten ist, wobei der molare Prozentanteil aus einer Disaccharid-Zusammensetzung berechnet wird, die mittels eines enzymatischen Dissacharid-Analyseverfahrens erhalten wird, in welchem das Glycosaminoglycan mit Glycosaminoglycan abbauenden Enzymen abgebaut und mittels einer Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie analyisert wird. Wie unten beschrieben, hat das Glycosaminoglycan besonders bevorzugt eine effektive Disaccharid-Ausbeute von nicht weniger als 60%.
Wie später mit Bezug auf das Testverfahren 1 beschrieben, bezieht sich das oben genannte chemische Dissacharid-Analyseverfahren auf ein Verfahren, das die Zerlegung des zu messenden Materials mit salpetriger Säure, die Reaktion des Produkts mit Para-Nitrophenyl-Hydrazin und die Analyse des Produkts durch eine HPLC umfasst.
Die Beschreibung, dass im Wesentlichen keine Sulfatgruppe, die an der Hydroxylgruppe an der 6-Position des Glycosaminrests gebunden ist, nachgewiesen wird, bedeutet gewöhnlich, dass in dem vorher genannten chemischen Disaccharid-Analyseverfahren es nicht möglich ist, einen Peak für ein ISMS (IdoA(2S)α1 → 4AnMan(6S)-PNP, wobei AnMan(6S)-PNP AnMan(6S)-CH=N-NH-PNP bezeichnet und AnMan(6S) 2,5-Anhydromannose-6-O-Sulfat bezeichnet), das durch die obige chemische Behandlung hergestellt ist, durch die gewöhnliche HPLC nachzuweisen. Er kann speziell unter Verwendung eines Index bestimmt werden, wobei ein Prozentanteil einer Anzahl aller Glucosaminreste, die keine 6-O-Sulfatgruppe aufweisen, relativ zu der gesamten Glucosaminrest-Anzahl in dem Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung, die aus einer Fläche des ISM (IdoA(2S)α1 → 4AnMan(6S)-PNP, wobei AnMan-PNP AnMan-CH=N-NH-PNP bezeichnet und AnMan 2,5-Anhydromanose bezeichnet) -Peaks und einer Fläche des ISMS-Peaks berechnet wird. Nicht weniger als 95% kann zum Beispiel angesehen werden, um zu bedeuten „im Wesentlichen nicht nachgewiesen", und 100% ist noch bevorzugter. Zur Reduzierung der antikoagulierenden Wirkung ist es bevorzugt, dass dort im Wesentlichen kein Glucosaminrest mit der 6-O-Sulfat-Gruppe in der Struktur des Glycosaminoglycans der Erfindung vorliegt. Zur Einfachheit wird hier weiter unten das Verhältnis der Desulfatierung an der 6-Position des Glucosaminrests als das „6-Desulfatierungs-Verhältnis" bezeichnet.
Das 6-Desulfatierungs-Verhältnis kann auch aus der Signalintensität berechnet werden, die bei der Nuklear-Magnet-Resonanz-Spektrometrie, wie in den Beispielen beschrieben, erhalten wird. Die auf diesem Weig erhaltenen Ergebnisse stimmen im Wesentlichen mit dem „6-Desulfatierungs-Verhältnis" überein, das durch das vorher genannte chemische Disaccharid-Analyseverfahren erhalten wird.
Die Position und die Sulfatgruppen-Quantität, die an den konstituierenden Zuckerresten in der Heparinstruktur des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung gebunden sind, können aus einer Zusammensetzung (Disaccharid-Zusammensetzung) von ungesättigten Disacchariden berechnet werden, die durch ein enzymatisches Disaccharid-Analyseverfahren nachgewiesen werden, in dem das Glycosaminoglycan mit Glycosaminoglycan abbauenden Enzymen verdaut und mittels einer Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie analysiert wird (enzymatisches Disaccharid-Analyseverfahren unter Verwendung einer Kombination eines Verdaus mit Glycosaminglycan abbauenden Enzymen und einer HPLC).
Der „molare Prozentanteil eines Uronsäurerests, der eine Sulfatgruppe an der 2-Position relativ zu den gesamten Uronsäureresten aufweist" bedeutet, den Gesamtanteil der ungesättigten Disaccharide als 100% anzunehmen, die durch die unten genannte allgemeine Formel ausgedrückt sind [die Summe (Molaranzahl) von 2-Acetamido-2-Deoxy-4-O-(4-Deoxy-α-L-Threo-Hex-4-Enopyranosyl-Uronsäure)-D-Glucose im Folgenden als „ΔDiHS-OS" bezeichnet), 2-Deoxy-2-Sulfamin-4-O-(4-Deoxy-α-L-Threo-Hex-4-Enopyranosyl-Uronsäure)-D-Glycose (im Folgenden als „ΔDiHS-NS" bezeichnet), 2-Acetamid-2-Deoxy-4-O-(4-Deoxy-α-L-Threo-Hex-4-Enopyranosyl-Uronsäure)-6-O-Sulfo-D-Glycose (im Folgenden als „ΔDiHS-6S" bezeichnet), 2-Acetamid-2-Deoxy-4-O-(4-Deoxy-2-O-Sulfo-α-L-Threo-Hex-4-Enopyranosyl-Uronsäure)-D-Glucose (im Folgenden als „ΔDiHS-US" bezeichnet), 2-Deoxy-2-Sulfamin-4-O-(4-Deoxy-α-L-Threo-Hex-4-Enopyranosyl-Uronsäure)-6-O-Sulfo-D-Glucose (im Folgenden als „ΔDiHS-di(6, N)S" bezeichnet), 2-Deoxy-2-Sulfamin-4-O-(4-Deoxy-2-O-Sulfo-α-L-Threo-Hex-4-Enopyranosyl-Uronsäure)-D-Glucose (im Folgenden als „ΔDiHS-di(U, N)S" bezeichnet), 2-Acetamid-2-Deoxy-4-O-(4-Deoxy-2-O-Sulfo-α-L-Threo-Hex-4-Enopyranosyl-Uronsäure)-6-O-Sulfo-D-Glucose (im Folgenden als „ΔDiHS-di(U, 6)S" bezeichnet), und von 2-Deoxy-2-Sulfo-4-O-(4-Deoxy-2-O-Sulfo-α-L-Threo-Hex-4-Enopyranosyl-Uronsäure)-6-O-Sulfo-D-Glucose (im Folgenden als „ΔDiHS-tri(U, 6, N)S" bezeichnet], wobei ein Verhältnis der vorher genannten ungesättigten Disaccharide jeweils die Sulfatgruppe an der 2-Position des Uronsäurerests aufweist (die Summe (Molaranzahl) von ΔDiHS-US, ΔDiHS-di(U, N)S, ΔDiHS-di(U, 6)S und von ΔDiHS-tri(U, 6, N)S die als prozentuale Angaben, wie in der Analyse durch das enzymatische Disaccharid-Analyseverfahren unter Verwendung der Kombination eines Verdaus mit Glycosaminglycan abbauenden Enzymen und einer HPLC bestimmt wurden, dargestellt sind. Um die hohe Wirkung des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung für die Behandlung von Hauterkrankungen zu erhalten, ist dieser Wert gewöhnlich nicht weniger als 45%, bevorzugt nicht weniger als 50% und noch bevorzugter nicht weniger als 60%. Das Disaccharid-Analyseverfahren, das sich die Kombination eines enzymatischen Verdaus und einer HPLC zu Nutze macht, bezeichnet das später in dem Testverfahren 2 beschriebene enzymatische Disacharid-Analyseverfahren, das eine Kombination eines enzymatischen Verdaus und einer HPLC einsetzt.
Tabelle 1
Die Strukturen die durch die obigen Abkürzungen bezeichnet sind, können auch wie unten gezeigt, dargestellt sein:
ΔDiHS-OS: ΔHexA1 → 4GlcNAc, ΔDiHS-NS: ΔHexA1 → 4GlcNS, ΔDiHS-6S: ΔHexA1 → 4GlcNAc(6S), ΔDiHS-US: ΔHexA(2S)1 → 4GlcNAc, ΔDiHS-di(6, N)S: ΔHexA1 → 4GlcNS(6S), ΔDiHS-di(U, N)S: ΔHexA(2S)1 → 4GlcNS, ΔDiHS-di(U, 6)S: ΔHexA(2S)1 → 4GlcNAc(6S), ΔDiHS-tri(U, 6, N)S: ΔHexA(2S)1 → 4GlcNS(6S).
In den obigen Formeln stellt ΔHexA eine ungesättigte Hexuronsäure dar, stellt GlcNAc N-Acetylglucosamin dar, stellt GlcNS N-sulfatiertes Glucosamin dar und die Bindungspositionen der Sulfatgruppen sind in den Klammern gezeigt.
Die durch das enzymatische Disaccharid-Analyseverfahren erhaltenen nummerischen Werte spiegeln die Position und die Anzahl der Sulfatgruppen des Glycosaminoglycans vor dem enzymatischen Verdau wider. Für eine noch akkuratere Widerspiegelung muss der enzymatische Verdau noch einheitlicher und die Verdaubarkeit (enzymatische Verdaubarkeit (das unten beschriebene Testverfahren 4)) so hoch wie möglich sein, gewöhnlich nicht weniger als 60%, bevorzugt nicht weniger als 70% und noch bevorzugter nicht weniger als 80%.
Des Weiteren ist die effektive Disaccharid-Ausbeute des Glycosaminoglycans, die mittels des enzymatischen Disaccharid-Analyseverfahrens berechnet wird, und das Verhältnis der Disaccharid-Einheiten zeigt, die durch das Verfahren innerhalb des Glycosaminoglycans identifiziert werden können, das Ziel der Analyse. Die effektive Disaccharid-Ausbeute, die einen Index für die Leichtigkeit der Strukturidentifizierung darstellt, ist gewöhnlich nicht weniger als 60%, bevorzugt nicht weniger als 70% und noch bevorzugter nicht weniger als 80%.
Die „effektive Disaccharid-Ausbeute" ist ein Wert, der als prozentualer Gehalt ausgedrückt ist, der durch Multiplikation eines Verhältnisses der Gesamtfläche der Peaks der identifizierbaren ungesättigten Disaccharide (ΔDiHS-OS, ΔDiHS-NS, ΔDiHS-6S, ΔDiHS-US, ΔDiHS-di(6,N)S, ΔDiHS-di(U,N)S, ΔDiHS-di(U, 6)S und ΔDiHS-tri(U,6,N)S) mit der Gesamtfläche der Peaks der ungesättigten Disaccharide durch die in dem vorher genannten Disaccharid-Analyseverfahren verwendeten HPLC nachgewiesen und durch eine Enzymverdaubarkeit, erhalten wird.
In dem Fall des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung ist der Anteil der ungesättigten Disaccharide, die einen Glucosaminrest enthalten, der eine Sulfatgruppe an der 6-Position aufweist (die Summe von ΔDiHS-6S, ΔDiHS-di(6,N)S, ΔDiHS-di(U,6)S und von ΔDiHS-tri(U,6,N)S) ist nicht mehr als 10 Molprozent, bevorzugt nicht mehr als 5 Molprozent und ΔDiHS-tri(U,6,N)S ist nicht mehr als 1,5 Molprozent, bevorzugt nicht mehr als 1 Molprozent und noch bevorzugter ist sie, wie durch das enzymatische Disaccharid-Analyseverfahren analysiert, (in der Disaccharid-Zusammensetzung) nicht nachweisbar.
Das 6-Desulfatierungs-Verhältnis des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung, das unter Verwendung des Standard-Heparins, welches unten als eine Referenz genannt ist, berechnet wird, ist normalerweise nicht weniger als 90%, wenn es durch das enzymatische Disaccharid-Analyseverfahren analysiert wird.
Heparin ist dafür bekannt, dass es eine Interaktion mit (Affinität zu) verschiedenen Zytokinen, z.B. zu dem Fibroblasten Wachstumsfaktor, dem Hepatozyten Wachstumsfaktor, dem vaskulären endothelialen Zell-Wachstumsfaktor, dem transformierenden Wachstumsfaktor, dem epidermalen Wachstumsfaktor, dem Midkine, dem Interleukin 8, dem Vitronektin, dem Heparin bindenden Gehirnzell-mitogenen- Faktor und dem Heparin bindenden Neurit-Auswuchs-fördernden-Faktor usw.) zeigt, und es ist bekannt geworden, das Sulfatgruppen, die an die Heparin-Struktur gebunden sind, eine wichtige Rolle bei solchen Interaktionen spielen. Da das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung im Wesentlichen keine 6-O-Sulfatgruppe des Glucosaminrests aufweist, gehen auch die antikoagulierende Wirkung, die Affinität zu dem ATIII, welches eine wichtige Rolle bei dieser Aktion spielt, und die hämorrhagische Aktivität verloren, wobei die Heparin-Interaktion mit (Affinität zu) den vorher genannten Zytokinen erhalten bleibt. Um daher die Affinität des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung zu erhalten, ist der molare Prozentanteil der ungesättigten Disaccharide, die Glucosaminreste mit einer Sulfatgruppe aufweisen, die an die Aminogruppe an der 2-Position gebunden ist (die Summe von ΔDiHS-NS, ΔDiHSdi(6,N)S, ΔDiHS-di(U,N)S und von ΔDiHS-tri(U,6,N)S) nicht weniger als 65 Molprozent ist, noch bevorzugter nicht weniger als 75 Molprozent in der Zusammensetzung (Disaccharid-Zusammensetzung) der ungesättigten Disaccharide ist, die unter Verwendung des oben genannten enzymatischen Disaccharid-Analyseverfahrens erhalten werden. Und, wie oben beschrieben, ist der molare Prozentanteil des Uronsäurerests, der eine 2-O-Sulfat-Gruppe aufweist, relativ zu der Summe der Uronsäurereste normalerweise nicht weniger als 45%, bevorzugt nicht weniger als 50%, noch bevorzugter nicht weniger als 60%.
Um darüber hinaus die Affinität für die Zytokine zu erhalten, ist es, wenn Sodium 3-(trimethylsily)-propionat (im Weiteren als „TSP" abgekürzt) als eine Referenz (0 ppm) bei der strukturellen Analyse durch die ¹³C-Nuklear-Magnet-Resonanz (NMR)-Spektrometrie unter Verwendung einer Deuterium-Sauerstoff-Lösung (unten in Beispiel 3 beschrieben) verwendet wird, bevorzugt, dass während ein Peak bei 70,0 bis 71,0 ppm beobachtet wird, im Wesentlichen kein Peak bei 66,5 bis 67,5 ppm beobachtet werden sollte, und es ist weiterhin bevorzugt, dass wenn die Signalintensitäten um 98,3 ppm, 100 ppm und 102 ppm verglichen werden, die beiden Signalintensitäten um 100 ppm und 102 ppm höher sein sollten als die Signalintensität um 98,3 ppm. In einer der am meisten bevorzugten Ausführungen wird zusätzlich zu den vorher genannten Merkmalen kein Peak in einer Region von 96,5 bis 97,0 ppm beobachtet.
