WO1996001278A1

WO1996001278A1 - Procede pour produire un polysaccharide desulfate et une heparine desulfatee

Info

Publication number: WO1996001278A1
Application number: PCT/JP1995/001321
Authority: WO
Inventors: Saburo Hara; Keiichi Yoshida; Masayuki Ishihara
Original assignee: Seikagaku Corporation
Priority date: 1994-07-01
Filing date: 1995-07-03
Publication date: 1996-01-18
Also published as: EP1371666A2; HU9603606D0; EP0769502B1; EP1371666A3; DE69535565D1; HUT76426A; US6545136B1; HU218600B; EP0769502A1; US6809086B2; EP1371666B1; DE69531945D1; US20030149253A1; EP0769502A4; DE69535565T2; JP3929486B2; US6140481A; DE69531945T2

Description

明細書脱硫酸化多糖の製造法及び脱硫酸化へパリン技術分野

本発明は、硫酸化多糖の第 1級水酸基に結合している硫酸基を選択的に脱硫酸した脱硫酸化多糖の製造法及びこの製造法により得られた脱硫酸化されたへパリンに関する。背景技術

生物活性を有する硫酸化多糖を提供するために、硫酸化多糖の様々な脱硫酸化方法が研究されている。硫酸化多糖の脱硫酸化方法としては、塩化水素 Zメタノール中で酸触媒により脱硫酸化する方法が知られている（Kantor T. G. and Schubert M. , J. Amer. Chem. Soc. Vol. 79， p. 152 (1957) )。しかし、この方法では特定の硫酸基のみを脱硫酸化することはできず、またグリコシド結合のメタノリシスによる糖鎖の切断が起こるため低分子量化し、もとの鎖長を有する反応生成物の収量は低下する。

収量よく脱硫酸化を行う方法として、ジメチルスルホキシド（D M S 0 ) 、 N , N—ジメチルホルムアミド（D M F ) 又はピリジン等の非プロトン性溶媒中 (Usov A. et al. Carbohydr. Res. , Vol. 18, p. 336 (1971) )又は少量の水又はメタノールを含む D M S 0中（Nagasawa K. et al. Carbohydr. Res. , Vol. 58, p. 47 (1977) , Nagasawa K. et al. J, Biochem. , Vol. 86, p. 1323 (1979) )で行うソルボリシスがある。ソルボリシスの反応機構は、非プロトン性の溶媒中で三酸化硫黄とアミンの複合体を用いて行う硫酸化反応の逆反応であることが知られている。この反応は、反応条件をコントロールすることにより N—硫酸基の選択的脱硫酸方法として用いることができる。しかし、第 1級又は第 2級水酸基に結合している 0—硫酸基を脱離させることはできなかった。さらに、この方法をオリゴ糖又は多糖に適用した場合、 D M S 0等の溶媒を反応後に除去する操作が煩雑であること、完全に脱硫酸化するには反応温度を上昇させる必要があり、このような反応条件ではグリコシド結合の切断が起こること、などの問題点があつ i o

他方、糖類の第 1級水酸基に結合した硫酸基を特異的に脱硫酸化する方法として、 N, 0—ビス（トリメチルシリル）ァセトアミド（B T SA) を用いる方法力ある (Matsuo, M. et al. , Carbohydr. Res. , Vol. 241, pp. 209-215 (1993)) 。この方法をへパリンに適用した場合、グルコサミンの 6位の硫酸基は比較的特異的に除去される。しかし、酵素消化法によってその微細構造を調べた結果では、第 1級水酸基に結合した硫酸基が脱離すると同時に少量の N—硫酸基の離脱が起こることが分かった。このため、より選択性の高い第 1級水酸基結合硫酸基の除去法が求められていた。

第 1級水酸基に結合している硫酸基の特異的脱離法の開発は、ヒ卜に対し好ましい生物活性を有する医薬品の創造を目的とした硫酸化多糖を提供するために非常に重要である。例えば、硫酸化多糖であるデキストラン硫酸、キシラン硫酸、コンドロイチン硫酸、へパリンなどは、脂質代謝改善剤、抗血栓剤として使用されているが、人工的に硫酸基を導入したものは、導入した硫酸基の位置が特定できず、多量に硫酸基を導入するに従い組織からの出血傾向が強まる副作用が生ずることも知られている。また、天然由来の硫酸化多糖は、起源の違いにより硫酸基の位置、量がそれぞれ異なり、各硫酸化多糖の生理活性も微妙に異なる。

