DE69531945T2

DE69531945T2 - Verfahren zur herstellung von desulfatiertem polysaccharid und desulfatiertem heparin

Info

Publication number: DE69531945T2
Application number: DE69531945T
Authority: DE
Inventors: Saburo Hara; Keiichi Yoshida; Masayuki Tachikawa-shi ISHIHARA
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1994-07-01
Filing date: 1995-07-03
Publication date: 2004-08-19
Anticipated expiration: 2015-07-04
Also published as: EP0769502A1; HU9603606D0; WO1996001278A1; EP1371666A2; US6809086B2; EP1371666B1; US6545136B1; US20030149253A1; EP0769502A4; HUT76426A; EP1371666A3; DE69535565T2; DE69531945D1; HU218600B; JP3929486B2; DE69535565D1; EP0769502B1; US6140481A

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines desulfatierten Polysaccharids, bei dem die Sulfatgruppe(n), die an die primäre(n) Hydroxygruppe(n) eines sulfatierten Polysaccharids gebunden ist/sind, selektiv desulfatiert wird/werden, und ein nach diesem Herstellungsverfahren erhaltenes desulfatiertes Heparin.
Stand der Technik
Zur Bereitstellung sulfatierter Polysaccharide mit biologischer Aktivität wurden verschiedene Methoden zur Desulfatierung sulfatierter Polysaccharide untersucht. Eine bekannte Methode zur Desulfatierung sulfatierter Polysaccharide war eine Methode, bei der die Desulfatierung mit einem sauren Katalysator in Chlorwasserstoff/Methanol durchgeführt wird (Kantor T. G. und Schubert M., J. Amer. Chem. Soc. Bd. 79, S. 152 (1957)). Bei dieser Methode ist es jedoch unmöglich, nur die spezifische(n) Sulfatgruppe(n) zu desulfatieren, und als Folge der Methanolyse von Glycosidbindungen erfolgt eine Spaltung der Zuckerkette unter Verringerung des Molekulargewichts, wodurch die Ausbeute an Reaktionsprodukt mit der ursprünglichen Kettenlänge geringer wird.
Als Desulfatierungsmethode mit guter Ausbeute ist die Solvolyse zu nennen, die in einem aprotischen Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid (DMSO), N,N-Dimethylformamid (DMF) oder Pyridin usw. (Usov A. et al., Carbohydr. Res., Bd. 18, S. 336 (1971)) oder in DMSO, das eine geringe Menge Wasser oder Methanol enthält (Nagasawa K. et al., Carbohydr. Res., Bd. 58, S. 47 (1977), Nagasawa K. et al., J. Biochem., Bd. 86, S. 1323 (1979)), durchgeführt wird. Es war bekannt, daß der Reaktionsmechanismus der Solvolyse die Rückreaktion einer Sulfatierungsreaktion ist, die mit einem Komplex aus Schwefeltrioxid und einem Amin in einem aprotischen Lösungsmittel durchgeführt wird. Diese Reaktion kann durch Steuerung der Reaktionsbedingungen als Methode zur selektiven Desulfatierung der N-Sulfatgruppe(n) eingesetzt werden. Die an die primäre(n) oder sekundäre(n) Hydroxygruppe(n) gebundene(n) O-Sulfatgruppe(n) kann/können jedoch nicht abgespalten werden. Bei Anwendung dieser Methode auf Oligosaccharide oder Polysaccharide besteht außerdem das Problem, daß die Entfernung von Lösungsmitteln wie DMSO usw. nach der Umsetzung schwierig ist, daß man die Reaktionstemperatur erhöhen muß, damit eine vollständige Desulfatierung erfolgt, daß unter solchen Reaktionsbedingungen eine Spaltung von Glycosidbindungen erfolgt usw.
Als Methode zur spezifischen Desulfatierung einer Sulfatgruppe(n), die an eine primäre Hydroxygruppe(n) eines Saccharids gebunden ist/sind, ist andererseits ein Verfahren mit N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid (BTSA) zu nennen (Matsuo, M. et al., Carbohydr. Res., Bd. 241, S. 209–215 (1993)). Wenn diese Methode auf Heparin angewandt wird, werden Sulfatgruppen in 6-Stellung des Glucosamins relativ spezifisch abgespalten. Bei einer genaueren Strukturuntersuchung durch Enzymverdau wurde jedoch gefunden, daß gleichzeitig mit der Abspaltung der Sulfatgruppe(n), die an die primäre(n) Hydroxygruppe(n) gebunden ist/sind, auch eine Abspaltung geringer Mengen der N-Sulfatgruppe(n) erfolgt. Daher bestand Bedarf an einem selektiveren Verfahren zur Abspaltung der an die primäre(n) Hydroxygruppe(n) gebundenen Sulfatgruppe(n).
Die Entwicklung eines Verfahrens zur spezifischen Abspaltung der Sulfatgruppe(n), die an die primäre(n) Hydroxygruppe(n) gebunden ist/sind, ist sehr wichtig, um sulfatierte Polysaccharide für Medikamente bereitzustellen, die beim Menschen bevorzugte biologische Wirkungen besitzen. Beispielsweise wurden Dextransulfat, Xylansulfat, Chondroitinsulfat, Heparin usw., bei denen es sich um sulfatierte Polysaccharide handelt, als Mittel zur Verbesserung des Fettstoffwechsels oder als antithrombotische Mittel verwendet. Es war jedoch auch bekannt, daß man bei künstlich eingebauten Sulfatgruppen die Positionen der eingebauten Sulfatgruppen nicht spezifizieren kann und daß die Tendenz zur Gewebeblutung als Nebenwirkung bei Einbau größerer Mengen Sulfatgruppen erhöht wird. Auch unterscheiden sich sulfatierte Polysaccharide, die aus natürlichen Materialen stammen, abhängig von ihrer unterschiedlichen Herkunft in der Stellung bzw. der Menge der Sulfatgruppen, und die physiologische Wirkung der jeweiligen sulfatierten Polysaccharide unterscheidet sich ebenfalls leicht.