Das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung weist eine hohe Wirksamkeit zur Förderung der Wirkungen der vorher genannten Zytokine und u.a. auf die Aktivität des basischen Fibroplasten-Wachstumsfaktor (bFGF) (Zellproliferation fördernde Wirkung) auf, und es weist bevorzugt eine Wirksamkeit zur Förderung der bFGF-Aktivität auf, die nicht weniger als 80%, noch bevorzugter nicht weniger als 90% der bFGF-aktivitätsfördernden Wirksamkeit eines Standard-Heparins oder eines kommerziell erhältlichen Heparins entspricht, wie mit dem Verfahren zur Messung der bFGF-aktivitätsfördernden Wirkung bestimmt wurde, in welchem die bFGF-aktivitätsfördernde Wirkung für kultivierte Zellen gemessen wird, die einer Inhibition der Zellproliferation unter Verwendung von NaClO₃ unterzogen werden (siehe Testverfahren 9 in den Beispielen, Messung 1 für die bFGF-aktivitätsfördernde Wirkung). Des Weiteren weist das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung vorzugsweise auch eine Wirksamkeit zur Förderung der bFGF-Aktivität auf, die nicht weniger als 70%, noch bevorzugter nicht weniger als 80%, und am meisten bevorzugt nicht weniger als 90% der bFGF-aktivitätsfördernden Wirksamkeit eines Standard-Heparins oder eines kommerziell erhältlichen Heparins entspricht, wie durch ein Verfahren zur Messung der bFGF-aktivitätsfördernden Wirksamkeit, in dem die bFGF-aktivitätsfördernde Wirksamkeit für kultivierte Zellen gemessen wird, die ohne Verwendung von NaClO₃ kultiviert werden (siehe Testverfahren 9 in den Beispielen, Messung 2 für die bFGF-aktivitätsfördernde Wirksamkeit).
Da die hochsulfatierte Region (sulfatiertes Cluster) in der Backbone-Struktur des Heparins, welche als ΔDiHS-tri(U,6,N)S durch das vorher genannte Disaccharid-Analyseverfahren nachgewiesen wird, stark die antikoagulierende Wirkung und die hämorrhagische Aktivität betrifft, ist ΔDiHS-tri(U,6,N)S nicht mehr als 1,5 Molprozent, vorzugsweise nicht mehr als 1 Molprozent in dem Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung, und noch bevorzugter ist sie, wie durch das vorher genannte enzymatische Disaccharid-Analyseverfahren bestimmt, in der Zusammensetzung (Disaccharid-Zusammensetzung) der ungesättigten Disaccharide nicht nachweisbar. Ein solches Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung hat im Wesentlichen die antikoagulierende Wirkung und die hämorrhagische Aktivität verloren.
Das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung hat, wie unter Verwendung einer Gelfiltration bestimmt, vorzugsweise ein durchschnittliches Molekulargewicht von 3.000 bis 30.000, noch bevorzugter von 5.000 bis 20.000, am bevorzugtesten von 7.000 bis 16.000, aber es ist nicht besonders eingeschränkt.
Wie oben genannt, hat das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung im Wesentlichen die antikoagulierende Wirkung und die hämorrhagische Aktivität verloren. Das bedeutet, wenn die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (im Folgenden auch als „APTT" abgekürzt) und die Thromboplastinzeit (im Folgenden auch als „TT" abgekürzt) unter Zugabe von Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung bei einer Endkonzentration von 30 μg/ml in einer Reaktionsmischung in den Messverfahren für APTT und TT gemessen werden (Testverfahren 5 und 6), überschreitet APTT keine 50 Sekunden und mit der Zugabe in einer Endkonzentration von 100 μg/ml überschreitet TT keine 50 Sekunden.
Des Weiteren ist eine Konzentration bei der Messung für die Antithrombin-Aktivität unter Verwendung von einem Rinder-ATIII (z.B. das in dem unten genannten Testverfahren (Testverfahren 7) beschriebene Verfahren [Messverfahren für die Antithrombin-Aktivität] usw.) die eine 50%ige Inhibition (IC₅₀) bietet, vorzugsweise nicht weniger als 50 μg/ml, noch bevorzugter nicht weniger als 100 μg/ml.
Da das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung im Wesentlichen die oben genannte antikoagulierende Wirkung und die hämorrhagische Aktivität verloren hat, und wie in den unten genannten Beispielen beschrieben werden wird, eine ausgezeichnete wundheilungsfördernde Wirkung und eine Wirksamkeit bei der Behandlung von Hautgeschwüren aufweist, ist es als ein Wirkstoff für Pharmazeutika nützlich.
Obwohl das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung auch in einer freien Form verwendet werden kann, wird es vorzugsweise als ein pharmazeutisch zulässiges Salz erhalten. Beispiele für ein solches Salz enthalten z.B. solche pharmazeutisch zulässigen Salze, die von Alkalimetallsalzen, wie z.B. Natriumsalze und Kaliumsalze, von alkalischen Erdmetallsalzen, wie z.B. Magnesiumsalze und Kalziumsalze, von Amoniumsalzen, Aminsalzen, wie z.B. Tributylamin-Salzen usw., ausgewählt werden, aber Alkalimetallsalze, insbesondere Natriumsalze, werden bevorzugt.
2. Inhibitor der vorliegenden Erfindung
Der Inhibitor der vorliegenden Erfindung ist ein Fructose-1,6-bis-phosphat-Aldolase-Inhibitor, der dadurch gekennzeichnet ist, das er das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung als einen Wirkstoff enthält.
Das oben genannte Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung, welches als ein Wirkstoff eines Inhibitors der vorliegenden Verwendung verwendet werden kann, zeigt eine hohe Affinität zur Fructose-1,6-bis-phosphat-Aldolase (im Weiteren als „FPA" abgekürzt), die als ein Enzym bekannt ist, das die Reaktionsgeschwindigkeiten der Glycolyseenzyme kontrolliert, und weist eine Aktivität zur Inhibierung der Reaktion für das Enzym auf. Daher kann das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung den gesamten Glycoslysestoffwechsel inhibieren, und es kann daher als ein Wirkstoff eines Glycolyse-Inhibitors, insbesondere eines FPA-Inhibitors, verwendet werden.
Wie in den unten genannten Beispielen gezeigt, wurde es gefunden, dass jedes, (1) das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung, (2) ein Derivat, das dem Heparin entspricht, von dem nur die Sulfatgruppe, die durch die Esterbindung an der Hydroxylgruppe (2ODSH) an der 2-Position des Uronsäurerests des Heparins gebunden ist, entfernt ist, und (3) ein Derivat, das dem Heparin entspricht, von dem nur die Sulfatgruppe, die durch die Amidbindung an der Aminogruppe (NDSH) der 2-Position des Glucosaminrests des Heparins gebunden ist, entfernt ist, eine Affinität zu der FPA zeigte und inhibierten die Aktivität der FPA. Obwohl diese Ergebnisse zeigten, dass Heparin die höchste Aktivität zur Inhibierung der FPA zeigte, wurde es auch gefunden, dass unter den Substanzen von (1), (2) und (3) das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung die höchste FPA inhibitorische Aktivität zeigte, das Derivat von (2) die zweithöchste inhibitorische Aktivität zeigte und das Derivat von (3) die schwächste inhibitorische Aktivität zeigte. Daher zeigen diese experimentellen Ergebnisse an, dass es am wichtigsten ist, die Sulfatgruppe an der Aminogruppe an der 2-Position des Glucosaminrests in der Heparin-Struktur zu haben, es am zweitwichtigsten für die FPA-Aktivität ist, die Sulfatgruppe, die an der Hydroxylgruppe an der 2-Position des Uronsäurerests in der Heparin-Struktur gebunden ist, zu haben, und die Sulfatgruppe der geringsten Beteiligung ist die Sulfatgruppe, die durch die Esterbindung an der Hydroxylgruppe an der 6-Position des Glucosaminrests gebunden ist. Die vorliegende Erfindung wurde basierend auf diesen Ergebnissen vollendet, und der Inhibitor der vorliegenden Erfindung ist ein FPA-Inhibitor, der als einen Wirkstoff das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung enthält, das eine hohe FPA inhibitorische Aktivität, die mit der des Heparins vergleichbar ist, und verminderte Nebeneffekte, die durch das Heparin gezeigt werden, wie z.B. eine hämorrhagische Aktivität, aufweist.
Das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung, das als ein Wirkstoff für den FPA-Inhibitor verwendet wird, enthält vorzugsweise nicht weniger als 40 Molprozent eines Glucosaminrests, von dem eine Aminogruppe an der 2-Position sulfatiert ist, relativ zu der Gesamtmenge der Glucosaminreste, die die Backbone-Struktur des Glucosamins bilden. Noch spezieller ist in dem vorher genannten enzymatischen Disaccharid-Analyseverfahren (Disaccharid-Zusammensetzung) der molare Prozentanteil der ungesättigten Disaccharide, die Glucosaminreste enthalten, die die Sulfatgruppe an der 2-Position aufweisen (ΔDiHS-NS, ΔDiHS-di(6, N)S, ΔDiHS-di(U,N)S, ΔDiHS-tri(U,6,N)S) vorzugsweise nicht weniger als 40 Molprozent, noch vorzugsweise nicht weniger als 50 Molprozent. Des Weiteren enthält das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung, das als ein Wirkstoff für den FPA-Inhibitor verwendet wird, vorzugsweise nicht weniger als 45 Molprozent eines Uronsäurerests, von dem eine Hydroxylgruppe an der 2-Position sulfatiert ist, relativ zu den gesamten Uronsäureresten, die die Backbone-Struktur des Glycosaminoglycans bilden. Noch spezieller ist in dem vorher genannten enzymatischen Disaccharid-Analyseverfahren (Disaccharid-Zusammensetzung), der molare Prozentanteil der Uronsäurereste, die die Sulfatgruppe an der 2-Position aufweisen (ΔDiHS-US, ΔDiHS-di(U,6)S, ΔDiHS-di(U,N)S, ΔDiHS-tri(U,6,N)S) normalerweise nicht weniger als 45 Molprozent, vorzugsweise nicht weniger als 50 Molprozent.
Das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung, das als ein Wirkstoff für den FPA-Inhibitor verwendet wird, weist vorzugsweise Ki-Werte von weniger als 0,4 μg/ml und weniger als 2,5 μg/ml für die Isozyme A4 und C4 der Rinderhirn-Fruktose-1,6-bisphosphat-Aldolase auf, die entsprechend unter den im unten beschriebenen Beispiel 17 genannten Bedingungen bestimmt werden.
Der Inhibitor der vorliegenden Erfindung kann als ein Mittel zur Behandlung und Prävention von Krankheiten oder Funktionsstörungen verwendet werden, die von einem Hypermetabolismus des Glycolyse-Stoffwechsels begleitet werden. Beispiele für solche Erkrankungen oder Funktionsstörungen, die von einem Hypermetabolismus des Glycolyse-Stoffwechsels begleitet werden, enthalten z.B. eine Malariaparasiten-Infektion usw., und Pharmazeutika, die den Inhibitor der vorliegenden Erfindung enthalten, werden in Betracht gezogen, einen therapeutischen oder prophylaktischen Effekt bei solchen Erkrankungen oder Funktionsstörungen zu zeigen.
3. Pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung
Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass sie das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung als einen Wirkstoff enthält.
Da das vorher genannte Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung im Wesentlichen frei von der antikoagulierenden Wirkung und der hämorrhagischen Wirkung ist, welche in Betracht gezogen werden, um Probleme wie Nebeneffekte zu bekommen, kann es an lebende Körper als ein Arzneimittel verabreicht werden.
Unter den physiologischen Wirkungen, die das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung aufweist, sind besonders die Wirkungen zur Förderung der Gewebsverletzungen oder der Geschwürheilung bemerkenswert, und das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung kann als ein Mittel zur Behandlung (enthaltend prophylaktische Mittel) von Wunden und Gewebsgeschwüren verwendet werden. Das vorher genannte Gewebe enthält epitheliale Gewebe, wie z.B. Haut, Cornea und Mucosa, enthaltend die Mucosa betreffend die Nasenhöhle und die Mucosa betreffend die Mundhöhle, Bindegewebe, wie z.B. Knorpel und Knochen, und Nervengewebe, wie auch den Verdauungstrakt und Blutgefäßgewebe usw. Die Wunden enthalten Funktionsstörungen, die in den vorher genannten Geweben auftreten (bspw. Verletzungen, die durch äußere Gewalt, Brandwunden usw. verursacht sind). Unter diesen ist eine bevorzugte Ausführung der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung insbesondere ein Mittel zur Förderung der Heilung von Wunden oder Geschwüren, die auf der Haut ausgebildet sind (Mittel zur Behandlung von Hauterkrankungen), und die am meisten bevorzugten Ausführungen der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung sind ein Mittel zur Förderung der Heilung von Hautwunden und ein Mittel zur Behandlung von Hautgeschwüren. Das vorher genannte Hautgeschwür enthält, z.B., zusätzlich zu gewöhnlichen Hautgeschwüren renitente Hautgeschwüre, wie z.B. Geschwüre an den unteren Extremitäten und den Dekubitus (ein diabetische Hautgeschwür ist auch enthalten).
Da das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung eine hohe Affinität zum bFGF und, wie unten in den Beispielen dargestellt, eine hohe Aktivität zur Förderung dieser Aktivität zeigt, kann die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zusätzlich zu den vorher genannten Ausführungen als Ausführung verwendet werden, die in der Absicht verabreicht wird, um Funktionsstörungen und Erkrankungen zu heilen, bei denen davon ausgegangen wird, dass bFGF involviert ist, und es zeigt verglichen mit den Pharmazeutika, die die bekannten modifizierten Heparine enthalten, eine noch hervorragendere Wirkung. Beispiele für solche Funktionsstörungen und Erkrankungen enthalten z.B. eine Erkrankung der Wurzelhaut, eine Restenose, Krebs, Erkrankungen, die eine Neovaskularisation enthalten (proliferierende Retinitis, rheumatoide Arthritis, Psoriasis, usw.), einen ischemischen Reperfusionsschaden, eine Entzündung, verschiedene Kreislauf-Organ-Erkrankungen, usw.
Wie für den Inhibitor der vorliegenden Erfindung erklärt, kann es darüber hinaus als ein Wirkstoff zur Behandlung und Prävention von Erkrankungen verwendet werden, die von einem Hypermetabolismus des Glycolyse-Stoffwechsels begleitet werden, da das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung eine FPA-inhibitorische Wirkung aufweist,
Daher können Hauterkrankungen behandelt werden und können Erkrankungen, die von einem Hypermetabolismus des Glycolyse-Stoffwechsels begleitet werden, durch Verabreichung einer wirksamen Menge des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung an ein Individuum, das die Behandlung von Hauterkrankungen oder die Prävention von Erkrankungen benötigt, welche von einem Hypermetabolismus des Glycolyse-Stoffwechsels begleitet werden, behandelt oder verhindert werden.