いろいろな生理活性蛋白質との特異的な結合能をもつへパリンの脱硫酸化はとりわけ重要と考えられる。例えば、塩基性繊維芽細胞増殖因子（b FGF) と相互作用し、その安定化と細胞増殖に対する活性を促進するへパリンの構造は、 N—硫酸基とィズロン酸の 2位硫酸基 _を豊富に含んでおり、 6位硫酸基を必要としなレヽ (Ishihara, M. et al. , Glycobiology, Vol. 4， pp.451-458 (1994))。一方、酸性繊維芽細胞増殖因子（a FGF) や FGF - 4 (カポシ肉腫 F GF) との活性促進には豊富な 6位硫酸基も必要である（Ishihara, M. , Glycobiology, Vol. 4， pp. 817-824 (1994)) 。従って、へパリンからグルコサミンの第 1級水酸基（6位水酸基）の硫酸基を除去することにより得られた選択的 6位脱硫酸化へパリンは、脱硫酸化を行う前のへパリンと比べて抗凝固活性は低下するが、特異的に b F GF活性を促進する効果を維持し、且つ、他の多くの生体内生理活性分子との相互作用から生じる望ましくない生理活性を低く抑える効果が期待できる。

繊維芽細胞増殖因子（FGF) と多糖類を使用した組成物としては、例えば、特開平 6— 80583号に記載された、 FGFと、抗ウィルス活性を有する硫酸化多糖及び賦形剤から成る医薬組成物、 EP公開 509517号に記載された、 F GFと、 Lーィズロン酸 2硫酸及び N—スルホー D -グルコサミンから成り、かつ 8— 18糖で構成される FGFと結合性を有するオリゴ糖の少なくとも 1種を含有する組成物、及び特開平 2— 40399号に記載された、 FGFムティンとグリコサミノグリカンとの複合体或いはこれらを配合した組成物が提案されている。このうち、 U S P 5288704号に記載の医薬組成物において使用されている硫酸化多糖としては、脱硫酸化されたものは記載されておらず、医薬組成物は抗ウィルス活性の共働作用による増強を目的としている。また、 EP公開 509517号に記載された組成物は、脱硫酸化されていない特定のオリゴ糖を使用しており、特開平 2— 40399号に記載された組成物は、天然のグリコサミノグリカンを使用しており、脱硫酸化処理が施されたものではない。

本発明者は、硫酸化多糖の第 1級の水酸基に結合している硫酸基のみを脱硫酸化することにより、出血作用などの副作用が少なく、かつその硫酸化多糖本来の生物活性をより特異的に発現させることを百的として、位置選択性が高く、グリコシド結合の切断、 N -硫酸基の脱離等の副反応のない脱硫酸化法を鋭意検討し、本発明に到達した。発明の開示

本発明は、第 1級水酸基が硫酸エステル化された糖を構成糖として含有する硫酸化多糖に、下記式（I)

0

II

(R¹ ) a C-CN-S i (R³ ) 3 (I)

R²

式中、 R¹ は同一又は異なり水素原子又はハロゲン原子を示し、 R² は低級アルキル基を示し、 R³ は同一又は異なり低級アルキル基、ァリール基又はハロゲン原子を示す、

で表されるシリル化剤を反応させることにより、第 1級水酸基に結合している硫酸基を選択的に脱硫酸化することを特徴とする脱硫酸化多糖の製造法である。上記方法において、硫酸化多糖を有機塩基塩などの有機溶媒可溶性塩とし、反応を有機溶媒中で行うことが好ましい。

また、脱硫酸化反応後、更にシリル化された水酸基のシリル基を除去する処理を行うことが好ましい。

本発明は、また、下記の特性：

( 1 ) 酵素分解および高速液体クロマトグラフィーを用いる測定によつて測定した不飽和二糖組成のうち、第 2図に示す Δϋ i H S - t r i (U,6,N) S含量が 10〜40%、 Δ D i H S - d i (U,N) S含量が 30〜60%、

(2) N -置換硫酸基を含む二糖含量が 75〜95%、

(3) 重量平均分子量（Mw) が 4, 000-30, 000ダルトン、

(4) 抗トロンビン活性が 20UZmg〜l 50 U/m 及び

( 5 ) 塩基性繊維芽細胞増殖因子の細胞増殖に対する活性促進効果が脱硫酸化を行なっていないへパリンに対して 80%以上を維持する

を有することを特徴とする選択的に脱硫酸化されたへパリンを提供する。

本発明は、更に、上記の製造法によりへパリンを脱硫酸化して得られた脱硫酸化へパリンであって、前記（1) 〜（5) の特性を有することを特徴とする選択的に脱硫酸化されたへパリンを提供する。

本発明は、更に、上記脱硫酸化へパ_リンを有効成分として含有する塩基性繊維芽細胞増殖因子活性促進剤、並びに上記脱硫酸化へパリン及び塩基性繊維芽細胞増殖因子を含有する塩基性繊維芽細胞増殖因子の細胞増殖に対する活性が促進された組成物を提供する。図面の簡単な説明