Die Desulfatierung von Heparin, das die Fähigkeit besitzt, spezifisch an verschiedene physiologisch aktive Proteine zu binden, wird als äußerst wichtig erachtet. Beispielsweise enthält die Struktur von Heparin, die mit dem basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) in Wechselwirkung tritt, um dessen Stabilisierung und Wirkung auf die Zellproliferation zu verbessern, größere Mengen N-Sulfatgruppen und Sulfatgruppen in 2-Stellung der Iduronsäure, und in 6-Stellung wird keine Sulfatgruppe benötigt (Ishihara, M. et al., Glycobiology. Bd. 4, S. 451–458 (1994)). Um andererseits die Aktivität des sauren Fibroblastenwachstumsfaktor (aFGF) oder von FGF-4 (Kaposi-Sarkom-FGF) zu verbessern, sind auch größere Mengen Sulfatgruppen in 6-Stellung erforderlich (Ishihara, M., Glycobiology, Bd. 4, S. 817–824 (1994)). Daher ist die gerinnungshemmende Wirkung bei einem in 6-Stellung selektiv desulfatierten Heparin, das durch Abspalten der Sulfatgruppe(n) der primären Hydroxygruppe(n) (Hydroxygruppe in 6-Stellung) des Glucosamins von Heparin erhalten wurde, verglichen mit dem Heparin vor der Desulfatierung geringer. Der spezifische Effekt der Verbesserung der §Wiorkung von bFGF bleibt jedoch erhalten, und in geringem Maße ist auch ein unerwünschte physiologische Wirkungen supprimierender Effekt zu erwarten, der auf in vivo-Wechselwirkungen mit zahlreichen anderen physiologisch aktiven Molekülen zurückgeht.
Als Zusammensetzungen mit Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) und Polysacchariden wurden beispielsweise die in der Japanischen Auslegeschrift Nr. 80583/1994 (entsprechend dem US-Patent Nr. 5 288 704) beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung, die FGF, ein sulfatiertes Polysaccharid mit antiviraler Aktivität und einen Hilfsstoff umfaßt, die in der Europäischen Patentschrift Nr. 509 517 beschriebene Zusammensetzung, die FGF, 2-O-sulfatierte L-Iduronsäure und N-Sulfo-D-glucosamin umfaßt und die ferner wenigstens ein aus 8–18 Sacchariden bestehendes Oligosaccharid enthält, das die Fähigkeit besitzt, an FGF zu binden, und ein in der Japanischen Auslegeschrift Nr. 40399/1990 beschriebener Komplex aus FGF-Mutein und Glycosaminoglycan oder eine hieraus formulierte Zusammensetzung vorgeschlagen. Dabei wird wie bei dem sulfatierten Polysaccharid, das in der in der USP 5 288 704 beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet wird, kein desulfatiertes Polysaccharid beschrieben und die pharmazeutische Zusammensetzung zielt durch eine cooperative Wirkung auf die Verbesserung der antiviralen Aktivität ab. Auch die in der Europäischen Patentschrift Nr. 509 517 beschriebene Zusammensetzung setzt ein spezielles Oligosaccharid ein, das nicht desulfatiert ist, und die in der Japanischen Auslegeschrift Nr. 40399/1990 beschriebene Zusammensetzung setzt natürliches Glycosaminoglycan ein, das keiner Desulfatierungsbehandlung unterzogen wurde.
Damit die den sulfatierten Polysacchariden inhärente biologische Wirkung durch Desulfatierung nur derjenigen Sulfatgruppe(n), die an die primäre(n) Hydroxygruppe(n) der sulfatierten Polysaccharide gebunden ist/sind, spezifischer und mit weniger Nebenwirkungen, wie hämorrhagischer Wirkung usw. exprimiert wird, hat der Erfinder intensiv einen Desulfatierungsprozess untersucht, bei dem die Positionsselektivität hoch ist und bei dem es zu keinen Nebenreaktionen wie der Spaltung von Glycosidbindungen, der Abspaltung der N-Sulfatgruppe(n) usw, kommt, und ist zu der vorliegenden Erfindung gelangt.
Offenbarung der Erfindung
Bei der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein Verfahren zur Herstellung eines desulfatierten Polysaccharids, das die Umsetzung eines sulfatierten Polysaccharids, welches ein Saccharid als Zuckerbestandteil aufweist, in dem eine primäre Hydroxygruppe sulfatiert ist, mit einem Silylierungsmittel der folgenden Formel (I) umfaßt
worin die R¹-Reste gleich oder verschieden sind und jeweils ein Wasserstoffatom oder ein Halogenatom bedeuten, R² eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet und die R³-Reste gleich oder verschieden sind und jeweils eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Phenylgruppe oder ein Chloratom oder ein Fluoratom bedeuten,
um eine Sulfatgruppe, die an die primäre Hydroxygruppe gebunden ist, selektiv zu desulfatieren.
Bei dem obigen Verfahren ist es bevorzugt, daß das sulfatierte Polysaccharid in ein in einem organischen Lösungsmittel lösliches Salz, beispielsweise ein organisches basisches Salz usw. überführt wird und daß die Umsetzung in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt wird.
Ferner ist es bevorzugt, daß die Silylgruppe(n) nach der Desulfatierungsreaktion von der/den silylierten. Hydroxygruppe(n) abgespalten wird/werden.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, ein selektiv desulfatiertes Heparin herzustellen, das die folgenden Eigenschaften besitzt:
In der Zusammensetzung ungesättigter Disaccharide der folgenden Formel:
worin R¹, R² und R³ die ihnen in 2 zugeschriebenen Bedeutungen haben, wobei diese Zusammensetzung ungesättigter Disaccharide mit Enzymverdau und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gemessen wird, beträgt

(1) der Anteil des ungesättigten Disaccharids, das ΔDiHS-6S entspricht und worin R¹ SO₃- ist, R² eine Acetylgruppe ist und R³ Wasserstoff ist, 1,1% oder weniger, der Anteil des ungesättigten Disaccharids, das ΔDiHS-di(6,N)S entspricht und worin R¹ SO₃- ist, R² SO₃- ist und R³ Wasserstoff ist, beträgt 7,9% oder weniger, der Anteil des ungesättigten Disaccharids, das ΔDiHS-di(U,6)S entspricht und worin R¹ SO₃- ist, R² eine Acetylgruppe ist und R³ SO₃- ist, beträgt 1,7% oder weniger, der Anteil des ungesättigten Disaccharids, das ΔDiHS-tri(U,6,N)S entspricht und worin R¹ SO₃- ist, R² SO₃- ist und R³ SO₃- ist, beträgt 36,7% oder weniger, und
(2) die Summe der Anteile des ungesättigten Disaccharids, das ΔDiHS-US entspricht und worin R¹ Wasserstoff ist, R² eine Acetylgruppe ist und R³ SO₃- ist, des ungesättigten Disaccharids, das ΔDiHS-di(U,N)S entspricht und worin R¹ Wasserstoff ist, R² SO₃- ist und R³ SO₃- ist, des ungesättigten Disaccharids, das ΔDiHS-di(U,N)S entspricht und worin R¹ SO₃- ist, R² eine Acetylgruppe ist und R³ SO₃- ist, und des ungesättigten Disaccharids, das ΔDiHS-tri(U,6,N)S entspricht und worin R¹ SO₃- ist, R² SO₃- ist und R³ SO₃- ist, liegt zwischen 71,6% und 76,8%.