Die Dosierungsformen und die Verabreichungswege, die verwendet werden, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung an einen leben den Körper verabreicht wird, kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von den Merkmalen und dem Schweregrad der vorliegenden Erkrankungen ausgewählt werden. Z.B. kann das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung so wie es ist, sicher parenteral oder oral oder in der Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die andere pharmazeutisch zulässige Träger, Arzneistoffträger, Verdünnungsmittel usw. enthält (z.B. externe Präparationen, wie z.B. Lösungen, Suspensionen, Salben, Pflaster, Lotionen, Pasten, Einreibemittel und Lappen und Injektionen, Zäpfchen, Tabletten, Kapseln, usw.), an warmblütige Tiere verabreicht werden (z.B. den Mensch, die Maus, die Ratte, den Hamster, das Kaninchen, den Hund, die Katze, das Pferd, usw.).
Wenn das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung als ein Wirkstoff zur Behandlung von Hauterkrankungen verwendet wird, ist die parenterale Verabreichung besonders bevorzugt, und geeignete Dosierungsformen für eine solche Verabreichung enthalten die vorher genannten externen Präparationen. Die Verabreichung kann durch Tröpfeln, Auftragen, Vergipsen usw. erzielt werden, ist aber nicht darauf eingeschränkt.
Die Formuliermengen in den Zusammensetzungen und die Verabreichungsmengen des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung sollten individuell in Abhängigkeit von den Verabreichungsmaßnahmen der Präparationen, der Dosierungsformen, den spezifischen Voraussetzungen der Patienten, dem Körpergewicht der Patienten usw. entschieden werden und sie sind nicht besonders eingeschränkt. Jedoch ist die Verabreichungsmenge des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung allgemein, z.B. etwa 100 μg/kg bis etwa 100 mg/kg am Tag. In Bezug auf die Verabreichungsfrequenz der Präparationen, kann sie einmal am Tag sein oder sie kann zwei- bis viermal am Tag sein.
Die Menge des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung, die zu der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung hinzugegeben wird, variiert in Abhängigkeit von der Dosierungsform der Zusammensetzung. Sie kann z.B. etwa 10 μg bis etwa 50 μg pro Einheit der Zusammensetzung sein, aber sie sollte in Abhängigkeit von der Dosierungsform, den spezifischen Voraussetzungen der Patienten usw. angemessen kontrolliert werden.
Die in einem akuten Toxizitätstest in Mäusen (Männchen und Weibchen) bestimmte 50%-ige Todesdosis (LD₅₀) von normalem Heparin ist dafür bekannt, dass sie nicht weniger als 5.000 mg/kg für die orale Verabreichung, nicht weniger als 2.500 mg/kg für die subkutane oder intraperitonale Verabreichung oder nicht weniger als 1.000 mg/kg für die intravenöse Injektion ist, und es wird zur Zeit allgemein als ein Arzneimittel (Antikoagulans) verwendet. Daher ist dessen Sicherheit schon festgestellt worden.
Auf der anderen Seite zeigte das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung, das für die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wie in den unten genannten Beispielen angegeben, keinen Todesfall, wenn es an normale Ratten und Mäuse mit angeborener Diabetes verabreicht wurde. Des Weiteren ist das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung eine Substanz, die auf Heparin basierend hergestellt ist und eine extrem reduzierte antikoagulierende Wirkung und hämorrhagische Aktivität im Vergleich mit Heparin zeigt oder im Wesentlichen diese Wirkungen verloren hat. Daher kann die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung enthält, als hochsicher für warmblütige Tiere genannt werden.
4. Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung
Das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des vorher genannten Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung und enthält die folgenden Schritte:

(a) Erhitzen eines pyridinlöslichen Salzes des Glycosaminoglycans, das eine Backbone-Struktur aufweist, die ein sich wiederholendes Disaccharid umfasst, das einen Uronsäurerest und einen Glucosaminrest trägt, und Sulfatgruppen aufweist, in Pyridin bei einer Temperatur von nicht weniger als 100°C in der Gegenwart von MTSTFA für einen Zeitraum, der lang genug ist, dass im Wesentlichen keine Sulfatgruppe, die an der Hydroxylgruppe an der 6-Position des Glucosaminrests gebunden ist, nachgewiesen werden sollte, wobei dies durch das enzymatisches Disaccharid-Dialyseverfahren bestimmt wird,
(b) Abdampfen des Pyridins aus der in Schritt (a) erhaltenen Reaktionsmischung und
(c) Zugabe von Wasser zu der in Schritt (b) erhaltenen Reaktionsmischung und dann Platzieren der Mischung unter reduziertem Druck bei einer gewöhnlichen Temperatur.

Ein Beispiel für das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung wird unten erklärt werden.
(a) Der Erhitzungsschritt eines Pyridin löslichen Salzes in Pyridin bei einer Temperatur von nicht weniger als 100°C in der Gegenwart von MTSTFA
Das „Pyridin lösliche Salz des Glycosaminoglycans, das eine Backbone-Struktur aufweist, die ein sich wiederholendes Disaccharid umfasst, das einen Uronsäurerest und einen Glucosaminrest trägt, und Sulfatgruppen aufweist", das in dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist vorzugsweise ein Pyridiniumsalz des Heparins, obwohl es nicht besonders eingeschränkt ist, solange es ein Pyridin lösliches Salz des Heparins ist. Ein solches Pyridiniumsalz eines Heparins kann z.B. durch Durchlaufen eines Natriumsalzes eines Heparins durch eine Kationen-Austauscher-Säule (z.qB. eine mit Amberlite IR-120B (H⁺-Form)-Harz gepackte Säule (hergestellt von ORGANO CORP.)), die mit destilliertem Wasser equilibriert ist, um in eine freie Form überführt zu werden, und Zugabe von Pyridin im Überfluss zu der resultierenden sauren Fraktion, um dessen pH auf 5 bis 7, vorzugsweise auf 5,5 bis 6,5 einzustellen, und dem Lyophilisieren der Fraktion erhalten werden. Auch ein kommerziell erhältliches Heparin-Pyridinium-Salz kann verwendet werden.
Das vorher genannte Pyridin lösliche Salz des Heparins wird in Pyridin in der Gegenwart von MTSTFA reagiert. Das für die Reaktion verwendete MTSTFA wird in einer Menge von normalerweise des 6-fachen bis 12-fachen Volumens (w/w), vorzugsweise des 8-fachen bis 11-fachen Volumens (w/w) des Pyridin löslichen Salzes des Heparins hinzugegeben. Die Menge des für die Reaktion verwendeten Pyridins ist vorzugsweise das 5- bis 150-fache Volumen (v/w), vorzugsweise das 10- bis 120- fache Volumen (v/w), besonders bevorzugt das 15- bis 110-fache Volumen (v/w) des Pyridin löslichen Salzes des Heparins, aber es ist nicht auf diese Mengen eingeschränkt.
Die Temperatur für die vorher genannte Reaktion ist vorzugsweise 100 bis 115°C, besonders bevorzugt 108 bis 112°C. Die Zeitdauer, die lang genug ist, das im Wesentlichen keine Sulfatgruppe, die an der Hydroxylgruppe an der 6-Position des Glycosaminrests gebunden ist, die in dem chemischen Disaccharid-Analyseverfahren nachgewiesen werden sollte, wenn eine Temperatur innerhalb des vorher genannten bevorzugten Temperaturbereiches aufrechterhalten wird, ist vorzugsweise 90 bis 150 Minuten, besonders bevorzugt 100 bis 130 Minuten. Darüber hinaus ist es durch Aufrechterhalten der vorher genannten Temperatur für 10 bis 20 Minuten, 25 bis 35 Minuten oder 50 bis 70 Minuten z.B. auch möglich, ein Glycosaminoglycan herzustellen, das etwa 50%, etwa 70% oder entsprechend etwa 90% des 6-Desulfatierungs-Verhältnisses aufweist. Das bedeutet, dass es bei dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung möglich ist, das 6-Desulfatierungs-Verhältnis, wie oben beschrieben, durch Kontrolle der Reaktionszeit genau zu bestimmen.
Nach der Beendung der vorher genannten Reaktion wird die Reaktion bevorzugt durch Kühlen der Reaktionsmischung gestoppt. Eine solche Kühlung kann z.B. durch Stehenlassen eines Gefäßes, welches die Reaktionsmischung enthält, bei Raumtemperatur oder durch Kühlen unter fließendem Wasser oder Eis erzielt werden. Während das Verfahren zum Kühlen nicht besonders eingeschränkt ist, wird es bevorzugt durch Kühlen mit Eis erzielt.
(b) Pyridin-Verdampfungsschritt
Das Pyridin wird aus der gekühlten Reaktionsmischung verdampft. Während das Pyridin mit jedem bekannten Verfahren zum Verdampfen organischer Lösungsmittel verdampft werden kann, wird es bevorzugt unter Verwendung eines Evaporators bei 25 bis 37°C unter vermindertem Druck wegen der Leichtigkeit dieses Verfahrens durchgeführt. Die Reaktionsmischung wird durch das Verdampfen konzentriert. Bezüglich des Grads der Konzentration der Reaktionsmischung ist er vorzugsweise 7- bis 25-fach der Konzentration, besonders bevorzugt 8- bis 20-fach der Konzentration der Reaktionsmischung.
Der Ausdruck „verminderter Druck" bedeutet gewöhnlich einen Druck von 1,33 bis 1,33 × 10^-2 Pascal (10^-2 bis 10^-4 Torr).
(c) Wasserzugabeschritt und Platzieren unter vermindertem Druck bei gewöhnlicher Temperatur
Zu der durch Verdampfen des Pyridins konzentrierten Reaktionsmischung wird Wasser hinzugefügt, um MTSTFA, das an den Hydroxylgruppen gebunden ist, und freies MTSTFA abzubauen. Die Menge des zugefügten Wassers ist vorzugsweise eine 1,5- bis 3-fache Menge und am meisten bevorzugt eine 1,8- bis 2,5-fache Menge im Hinblick auf die konzentrierte Reaktionsmischung. Wenn das Wasser, wie oben beschrieben, zu der konzentrierten Reaktionsmischung hinzugegeben wird, wird eine weiße Trübung in der Reaktionsmischung erzeugt. Um die weiße Trübung zu entfernen, wird die konzentrierte Reaktionsmischung, zu der das Wasser hinzugefügt wird, unter vermindertem Druck bei einer gewöhnlichen Temperatur platziert. Der verminderte Druck bei einer gewöhnlichen Temperatur kann durch Verwendung eines Evaporators realisiert werden, und der verminderte Druck wird vorzugsweise bei 25 bis 37°C aufrechterhalten, bis die weiße Trübung verschwindet. Der verminderte Druck wird normalerweise für 5 bis 10 Minuten aufrechterhalten. Der verminderte Druck ist wie der vorher genannte verminderte Druck vorzugsweise ein Druck von 1,33 bis 1,33 × 10^-2 Pascal (10^-2 bis 10^-4 Torr), und er ist vorzugsweise ein Druck, unter dem die konzentrierte Mischung aufgrund des reduzierten Drucks gekocht wird.
(d) Andere Schritte
Nach der Behandlung des vorher genannten Schritts (c) werden die Abbauprodukte des MTSTFA's und die organischen Lösungsmittel vorzugsweise aus der Reaktionsmischung entfernt. Zu diesem Zweck können bekannte Verfahren verwendet werden, die Verfahren unter Verwendung einer Dialyse, einer Ethanol-Präzipitation, einer Kation-Austauscher-Säule usw. enthalten.
Wenn eine Dialyse verwendet wird, kann nur fließendes Wasser oder eine Kombination aus fließendem Wasser und destilliertem Wasser als die äußere Flüssigkeit der Dialyse verwendet werden. Wenn gegen fließendes Wasser dialysiert wird, wird die Dialyse für mindestens 24 Stunden, vorzugsweise für mindestens 40 Stunden, am meisten bevorzugt für 48 Stunden durchgeführt. Wenn die Dialyse unter Verwendung einer Kombination aus fließendem Wasser und destilliertem Wasser durchgeführt wird, kann die Reaktionsmischung gegen fließendes Wasser dialysiert und dann gegen destilliertes Wasser dialysiert werden. Nachdem, wie oben beschrieben, die Dialyse gegen fließendes Wasser durchgeführt ist, wird die Dialyse gegen destilliertes Wasser normalerweise für mindestens eine Stunde, vorzugsweise für 1,5 bis 2,5 Stunden durchgeführt.
Von der Reaktionsmischung, von der die Abbauprodukte des MTSTFA's und die organischen Lösungsmittel entfernt werden, kann das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung in der Form eines Salzes davon durch ein gewöhnliches Verfahren zum Präzipitieren des Glycosaminoglycans erhalten werden.
Als das Verfahren zum Erhalten des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung als ein Salz, kann z.B. ein Verfahren genannt werden, dass das Fraktionieren der inneren Lösung, die durch die Dialyse unter Verwendung einer mit destilliertem Wasser equilibrierten Kation-Austauscher-Säule erhalten wird (z.B. eine mit Amberlite IR-120B (H⁺-Form)-Harz gepackte Säule (hergestellt von ORGANO CORP.)), um eine saure Fraktion zu sammeln, das Einstellen des pH's auf die saure Fraktion auf 8 bis 10, vorzugsweise 8,5 bis 9,5 durch Zugabe einer wässrigen alkalischen Lösung (z.B. eines wässrigen Alkalimetallhydroxids oder Erdalkalimetallhydroxids, wie z.B. ein wässriges Natriumhydroxid, ein wässriges Kaliumhydroxid, ein wässriges Magnesiumhydroxid und ein wässriges Kalziumhydroxid, vorzugsweise bei einer Konzentration von 0,1 bis 2 N), das Dialysieren der Fraktion gegen fließendes Wasser für normalerweise mindestens 15 Stunden, vorzugsweise etwa 18 Stunden, dann gegen destilliertes Wasser für normalerweise 1,5 bis 2,5 Stunden und das Lyophilisieren der durch die Dialyse erhaltenen inneren Lösung, umfasst. Durch dieses Verfahren kann ein lyophilisiertes Produkt des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung erhalten werden.
Eine modifizierte Version des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung mit unterschiedlichen Graden der Sulfatierung an der 2-Position des Glucosaminrests und der 2-Position des Uronsäurerests kann wie benötigt durch Veränderung solcher Sulfatierungsgrade des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung zweckmäßig unter Verwendung eines Verfahrens, das die Sulfatierung der Aminogruppe an der 2-Position des Glucosaminrests oder der Hydroxylgruppe an der 2-Position des Uronsäurerests, welche die Backbone-Struktur bilden, umfasst, und mit einem Verfahren, das die Freisetzung der Sulfatgruppe an der 2-Position des Uronsäurerests, welcher die Backbone-Struktur ausmacht, umfasst, in Kombination hergestellt werden.