第 1図は、 MT S T F A量変化に伴うメチルー α—ガラクトビラノシドー 6硫酸の脱硫酸化率を示したグラフである。第 2図は、グリコサミノグリカンを酵素消化することによつて生成する各種不飽和二糖異性体の構造と略称の関係を示すものである。図中、 A cはァセチル基を示す。発明を実施するための最良の形態

本発明の製造法によれば、硫酸化多糖の第 1級水酸基（構成糖単位が五炭糖 (ペン卜ース）又は六炭糖類（へキソース）からなる場合は、それぞれ 5位又は 6位の水酸基を表す）に結合している硫酸基の完全な脱硫酸化を、又は反応条件を制御することによって部分的な脱硫酸化を、位置選択的に行うことができる。本発明の方法が適用される硫酸化多糖は、第 1級水酸基が硫酸エステル化された糖を構成糖として有する多糖（本発明においては、「多糖」をオリゴ糖及び複合多糖を包含する用語として使用する）であれば特に制限されない。このような硫酸化多糖は天然物から抽出単離されたものであっても、合成されたものであつてもよい。このような硫酸化多糖としては、 N—置換グリコサミンを構成糖として有するものが挙げられ、特に従来の脱硫酸化法では脱硫酸化されやすい N—硫酸基を有する N—硫酸化グリコサミンを構成糖とするものが好ましい。

本発明において使用される硫酸化多糖として、具体的には、第 1級水酸基が硫酸エステル化された N—置換グリコサミンを構成糖として有するもの等が挙げられる。 N—置換グリコサミンとしては、 N—硫酸化もしくは N—ァセチル化されたダルコサミンもしくはガラクトサミンを構成糖として有するグリコサミノグリカン、例えば、へパリン、へパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸等； D—ガラクトースー 6硫酸を構成糖として有するフノラン；及び L一ガラクトースー 6硫酸を構成糖として有するボルフイラン等が例示される。

本発明では通常脱硫酸化反応を有機溶媒中で行うので、硫酸化多糖は有機溶媒に可溶性の塩として反応に供される。この様な有機溶媒可溶性塩としては、硫酸化多糖の有機塩基塩が挙げられ、有機塩基としては、ピリジン、ジメチルァユリン、ジェチルァニリン等の芳香族ァミン；トリメチルァミン、トリェチルアミン、トリブチルァミン、 N , N—ジイソプロピルェチルァミン、トリオクチルァミン、 N, N, N' ， N' ーテトラメチルー 1， 8—ナフタレンジァミン等の 3 級ァミン； N—メチルピリミジン、 N—ェチルピリミジン、 N—メチルモルホリン、 N—ェチルモルホリン等の N—アルキル複素環ァミン等が挙げられる。硫酸化多糖の有機塩基塩は、遊離の硫酸化多糖を有機塩基と反応させることによって容易に得ることができる。

脱硫酸化反応は、通常無水の有機溶媒中、硫酸化多糖に前記式（I) で示されるシリル化剤を作用させることによって達成される。この反応によって、硫酸ェステル化された水酸基から硫酸基が脱離するとともに、水酸基のシリル化が起こる。

反応に使用する有機溶媒は、硫酸化多糖の塩の形成に使用した前記の有機塩基 (ピリジン等）が好ましいが、有機塩基の代わりに、ァセトニトリル、 N， N— ジメチルホルムアミド（DMF) 、ジメチルスルホキシド（DMSO) 、 N, N—ジメチルァセトアミド、テトラヒドロフラン（THF) 、 1， 4ージォキサン等の非プロトン性溶媒を使用してもよい。

シリル化剤である式（I) で表される化合物において、 R¹ は同一又は異なり水素原子又はフッ素等のハロゲン原子を示し、 R² はメチル、ェチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、 s e c—ブチル、 ter t—ブチル、ペンチル、イソペンチル、へキシル等の炭素数 1〜6の低級アルキル基を示し、 R³ は同一又は異なり前記と同様の低級アルキル基、フヱニル等のァリール基又は塩素、フヅ素等のハロゲン原子を示す。式（ I ) における（R³ ) ₃ S iとしては、トリメチルシリル、トリェチルシリル、ジメチルイソプロビルシリル、ィソプロピルジメチルシリル、メチルジー t一プチルシリル、 tーブチルジメチルシリル、七一プチルジフヱニルシリル、トリイソプロビルシリル基等が例示される。式（ I ) で表されるシリル化剤として最も好ましいものは、 N—メチルー N—トリメチルシリルァセトアミド（MTMS A) 又は N—メチルー N—トリメチルシリルトリフルォロアセトアミド（MTSTFA) である。