Ferner eignet sich die vorliegende Erfindung zur Bereitstellung eines selektiv desulfatierten Heparins, das durch Desulfatierung von Heparin nach dem obigen Herstellungsverfahren erhalten wurde und das die obigen Eigenschaften besitzt.
Ferner eignet sich die vorliegende Erfindung zur Bereitstellung eines Mittels zur Verbesserung der Wirkung des basischen Fibroblastenwachstumsfaktors, das das obige desulfatierte Heparin als Wirkstoff enthält, sowie einer Zusammensetzung, mit der die Wirkung des basischen Fibroblastenwachstumsfaktors auf die Zellproliferation verbessert wird und die das obige desulfatierte Heparin und den basischen Fibroblastenwachstumsfaktor enthält.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Kurve, die die von der Veränderung der MTSTFA-Menge begleitete Desulfatierungsrate von Methyl-α-galactopyranosid-6-sulfat zeigt.
2 zeigt die Strukturbeziehungen und die abgekürzten Namen der verschiedenen durch Enzymverdau von Glycosaminoglycan gebildeten ungesättigten Disaccharidisomere. In der Figur bedeutet Ac eine Acetylgruppe.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Gemäß dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung kann durch Steuerung der Reaktionsbedingungen positionsselektiv eine vollständige Desulfatierung oder eine partielle Desulfatierung der an die primäre(n) Hydroxygruppe(n) gebundenen Sulfatgruppe(n) (wenn die einzelne Zuckereinheit Pentose oder Hexosen umfaßt, stellt diese Gruppe eine Hydroxygruppe in 5-Stellung bzw. 6-Stellung dar) des sulfatierten Polysaccharids erfolgen.
Das sulfatierte Polysaccharid, auf das das Verfahren der vorliegenden Erfindung angewandt wird, unterliegt keiner besonderen Beschränkung, solange es sich um ein Polysaccharid (in der vorliegenden Erfindung wird "Polysaccharid" als ein Begriff gebraucht, der sowohl Oligosaccharide als auch komplexe Polysaccharide umfaßt), mit einem Saccharid als Zuckerbestandteil handelt, bei dem die primären Hydroxygruppen sulfatiert sind. Ein solches sulfatiertes Polysaccharid kann durch Extraktion aus einem natürlichen Material isoliert oder synthetisiert sein. Als Beispiele für derartige sulfatierte Polysaccharide sind solche zu nennen, die ein N-substituiertes Glucosamin als Zuckerbestandteil aufweisen, und besonders bevorzugt sind solche, die N-sulfatiertes Glucosamin mit N-Sulfatgruppe(n) als Zuckerbestandteil aufweisen, die durch herkömmliche Desulfatierungsverfahren leicht desulfatiert werden.
Als sulfatierte Polysaccharide, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind insbesondere solche zu nennen, die als Zuckerbestandteil ein N-substituiertes Glucosamin aufweisen, in dem eine primäre Hydroxygruppe sulfatiert ist. Beispiele für sulfatierte Polysaccharide mit N-substituiertem Glucosamin als Zuckerbestandteil sind Glucosaminoglycan mit N-sulfatiertem oder N-acetyliertem Glucosamin oder Galactosamin als Zuckerbestandteil, beispielsweise Heparin, Heparansulfat, Chondroitinsulfat, Dermatansulfat, Keratan sulfat; Funoran mit D-Galactose-6-sulfat als Zuckerbestandteil; und Porphyran mit L-Galactose-6-sulfat als Zuckerbestandteil.
In der vorliegenden Erfindung wird die Desulfatierungsreaktion im allgemeinen in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt, so daß das sulfatierte Polysaccharid für die Umsetzung als Salz bereitgestellt wird, das in einem organischen Lösungsmittel löslich ist. Als Beispiele für solche in einem organischen Lösungsmittel löslichen Salze sind organische basische Salze des sulfatierten Polysaccharids zu nennen, und als organische Basen sind aromatische Amine wie Pyridin, Dimethylanilin, Diethylanilin; tertiäre Amine wie Trimethylamin, Triethylamin, Tributylamin, N,N-Diisopropylethylamin, Trioctylamin, N,N,N',N'-Tetramethyl-1,8-naphthalindiamin; heterocyclische N-Alkylamine wie N-Methylpyrimidin, N-Ethylpyrimidin, N-Methylmorpholin, N-Ethylmorpholin zu nennen. Das organische basische Salz des sulfatierten Polysaccharids läßt sich leicht durch Umsetzung des freien sulfatierten Polysaccharids mit einer organischen Base erhalten.
Die Desulfatierung erfolgt, indem man das durch die obige Formel (I) dargestellte Silylierungsmittel, im allgemeinen in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel, auf das sulfatierte Polysaccharid einwirken läßt. Bei dieser Umsetzung wird die Sulfatgruppe von der sulfatierten Hydroxygruppe abgespalten und außerdem kommt es zu einer Silylierung der Hydroxygruppe.
Als organische Lösungsmittel, die bei der Umsetzung eingesetzt werden können, sind die obigen organischen Basen (Pyridin, Dimethylanilin, Diethylanilin) bevorzugt, die zur Bildung des Salzes des sulfatierten Polysaccharids eingesetzt werden, anstelle der organischen Basen können jedoch auch aprotische Lösungsmittel wie Acetonitril, N,N-Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO), N,N-Dimethylacetamid, Tetrahydrofuran (THF), 1,4-Dioxan usw. verwendet werden.