Als das Verfahren zur Sulfatierung der Aminogruppe an der 2-Position des Glucosaminrests kann z.B. das Verfahren von Nagasawa et al. (Carbohydr. Res., (1989) 193, 165-172) mit einer Modifikation genannt werden. D.h., dass das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung oder ein Salz davon in einer alkalischen Lösung etwa bei pH 9 bis 10 (z.B. eine Natriumcarbonatlösung, eine Natriumhydroxidlösung, eine Kaliumhydroxidlösung usw.) gelöst wird und festes Trimethylammonium-Sulfonat oder Triethylammonium-Sulfonat zusätzlich bei 50 bis 55°C über 6 bis 24 Stunden hinzugegeben wird.
Des Weiteren kann als das Verfahren zur Sulfatierung der Hydroxylgruppe an der 2-Position des Uronsäurerests, z.B. auch das Verfahren von Nagasawa et al. (Carbohydr. Res. (1989) 193, 165-172) genannt werden, welches das gleiche, wie oben genannte, Verfahren mit einer Modifikation ist. D.h., dass das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung in einer konventionellen Weise in ein Tributylammoniumsalz durch Salzaustausch umgewandelt wird, und das erhaltene Tributylammoniumsalz des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung wird vollständig in N,N-Dimethylformamid gelöst, und es wird ihm erlaubt mit 5 bis 20 Molaräquivalenten/(Mol der freien Hydroxylgruppen) eines sulfatierten Pyridins bei -10 bis 0°C für eine Stunde zu reagieren. Bei diesem Verfahren wird jedoch einhergehend mit der Sulfatierung der Hydroxylgruppe an der 2-Position des Uronsäurerests auch die Sulfatgruppe an der 6-Position des Glucosaminrests sulfatiert. Wenn dieses Verfahren verwendet wird, ist es daher bevorzugt, das Produkt dem Verfahren zur Herstellung des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung erneut zu unterziehen, um die Sulfatgruppe an der 6-Position des Glucosaminrests freizusetzen.
Als das Verfahren zur Freisetzung der Sulfatgruppe an der 2-Position des Uronsäurerests kann z.B. eine teilweise modifizierte Version eines Verfahrens von Jaseja et al. (Can. J. Chem. (1989) 67, 1449-1456) genannt werden. D.h., dass ein Natriumsalz des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung in einer NaOH-Lösung gelöst und sofort lyophilisiert wird. Das erhaltene lyophilisierte Pulver wird in destilliertem Wasser gelöst und auf pH 6 bis 8, vorzugsweise pH 6,5 bis 7,5 durch Zugabe von Essigsäure eingestellt. Dann wird diese Lösung der Dialyse unterzogen und lyophilisiert.
Eine Präparation eines Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung enthält vorzugsweise wenige kontaminierende Endotoxine. Insbesondere ist die Menge solcher kontaminierenden Endotoxine (Endotoxin-Aktivität), die in einem mg einer Präparation des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung enthalten sind, vorzugsweis nicht mehr als 0,2 USP Endotoxin-Unit (EU), noch bevorzugter nicht mehr als 0,1 EU, am meisten bevorzugt weniger als 0,05 EU, aber ist nicht darauf eingeschränkt.
Des Weiteren weist eine Präparation des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung vorzugsweise einen Gehalt eines Restpyridins von nicht mehr als 200 ppm, noch bevorzugter nicht mehr 150 ppm, am meisten bevorzugt nicht mehr als 100 ppm auf, um die Sicherheit zu gewährleisten, wenn die Präparation des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung als ein Ausgangsmaterial für Pharmazeutika verwendet wird. Gemäß dem japanischen Arzneibuch ist der Restgehalt in pharmazeutischen Präparationen des Pyridins mit nicht mehr als 200 ppm angeordnet.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt den Zeitverlauf der Veränderung eines ¹³C-MNR-Spektrums während der Herstellung eines Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung (Erfindung 2). 1 (1) zeigt ein ¹³C-MNR-Spektrum des Standard-Heparins (Standard-H). 1 (2), (3), (4) und (5) zeigen ¹³C-MNR-Spektren eines Glycosaminoglycans, das unter Veränderung der Reaktionszeit bei 110°C bis 15, 30, 60 und entsprechend 120 Minuten erhalten wird (Kontrolle 3, Kontrolle 4, Kontrolle 5 und Erfindung 2). In der Figur ist 6S ein Signal der 6-Position eines Kohlenstoffatoms eines Glucosaminrests, der eine 6-O-Sulfatgruppe aufweist, und 6 ist ein Signal der 6-Position eines Kohlenstoffatoms eines Glucosaminrests ohne eine 6-O-Sulfatgruppe.
2 zeigt ein ¹³C-MNR-Spektrum eines Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung (Erfindung 1).
3 zeigt ein ¹³C-MNR-Spektrum eines Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung (Erfindung 3).
4 zeigt ein ¹³C-MNR-Spektrum eines Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung (Erfindung 4).
5 zeigt ein ¹³C-MNR-Spektrum eines Kontroll-Glycosaminoglycans (Kontrolle 1).
6 zeigt ein ¹³C-MNR-Spektrum eines Kontroll-Glycosaminoglycans (Kontrolle 2).
7 zeigt die heilungsfördernde Wirksamkeit des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung bei einer heilenden Hautwunde (Erfindung 2).
8 zeigt die heilungsfördernde Wirksamkeit des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung bei einem diabetischen Hautgeschwür (Erfindung 2).
BESTES VERFAHREN ZUR AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung mit Bezug auf die vorliegenden Beispiele noch spezieller erklärt werden.
Als erstes werden die Testverfahren erklärt werden.
Testverfahren 1
[Nachweis der Sulfatgruppe, die an der Hydroxylgruppe an der 6-Position eines Glucosaminorests gebunden ist, unter Verwendung eines chemischen Disaccharid-Analyseverfahrens und Berechnung des 6-Desulfatierungs-Verhältnisses]
Gemäß dem Verfahren von Kariya et al. (Kariya et al., J. Biochem. (1998) 123, 240-246) wurde das 6-Desulfatierungs-Verhältnis einer Testsubstanz bestimmt. D.h., 100 μl einer salpetrigen Säurelösung (pH 1,5) wurden zu 1 mg einer Probe hinzugegeben und bei Raumtemperatur für 10 Minuten belassen. Die Mischung wurde mit 1 N Natriumcarbonat auf pH 7,5 eingestellt und durch Einblasen eines Edelgases getrocknet. Zu dem getrockneten Produkt wurden 200 μl destilliertes Wasser und 200 μl Acetonitril hinzugegeben, das 1 % PNP-Hydrazin enthält, und die Mischung wurde bei 37°C für 30 Minuten belassen, um eine Ankopplungsreaktion des Glycosaminoglycans und des PNP's zu erlauben. Dann wurde es teilweise unter Verwendung einer SepPak C-18-Kartuschen-Säule (Waters) gereinigt. Das teilweise gereinigte Produkt wurde mittels einer IPRP-HPLC (Ion-Paarungs-Reverse-Phase-HPLC) analysiert, um die Anwesenheit oder die Abwesenheit eines ISMS-Peaks zu bestimmen (IdoA(2S)-AnMan(6S)-PNP). Des Weiteren wurden die ISM-Peakflächen (IdoA(2S)-AnMan-PNP) und ISMS (IdoA(2S)-AnMan(6S)-PNP) berechnet und die erhaltenen Werte wurden verwendet, um das 6-Desulfatierungs-Verhältnis gemäß der folgenden Formel zu berechnen: 6-Desulfatierungs-Verhältnis = (B0 × A1 – A0 × B1) / (B0(A1 + B1)) × 100 (%),wobei A₀ die ISM-Peakfläche ist, wenn das unten genannte Standard-Heparin als eine Probe verwendet wird, B₀ ist die ISMS-Peakfläche, wenn das unten genannte Standard-Heparin als eine Probe verwendet wird, A₁ ist die ISM-Peakfläche, wenn eine Testsubstanz (als genereller Name für zu messende Substanzen, wie z.B. Standard-Heparin, Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung usw. verwendet) als eine Probe verwendet wird, und B₁ ist die ISMS-Peakfläche, wenn die Testsubstanz als eine Probe verwendet wird.
Testverfahren 2
[Enzymatisches Disaccharid-Analyseverfahren, welches die Kombination eines Verdaus mit Glycosaminoglycan abbauenden Enzymen und die Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie verwendet]
(1) Verdau mit Glycosaminoglycan abbauenden Enyzmen
1,0 mg einer Testsubstanz wurde in 220 μl eines 20 mM Natriumacetats (pH 7,0) gelöst, das 2 mM Kalziumacetat enthält. Glycosaminoglycan abbauende Enzyme (jeweils 20 mU einer Heparinase und einer Heparitinase I und II) wurden dazu gegeben, und es wurde ihnen erlaubt bei 37°C für zwei Stunden zu reagieren.
(2) Analyse durch die HPLC
Der enzymatische Verdau der unter der obigen (1) erhaltenen Lösung (20 μl) wurde unter Verwendung einer HPLC (Shimadzu Corp., Model LC6AD) unter den folgenden Bedingungen analysiert. Eine Ionenaustauschersäule (Dionex, CarboPac PA-1-Säule, Φ 4,0 × 250 mm) wurde entsprechend mit einem bekannten Verfahren (Kariya, et al., Comp. Biochem. Physiol. (1992) 103B, 473-479) verwendet, um eine Elution bei einer Flussrate von 1 ml pro Minute unter Verwendung eines Lithium-Chlorid-Gradienten (50 mM → 2,5 M) auszuführen, und ein Absorptionsvermögen bei 232 nm wurde gemessen.
(3) Berechnung der Disaccharid-Zusammensetzung, Molprozent des 2-O-sulfatierten Uronsäurerests in den gesamten Uronsäureresten und eine effektive Disaccharid-Ausbeute
Die Disacharid-Zusammensetzung wurde durch Bestimmung der Quantität jedes identifizierbaren ungesättigten Disaccharids (ΔDiHS-OS, ΔDiHS-NS, ΔDiHS-6S, ΔDiHS-US, ΔDiHS-di(6,N)S, ΔDiHS-di(U,N)S, ΔDiHS-di(U,6)S und ΔDiHS-tri(U,6,N)S) aus den unter der obigen (2) durch die HPLC nachgewiesenen Peakflächen und Berechnen des Anteils jedes ungesättigten Disaccharids (Molprozent). Das Molprozent des Uronsäurerests in den gesamten Uronsäureresten wurde als Anteil der ungesättigten Disaccharide berechnet, die die Sulfatgruppe an der 2-Position des Uronrestes aufweisen (Gesamtfläche der Peaks von ΔDiHS-US, ΔDiHS-di(U,N)S, ΔDiHS-di(U,6)S und ΔDiHS-tri(U,6,N)S) unter Annahme der Gesamtquantität der durch die HPLC identifzierbaren ungesättigten Disaccharide [Gesamtfläche der Peaks von ΔDiHS-OS, ΔDiHS-NS, ΔDiHS-6S, ΔDiHS-US, ΔDiHSdi(6,N)S, ΔDiHS-di(U,N)S, ΔDiHS-di(U,6)S und ΔDiHS-tri(U,6,N)S] als 100%.
Die effektive Disaccharid-Ausbeute ist als prozentualer Gehalt eines Anteils der Gesamtfläche der Peaks der identifizierbaren ungesättigten Disaccharide (ΔDiHS-OS, ΔDiHS-NS, ΔDiHS-6S, ΔDiHS-US, ΔDiHS-di(6,N)S, ΔDiHS-di(U,N)S, ΔDiHS-di(U,6)S und ΔDiHS-tri(U,6,N)S) in der Gesamtfläche aller durch die HPLC-Analyse in dem obigen Disaccharid-Analyseverfahren nachgewiesenen Peaks, multipliziert mit der entsprechend dem folgenden Testverfahren 4 gemessenen enzymatischen Verdaubarkeit, dargestellt.
Testverfahren 3
[Messung des Molekulargewichts]
10 μl einer Lösung, die 3% (w/w) einer Testsubstanz enthält, wurde durch eine HPLC-Gelfiltration analysiert. Die verwendete Säule war eine TSK-Gel-(G4000+G3000+G2500)PW_XL (Tosoh Corp., Φ 7,8 × 300 mm). Die Testsubstanz wurde unter Verwendung von 0,2 M Natriumchlorid als ein Elutionsmittel bei einer Flussrate von 0,6 ml/Minute eluiert. Ein Differential-Refraktometer (Shimadzu Corp., Modell AID-2A) wurde verwendet, um die Testubstanz nachzuweisen. Das Molekulargewicht wurde unter Verwendung eines Heparins mit vorbestimmtem Molekulargewicht (durchschnittliches Molekulargewicht) als Kontrolle verwendet (Kaneda et al., Biochem. Biophys. Re. Comm. (1996) 220, 108-112).
Testverfahren 4
[Messverfahren für die enzymatische Verdaubarkeit]
(1) Verdau mit Glycosaminoglycan abbauenden Enzymen
1,0 mg einer Testsubstanz wurde in 220 μl eines 20 mM Natriumacetats (pH 7,0) gelöst, das 2 mM Kalziumacetat enthält. Glycosaminoglycan abbauende Enzyme (jeweils 20 mU einer Heparinase und einer Heparitinase I und II) wurden dazugegeben, und es wurde ihnen erlaubt bei 37°C für zwei Stunden zu reagieren.
(2) Analyse durch Gelfiltration
20 μl der nach dem enzymatischen Verdau gemäß der obigen (1) erhaltenen Lösung wurden unter Verwendung einer HPLC-Gelfiltration technisch analysiert. Die verwendete Säule war eine TSK-Gel-(G4000+G3000+G2500)PW_XL (Tosoh Corp., Φ 7,8 × 300 mm). Die Testsubstanz wurde unter Verwendung eines 0,2 M Natriumchlorids als ein Elutionsmittel bei einer Flussrate von 0,6 ml pro Minute eluiert. Ein Differential-Refraktormeter (Shimadzu Corp., Modell AID-2A) wurde verwendet, um die Testsubstanz nachzuweisen. Die enzymatische Verdaubarkeit wurde als prozentualer Gehalt der Gesamtfläche der Peaks bei den Retentions-Zeiten von 41,5 Minuten (trisulfatiertes ungesättigtes Disaccharid), 42 Minuten (disulfatiertes ungesättigtes Disaccharid), 43 Minuten (monosulfatiertes ungesättigtes Disaccharid) und 45 Minuten (ungesättigtes Disaccharid ohne eine Sulfatgruppe) relativ zu der Gesamtfläche der Peaks bei den Retentionszeiten von 40 Minuten (ungesättigte Tetrasaccharide), 41,5 Minuten (trisulfatiertes ungesättigtes Disaccharid), 42 Minuten (disulfatiertes ungesättigtes Disaccharid), 43 Minuten (monosulfatiertes ungesättigtes Disaccharid) und 45 Minuten (ungesättigtes Disaccharid ohne eine Sulfatgruppe) berechnet.