反応は、室温〜 10 o^ecにおいて数分〜数十時間で終了する。室温より低い温度では反応が十分に進行せず、 100* 以上の温度では硫酸化多糖のグリコシド結合が開裂するおそれがある。反応条件、特に反応温度を変化させることによつて脱硫酸化の程度を制御することができる。例えば、 3 0〜1 0 0で、 3 0分〜 3時間程度、好ましくは 6 5〜9 0 °C、 3 0分〜 2時間の反応では、存在する硫酸基の部分的な脱硫酸化を行うことができ、 9 0〜1 0 0 ^eC、 2〜6時間程度の反応ではより完全な脱硫酸化を行うことができる。

シリル化剤の使用量は、硫酸化多糖の全水酸基（非置換及び置換水酸基の全て） 1モルに対して 3〜1 0 0倍モル程度であり、好ましくは 3〜3 0倍モル程度である。シリル化剤の使用量を変化させることによつても脱硫酸化の程度を制御することができる。

かくして、硫酸化多糖の第 1級水酸基に結合している硫酸基が部分的に又は完全に除去された脱硫酸化多糖を得ることができる。なお、脱硫酸化反応後、未反応のシリル化剤を非反応性とするため、また脱硫酸化多糖の水酸基に結合したシリル基を除去するためには、例えば反応液に水を加え及び又は反応液を水に対して透析することにより目的を達成することができる。さらに、必要に応じて常法に従ってシリル基の除去反応を行うこともできる。この反応は、例えば上記の処理を行った溶液を、 P H 9〜9 . 5程度のアルカリ条件下又は加熱条件下に置くことによって行われる。

脱硫酸化多糖にァニオン性の官能基が存在する場合、それに対する対イオンを溶液中に存在させて塩を形成させることができる。例えば、シリル基除去反応後の脱硫酸化多糖の水溶液に水酸化アルカリ金属（水酸化ナトリウム等）を添加し、必要に応じて透析した後、凍結乾燥等の非加熱条件下における脱水工程に付すことによって、脱硫酸化多糖のアルカリ金属塩を得ることができる。具体的には、これらに残存する硫酸基を N a塩とするために、水酸化ナトリウムを加えて p H 9前後に調整し、透析した後、凍結乾燥して脱硫酸化多糖のナトリウム塩を得ることができる。

本発明の製造法により得られる選択的に脱硫酸化された脱硫酸化多糖の中で、特にへパリンが好ましく、この選択的に脱硫酸化されたへパリンは、下記の特性を有するものである。

( 1 ) 酵素分解および高速液体クロマトグラフィーを用いる測定によって測定した不飽和二糖組成のうち、 Δ D i H S— t r i (U, 6，N) S含量が 1 0〜4 0 %、 Δ D i H S - d i (U,N) S含量が 30〜60%であり、

(2) N—置換硫酸基を含む二糖含量が 75〜95%であり、

(3) 重量平均分子量 Mwが 4， 000〜30, 000ダルトンであり、

(4) 抗トロンビン活性が、 2 OUZmg〜： L 5 OUZmgの値を示し、

(5) 塩基性繊維芽細胞増殖因子の細胞増殖に対する活性促進効果が、脱硫酸化を行なっていないへパリンに対して、その 80%以上を維持するものである。ここで、（ 1 ) の Δ D i H S— t r i (U，6,N) S含量とは、後述する試験法「酵素消化による二糖分析」によって得られる値であり、へパリンをへパリン分解酵素で分解した結果生ずる各種の不飽和二糖（第 2図参照）のうち、ゥロン酸の 2位、グルコサミンのァミノ基及び 6位が硫酸化されたものの含量を意味し、 Δ D i H S - d i (U,N) S含量とは、同様にゥロン酸の 2位及びグルコサミンのァミノ基が硫酸化されたものの含量を意味する。好ましくは、 AD i HS— t r i (U.6.N) S含量が 10〜20%であり、 Δ D i H S— d i (U, N) S含量が 50〜60 %である。

(2) の N—置換硫酸基を含む二糖含量は、脱硫酸化を行なったへパリン中の全構成糖単位に対する N—置換硫酸基を含む二糖の含量（モル％) である。

(3) の重量平均分子量は、高速ゲルろ過クロマトグラフィーにより、コンドロイチン硫酸の分子量標準品を対照にして求めた重量平均分子量（Mw) の値であり、好ましくは 10， 000〜 20, 000ダルトンである。

なお、ゲルろ過クロマトグラフィーにより測定した場合、脱硫酸化される前のへパリンの重量平均分子量は、通常、 4， 000〜30， 000ダルトンの範囲であるが、本発明の方法で脱硫酸化されたへパリンの重量平均分子量には殆ど変化がない。

尚、実施例において脱硫酸化前後の分子量は以下の条件で測定した。

ゲルろ過（G P C) H P L C

カラム： TSKge l G-4000+G-3000+G-2500 (東ソ一㈱製）

溶媒： 0. 2M N a C 1 , 1. 0 m 1 /m i n

検出器：示差屈折計（R I) 、紫外吸収（UV 230 nm)