In der durch die Formel (I) dargestellten Verbindung, bei der es sich um das Silylierungsmittel handelt, sind die R¹-Reste gleich oder verschieden und bedeuten jeweils ein Wasserstoffatom oder ein Halogenatom wie Fluor, R² bedeutet eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, tert-Butyl, Pentyl, Isopentyl, Hexyl, und die R³-Reste sind gleich oder verschieden und bedeuten jeweils die gleichen Alkylgruppen wie oben beschrieben, eine Phenylgruppe oder ein Chloratom oder ein Fluoratom; Beispiele für (R³)₃Si in der Formel (I) sind Trimethylsilyl-, Triethylsilyl-, Dimethylisopropylsilyl-, Isopropyldimethylsilyl-, Methyldi-tert-butylsilyl-, tert-Butyldimethylsilyl-, tert-Butyldiphenylsilyl- und Triisopropylsilylgruppen. Ganz besonders bevorzugt als Silylierungsmittel der Formel (I) ist N-Methyl-N-trimethylsilylacetamid (MTMSA) oder N-Methyl-N-trimethylsilyltrifluoracetamid (MTSTFA).
Die Umsetzung erfolgt zwischen Raumtemperatur und 100°C innerhalb von mehreren Minuten und mehreren zehn Stunden. Bei einer tieferen Temperatur als Raumtemperatur läuft die Reaktion nicht rasch genug ab, während bei einer Temperatur von 100°C oder höher die Glycosidbindung des sulfatierten Polysaccharids gespalten werden kann. Durch Änderung der Reaktionsbedingungen, insbesondere der Reaktionstemperatur, läßt sich der Umfang der Desulfatierung steuern. Beispielsweise läßt sich durch Umsetzung zwischen 30 und 100°C über etwa 30 Minuten bis 3 Stunden, vorzugsweise zwischen 65 und 90°C über 30 Minuten bis 2 Stunden, eine partielle Desulfatierung der vorhandenen Sulfatgruppen erreichen, und durch Umsetzung zwischen 90 und 100°C über etwa 2 bis 6 Stunden läßt sich eine vollständigere Desulfatierung erreichen.
Die Menge des eingesetzten Silylierungsmittels beträgt etwa die 3- bis 100fache molare Menge, vorzugsweise die etwa 3- bis 30fache molare Menge, bezogen auf ein Mol aller Hydroxygruppen (sowohl unsubstituierte als auch substituierte Hydroxygruppen) des sulfatierten Polysaccharids. Ferner läßt sich durch Veränderung der Menge des eingesetzten Silylierungsmittels auch das Ausmaß der Desulfatierung steuern.
Auf diese Weise läßt sich ein desulfatiertes Polysaccharid erhalten, bei dem die Sulfatgruppen des sulfatierten Polysaccharids, die an die primären Hydroxygruppen gebunden sind, partiell oder vollständig entfernt sind. Um das nicht-umgesetzte Silylierungsmittel nach der Desulfatierungsreaktion reaktionsunfähig zu machen oder um die an die Hydroxygruppen des desulfatierten Polysaccharids gebundenen Silylgruppen zu entfernen, kann der Reaktionsmischung beispielsweise Wasser zugegeben und/oder die Reaktionsmischung gegen Wasser dialysiert werden. Falls erforderlich kann die Reaktion zur Abspaltung der Silylgruppen außerdem auch nach üblichen Methoden durchgeführt werden. Eine solche Umsetzung erfolgt beispielsweise, indem man die der obigen Behandlung unterzogene Lösung auf alkalische Bedingungen von etwa pH 9 bis 9,5 einstellt oder erhitzt.
Wenn in dem desulfatierten Polysaccharid eine anionische funktionelle Gruppe vorliegt, kann ein Salz gebildet werden, wenn in der Lösung ein dementsprechendes Gegenion vorliegt. Beispielsweise läßt sich ein Alkalimetallsalz des desulfatierten Polysaccharids erhalten, indem man der wäßrigen Lösung des desulfatierten Polysaccharids nach der Umsetzung zur Entfernung der Silylgruppen ein Alkalimetallhydroxid (Natriumhydroxid usw.) zusetzt, die Mischung falls nötig dialysiert und der Mischung anschließend unter Bedingungen, die kein Erhitzen erfordern, das Wasser entzieht, beispielsweise durch Lyophilisieren. Genauer gesagt wird zur Umwandlung verbliebener Sulfatgruppen in Natriumsalze Natriumhydroxid zugegeben, um den pH der Lösung auf etwa 9 einzustellen, und die Mischung wird dialysiert und dann lyophilisiert, um das Natriumsalz des desulfatierten Polysaccharids zu erhalten.
Unter den durch das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung erhältlichen desulfatierten Polysacchariden, die selektiv desulfatiert werden, ist Heparin besonders bevorzugt, und dieses selektiv desulfatierte Heparin besitzt die folgenden Eigenschaften.

(1) In der mit Enzymverdau und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gemessenen Zusammensetzung ungesättiger Disaccharide beträgt der ΔDiHS-tri(U,6,N)S-Anteil 10 bis 40% und der ΔDiHS-di(U,N)S-Anteil beträgt 30 bis 60%,
(2) der Anteil an Disaccharid mit N-substituierten Sulfatgruppe(n) beträgt 75 bis 95%,
(3) das massegemittelte Molekulargewicht Mw beträgt 4.000 bis 30.000 Dalton,
(4) die Antithrombin-Aktivität zeigt einen Wert von 20 U/mg bis 150 U/mg, und
(5) der Effekt der Verbesserung der Wirkung von basischem Fibroblastenwachstumsfaktor auf die Zellproliferation bleibt im Vergleich mit nicht-desulfatiertem Heparin zu 80% oder mehr erhalten.

Der ΔDiHS-tri(U,6,N)S-Anteil von (1) stellt hier einen Wert dar, der mit Hilfe der nachfolgend beschriebenen Testmethode "Analysis of disaccharide by enzymatic digestion" erhalten wurde, und bedeutet den Anteil des Disaccharids unter den verschiedenen durch Abbau von Heparin mit Heparin-abbauenden Enzymen gebildeten ungesättigten Disacchariden (siehe 2), bei dem die 2-Stellung der Uronsäure und die Aminogruppe und die 6-Stellung von Glucosamin sulfatiert sind. Ähnlich bedeutet der ΔDiHS-di(U,N)S-Anteil den Anteil des Disaccharids, bei dem die 2-Stellung der Uronsäure und eine Aminogruppe des Glucosamins sulfatiert sind. Bevorzugt beträgt der ΔDiHS-tri(U,6,N)S-Anteil 10 bis 20% und der ΔDiHS-di(U,N)S-Anteil beträgt 50 bis 60%.