Testverfahren 5
[Messverfahren für die aktivierte partielle Thromboplastin-Zeit (APTT)]
Eine Injektionsspritze, die 3,2% Natriumcitrat enthält, wurde verwendet, um Blut in einem 9-fachen Volumen des wässrigen Natriumcitrats aus der abdominalen Vena Cava der Ratte zu sammeln. Die Mischung wurde bei 4°C bei 1.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert, um Plasma zu erhalten. 100 μl des Plasmas und 100 μl einer physiologischen Salzlösung, die eine Testsubstanz in einer vorbestimmten Konzentra tion enthält, wurden in Messbecher dispensiert und bei 37°C für eine Minute inkubiert. Dann wurden 100 μl Actin (Markenname von Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd.), welches vorher bei 37°C für 5 Minuten belassen worden ist, hinzugegeben und bei 37°C für weitere 2 Minuten inkubiert. Anschließend wurde der Beginn einer Koagulation durch Zugabe von 100 μl einer 0,02 M Kalziumchlorid-Lösung, die vorher bei 37°C gehalten wurde, ermöglicht. Die Koagulationszeit wurde unter Verwendung eines automatischen Blut-Koagulations-Messapparats (Baxter, Modell AMELUNG KC10A) gemessen.
Testverfahren 6
[Messverfahren für die Thrombin-Zeit (TT)]
100 μl des Plasmas, das gemäß dem für das oben beschriebene APTT-Messverfahren erklärten Verfahrens hergestellt ist, und 100 μl einer physiologischen Salzlösung, die eine Testsubstanz in einer vorbestimmten Konzentration enthält, wurden in Messbecher dispensiert und bei 37°C für eine Minute inkubiert. Dann wurde die Koagulation durch Zugabe von 100 μl Thrombin (10 U/ml, Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd.), das vorher bei 37°C für 5 Minuten belassen wurde, gestartet. Die Koagulationszeit wurde unter Verwendung eines Koagulometers (Baxter, Modell AMELUNG KC10A) gemessen.
Testverfahren 7
[Messverfahren für die Antithrombin-Aktivität]
Drei Lösungen, 350 μl eines 20 mM Tris-Puffer (pH 7,4), der 150 mM Natriumchlorid, 10 mM Kalziumchlorid und 0,1% Rinderserum-Albumin enthält, 100 μl einer Rinder-ATIII-Lösung (1 U/ml in dem gleichen Puffer) und 100 μl einer zweifach seriell verdünnten wässrigen Lösung einer Testsubstanz (Probe), wurden in dem gekühlten Zustand gemischt und bei 37°C für 2 Minuten inkubiert. Zu dieser Lösung wurden 50 μl einer Rinder-Thrombin-Lösung (50 mU/ml in destilliertem Wasser) hinzugegeben und bei 37°C für 5 Minuten inkubiert. Dann wurden zu der Mischung 100 μl einer Substratlösung (Boc-Val-Pro-Arg-MCA (Peptid-Labor, Boc bezeichnet Tert-Butyloxycarbonyl und MCA bezeichnet 7-Amino-4-methylcoumarin und 70 μM wässrige Lösung) hinzugegeben, und die Mischung wurde gerührt und bei 37°C für 3 Minuten inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion durch Zugabe von 300 μl einer 30%-igen Essigsäure gestoppt. Die Fluoreszenzintensität der Reaktionsmischung wurde bei einer Anregungswellenlänge von 350 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 444 nm gemessen. Eine Blindprobe 1, in der destilliertes Wasser anstatt der in der obigen Reaktionsmischungszusammensetzung verwendeten Probe verwendet wurde und eine Blindprobe 2, die aus einer Reaktionsmischung zusammengesetzt ist, die nur das Substrat und den Puffer enthält, wurden in der gleichen Weise behandelt und dessen Fluoreszenzintensität wurde gemessen.
Das Thrombin-Aktivität-Inhibitions-Verhältnis wurde gemäß der folgenden Gleichung berechnet und die Inhibitionsverhältnisse in den Testsubstanzkonzentrationen wurden in einem halblogarithmischen Diagramm eingezeichnet, um eine Konzentration zu erhalten, die 50% Inhibition zeigt (IC₅₀). Thrombin-Aktivität-Inhibitions-Verhältnis = (1 – (ΔFs/ΔFb)) × 100 (%),wobei ΔFs (die Fluoreszenzintensität der Probe – der Fluoreszenzintensität der Blindprobe 1) darstellt und ΔFb (die Fluoreszenzintensität der Blindprobe 2 – der Fluoreszenzintensität der Blindprobe 1) darstellt.
Testverfahren 8
[Messverfahren für die hämorrhagische Aktivität]
Eine Ratte wurde mit Ether anästhesiert und dann wurden subkutan in ihren Rücken 0,4 ml einer physiologischen Salzlösung verabreicht, die 0,2 mg, 0,4 mg oder 0,8 mg jeder Testsubstanz pro Verabreichungsstelle enthält. Als eine Negativkontrolle wurden 0,4 ml einer physiologischen Salzlösung subkutan pro Stelle verabreicht. Die Ratte wurde 24 Stunden später durch Ausbluten getötet. Die Haut um jede Injektionsstelle herum wurde entfernt und die großen und kleinen Durchmesser der subkutanen Ekchymose wurden unter Verwendung einer Schublehre gemessen, um die Fläche zu berechnen. Die Differenz gegenüber der negativen Kontrollgruppe wurde durch den Dunnett's multiplen Vergleichstest bestimmt.
Testverfahren 9
[Messung 1 für einen die bFGF-Aktivität fördernden Effekt (mit Zugabe von NaClO₃)]
A31-Zellen (BABUc-Maus-3T3-Zellen) die in dem DMEM (Asahi Techno Glass) subkultiviert werden, das 10% Rinderserum enthält, wurden in ein DMEM-ITS-Medium (ITS hergestellt von GIBCO BRL, 10 mg/l Insulin, 5,5 mg/l Transferrin und 6,7 μg/l selenige Säure), das 20 mM NaClO₃ und 2 ng/ml eines menschlichen rekombinanten basischen Fibroblast-Wachstumsfaktor (hrbFGF, Promega) enhält, in einer Dichte von 5 × 10⁴ Zellen/ml suspendiert. Jede Testsubstanz wurde zu der Zell-Suspension in einer Endkonzentration von 1 μg/ml hinzugegeben. 100 μl der Zell-Suspension wurde in jedes Loch einer 96-Loch-Mikrotiter-Platte ausgesät und kultiviert. Nach dem Kultivieren für 3 Tage, wurden 20 μl einer Zelltiter-96AQ-nichtradioaktiven-Zell-Proliferations-Assay-Lösung (Promega) zu jedem Loch gegeben und bei 37°C für zwei Stunden kultiviert. Die Zell-Proliferation jedes Lochs wurde unter Verwendung eines Absorptionsmessgeräts quantifiziert, um das Absorptionsvermögen bei einer Wellenlänge von 492 nm zu messen. Der Zell-Proliferationsgrad in der Gegenwart jeder Testsubstanz wurde unter der Annahme des Zell-Proliferationsgrads in der Gegenwart eins Standard-Heparins als 100% und des Zell-Proliferationsgrads der Negativkontrolle (es wurde nur eine phosphatgepufferte physiologische Salzlösung (PBS) aber keine Testsubstanz als Lösungsmittel hinzugegeben) als 0% berechnet.
[Messung für einen die bFGF-Aktivität fördernden Effekt (ohne Zugabe von NaClO₃)]
A31-Zellen (BALB/c-Maus-3T3-Zellen), die in dem 10% Rinderserum enthaltenden DMEM (Asahi Techno Glass) subkultivert sind, wurden in das DNEM-ITS-Medium (ITS hergestellt von GIBCO BRL, 10 mg/l Insulin, 5,5 mg/l Transferrin und 6,7 μg/l selenige Säure), welches 2 ng/ml hrbFGF (Promega) enthält, in einer Dichte von 5 × 10⁴ Zellen/ml suspendiert. Jede Testsubstanz wurde in einer Endkonzentration von 20 μg/ml zu der Zellsuspension hinzugegeben. 100 μl der Zellsuspension wurden in jedes Loch einer 96-Loch-Mikrotiter-Platte ausgesät und kultiviert. Nach dem Kultivieren für drei Tage wurde in jedes Loch 20 μl Zelltiter-96AQ-nichtradioaktive-Zell-Proliferation-Assay-Lösung (Promega) hinzugegeben und bei 37°C für 2 Stunden kultiviert. Die Zell-Proliferation jedes Lochs wurde unter Verwendung eines Absorptionsmessgeräts zur Messung der Absorptionsfähigkeit bei einer Wellenlänge von 492 nm quantifiziert. Der Zell-Proliferationsgrad in der Gegenwart jeder Testsubstanz wurde unter Annahme des Zell-Proliferationsgrads in der Gegenwart eines Standard-Heparins als 100% und des Zell-Proliferationsgrads der Negativkontrolle (es wurde nur eine phosphatgepufferte physiologische Salzlösung (PBS) aber keine Testsubstanz als Lösungsmittel hinzugegeben) als 0% berechnet.
[Messung 3 für eine die bFGF-Aktivität fördernden Effekt (ohne Zugabe von NaClO₃/primäre Kulturzellen)]
C57BL/6-Mäuse (9 Wochen alte Weibchen, Charles River) wurden unter einer Etheranästhesie auf ihrem Rücken rasiert und zuvor sterilisierte Wattebäusche wurden unter der Haut (zwei Stellen/Maus) eingebettet. Die Wattebäusche wurden 10 Tage später zusammen mit Granulationsgeweben entfernt. Die Wattebäusche wurden zweimal mit einer Penicillin/Streptomycin-Lösung (Penicillin: 200 U/ml, Streptomycin: 200 μg/ml) und einmal mit PBS gewaschen. Dann wurde die Membran, die die Wattebäusche ummantelt, entfernt. Die Wattebäusche wurden in ein Gefäß mit einer Lösung transferiert, die 0,1% Collagenase und 0,25% Trypsin enthält, und in einem Thermostat bei 37°C für eine Stunde geschüttelt. Die behandelte Lösung wurde durch einen Zellfilter (Φ = 70 μm) gesiebt. RPMI1640-Medium (Iwaki), das 10% Rinderserum enthält, wurde dazugegeben, und die Mischung wurde leicht geschüttelt und bei 2.000 × g für 3 Minuten zentrifugiert. Die erhaltenen Zellen wurden dreimal mit dem gleichen Medium gewaschen, in das gleiche Medium mit einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen/ml resuspendiert und in eine 10 cm Petrischale ausgesät. Am folgenden Tag wurden die nicht adhärenten Zellen entfernt und die Zellen wurden in einem CO₂-Inkubator bei 37°C kultiviert, bis ein subkonfluentes Stadium erhalten wurde.
Die subkonfluenten Zellen wurden unter Verwendung einer 0,25%-igen Trypsin und 0,05%-igen EDTA Lösung von der Petrischale gelöst. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation gewaschen und in einem Basal-ME/S-MEM-Medium (Gibco), das 0,1% dialysiertes Rinderserum enthält, mit 5 × 10⁴ Zellen/ml suspendiert. 100 μl der Zellsuspension wurden in jedes Loch einer 96-Loch-Mikrotiter-Platte dispensiert. Des Weiteren wurden 50 μl des Basal-ME/S-MEM-Medium, das 4 μg/ml hrbFGF (Promega) enthält, und 50 μl des Basal-ME/S-MEM-Medium, das die Erfindung 2 enthält, zu jedem Loch dispensiert und die Zellen wurden in dem CO₂-Inkubator bei 37°C für 3 Tage kultiviert. Nachdem die Kultivierung abgeschlossen war, wurden 15 μl einer Zell-Auszählungs-Lösung (Dojin) zu jedem Loch hinzugegeben und die Kultivierung wurde für weitere 3 Stunden fortgesetzt. Dann wurde das Absorptionsvermögen des Mediums bei 450 nm gemessen. Als eine Negativkontrolle wurde eine Probe verwendet, zu der nur das Basal-MEIS-MEM-Medium als ein Lösungsmittel, aber nicht die Erfindung 2 hinzugegeben wurde. Als eine Positivkontrolle wurde eine Probe verwendet, zu der anstatt der Erfindung 2 in dem Basal-ME/S-MEM-Medium ein Standard-H gelöst war.
Referenzbeispiel 1
[Als Kontrolle in den Beispielen verwendetes Standard-Heparin]
Als ein Standard-Heparin wurde ein Heparin verwendet, das aus dem Schweinedünndarm (kommerziell erhältlich von SPL) stammt. Dieses Heparin hatte die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften.

(1) Die folgende entsprechend zu dem obigen Testverfahren 2 (die effektive Disaccharid-Ausbeute: 85,5%) durch das Disaccharid-Analyseverfahren erhaltene Disaccharid-Zusammensetzung (Molprozent). Tabelle 2
(2) Antikoagulierende Wirkung von 160 IU/mg.
(3) Durch das obige Test-Verfahren 3 bestimmtes durchschnittliches Molekulargewicht innerhalb des Bereichs von 13.000 bis 15.000 Da.
(4) Durch das obige Test-Verfahren 4 bestimmte enzymatische Verdaubarkeit von 89,9%.
(5) Durch das obige Test-Verfahren 5 mittels dem APTT-Messverfahren gemessene APTT von nicht weniger als 200 Sekunden, wenn eine Lösung verwendet wird, die 3 μg/ml Standard-H enthält.
(6) Durch das obige Test-Verfahren 6 mittels dem TT-Messverfahren gemessene TT von nicht weniger als 600 Sekunden, wenn eine Lösung von 1 μg/ml eines Standard-H's verwendet wird.

Nachstehend wird dieses Standard-Heparin lediglich als „Standard-H" bezeichnet.
Referenzbeispiel 2
Herstellung eines Kontroll-Glycosaminoglycans 1 (bekannte Substanz 1)
Ein Kontroll-Glycosaminoglycan 1 (nachstehend zur Vereinfachung als Kontrolle 1 bezeichnet) wurde gemäß dem in einem Beispiel der WO 96/01278 beschriebenen Verfahrens hergestellt. D.h., 200 mg als Pyridinium-Salz aus einem Standard-H in einer konventionellen Weise hergestelltes Heparin-Pyridinium-Salz (nachstehend „HepP") wurde dazugegeben und in 20 ml eines dehydrierten Pyridins gelöst. Zu der Lösung wurden 4 ml MTSTFA (etwa 4 g, 20-faches Gewicht von HepP) hinzugegeben und die Mischung wurde bei 95°C für 2 Stunden gerührt. Dann wurden zu der Mischung 20 ml Wasser hinzugegeben und die Mischung wurde unter Verwendung einer Millipore-Ultrafiltrations-Membran (Millipore) dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde auf 100°C erhitzt bis die weiße Trübung verschwand. Anschließend wurde die Lösung durch Zugabe von NaOH (1 N) auf pH 9 eingestellt und gegen fließendes Wasser für 18 Stunden und gegen destilliertes Wasser für 2 Stunden dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde lyophilisiert, um 130 mg eines Puders der Kontrolle 1 (Natriumsalz) zu erhalten.