注入量： 5 μ £ (1 Om g/m 1 ) (4) の抗トロンビン活性は、後記実施例記載の方法で測定した値である。脱硫酸されていないへパリンの抗トロンビン活性を、該方法によって測定した場合、その値は 1， 200UZmg〜l , 600 UZm _gを示すが、本発明の脱硫酸化へパリンの抗トロンビン活性は 20 UZm g〜l 50 U/m g, 好ましくは 30 U/m g〜l 00 UZm gの範囲であり、出血作用が低減されている。

(5) の塩基性繊維芽細胞増殖因子の細胞増殖に対する活性促進効果とは、後述の試験法「bFGFと aFGF活性促進効果の測定」によって細胞増殖を測定したときの、脱硫酸化剤処理前のへパリンによる b F G F活性維持効果に対し、本発明の脱硫酸化へパリンの b F G F活性維持効果を百分率で表わしたものであり、本発明の脱硫酸化へパリンは、脱硫酸化を行っていないへパリンが有する活性促進効果を、脱硫酸化後においても、 80%〜ほぼ 100%を維持しているものである。

本発明の製造法により得られる選択的に脱硫酸化されたへパリンは、これを有効成分として含有する塩基性繊維芽細胞増殖因子活性促進剤を提供すると共に、塩基性繊維芽細胞増殖因子と混合することにより、塩基性繊維芽細胞増殖因子の細胞増殖に対する活性促進がされた組成物を提供することができる。

本発明の脱硫酸化されたへパリンは、生体内外に投与することにより、 bFG Fの活性を安定化し、例えば、床ずれ（創傷治癒）等の治療又は予防に有用である。糖尿病患者はへパラン硫酸或いはへパリンが少なくなつている可能性があり、創傷治癒に用いられる b F G Fはへパラン硫酸またはへパリンがないと活性を十分に発現しないと考えられるので、本発明の上記組成物は特に糖尿病患者の床ずれの治療及び予防に有用である。また、内因性の bFG Fが十分に産出されている患者及び投与部位を治療する場合、必ずしも外部から b F GFを投与する必要はなく、本発明の脱硫酸化へパリンのみでも十分に目的を達成できるので、上記 b F G F活性促進剤を創傷治癒等の目的に使用することができる。本発明の b F G F活性促進剤又は上記の組成物を生体内外に投与する際の剤型及び投与経路としては、それらをそのまま、又は他の薬理学的に許容され得る担体、賦形剤、希釈剤等と共に医薬組成物（例えば、注射剤、錠剤、カプセル剤、液剤、軟青等）として、温血動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ゥサギ、犬、ネコ等）に対し、非経口的又は経口的に安全に投与することができる。また、本発明の bFGF活性促進剤及び上記組成物は、出血作用等の副作用が低減されており、医薬品としての安全性が高い。実施例

以下、実施例及び試験例により本発明を更に詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら制限するものではない。

硫酸化多糖の同定は以下の方法に基づいて行った。

試験法

1 ) 酵素消化による二糖分析

グリコサミノグリカンの脱硫酸化後の硫酸基の位置の分析は、次のようにして行うことができる。すなわち、脱硫酸化反応の処理前後のグリコサミノグリカンを酵素で消化し、生成した不飽和二糖を高速液体クロマトグラフィー（H P L C) で分析した。（新生化学実験講座 3, 糖質 II (1991) p49〜62に記載の Γ2 · 8グリコサミノグリカン分解酵素と HP LCを組合せた構造解析」参照）。

へパリン分解酵素による消化

新生化学実験講座 3、糖質 II p 54-59 (東京化学同人刊、 1991) の方法により、へパリン 0. 1 mgを 2mM酢酸カルシウムを含む 2 OmM 酢酸ナトリウム（p H 7. 0) 220 /1 に溶解して、 20mUのへパリナーゼ、 20mUのへパリチナーゼ I及び IIを加えて、 37 ^eCで 2時間反応させた。なお、脱硫酸化処理によつてアミノ基に結合した硫酸基が脱離した場合、このような脱硫酸化へパリンにはへパリン分解酵素類が作用しなくなるので、酵素反応に先立って予めアミノ基をァセチル化する必要がある。 N—ァセチル化は炭酸ナトリウムまたはダウエツクス（Dowex-1 (HC0₃)型）イオン交換樹脂を含む水溶液中、無水酢酸によって定量的に進行する（「糖鎖工学」、（株）産業調査会、バイオテクノロジー情報センター発行、 324 頁参照）。