Der Anteil des Disaccharids mit N-substituierten Sulfatgruppen von (2) stellt den Anteil (Mol-%) des Disaccharids mit N-substituierten Sulfatgruppen dar, bezogen auf die Gesamtheit der einzelnen Zuckereinheiten in dem der Desulfatierung unterzogenen Heparin.
Das massegemittelte Molekulargewicht von (3) ist ein Wert für das massegemittelte Molekulargewicht (Mw), der durch Hochleistungs-Gelpermeationschromatographie mit Chondroitinsulfat als Molekulargewichtsstandard als Kontrolle bestimmt wurde, und er beträgt vorzugsweise 10.000 bis 20.000 Dalton.
Bei der Messung durch Gelpermeationschromatographie liegt das massegemittelte Molekulargewicht von Heparin vor der Desulfatierung im allgemeinen im Bereich von 4.000 bis 30.000 Dalton und das massegemittelte Molekulargewicht des mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung desulfatierten Heparins bleibt nahezu unverändert.
In den Beispielen wurde das Molekulargewicht vor und nach Desulfatierung unter folgenden Bedingungen gemessen.
Gelpermeations(GPC)-HPLC

Säule: TSK-Gel G-4000 + G-3000 + G-2500 (hergestellt von Tosoh K.K.)
Lösungsmittel: 0,2 M NaCl, 1,0 ml/min
Detektor: Differentialrefraktometer (RI), W-Absorption (UV 230 nm)
Beladungsmenge: 5 μl (10 mg/ml)

Die Antithrombin-Aktivität von (4) ist ein Wert, der durch die in den nachfolgenden Beispielen beschriebene Methode bestimmt wurde. Wenn die Antithrombin-Aktivität von nicht-desulfatiertem Heparin mit dieser Methode gemessen wird, beträgt ihr Wert 1200 U/mg bis 1600 U/mg, die Antithrombin-Aktivität des desulfatierten Heparins der vorliegenden Erfindung liegt jedoch im Bereich von 20 U/mg bis 150 U/mg, vorzugsweise von 30 U/mg bis 100 U/mg, und die hämorrhagische Wirkung ist reduziert.
Der Effekt der Verbesserung der Wirkung von basischem Fibroblastenwachstumsfaktor auf die Zellproliferation von (5) ist der in Prozent angegebene, die bFGF-Wirkung erhaltende Effekt des desulfatierten Heparins der vorliegenden Erfindung im Vergleich mit dem die bFGF-Wirkung erhaltenden Effekt des Heparins vor Behandlung mit einem Desulfatierungsmittel, wenn die Zellproliferation mit der nachfolgend beschriebenen Testmethode "Measurement of bFGF und aFGF activities-accelerating effect" gemessen wird. Selbst nach Desulfatierung behält das desulfatierte Heparin der vorliegenden Erfindung 80 bis etwa 100 des wirkungsverbessernden Effekts, den das nicht-desulfatierte Heparin besitzt.
Das mit dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung erhaltene selektiv desulfatierte Heparin liefert ein Mittel zur Verbesserung der Wirkung von basischem Fibroblastenwachstumsfaktor, das dieses als Wirkstoff enthält, und liefert durch Mischen von diesem mit basischem Fibroblastenwachstumsfaktor ferner eine Zusammensetzung, in der die Wirkung des basischen Fibroblastenwachstumsfaktors auf die Zellproliferation verbessert ist.
Durch innerliche oder äußerliche Verabreichung des desulfatierten Heparins der vorliegenden Erfindung an den lebendigen Körper wird die bFGF-Wirkung stabilisiert, was zur Behandlung oder Vorbeugung, beispielsweise bei der Wundheilung (Decubitus usw.) usw. von Nutzen ist. Bei Diabetikern kann das Heparansulfat oder das Heparin reduziert sein und es wird angenommen, daß sich die Wirkung von bFGF, das bei der Wundheilung verwendet wird, ohne Heparansulfat oder Heparin als nicht ausreichend erweist, so daß die obige Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zur Behandlung und Vorbeugung von Decubitus bei Diabetikern besonders geeignet ist. Wenn Patienten und Applikationsstellen behandelt werden, bei denen genügend endogenes bFGF produziert wird, ist es außerdem nicht unbedingt erforderlich, bFGF äußerlich zu verabreichen, und das Problem läßt sich ausreichend allein mit dem desulfatierten Heparin der vorliegenden Erfindung lösen, so daß das obige, die Wirkung von bFGF verbessernde Mittel für die Wundheilung verwendet werden kann. Was die Präparateform und den Verabreichungsweg bei der innerlichen oder äußerlichen Verabreichung des die Wirkung von bFGF verbessernden Mittels oder der obigen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung an den lebendigen Körper betrifft, so können sie Warmblütern (z. B. Menschen, Mäuse, Ratten, Hamster, Kaninchen, Hunde, Katzen) gefahrlos parenteral oder oral verabreicht werden, entweder als solche oder als pharmazeutische Zusammensetzungen (z. B. als Injektion, Tablette, Kapsel, Lösung, Salbe) zusammen mit weiteren pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen, Hilfsstoffen, Verdünnungsstoffen.
Ferner werden bei dem die Wirkung von bFGF verbessernden Mittel und bei der obigen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung Nebenwirkungen wie die hämorrhagische Wirkung usw. reduziert, so daß die Sicherheit als Medikament hoch ist.
Beispiele
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung unter Bezug auf das Beispiel und die Testbeispiele näher veranschaulicht, ohne daß dies den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränkt.
Die Identifizierung des sulfatierten Polysaccharids erfolgte auf Basis der folgenden Methoden.
Testmethoden
1) Disaccharidanalyse durch Enzymverdau
Die Analyse der Stellungen der Sulfatgruppen nach Desulfatierung von Glycosaminoglycan kann wie nachfolgend beschrieben erfolgen. Das heißt, vor und nach Desulfatierung wurden die Glycosaminoglycane mit Enzymen verdaut und die gebildeten ungesättigten Disaccharide wurden mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) analysiert (siehe "2·8 Structure analysis using glycosaminoglycan-decomposing enzymes and HPLC in combination", beschrieben in New Biochemical Experiment Lecture 3, Carbohydrates II (1991), S. 49–62).