Referenzbeispiel 3
Herstellung eines Kontroll-Glycosaminoglycans 2 (bekannte Substanz 2 und Solvolyse + N-re-Sulfatierung)
Ein Kontroll-Glycosaminoglycan 2 (nachstehend zur Vereinfachung als „Kontrolle 2" bezeichnet) wurde gemäß der Beschreibung des Beispiels 1 der WO 95/30424 hergestellt. D.h., 50 mg HepP wurden dazugegeben und in 10 ml Wasser gelöst. Diese Lösung wurde mit 90 ml Dimethylsulfoxid verdünnt und die Mischung wurde auf einem heißen Wasserbad bei 100°C für 72 Stunden gerührt. 50 ml 5%-iges Natriumhydrogencarbonat wurden dazugegeben und die Mischung wurde gekühlt. Dann wurde die Lösung zweimal gegen 1 l einer 0,1 M Natriumacetatlösung jeweils für 12 Stunden dialysiert und gründlich gegen destilliertes Wasser dialysiert.
Zu dieser dialysierten Lösung wurden wässriges Natriumcarbonat in einer Konzentration von 0,1 M und des Weiteren 5 Molar-Äquivalente Pyridin/SO₃ hinzugegeben und die Mischung wurde bei 60°C für 24 Stunden gerührt. In dem Zeitraum von 24 Stunden wurden alle 8 Stunden zweimal 5 Molar-Äquivalente Pyridin/SO₃ hinzugegeben. Dann wurde die Lösung gegen fließendes Wasser für 18 Stunden und gegen destilliertes Wasser für 2 Stunden dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde gefiltert und lyophilisiert, um 47,5 mg eines Pulvers der Kontrolle 2 (Natriumsalz) zu erhalten.
Beispiel 1
[Herstellung des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung usw.]
HepP und MTSTFA wurden zu Pyridin hinzugegeben und die Mischung wurde gerührt, erhitzt und für einen bestimmten Zeitraum unter jeder der in der folgenden Tabelle 3 beschriebenen Reaktionsbedingungen inkubiert. Das Gefäß, das die Reaktionsmischung enthält, wurde auf Eis gekühlt. Dann wurde die Mischung unter Verwendung eines rotierenden Evaporators unter vermindertem Druck 10-fach konzentriert und dann wurde ein 2-faches Volumen destilliertes Wasser dazugegeben. Des Weiteren wurde die Mischung unter vermindertem Druck unter Verwendung eines rotierenden Evaporators platziert, bis die weiße Trübung verschwand, und für 48 Stunden gegen fließendes Wasser und für 2 Stunden gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde durch eine mit destilliertem Wasser equilibrierte Säule, die mit einem Amberlite-IR-120B (H⁺-Form)-Harz (Organo Corp.) gepackt ist, gegeben, und nur die saure Fraktion wurde unter den gesammelten Fraktionen gepoolt. Diese saure Fraktion wurde durch Zugabe von NaOH (1 N) auf pH 9 eingestellt und für 18 Stunden gegen fließendes Wasser und für 2 Stunden gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde lyophilisiert, um jede der Zielpräparationen (Natriumsalz) als Pulver zu erhalten.
Die erhaltenen Präparationen (die Glycosaminoglycane der vorliegenden Erfindung 1 bis 4 (Erfindungen 1 bis 4) und die Kontroll-Glycosaminoglycane 3 bis 6 (Kontrollen 3 bis 6)) und die für jede Präparation verwendeten Bedingungen sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Es wurden verschiedene Reaktionsskalen für die Erfindungen 1 bis 4 verwendet. Dieselbe Reaktionsskala wie die für die Erfindung 2 wurde für die Kontrollen 3 bis 5 verwendet, aber die Reaktionszeit wurde geändert, um die Kontrollen zu erhalten. Dieselbe Menge des HepP's wie die für die Erfindung 2 wurde für die Kontrolle 6 verwendet, aber das MTSTFA als das Silylierungsmittel wurde in 20-facher Menge verwendet und die Reaktionstemperatur wurde vermindert, um die Kontrolle zu erhalten.
Das durchschnittliche Molekulargewicht wurde gemäß dem Testverfahren 3 gemessen. Als ein Ergebnis ist es von etwa 12.500 Da für alle Substanzen offenbart wor den, und es wurde gefunden, dass das Molekulargewicht im Wesentlichen nicht reduziert worden ist.
Beispiel 2
(1) Enzymatische Verdaubarkeit
Die enzymatische Verdaubarkeit des Standard-H's, der Erfindungen 1 bis 4 und der Kontrollen 1, 2 und 6 wurden gemäß dem im Test-Verfahren 4 beschriebenen Verfahren gemessen. Auch das 6-Desulfatierungs-Verhältnis wurde außer für den Standard-H für die Substanzen gemäß dem im Testverfahren 1 beschriebenen Verfahren gemessen (Tabelle 4). Das 6-Desulfatierungs-Verhältnis der in Tabelle 4 gezeigten Kontrolle wurde aus dem Wert berechnet, der in der WO 96/01278 angegeben ist.
Tabelle 4
Es wurde offenbart, dass die hohe enzymatische Verdaubarkeit und das hohe 6-Desulfatierungs-Verhältnis in den Glycosaminoglycanen der vorliegenden Erfindung (Erfindungen 1 bis 4) und der Kontrolle 2 erreicht wurde.
(2) Disaccharid-Zusammensetzung
Die Disaccharid-Zusammensetzung wurde für den Standard-H, die Erfindungen 1 bis 4 und die Kontrollen 1, 2 und 6 gemäß dem in Test-Verfahren 2 beschriebenen enzymatischen Disaccharid-Verfahren bestimmt (Tabelle 5).
Als ein Ergebnis zeigte die Kontrolle 2, die durch das Desulfatierungs-Verfahren unter Verwendung der Solvolyse hergestellt wird, eine Disaccharid-Zusammensetzung, die merklich anders als die der anderen Substanzen ist. Es wurde auch gefunden, dass die Glycosaminoglycane der vorliegenden Erfindung weniger Sulfatgruppen an der 6-Position verglichen mit dem Standard-H, der Kontrolle 1 und der Kontrolle 6 aufwiesen. Des Weiteren wurden die Glycosaminoglycane der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass kein trisulfatiertes ungesättigtes Disaccharid (ΔDiHS-(U, 6, N)triS) entdeckt wurde.
Beispiel 3
Messung der Endotoxin-Konzentration
Die in der Glycosaminoglycan-Präparation der vorliegenden Erfindung kontaminierenden Endotoxine wurden durch eine kolorimetrische Quantifikation unter Verwendung eines Toxicolor-LS-50M-Sets (Seikagaku Corporation) gemessen. Das Toxicolor-Et-2 (Seikagaku Corporation) wurde als Standard-Endotoxin verwendet.
D.h., die Erfindung 5 wurde gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen zur Herstellung der Erfindung 2 verwendeten Verfahren unter Verwendung von endotoxinfreien Instrumenten, Pyridin und destilliertem Wasser hergestellt. Dann wurden jeweils 50 μl (1) einer wässrigen Lösung, in der die Erfindung 5 in einer Konzentration von 2 mg/ml verdünnt war, und (2) einer wässrigen Lösung von (1), die ein Endotoxin bei 0,212 EU/mL enthält, in Löcher einer endotoxinfreien Mikrotiterplatte dispensiert. In gleicher Weise wurden jeweils (3) eine 50 μl wässrige Lösung als eine Standardlösung, die Et-2 bei 0,424 EU/ml enthält, und (4) 50 μl destilliertes Wasser (endotoxinfrei) als eine Blindprobe in Löcher einer endotoxinfreien Mikrotiterplatte dispensiert. 50 μl des Hauptreagenz, das in dem Toxicolor-LS-50M-Set enthalten ist, wurden in jedes Loch, in welches (1) bis (4) dispensiert wurde, dazugegeben und die Platte wurde sofort auf einen Well-Reader SK601 (verkauft von Seikagaku Corporation) gesetzt. Der Zeitverlauf des Absorptionsvermögens (mAbs/Min) während der Reaktion bei 37°C für 30 Minuten wurde bei einer Messwellenlänge von 405 nm und einer Kontrollwellenlänge bei 492 nm gemessen, um eine Absoluteichungskurve zu erhalten, die für die Berechnung der Endotoxin-Konzentration verwendet wurde.
Da es möglich war, dass die Erfindung 5 selber eine inhibitorische Aktivität oder eine Hyperaktivität gegen LAL-Reagenzien hatte, wurde ein zusätzlicher Ertrag von einem gemessenen Wert, der einer zugegebenen Endotoxin-Unit-Menge entspricht, gemäß der folgenden Gleichung erhalten, und ein aktuell gemessener Wert wurde durch Multiplikation mit diesem korrigiert.
{(Messwert mit Zugabe) – (Messwert ohne Zugabe)} / (Zugegebene Endotoxin-Konzentration)
Die auf diese Weise erhaltene Endotoxin-Aktivität in einer wässrigen Lösung von 10 mg/ml der Erfindung 5 war 0,427 EU/ml. D.h., dass die kontaminierte Endotoxin-Menge der Erfindung 5 0,0427 EU/mg war. Auf diese Weise wurde es offenbart, dass eine Glycosaminoglycan-Präparation der vorliegenden Erfindung mit einer kontaminierenden Endotoxin-Menge, die als pharmazeutische Präparationen ausreichend gering war, nur durch dessen Herstellung mit dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden konnte.
Beispiel 4
Messung des Pyridin-Gehalts
Der Gehalt des Pyridins, der in dem Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung zurückbleibt, wurde gemessen. D.h., die Erfindung 3 (20 mg) wurde zu 5 N NaOH (1 ml) hinzugegeben und diese Lösung wurde für 5 Minuten geschallt. Zu dieser Lösung wurde 1 ml Diemethylether hinzugegeben und die Mischung wurde kräftig für 2 Minuten geschüttelt. Dann wurde die Lösung bei 3.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert, um in eine obere Schicht (1) (organische Schicht) und eine untere Schicht (1) (wässrige Schicht) unterteilt zu werden. Zu der unteren Schicht (1) wurde des Weiteren 1 ml Dimethylether hinzugegeben und die Mischung wurde kräftig gerührt. Dann wurde die Lösung unter den gleichen Bedingungen wie oben zentrifugiert, um in eine obere Schicht (2) (organische Schicht) und eine untere Schicht (2) (wässrige Schicht) unterteilt zu werden. Die untere Schicht (2) wurde verworfen. Die obere Schicht (1) und die obere Schicht (2) wurden kombiniert, um 2 ml eines Extrakts (1) zu erhalten.
Zu dem, wie oben beschrieben, erhaltenen Extrakt (1) wurden 400 μl einer 2N HCl hinzugegeben und die Mischung wurde für 2 Minuten kräftig gerührt. Diese Mischung wurde bei 3.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert, um in eine obere Schicht (3) (organische Schicht) und eine untere Schicht (3) (wässrige Schicht) unterteilt zu werden. Die obere Schicht wurde verworfen. Zu der unteren Schicht (3) wurden 5 N NaOH (800 μl) und des Weiteren 300 μl Dichlormethan hinzugegeben und dann wurde die Mischung für 2 Minuten kräftig gerührt. Die Lösung wurde bei 3.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert, um in eine obere Schicht (4) (wässrige Schicht) und eine untere Schicht (4) (organische Schicht) unterteilt zu werden. Die obere Schicht (4) wurde verworfen. 1 μl der unteren Schicht (4) wurde mittels einer Gaschromatographie analysiert.
Ein GC-18APFSC (Shimdazu Corp.) wurde für die Gaschromatographie verwendet und eine DB-5ms (Φ 0,25 mm (I.D. 0,5 μm) × 30 m: J&W) wurde als eine Säule verwendet. Als mobile Phase wurde Helium verwendet. Die Flussrate wurde auf 22 cm/s bei 80°C gesetzt und die Säule wurde bei 80°C für eine Minute belassen. Dann wurde für die Elution die Säulenheiztemperatur mit einer Rate von 10°C pro Minute bis auf 120°C heraufgesetzt. Der Nachwies wurde bei 300°C unter Verwendung einer FID (Flammen-Ionisations-Detektion) durchgeführt. Die Eichkurve wurde durch Analysieren von 1 μl Methanol, das Pyridin mit Konzentrationen von 20, 40, 60, 80 und 100 ppm enthält, erstellt. Der Feuchtigkeitsgehalt der Erfindung 3 wurde für die Berechnung auf 10% gesetzt. Für die Erfindung 3 wurde eine Extraktion und eine Quantifikation des restlichen Pyridin-Gehalts zweimal durchgeführt. Als ein Ergebnis waren die gemessenen Werte des restlichen Pyridin-Gehalts 73,1 ppm und 70,3 ppm. Beide Werte waren wesentlich kleiner als 200 ppm, welches der geregelte Wert für den Rest-Pyridin-Gehalt in Pharmazeutika ist.
Beispiel 5
[Strukturanalyse durch eine ¹³C-Nuklear-Magnet-Resonanz-Spektroskopie]
Der Standard-H, die Erfindungen 1 bis 4 und die Kontrollen 3 bis 5 wurden mittels der ¹³C-Nuklear-Magnet-Resonanz-Spektroskopie analysiert (¹³C-NMR) (Standard-H: 1 (1), Erfindung 1: 2, Erfindung 2: 1 (5), Erfindung 3: 3, Erfindung 4: 4, Kontrolle 3: 1 (2), Kontrolle 4: 1 (3), Kontrolle 5: 1 (4)). Ein NMR-Spektrometer Modell QE300 (GE) wurde für die ¹³C-NMR-Spektroskopie verwendet. Eine 5%-ige (w/v)-Lösung jeder Testsubstanz wurde in Deuteriumoxid hergestellt. Eine Messung wurde unter Verwendung von Methanol durchgeführt, welches eine chemische Verschiebung von 51,66 ppm zeigt, wenn TSP (Wako Pure Chemicals Industrials, Ltd.) als Standard (0 ppm), als interner Standard, bei einer Messtemperatur von 80°C mit einer Pulsweite von 60° und einer Integrationszahl von 90.000 Mal verwendet wurde. Die chemischen Verschiebungen der Signale des Standard-H's und der Erfindungen 1 bis 4 sind wie folgt (Tabelle 6).
Tabelle 6
Die Ergebnisse der ¹³C-NMR zeigen, dass das Signal des C-6 des Glucosaminrests bei 69,1 ppm (Signal eines Kohlenstoffatoms an der 6-Position mit einer Sulfatgruppe) und 62,6 bis 63,0 ppm (Signal eines Kohlenstoffatoms an der 6-Position ohne eine Sulfatgruppe) nachgewiesen wird. Unten (Tabelle 7) sind die Ergebnisse der Berechnung des Verhältnisses des Glucosaminrests mit nicht sulfatierter 6-Position (6-Position nicht sulfatiertes GLCN-Verhältnis) und das 6-Position Desulfatierungs-Verhältnis (de-6S-Verhältnis) des Glucosaminrests basierend auf dem Standard-H jeder Probe (Erfindungen 1 bis 4 und Kontrollen 3 bis 5) unter Verwendung der obigen Signalintensitäten und den Verhältnissen der Signalintensitäten gezeigt.