H P L Cによる分析

.へパリン分解酵素消化を行った後の溶液 50 μΐ を、 HP LC (医理化、モデル 852型）を用いて分析した。イオン交換カラム（Dionex社、 CarboPac PA-1 力ラム 4. Ommx 25 Omm) を使用し、 232 nmでの吸光度を測定した。流速 1 ml 分で、塩化リチウムを用いたグラジェント系（50mM→2. 5M) を用いる方法に準拠した（Kariya, et al. Comp. Biochem. Physiol. Vol. 103B, pp. 473- 479 (1992)) 。

2) ゲルろ過

硫酸化多糖の 3 %溶液 1 Ο μΐ を H P LCによるゲルろ過で分析した。カラムは T S Kgel- (G4000+G3000+G2500)PW_XL (東ソ一、 7.8 mm X 30 cm) を用い、溶離液に 0. 2M 塩化ナトリウムを使用して、 1. OmlZ分の流速で展開した。硫酸化多糖の検出には示差屈折計（島津， AID-2A) を用いた。

3) bFGFと aF G F活性促進効果の測定

10 %の牛血清を含んだ DMEM培地（Life Technologies社製）で継代維持された A 31細胞（BALB/c 3T3) を、 1 /x 1 Zmlのテストサンプルを含む 100 At 1の I T S + (Collaborative Research社製）、 2 OmMN a C 10₃ 、 2 ng/ mlヒト組換 bFGF (hrbFGF) (生化学工業㈱製）或いは 5 ng/ml ヒト組換 bFGF (hr bFGF) (生化学工業㈱製）を含んだ S 0₄ ²一フリー DME Mと共に 96一マルチウエルカルチャープレートにブレートした。 3日間の培養後、 20 μ 1のセルタイター 96 A Qノンラジオアクティブ細胞増殖アツセィ溶液（生化学工業㈱製）を各ゥュルに添加し、 37'Cで 2時間培養後、 0D₄₉。を測定することにより、それぞれのゥヱルの細胞増殖を定量した。表 2において、 b F G Fと a F G Fのそれぞれにおいて、 1 1ノ mlの脱硫酸化していないへパリンを加えた時の細胞増殖を 100とし、加えない時を 0とした。

4) 抗トロンビン活性の測定

1 50mM食塩、 1 OmM塩化カルシウム及び 0. 1 %牛血清アルブミンを含む 2 OmMトリス緩衝液（pH7. 4) 350 μ 1と牛アンチトロンビン ΠΙ溶液（ 1 UZml同緩衝液） 100 1並びにへパリン試料の倍数希釈水溶液 100 μ 1の 3液を冷却した状態で混合し、 37°Cで 2分間保温した。この溶液に牛トロンビン溶液（5 OmUZml蒸留水） 50 1を加え、 37^eCで 5分間保温後、基質溶液 (Boc-Val-Pro-Arg-MCA, 70 μΜ水溶液） 100 μ 1を加えて撹拌し、 37でで 3分間ィンキュペートし、 30%酢酸 300 μ 1を加えて反応を停止した。反応液の蛍光強度を励起波長 350nm、蛍光波長 444 nmにて測定した。上記反応液組成の試料の代わりに蒸留水を用いて測定したブランク 1と、基質と緩衝液のみの反応混液のブランク 2を同様に処理し、蛍光度を求めた。

トロンビン活性阻害率を次式から求め、試料濃度に対するそれぞれの阻害率を片対数グラフにプロットし、 50%阻害率（ I C₅。）を求めた。その結果を表 2 に示す。

トロンビン活性阻害率（％) = 100— (Δ F s/Δ F b) x 100

ただし、 AF s ：試料の蛍光強度一ブランク 1の蛍光強度

△ F b ：ブランク 2の蛍光強度一ブランク 1の蛍光強度

試験例

メチルー α—ガラクトビラノシドー 6硫酸アンモニゥム塩約 2mgZ3mlの水溶液に、アンバーライト IR-120(H+)型樹脂 5mlを加えて、遊離の硫酸エステル型に変換させた。樹脂を除去した後、ピリジン 2mlを加え、ピリジニゥム塩を形成させた。残余のピリジンを減圧下で留去し、残渣を凍結乾燥することにより、乾燥メチルー α—ガラクトビラノシドー 6硫酸ピリジニゥム塩を調製した。この試料を各 0. 2 mgづっ小分けし、これに乾燥ピリジン約 0. 05 mlと内部標準としてメチルー α—グルコシドを加えて、メチルー α—ガラクトビラノシドー 6硫酸ピリジニゥム塩の全水酸基モル量（[-OH] + [-0-SOa-]) に対する MT STFAのモル量が 0 20倍量までの異なる反応系を用意した。各系に MT S T F Aを加えた後、 80。Cで約 2時間加熱反応させた。完全に 0—トリメチルシリル化してガスクロマトグラフィ一分析を行うために、トリメチルシリルイミダゾールを反応液に加えて、 80 で 20分間加熱した。各系の反応混合物中のトリメチルシリル化メチルー α—ガラクトピラノシドを直接ガスクロマトグラフィーで測定することにより、脱硫酸量を算出して第 1図に示した。第 1図から、硫酸化単糖の場合は、上記反応条件において MTSTFAを糖の全水酸基モル量に対し、約 1 3倍モル量以上使用すれば、第 1級水酸基の硫酸エステルをほぼ完全に脱硫酸化できることが分かる。