Verdau mit Heparin-abbauenden Enzymen
Entsprechend dem Verfahren nach New Biochemical Experiment Lecture 3, Carbohydrates II, S. 54–59 (veröffentlicht von Tokyo Kagaku Dojin, 1991) wurden 0,1 mg Heparin in 220 μl 20 mM-Natriumacetat (pH 7,0), das 2 mM Calciumacetat enthielt, gelöst und zu der Lösung wurden 20 mU Heparinase und 20 mU Heparitinasen I und II gegeben. Die Mischung wurde 2 Stunden bei 37°C reagieren gelassen. Falls bei der Desulfatierungsbehandlung Sulfatgruppen abgespalten wurden, die an Aminogruppen gebunden waren, greifen Heparin-abbauende Enzyme das derart desulfatierte Heparin nicht an, so daß es erforderlich ist, die Aminogruppen vor der enzymatischen Umsetzung zu acetylieren. Die N-Acetylierung erfolgt mit Essigsäureanhydrid in wäßriger Lösung, die Natriumcarbonat oder Dowex-Ionenaustauscherharz (Typ Dowex-1 (HCO₃)) enthält, quantitativ (siehe "Sugar Chain Engineering", veröffentlicht von K.K. Sangyo Chosakai und Biotechnology Information Center, S. 324).
HPLC-Analyse
Nach dem Verdau mit den Heparin-abbauenden Enzymen wurden 50 μl der Lösung mittels HPLC analysiert (Irika, Modell 852). Die Extinktion bei 232 nm wurde unter Verwendung einer Ionenaustauschersäule gemessen (Dionex Co., CarboPac PA-1-Säule, 4,0 mm × 250 mm). Die Messung erfolgte mit einem Gradientensystem (50 mM → 2,5 M) unter Verwendung von Lithiumchlorid bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/min (Kariya et al., Comp. Biochem. Physiol., Bd. 103B, S. 473–479 (1992)).
2) Gelpermeation
10 μl einer 3%igen Lösung von sulfatiertem Polysaccharid wurden durch Gelpermeation mittels HPLC analysiert. Die Entwicklung erfolgte mit TSK-Gel (G4000 + G3000 + G2500)PW_XL als Säule (Tosoh, 7,8 mm × 30 cm) und mit 0,2 M Natriumchlorid als Elutionslösung bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,0 ml/min. Zum Nachweis des sulfatierten Polysaccharids wurde ein Differentialrefraktometer (Shimadzu, AID-2A) verwendet.
3) Messung des die Wirkung von bFGF und aFGF erhöhenden Effekts
A31-Zellen (BALB/c 3T3), die in einem DMEM-Medium (hergestellt von Life Technologies Co.) mit 10% Rinderserum passagiert worden waren, wurden mit 100 μl ITS⁺ in eine 96-Loch-Kulturplatte (hergestellt von Collaborative Research Co.) plattiert, enthaltend 1 μl/ml Testprobe, 20 mM NaClO₃ und SO₄ ^2–-freies DMEM, das 2 ng/ml humanen rekombinanten bFGF (hrbFGF) (hergestellt von Seikagaku Kogyo K.K.) oder 5 ng/ml humanen rekombinanten bFGF (hrbFGF) (hergestellt von Seikagaku Kogyo K.K.) enthielt. Nach 3 Tagen Kultivierung wurden 20 μl Zelltiterlösung eines nicht-radioaktiven 96AQ-Zellproliferationsassays (hergestellt von Seikagaku Kogyo K.K.) in die einzelnen Vertiefungen gegeben. Nach 2 Stunden Kultivierung bei 37°C wurde die OD₄₉₀ bestimmt, um die Zellproliferation in den jeweiligen Vertiefungen zu quantifizieren. In Tabelle 2 wurde die Zellproliferation sowohl für bFGF als auch für aFGF bei Zugabe von 1 μl/ml nicht-desulfatiertem Heparin als 100 definiert und wenn kein Heparin zugegeben wurde sie als 0 definiert.
4) Messung der Antithrombin-Aktivität
Drei Lösungen, 350 μl eines 20 mM-Tris-Puffers (pH 7,4), der 150 mM Salz, 10 mM Calciumchlorid und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, 100 μl einer Lösung von bovinem Antithrombin III (1 U/ml des gleichen Puffers) und 100 μl der mehrfach verdünnten Heparinprobe, wurden in gekühltem Zustand vermischt und die Mischung wurde 2 Minuten bei 37°C inkubiert. Zu dieser Lösung wurden 50 μl einer Lösung von bovinem Thrombin (50 mU/ml in destilliertem Wasser) gegeben und die Mischung wurde 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Hierzu wurden dann 100 μl einer Substratlösung (Boc-Val-Pro-Arg-MCA, 70 μM wäßrige Lösung) gegeben und die Mischung wurde gerührt. Die Mischung wurde 3 Minuten bei 37°C inkubiert und es wurden 300 μl 30%ige Essigsäure zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Die Fluoreszenzintensität der Reaktionsmischung wurde bei einer Anregungswellenlänge von 350 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 444 nm gemessen. Eine mit destilliertem Wasser anstelle der Probe der obigen Reaktionsmischungszusammensetzung abgemessene Blindprobe 1 und eine Blindprobe 2 der Reaktionsmischung, die nur das Substrat und den Puffer enthielt, wurden in gleicher Weise behandelt und die Fluoreszenzintensitäten wurde bestimmt.