Tabelle 7
Wie aus diesen Ergebnissen ersichtlich ist, wurde eine nahezu 100%-ige 6-Position-Desulfatierung durch die Reaktion für 2 Stunden erreicht, wenn unter den obigen Desulfatierungsbedingungen bei 110°C inkubiert wurde.
Die Kontrolle 1 und die Kontrolle 2 wurden unter Verwendung der, wie oben beschriebenen, ¹³C-NMR-Spektroskopie analysiert. Für die Kontrolle 1 wurde die Peak-Position jedes Kohlenstoffatoms nahe an jenen Positionen der Erfindungen 1 bis 4 nachgewiesen, aber kennzeichnende Peaks, die nicht in einer der Erfindungen 1 bis 4 und dem Standard-H bei 67 ppm und 96,5 bis 97,0 ppm nachgewiesen wurden, wurden nicht beobachtet (fortlaufend) (5). Da diese kennzeichnenden Peaks nicht in der Kontrolle 3, der Kontrolle 4 und der Kontrolle 5 beobachtet wurden (Substanzen, die durch Änderung der Reaktionszeit bei der Herstellung der Erfindung 2 erhalten werden), wurde es offenbart, dass die Kontrolle 1 eine andere Struktur als die des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung oder den durch die Veränderung der 6-Position-Desulfatierungs-Reaktions-Zeit erhaltenen Substanzen aufweist.
Für die Kontrolle 2 wurde es gefunden, dass der Peak des Kohlenstoffatoms an der 3-Position der Uronsäure nicht in dem Bereich von 70,0 bis 71,0 ppm beobachtet wird, der für den Standard-H und die Erfindungen 1 bis 4 beobachtet wurde (6). Wenn des Weiteren Peaks um 98,3 ppm, 100 ppm und 102 ppm, die für die Heparin-Struktur beobachtet werden, verglichen wurden, war der Peak um 98,3 ppm der höchste, was die Diagrammcharakteristik ausmacht. Diese Ergebnisse zeigten auch, dass die Kontrolle 2 auch eine unterschiedliche Struktur zu der des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung aufwies.
Beispiel 6
[Messung der antikoagulierenden Wirkung]
(1) Messung der aktivierten partiellen Thromboplastin-Zeit (APTT)
Die APTT des Standard-H's, der Erfindung 2, der Kontrolle 4 und der Kontrolle 5 wurden gemäß dem im Testverfahren 5 beschriebenen Verfahren gemessen (Tabelle 8). Als ein Ergebnis wurde es gefunden, dass die APTT im Standard-H, in der Kontrolle 4 und der Kontrolle 5 verlängert waren, wohingegen die Erfindung 2 kaum eine Wirkung zeigte, um die APTT zu verlängern. Da die 6-Position-Desulfatierungs-Verhältnisse für die Kontrolle 1 und die Kontrolle 6 zwischen denen der Kontrolle 4 und der Kontrolle 5 waren, wurde es vorhergesagt, dass sie eine mittlere antikoagulierende Wirkung zwischen der Kontrolle 4 und der Kontrolle 5 zeigen würden.
Tabelle 8
(2) Messung der Thrombin-Zeit (TT)
Die TT des Standard-H's, der Erfindung 2, der Kontrolle 4 und der Kontrolle 5 wurde gemäß dem im Testverfahren 6 beschriebenen Verfahren gemessen (Tabelle 9). Als ein Ergebnis wurde es gefunden, dass die TT im Standard-H, der Kontrolle 4 und der Kontrolle 5 verlängert war, wohingegen die Erfindung 2 keine Wirkung zeigte, um die TT zu verlängern. Da die 6-Position-Desulfatierungs-Verhältnisse der Kontrolle 1 und der Kontrolle 6 zwischen denen der Kontrolle 4 und der Kontrolle 5 waren, wurde es vorhergesagt, dass sie eine mittlere antikoagulierende Wirkung zwischen der Kontrolle 4 und der Kontrolle 5 zeigen würden.
Tabelle 9
(3) Messung der Antithrombin-Aktivität
Die Antithrombin-Aktivität des Standard-H's, der Erfindung 2 und der Kontrolle 1 wurden gemäß dem im Test-Verfahren 7 beschriebenen Verfahren gemessen (Tabelle 10). Die Ergebnisse offenbaren, dass die Antithrombin-Aktivität der Erfindung 2 im Vergleich mit dem Standard-H und der Kontrolle 1 wesentlich verringert war.
Tabelle 10
Beispiel 7
[Hämorrhagische Aktivität des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung]
Die hämorrhagische Aktivität des Standard-H's und der Erfindung 2 wurden gemäß dem im Test-Verfahren 8 beschriebenen Verfahren gemessen (Tabelle 11). Die Ergebnisse offenbaren, dass die Erfindung 2 vollständig die hämorrhagische Aktivität verloren hat.
Tabelle 11
Beispiel 8
[Wundheilungsfördernde Aktivität des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung bei Wunden einer heilenden Haut]
Die wundheilungsfördernde Aktivität des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung bei Wunden einer heilenden Haut wurde unter Verwendung gesunder Ratten untersucht. D.h., eine gesunde Ratte wurde an ihrem Rücken rasiert und die Haut wurde bis zu einer subkutanen Region unter Verwendung eines ophthalmologischen Bohrers mit Φ 8 mm freigelegt. Die Haut wurde unter Verwendung ophthalmologischer Scheren und Pinzetten entfernt, um zwei schadhafte Wunden auf ihrem Rücken zu erzeugen. Dann wurden ölhaltige Salben präpariert, wobei jede 0,5 Gewichtsprozent des Standard-H's, der Erfindung 2 oder der Kontrolle 4 enthält, und 0,1 g jeder Salbe wurde jeden Tag aufgetragen, um die Ausmaße der Wundheilung basierend auf den geheilten Flächen zu vergleichen. Die Ratte wurde unter einer Etheranästhesie bewegungslos platziert und dann wurden Fotos der schadhaften Abschnitte mit einer konstanten Brennweite gemacht. Jede geheilte Fläche wurde durch Subtraktion der Fläche bei jeder Messung von der direkt nach der Erzeugung der schadhaften Stellen bestimmten Fläche gemessen. Die statistische Analyse wurde mittels dem Tukey's multiplen Vergleichstest durchgeführt. Als ein Ergebnis wurde eine bemerkenswerte heilungsfördernde Aktivität einer Hautwunde in der Gruppe der Tiere beobachtet, bei denen die unter Verwendung der Erfindung 2 hergestellte Salbe aufgetragen wurde (7).
Beispiel 9
[Diabetische Hautgeschwür heilungsfördernde Aktivität des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung]
Die diabetische Hautgeschwür heilungsfördernde Aktivität des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung wurde unter Verwendung von Mäusen mit angeborener Diabetes untersucht (db/db-Mäuse (Weibchen): Japan Clare). D.h., eine Maus mit angeborener Diabetes wurde auf ihrem Rücken rasiert und die Haut wurde bis zu einer subkutanen Region unter Verwendung eines ophthalmologischen Bohrers mit Φ 8 mm freigelegt. Die Haut wurde unter Verwendung ophthalmologischer Scheren und Pinzetten entfernt, um zwei schadhafte Wunden auf ihrem Rücken zu erzeugen. Dann wurden 50 μl einer physiologischen Salzlösung, die 1 % (w/w) des Standard-H's, der Erfindung 2 oder der Kontrolle 4 enthält, jeden Tag aufgetropft, um die Ausmaße der Wundheilung zu vergleichen. Die Ratte wurde unter einer Etheranästhesie bewegungslos platziert und dann wurden Fotos der schadhaften Stellen mit einer konstanten Brennweite gemacht. Die schadhaften Hautstellen wurden auf den Fotosauszügen unter Verwendung eines Bildanalyse-Systems gemessen, um die Messung durchzuführen. Jede geheilte Fläche wurde durch Subtraktion der Fläche bei jeder Messung von der direkt nach der Erzeugung der schadhaften Stellen bestimmten Fläche gemessen. Die statistische Analyse wurde mittels dem Tukey's multiplen Vergleichs-Test durchgeführt. Als ein Ergebnis wurde es offenbart, dass die Erfindung 2 statistisch signifikant die Heilung nach dem 11. Tag von Beginn der Verabreichung förderte, obwohl keine bemerkenswerten Unterschiede in irgendeiner der Testsubstanzen für die ersten 7 Tage beobachtet wurden.
Beispiel 10
[Messung der Affinität für den bFGF des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung]
Es wurde die Affinität des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung für den Zell-Proliferationsfaktor gemessen. D.h., 0,2 mg der Erfindung 2 wurden in 100 μl eines 50 mM Natriumhydrogencarbonat-Puffers (pH 8,5) gelöst. Eine wässrige Lösung, die 74 μg NHS-LC-Biotin (Succinimidyl-6-(Biotinamid)-Hexanoat, Pierce) enthält, wurde dazugegeben, und es wurde der Mischung erlaubt, bei Raumtemperatur für 30 Minuten zu reagieren. Anschließend wurde das 2,5-fache Volumen Ethanol zu der Lösung hinzugegeben und die präzipitierte und biotinylierte Erfindung 2 wurde mittels Zentrifugation gesammelt. Diese biotinylierte Erfindung 2 wurde auf einem avidinylierten Sensorchip (BIAcore AB, SA) immobilisiert. Der in einer flüssigen Phase gelöste bFGF wurde mit der Sensorchipoberfläche in Kontakt gebracht und dann wurde die Interaktion zwischen der Erfindung 2 und dem bFGF durch zwei Arten von Verfahren, dem Affinitäts- und kinetischen Analyseverfahren und dem stationären Analyseverfahren, wobei beide den Oberflächen-Plasmon-Effekt verwenden, analysiert.
Als ein Ergebnis waren die in dem vorher genannten Analyseverfahren erhaltenen Assoziationsrate-Konstanten (K_a) 1,3 (M^-1 S^-1 10^-6) für den als Kontrolle verwendeten Standard-H und entsprechend 1,0 (M^-1 S^-1 10^-6) für die Erfindung 2. Die Dissoziationsrate-Konstanten (K_d) waren 4,8 (S^-1 10^-3) für den Standard-H und entsprechend 5,3 (S^-1 10^-3) für die Erfindung 2. Die von diesen Ergebnissen berechneten Dissoziations-Konstanten (K_D) waren 4,1 nM für den Standard-H und entsprechend 4,3 nM für die Erfindung 2.
Die bei dem letzteren Analyseverfahren erhaltenen Dissoziations-Konstanten (K_D) waren 23 nM für den Standard-H und entsprechend 24 nM für die Erfindung 2.
Es ist aus diesen Ergebnissen ersichtlich, dass die Affinität der Erfindung 2 für den bFGF im Wesentlichen die gleiche wie die des Standard-H's ist.
Beispiel 11
[Messung des die bFGF-Aktivität fördernden Effekts des Glycosaminglycans der vorliegenden Erfindung (mit Zugabe von NaClO₃)]
Der die bFGF-Aktivität fördernde Effekt der Erfindung 2 wurde gemäß der im Test-Verfahren 9 beschriebenen [Messung 1 für den die bFGF-Aktivität fördernden Efffekt] gemessen. Auf die gleiche Weise wurden auch die die bFGF-Aktivitätsfördernden Effekte der Kontrolle 1 und der Kontrolle 2 gemäß dem gleichen Verfahren gemessen. Als ein Ergebnis wurde es gefunden, dass die Erfindung 2 einen gleichen Grad des die bFGF-Aktivität fördernden Effekts wie der für den Standard-H hatte (Tabelle 12). Es wurde auch gefunden, dass die Kontrolle 1 etwa 26% des die bFGF-Aktivität fördernden Effekts verglichen mit dem des Standard-H's hatte, was nicht mehr als ein viertel von dem der Erfindung 2 ist. Dieses deutet an, dass der durch die ¹³C-NMR bestimmte strukturelle Unterschied den Unterschied des die bFGF-Aktivität fördernden Effekts verursacht.
Tabelle 12
Beispiel 12
[Messung 2 für den die bFGF-Aktivität fördernden Effekt des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung (ohne Zugabe von NaClO₃)]
Der die bFGF-Aktivität fördernde Effekt des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung (Erfindung 2) wurde gemäß der im Testverfahren 9 beschriebenen [Messung 2 für den die bFGF-Aktivität fördernden Effekt] gemessen. Die Kontrolle 2 wurde als eine vergleichende Kontrolle verwendet. Als ein Ergebnis wurde es gefunden, dass die Erfindung 2 den gleichen Grad des die bFGF-Aktivität fördernden Effekts wie der des Standard-H's hatte (Tabelle 13). Es wurde auch offenbart, dass der die bFGF-Aktivität fördernde Effekt der Kontrolle 2 nicht mehr als einhalb der Erfindung 2 war.
Tabelle 13
Beispiel 13
[Messung 3 für den die bFGF-Aktivität fördernden Effekt des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung (ohne Zugabe von NaClO₃/primäre Kulturzelle)]
Der die bFGF-Aktivität fördernde Effekt des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung (Erfindung 2) auf primäre Kulturzellen wurde gemäß der im Test-Verfahren 9 beschriebenen [Messung 3 für den die bFGF-Aktivität fördernden Effekt] gemessen. Standard-H wurde als eine vergleichende Kontrolle verwendet. Als ein Ergebnis wurde es gefunden, dass die Erfindung 2 75% eines die bFGF-Aktivität fördernden Effekts des Standard-H's auf primäre Kulturzellen hatte (Tabelle 14).
Tabelle 14
Beispiel 14
[Messung der Affinität zur Fructose-1,6-bis-phosphat-Aldolase des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung]
Die Affinität zwischen der Fructose-1,6-bis-phosphat-Aldolase (nachstehend als „FPA" bezeichnet), welche ein Schlüsselenzym des Glycolyse-Stoffwechsels bei der Atmung ist, und dem Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung wurde durch eine Affinitätschromatographie gemessen, wobei eine Säule für eine FPLC verwendet wurde, die mit einem Affinitätsgel-Trägermaterial gepackt ist, der gemäß dem Verfahren von Sasaki et al. hergestellt wird (J. Chromatogr. (1987) 400, 123-132). Das Affinitätsgel-Trägermaterial wurde wie folgt hergestellt. 200 mg der Erfindung 2 wurden in 5 ml eines 2-M-Phosphatpuffers (pH 7,2) gelöst und 5 g Aminoagarose-Gel-Pulver wurden in der Lösung suspendiert. 15 mg NaB(CN)H₃ wurden zu der Mischung hinzugegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur ausreichend gerührt, und es wurde ihr erlaubt für 24 Stunden zu reagieren. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde das Gel, das das Kopplungsprodukt enthält, gefiltert und dreimal mit Wasser gewaschen, um komplett entsalzt zu werden. Das entsalzte Gel wurde in 5 ml einer 0,2 M CH₃COONa-Lösung suspendiert und 2,5 ml saures Anhydrid wurden dazugegeben und erlaubt bei 0°C für 30 Minuten und dann bei Raumtemperatur für 30 Minuten zu reagieren. Nachdem die Reaktion vollständig war, wurde das hergestellte Gel gewaschen, um komplett entsalzt zu werden.