実施例

へパリンのナトリウム塩（重量平均分子量： 12, 200ダルトン） 20 Omg をアンバーライト IR-120 (H+型）カラム（ l XlOcm) にかけ、溶出液に過剰のピリジンを加えて P H 8に中和し、凍結乾燥してへパリンのピリジニゥム塩を調製した。このへパリンのピリジニゥム塩を脱水したピリジン 2 Omlに溶解して反応試料とした。へパリンの糖骨格の 20倍モル量（約 4 ml) の MT S T F Aを加え、 65、 75、 85、 90及び 95でで 2時間攪拌した。反応終了後、 20 ml の水を加えて未反応の MT S T FAを加水非反応性とすることにより反応を停止させ、ミリポア限外ろ過膜を用いて透析してトリメチルシリル化したへパリンの脱硫酸化処理物溶液を得た。

次にトリメチルシリル基を加水分解除去するため、透析内液を 1 0 O^eCで 30 分から 1時間（溶液が透明になるまで）加熱沸騰させた。水酸化ナトリウムを加えて pH9〜9. 5に調整した後、透析した。透析内液を凍結乾燥して、へパリンの脱硫酸化処理物 1 3 Omg相当のナトリゥム塩を得た。

比較例

対照実験として、実施例に準じ、 MT STFAの代わりに N， 0—ビス（トリメチルシリル）ァセトアミド（BT SA) を用いて 90。Cで反応させた。

へパリンの上記シリル化剤処理前後の酵素消化による二糖分析値を表 1に示す。

上記のへパリンの各脱硫酸化処理物を炭酸ナトリウム水溶液（pH6. 5) 中、 4 ^eCにおいて無水酢酸とメタノールを用いて 2時間反応させ、ァセチル化した。この試料を上記試験法記載の分析方法に従ってへパリン分解酵素を用いて分解し、生成した不飽和二糖の各種異性体（第 2図）を H P LCで分画し、その組成比を分析した結果を表 1に示す。

表 1 へパリンの二 «5

AD i H S— 一糖 Jl5¾ 6

試料

OS NS 6S US di (6,N)S di (U.N)S di (U.6) S tri(U,6,N)S Total (%) 脱繊脾 (%) rm ^ff

¾ 埋 B'J 4. n 7

0 0.0 1 O.丄 4. n π

o U c

Όά.0 031丄 υ

90¾ 7.6 4.3 1.4 11.2 6.0 47.4 4.0 10.5 92.4 75 64.3

(比較）

MTSTFA麵

65°C 5.5 2.9 1.1 2.8 7.9 34.7 1.7 36.7 93.3 86 24.4

(本発明）

ガ 75°C 5.9 3.8 0.5 1.2 5.8 47.4 0.1 27.5 92.2 81 44.8 ノノ 85°C 6.9 3.8 0.9 8.0 6.1 51.7 1.3 14.9 93.6 79 62.2 ノノ 90"C 6.2 5.3 0.3 4.2 6.8 59.3 0.6 12.7 95.4 78 66.8 ノノ 95°C 6.3 9.4 0 2.4 5.3 67.6 0 1.6 92.6 65 88.8

Δ D i Η S -は麵肖化によって生じた不^ OH糖を表わす。の収率はゲルろ過 H PLCの麵値から算出した。

表 1は、 BTSA及び MTSTFAのいずれの処理によっても、 6位硫酸基の脱離によってへパリンの主構成成分二糖由来の AD i HS-Tr i (U.6.N) が著しく低下し、 Δ D i H S— d i (U,N)Sが増加したことを示している。しかし、 BT SA処理では、さらに N—硫酸基の脱離が生じたため、 AD i HS—d i (U， N) Sと Δ D i H S— T r i (U, 6, N) との合計量の減少と AD i HS— USの増加を引き起こした。すなわち、 MTSTFA処理ではへパリンの第 1級水酸基の硫酸基を B T S A処理と同程度除去することが可能であり、さらに B T S A処理により N—硫酸基の減少を抑制して 6位硫酸基に、より選択的に作用したことが分かる。

さらに、 MT S T F A処理前後のへパリンについて、ゲルろ過により分子量の変化を調べた結果、分子量の変化は殆んど認められなかった。

以上のことから、 MTSTFAによる脱硫酸化反応は、第 1級水酸基に結合している硫酸基に特異的に働き、他の位置の硫酸基及びグリコシド結合には影響を与えないことが明らかである。