Die Hemmung der Thrombin-Aktivität wurde mittels der folgenden Gleichung bestimmt und die Hemmung bei den jeweiligen Probenkonzentrationen wurde in einer halblogarithmischen Kurve aufgetragen, um die 50%ige Hemmung (IC₅₀) zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Hemmung der Thrombinaktivität (%) = 100 – (ΔFs/ΔFb) × 100wobei
ΔFs: Fluoreszenzintensität der Probe – Fluoreszenzintensität der Blindprobe 1
ΔFb: Fluoreszenzintensität der Blindprobe 2 – Fluoreszenzintensität der Blindprobe 1
Testbeispiel
5 ml eines Harzes vom Typ Amberlite IR-120(H⁺) wurden zu einer wäßrigen Lösung von etwa 2 mg/3 ml Methyl-α-galactopyranosid-6-sulfat-Ammoniumsalz gegeben, um das Salz in einen freien Sulfatester zu überführen. Nach Abtrennen des Harzes wurden dem Rückstand zur Bildung des Pyridiniumsalzes 2 ml Pyridin zugegeben. Restliches Pyridin wurde durch Abdampfen unter reduziertem Druck abgetrennt und der Rückstand wurde zur Herstellung von trockenem Methyl-α-galactopyranosid-6-sulfat-Pyridiniumsalz lyophilisiert. Diese Probe wurde in jeweils 0,2 mg aufgeteilt und es wurden etwa 0,05 ml trockenes Pyridin und Methyl-α-glycosid als interner Standard zugegeben, um verschiedene Reaktionssysteme herzustellen, bei denen die Molmenge von MTSTFA bezogen auf die Molmenge aller Hydroxygruppen ([-OH] + [-O-SO₃ ^–]) des Methyl-α-galactopyranosid-6-sulfat-Pyridiniumsalzes das 0- bis 20fache betrug. Nach Zugabe von MTSTFA zu den jeweiligen Systemen wurden die Mischungen durch Erhitzen auf 20°C für etwa 2 Stunden umgesetzt. Zur gaschromatographischen Analyse nach vollständiger O-Trimethylsilylierung wurde den Reaktionsmischungen Trimethylsilylimidazol zugegeben und die Mischungen wurden 20 Minuten auf 80°C erhitzt. Durch unmittelbare Messung von trimethylsilyliertem Methyl-α-galactopyranosid in den Reaktionsmischungen der jeweiligen Systeme wurden die Desulfatierungsmengen berechnet, die in 1 gezeigt sind. 1 ist zu entnehmen, daß die Sulfatester der primären Hydroxygruppen im Falle des sulfatierten Monosaccharids nahezu vollständig desulfatiert werden können, wenn MTSTFA unter den obigen Reaktionsbedingungen in etwa der 13fachen Molmenge oder mehr, bezogen auf die Molmenge aller Hydroxygruppen des Saccharids, eingesetzt wird.
Beispiel
200 mg Heparin-Natriumsalz (massegemitteltes Molekulargewicht: 12.200 Dalton) wurden auf eine Amberlite IR-120 (H⁺-Typ)-Säule (1 × 10 cm) aufgetragen und die Lösung wurde durch Zugabe eines Überschusses an Pyridin zu der Elutionslösung bis auf pH 8 neutralisiert und zur Herstellung des Heparin-Pyridiniumsalzes lyophilisiert. Dieses Heparin-Pyridiniumsalz wurde zur Herstellung einer Reaktionsprobe in 20 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Zu der Probe wurde MTSTFA in 20facher molarer Menge (etwa 4 ml) des Zuckergerüsts des Heparins gegeben und die Mischung wurde 2 Stunden bei 65, 75, 85, 90 und 95°C gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurden 20 ml Wasser zugegeben, um nicht-umgesetztes MTSTFA zu inaktivieren, wodurch die Reaktion gestoppt wurde. Die Reaktionsmischung wurde zum Erhalt einer Lösung des durch Desulfatierung des trimethylsilylierten Heparins erhaltenen Produkts mit einer Millipore-Ultrafiltrationsmembran dialysiert.
Um die Trimethylsilylgruppen durch Hydrolyse abzuspalten, wurde die dialysierte Lösung als nächstes durch Erhitzen auf 100°C (bis die Lösung transparent wurde) 30 Minuten bis 1 Stunde gekocht. Nach Zugabe von Natriumhydroxid zur Einstellen der Lösung auf pH 9 bis 9,5 wurde die Lösung dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde lyophilisiert, wobei ein Natriumsalz erhalten wurde, das 130 mg des durch Desulfatierung des Heparins erhaltenen Produkts entsprach.
Vergleichsbeispiel
Als Kontrollexperiment wurde die Reaktion entsprechend dem Beispiel bei 90°C durchgeführt, wobei anstelle von MTSTFA N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid (BTSA) eingesetzt wurde.
Die Werte für die Disaccharide, die bei dem Enzymverdau vor und nach der obigen Behandlung des Heparins mit Silylierungsmittel gemessen wurden, sind in Tabelle 1 gezeigt.
Die durch die obige Desulfatierung des Heparins jeweils erhaltenen Produkte wurden zur Acetylierung 2 Stunden bei 4°C mit Essigsäureanhydrid und Methanol in einer wäßrigen Natriumcarbonatlösung (pH 6,5) umgesetzt. Diese Proben wurden mit Heparin-abbauenden Enzymen entsprechend der in den obigen Testmethoden beschriebenen analytischen Methode abgebaut, die verschiedenen Isomere (2) der gebildeten ungesättigten Disaccharide wurden durch HPLC fraktioniert und die Ergebnisse der Analyse des Zusammensetzungsverhältnisses sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1 zeigt, daß ΔDiHS-tri(U,6,N), das den Hauptbestandteil der Disaccharide des Heparins bildet, sowohl bei der Behandlung mit BTSA als auch bei der Behandlung mit MTSTFA signifikant abnahm, und daß ΔDiHS-di(U,N)S durch Abspaltung der Sulfatgruppen in 6-Stellung zunahm. Bei der BTSA-Behandlung führte die Abspaltung der N-Sulfatgruppen jedoch darüber hinaus zu einer Abnahme der Gesamtmenge von ΔDiHS-di(U,N)S und ΔDiHS-tri(U,6,N)S und zu einer Zunahme an ΔDiHS-US. Man sieht also, daß die Sulfatgruppen bei der MTSTFA-Behandlung von den primären Hydroxygruppen des Heparins in gleichem Umfang wie bei der BTSA-Behandlung abgespalten werden konnten und daß sie, indem sie die Reduktion der N-Sulfatgruppe durch die BTSA-Behandlung supprimiert, die Sulfatgruppe in 6-Stellung außerdem selektiver angreift.
Bei der Untersuchung der Änderung der Molekulargewichte der Heparine durch Gelpermeation vor und nach Behandlung mit MTSTFA war ferner im Ergebnis nahezu keine Änderung des Molekulargewichts zu beobachten.