Eine Mischung aus einer A₄-Aldolase, einer C₄-Aldolase und einer Hybridtyp-Aldolase davon wurden auf eine Säure geladen, die mit dem Gel-Trägermaterial gepackt ist, auf der das Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung immobilisiert und die mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), das 1 mM EDTA und 0,5 mM 2-Mercaptoethanol enthält, equilibriert wurde. Die adsorbierte Fraktion wurde unter Verwendung eines linearen Konzentrationsgradienten des NaCl's (0 bis 1,0 M) eluiert, der aus zwei Arten von Lösungen gebildet ist: 15 ml eines 10 mM Tric-HCl's (pH 7,5), das 1 mM EDTA und 0,5 mM 2-Mercaptoehtanol enthält, und 15 ml eines 10 mM Tric-HCl's (pH 7,5), das 1,0 M NaCl, 1 mM EDTA und 0,5 mM 2-Mercaptoethanol enthält. Der Nachweis wurde durch Bestimmung des Absorptionsvermögens bei 220 nm durchgeführt, und es wurde eine NaCl-Konzentration gemessen, die dem höchsten Elutions-Peak entspricht.
Auf die gleiche Weise wurde eine Affinitätschromatographie mit den Trägermaterialien durchgeführt, die unter Verwendung anstelle der Erfindung 2, (1) den Standard-H, (2) ein Heparin-Derivat (nachstehend auch als „2ODSH" bezeichnet), welches durch Behandlung des Standard-H's durch das Verfahren von Jaseja et al. (Can. J. Chem. (1989) 67, 1449-1456) mit einer teilweisen Modifikation, um die Sulfatgruppe, die an der Hydroxylgruppe an der 2-Position des Uronsäurerests gebunden ist, der die Backbone-Struktur des Standard-H's durch die Esterbindung darstellt, zu entfernen, erhalten wurde, und (3) ein Heparin-Derivat (nachstehend auch als „NDSH" bezeichnet), welches durch Behandlung eines Standard-H's gemäß dem Verfahren von Inoue & Nagasawa (Carbohydr. Res. (1976) 46, 87-95) erhalten wurde, um die Sulfatgruppe, die an der Aminogruppe an der 2-Position des Glucosaminrests gebunden ist, der die Backbone-Struktur des Standard-H's durch die Estherbindung darstellt, zu entfernen und um das desulfatierte Produkt zu N-acetylieren. Eine NaCl-Konzentration, bei der der höchste Elutions-Peak erhalten wurde, wurde gemessen, um den Affinität-Grad zu vergleichen.
Als ein Ergebnis wurde es gefunden, dass die FPA aktive Fraktion bei etwa 0,37 M von dem mit dem Standard-H immobilisierten Gel-Trägermaterial eluiert wurde, während die Fraktion bei 0,31 bis 0,33 M von dem Gelträgermaterial, auf der die Erfindung 2, das 2ODSH oder das NDSH immobilisiert wurde, eluiert wurde. D.h., es wurde gefunden, dass diese Substanzen beinahe den gleichen Level der FPA-Affinität wie der des Standard-H's haben.
Beispiel 15
[Messung der Fructose-1,6-bis-phosphat-Aldolase inhibitorischen Aktivität des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung]
Die FPA inhibitorische Aktivität des Glycosaminoglycans der vorliegenden Erfindung wurde gemessen. Wenn das obige Enzym auf das Fructose-1,6-bis-phosphat als Substrat wirkt (nachstehend als „F-1,6-P2" bezeichnet), baut das Enzym das Substrat in Dihydroxyaceton-phosphat (nachstehend als „DHAP" bezeichnet) und in Glyceraldehyd-3-phosphat (GAL-3-P) ab. Wenn es auf Fructose-1-phosphat (nachstehend als „F-1-P" bezeichnet) als Substrat wirkt, baut es das Substrat in DHAP und Glyceraldehyd (GAL) ab. Daher wurde unter Verwendung von F-1,6-P2 und F-1-P als Substrate die Änderung der NADH (reduziertes Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid)-Menge durch Messung der Änderung des Absorptionsvermögens bei 340 nm gemessen, wenn das Glycerol-3-phosphat-Dehydrogenase-System in der Gegenwart einer Triose-phosphat-Isomerase gekoppelt wurde und auf diese Weise das hergestellte DHAP zu Glycerol-3-phosphat reduziert wurde.
Die Messung wurde gemäß dem Verfahren von Biostein & Rutter (J. Biol. Chem. (1963) 238, 3280-3285) durchgeführt. D.h., die Erfindung 2 wurde in einer Endkonzentration von 0,4 bis 4 μg/ml ([I]) zu 20 ml eines 0,1 M Glycylglycin-Puffers (pH 7,5), der 50 mM F-1,6-P2-Natriumsalz, 0,1 M F-1-P-Monocyclohexylammoniumsalz, 4 mg NADH und 500 μg einer Glycerol-3-phosphat-Dehydrogenase/Triosephosphat-Isomerase-Komplexlösung enthält, hinzugegeben. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5 bis 50 μl FPA (A₄-Aldolase (A₄-Isoform) und C₄-Aldolase (C₄-Isoform) unter den fünf Arten der Isoformen des FPA's, die aus dem Rinderhirn erhalten werden, 0,005 bis 0,02 Unit) zu der Reaktionsmischung gestartet. Die Reaktionsrate (v) wurde aus der Abnahme des Absorptionsvermögens bei 340 nm pro Zeiteinheit unter einer Temperaturbedingung von 25°C berechnet. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde 1/v gegen [I] „geplotted" (Dixon-Plot) und der Ki-Wert jedes Falls wurde von dem [I] Schnittwert berechnet.
In Bezug auf die FPA-Unit (Aktivität: Unit) wurde 1 Unit als die Menge des Enzyms definiert, das 1 μmol des Substrats pro Minute bei 25°C in dem obigen Reaktions system schneidet. Die spezifische Aktivität wurde als die Anzahl der Units pro mg des Proteins definiert.
Als eine Negativkontrolle für die obige inhibitorische Aktivität-Messung wurde die inhibitorische Aktivität unter Verwendung des in dem obigen Beispiel 14 beschriebenen 2ODSH's und des NDSH's, des Chondroitin-Sulfat-A's (Seikagaku Corporation) und des Chondroitin-Sulfat-C's (Seikagaku Corporation) gemessen.
Als ein Ergebnis zeigte die Erfindung 2 eine FPA inhibitorische Aktivität (Tabelle 15). Zusätzlich wurde es gefunden, dass das inhibitorische Schema der Erfindung 2 eine kompetitive Inhibition war.
Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde es vorgeschlagen, dass die Erfindung 2 als ein potenter FPA-Aktivität-Inhibitor verwendet werden könnte und er als ein Pharmazeutikum, wie z.B. ein Mittel zur Prävention der Infektion mit Malaria-Parasiten, z.B. wegen der Wirkung zur Inhibierung des Hypermetabolismus des Glycolyse-Stoffwechsels, verwendet werden kann.
Tabelle 15
Beispiel 16
[Beispiel einer pharmazeutischen Zusammensetzung]
(1) Injektion(s)-(Lösung)
Ein lyophilisiertes Produkt (30 mg/ml) der Erfindung 2 (Natriumsalz) wurde in 5% Mannitol wässriger Lösung in einer Endkonzentration von 5 mg/ml gelöst. Die Lösung wurde einer sterilisierenden Filtration unterzogen und in Ampullen in einer Menge von 2 ml für jede Ampulle abgefüllt, um eine Injektion(s)-(Lösung) herzustellen.
(2) Salbe
100 mg eines lyophilisierten Produkts der Erfindung 2 (Natriumsalz), 4 g Mineralöl, 8 g Mineralölgelee, 60 mg Methylparaben(Propylparaben-Mischung, 1 g einer nicht ionischen oberflächenaktiven Substanz und 30 g gereinigtes Wasser wurden gleichmäßig gemischt und in einen Behälter abgefüllt, um eine Salbe herzustellen.
Industrielle Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Glycosaminoglycan bereit, das eine Struktur, die wesentlich einfacher im Vergleich mit konventionellen modifizierten Heparinen identifizierbar ist, eine ausgezeichnete Wirkung für lebende Körper und keine antikoagulierende Wirkung und hämorrhagische Aktivität aufweist. Sie stellt auch die pharmazeutische Verwendung der Wirksamkeit des Glycosaminoglycans für lebende Körper bereit.

Claims

Glycosaminoglycan, das eine Backbone-Struktur, die ein sich wiederholendes Disaccharid umfasst, das einen Uronsäurerest und einen Glucosaminrest trägt, und Sulfatgruppen aufweist, wobei (1) im Wesentlichen keine Sulfatgruppe, die an der Hydroxylgruppe an der 6-Position des Glucosaminrestes in der Backbone-Struktur gebunden ist, nachgewiesen wird, wobei dies durch ein chemisches Disaccharid-Analyseverfahren bestimmt wird, in welchem das Glycosaminoglycan mit salpetriger Säure zerlegt, mit para-Nitrophenylhydrazin reagiert und mittels einer Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie analysiert wird, (2) der molare Prozentanteil eines Uronsäurerestes, der eine Sulfatgruppe an der 2-Position aufweist, nicht weniger als 45% relativ zu den gesamten Uronsäureresten ist, wobei der molare Prozentanteil aus einer Disaccharid-Zusammensetzung berechnet wird, die mittels eines enzymatischen Disaccharid-Analyseverfahrens erhalten wird, in welchem das Glycosaminoglycan mit Glycosaminoglycan abbauenden Enzymen digeriert und mittels einer Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie analysiert wird, und (3) eine enzymatische Fähigkeit zur Digerierung mit Glycosaminoglycan abbauenden Enzymen nicht weniger als 60% beträgt, wobei dies durch ein Verfahren bestimmt wird, in welchem das Glycosaminoglycan mittels einer Heparinase und den Heparitinasen I und II digeriert und mittels einer Gelfiltration analysiert wird.
Glycosaminoglycan, das eine Backbone-Struktur aufweist, die ein sich wiederholendes Disaccharid umfasst, das einen Uronsäurerest und einen Glucosaminrest trägt, und Sulfatgruppen aufweist, wobei (1) in einer durch ein enzymatisches Disaccharid-Analyseverfahren erhaltenen Disaccharid-Zusammensetzung des Glycosaminoglycans, in welchem das Glycosaminoglycan mit Glycosaminoglycan abbauenden Enzymen digeriert und mittels einer Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie analysiert wird, der Gesamtanteil der 2-Acetamid-2-deoxy-4-O-(4-deoxy-α-L-threo-hex-4-enopyranosyl-uronsäure)-6-O-Sulfo-D-glucose, der 2-Deoxy-2-sulfamin-4-O-(4-deoxy-α-L-threo-hex-4-enopyranosyl-uronsäure)-6-O-sulfo-D-glucose, der 2-Ace tamid-2-deoxy-4-O-(4-deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyl-uronsäure)-6-O-sulfo-D-glucose und der 2-Deoxy-2-sulfamin-4-O-(4-deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyl-uronsäure)-6-O-sulfo-D-glucose nicht mehr als 10 Molprozent ist, (2) die 2-Deoxy-2-sulfamin-4-O-(4-deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronsäure)-6-O-sulfo-D-glucose nicht mehr als 1,5 Molprozent beträgt, und eine effektive Disaccharid-Ausbeute nicht weniger als 60% beträgt, und (3) eine enzymatische Fähigkeit zur Digerierung mit Glycosaminoglycan abbauenden Enzymen nicht weniger als 60% beträgt, wobei dies durch ein Verfahren bestimmt wird, in welchem das Glycosaminoglycan mittels einer Heparinase und den Heparitinasen I und II digeriert und mittels einer Gelfiltration analysiert wird.
Glycosaminoglycan nach Anspruch 2, wobei in der durch das enzymatische Disaccharid-Analyseverfahren erhaltenen Disaccharid-Zusammensetzung der Gesamtanteil der 2-Acetamid-2-deoxy-4-O-(4-deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyl-uronsäure)-D-glucose, der 2-Deoxy-2-sulfamin-4-O-(4-deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyl-uronsäure)-D-glucose, der 2-Acetamid-2-deoxy-4-O-(4-deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyl-uronsäure)-6-O-sulfo-D-glucose und der 2-Deoxy-2-sulfamin-4-O-(4-deoxy-2-O-sulfo-α-L-threo-hex-4-enopyranosyl-uronsäure)-6-O-sulfo-D-glucose nicht weniger als 45 Molprozent ist.
Glycosaminoglycan nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei in einer ¹³C-kernmagnetischen Resonanz-Spektrometrie-Analyse des Glycosaminoglycans unter Verwendung einer 5%-igen Lösung des Glycosaminoglycans in Deuteriumoxid und von Natrium-3-(trimethylsilyl)-propionat als Standard im Wesentlichen kein Peak von 66,5 bis 67,5 ppm nachgewiesen wird und die Signalintensitäten bei etwa 100 ppm und 102 ppm höher als die Signalintensität bei etwa 98,3 ppm sind.
Verwendung des wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definierten Glycosaminoglycans als ein Fructose-1,6-bis-phosphat-Aldolase-Inhibitor.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die das wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definierte Glycosaminoglycan als einen Wirkstoff enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, die ein Mittel zur Behandlung von Gewebsverletzungen und Geschwüren ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, die ein Mittel zur Behandlung von Hauterkrankungen ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei das Mittel zur Behandlung von Hauterkrankungen ein Mittel zur Förderung der Heilung von Hautwunden oder ein Mittel zur Behandlung von Hautgeschwüren ist.
Verfahren zur Herstellung des wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definierten Glycosaminoglycans, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Erhitzen eines pyridin-löslichen Salzes des Glycosaminoglycans, das eine Backbone-Struktur aufweist, die ein sich wiederholendes Disaccharid umfasst, das einen Uronsäurerest und einen Glucosaminrest trägt, und Sulfatgruppen aufweist, in Pyridin bei einer Temperatur von nicht weniger als 100°C bei Anwesenheit von N-Methyl-N-trimethylsilyltrifluoracetamid für eine Zeitdauer, die lang genug ist, dass im Wesentlichen keine Sulfatgruppe, die an der Hydroxylgruppe an der 6-Position des Glycosaminrestes gebunden ist, nachweisbar sein sollte, wobei dies durch ein chemisches Disaccharid-Analyseverfahren bestimmt wird, in welchem das Glycosaminoglycan mit salpetriger Säure zerlegt, mit para-Nitrophenylhydrazin reagiert und mittels einer Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie analysiert wird, (b) Verdampfen des Pyridins aus der in dem Schritt (a) erhaltenen Reaktionsmischung, und (c) Hinzugeben von Wasser zu der in dem Schritt (b) erhaltenen Reaktionsmischung und dann Platzieren der Mischung unter vermindertem Druck bei einer Normaltemperatur.