Aus dem Vorhergehenden ist klar, daß die Desulfatierungsreaktion mit MTSTFA spezifisch an der an die primäre Hydroxygruppe gebundenen Sulfatgruppe angreift und weder Sulfatgruppen in anderen Stellungen oder Glycosidbindungen beeinträchtigt.
Ferner wurde die Thrombin-hemmende Aktivität und der die Wirkung von bFGF und aFGF verbessernde Effekt des Heparins untersucht, dessen Sulfatgruppe in 6-Stellung bei 65°C, 75°C, 85°C, 90°C und 95°C schrittweise desulfatiert wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Wie Tabelle 2 zeigt, bleibt der die bFGF-Wirkung verbessernde Effekt bis zur Desulfatierung bei 90°C erhalten, während die Hemmung von Thrombin bei der partiellen Desulfatierung in 6-Stellung bei 65°C eine abrupte Abnahme zeigt. Andererseits zeigte der die aFGF-Wirkung verbessernde Effekt bei der Desulfatierung der Sulfatgruppe in 6-Stellung eine leichte Abnahme. Insbesondere bei Desulfatierung der Sulfatgruppe in 6-Stellung bei einer Reaktionstemperatur von 85 bis 90°C wurde ein in 6-Stellung selektiv desulfatiertes Heparin erhalten, bei dem die gerinnungshemmende Aktivität, der die aFGF-Wirkung verbessernde Effekt usw. supprimiert waren und der spezifische, die bFGF-Wirkung verbessernde Effekt erhalten blieb.
Wenn Heparin mit einem massegemittelten Molekulargewicht im Bereich von 4.000 bis 30.000 durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung wie oben beschrieben desulfatiert wurde, wird die 6-Stellung wie in Tabelle 1 gezeigt spezifisch desulfatiert, die biologischen Wirkungen zeigen die gleiche Tendenz wie in Tabelle 2 angegeben, und es gibt nahezu keine Änderung des Molekulargewichts vor und nach der Desulfatierung.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Erfindungsgemäß wird von den Sulfatgruppen mit den verschiedenen Eigenschaften, die an das Zuckergerüst von sulfatierten Polysacchariden gebunden sind, nur die Sulfatgruppe spezifisch desulfatiert, die an eine primäre Hydroxygruppe gebunden ist, da der Unterschied zwischen einer Sulfatgruppe an einer primären Hydroxygruppe, einer Sulfatgruppe an einer sekundären Hydroxygruppe und einer N-Sulfatgruppe erkannt wird, wodurch ein sulfatiertes Polysaccharid mit Sulfatestern an spezifischen Positionen hergestellt werden kann, das bislang noch nicht im Stand der Technik bekannt war.
Insbesondere wird bei einem desulfatierten Produkt, das durch Desulfatierung von Heparin mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, eine unspezifische Bindung von Heparin an Proteine supprimiert und man erhält durch die Wechselwirkung mit basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) ein Heparin mit einer spezifischen physiologischen Aktivität. Außerdem kann dieses Produkt für einen breiten Bereich von Medikamenten zur Anwendung kommen, wie Medikamenten mit weniger Nebenwirkungen, beispielsweise Neigung zur Hämorrhagie, zur Behandlung von Wunden, Verbrennungen oder Hautgeschwüren, Medikamenten zur Behandlung von Osteoporose, Medikamenten zur Behandlung von Frakturen, Medikamenten zur Behandlung von Geschwüren des Verdauungstrakts, Medikamenten zur Verbesserung der Prognose bei Herzinfarkt, und zwar in Kombination mit bFGF oder alleine.
Ferner ist zu erwarten, daß das Desulfatierungsverfahren der vorliegenden Erfindung in breitem Umfang auch für andere physiologisch aktive Moleküle als bFGF Anwendung finden kann.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines desulfatierten Polysaccharids, das die Umsetzung eines sulfatierten Polysaccharids, welches ein Saccharid als Zuckerbestandteil aufweist, in dem eine primäre Hydroxygruppe sulfatiert ist, mit einem Silylierungsmittel der folgenden Formel (I) umfaßt
worin die R¹-Reste gleich oder verschieden sind und jeweils ein Wasserstoffatom oder ein Halogenatom bedeuten, R² eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet und die R³-Reste gleich oder verschieden sind und jeweils eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Phenylgruppe oder ein Chloratom oder ein Fluoratom bedeuten, um eine Sulfatgruppe, die an die primäre Hydroxygruppe gebunden ist, selektiv zu desulfatieren.
Verfahren zur Herstellung eines desulfatierten Polysaccharids nach Anspruch 1, wobei das sulfatierte Polysaccharid wenigstens einen Zucker als Zuckerbestandteil aufweist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus N-substituiertem Glucosamin, D-Galactose-6-sulfat und L-Galactose-6-sulfat besteht.
Verfahren zur Herstellung eines desulfatierten Polysaccharids nach Anspruch 1, wobei das sulfatierte Polysaccharid N-sulfatiertes Glucosamin oder N-acetyliertes Glucosamin als Zuckerbestandteil aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines desulfatierten Polysaccharids nach Anspruch 1, wobei das sulfatierte Polysaccharid Heparin, Heparansulfat, Chondroitinsulfat, Dermatansulfat, Keratansulfat, Funoran oder Porphyran ist.
Verfahren zur Herstellung eines desulfatierten Polysaccharids nach Anspruch 1, wobei das sulfatierte Polysaccharid N-substituiertes Glucosamin als Zuckerbestandteil aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines desulfatierten Polysaccharids nach Anspruch 5, wobei das sulfatierte Polysaccharid N-sulfatiertes Glucosamin als Zuckerbestandteil aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines desulfatierten Polysaccharids nach Anspruch 6, wobei das sulfatierte Polysaccharid Heparin oder Heparansulfat ist.
Verfahren zur Herstellung eines desulfatierten Polysaccharids nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das sulfatierte Polysaccharid in ein in einem organischen Lösungsmittel lösliches Salz überführt wird und die Umsetzung in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt wird.
Verfahren zur Herstellung eines desulfatierten Polysaccharids nach Anspruch 8, wobei das in einem organischen Lösungsmittel lösliche Salz des sulfatierten Polysaccharids ein organisches basisches Salz des sulfatierten Polysaccharids ist.
Verfahren zur Herstellung eines desulfatierten Polysaccharids nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, wobei nach der Desulfatierungsreaktion eine Silylgruppe von einer silylierten Hydroxygruppe abgespalten wird.