また、 6位硫酸基を 65 、 75°C, 85°C 90 ^eC及び 95 ^eCで段階的に脱硫酸化したへパリンのトロンビン阻害活性、 b F G Fと a F G Fの活性促進効果を調べた。その結果を表 2に示す。

表 2

表 2に示したように、トロンビン阻害活性は、 6 5 ^eCでの部分的 6位脱硫酸化で急激な減少を示すのに対し、 b F G F活性促進効果は 9 O 'Cでの脱硫酸化まで維持されている。一方、 a F G F活性促進効果は 6位硫酸基の脱硫酸化と共にゆるやかな減少を示した。特に、 8 5〜9 CTCの反応温度で 6位硫酸基の脱硫酸化を行なうことにより、抗凝固活性や a F G F G活性促進効果等を抑えた特異的な b F G F活性促進効果を維持する選択的 6位脱硫酸化へパリンが得られた。尚、重量平均分子量 4 , 0 0 0〜3 0 , 0 0 0の範囲のへパリンを前記と同様に、本発明の方法で脱硫酸化した場合、表 1と同様に 6位が特異的に脱硫酸化され、生物学的活性も表 2と同様の傾向を示し、脱硫酸化処理前後での分子量の変化もほとんどない。産業上の利用可能性

本発明によれば、硫酸化多糖の糖骨格に結合している性質の異なる硫酸基を、第 1級水酸基の硫酸基と第 2級水酸基の硫酸基及び N一硫酸基との違いを認識して、第 1級水酸基の硫酸基のみを特異的に脱硫酸化することにより、従来知られていない位置特定硫酸エステルを有する硫酸化多糖を製造することができる。特に、へパリンを本発明方法によって脱硫酸化して得られる脱硫酸化処理物はへパリンの非特異的な蛋白質への結合が抑制され、塩基性繊維芽細胞増殖因子 (b F GF) との相互作用による特異的生理活性が得られた。更に、 b FGFとの併用、或いは単独で、出血傾向等の副作用が少ない創傷、火傷、皮膚潰瘍治療薬、骨粗しょう症治療薬、骨折治療薬、消化器潰瘍治療薬、心筋梗塞予後改善薬等幅広い医薬品への応用が可能である。

また、本発明の脱硫酸化法は、 b F GF以外の他の生理活性分子に対しても、幅広い応用が期待できる。

Claims

請求の範囲

1. 第 1級水酸基が硫酸エステル化された糖を構成糖として有する硫酸化多糖に、下記式（ I )

0

II

(R¹ ) a C-CN-S i (R³ ) a (I)

R²

で表されるシリル化剤を反応させることにより、第 1級水酸基に結合している硫酸基を選択的に脱硫酸化することを特徴とする脱硫酸化多糖の製造法。

2. 硫酸化多糖が、 N—置換グリコサミン、 D—ガラクトースー 6硫酸及び L 一ガラクトースー 6硫酸から成る群より選択される少なくとも 1種を構成糖として有するものである請求の範囲第 1項記載の脱硫酸化多糖の製造法。

3. 硫酸化多糖が、 N—硫酸化グリコサミン又は N—ァセチル化グリコサミンを構成糖として有するものである請求の範囲第 1項記載の脱硫酸化多糖の製造法。

4. 硫酸化多糖が、へパリン、へパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマ夕ン硫酸、ケラタン硫酸、フノラン又はボルフイランである請求の範囲第 1項記載の脱硫酸化多糖の製造法。

5. 硫酸化多糖が、 N—置換グリコサミンを構成糖として有するものである請求の範囲第 1項記載の脱硫酸化多糖の製造法。

6. 硫酸化多糖が、 N—硫酸化グリコサミンを構成糖として有するものである請求の範囲第 5項記載の脱硫酸化多糖の製造法。

7. 硫酸化多糖が、へパリン又はへパラン硫酸である請求の範囲第 6項記載の脱硫酸化多糖の製造法。

8. 硫酸化多糖を有機溶媒可溶性塩とし、反応を有機溶媒中で行う請求の範囲第 1〜7項のいずれかに記載の脱硫酸化多糖の製造法。

9. 硫酸化多糖の有機溶媒可溶性塩が、硫酸化多糖の有機塩基塩である請求の範囲第 8項記載の脱硫酸化多糖の製造法。

10. 脱硫酸化反応後、更にシリル化された水酸基のシリル基を除去する請求の範囲第 1〜 9項のいずれかに記載の脱硫酸化多糖の製造法。

1 1. 下記の特性：

( 1 ) 酵素分解および高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した不飽和二糖組成のうち、 Δ D i H S— t r i (U，6,N) S含量が 10〜40%、 Δ D i H S - d i (U,N) S含量が 30〜60%、

(2) N -置換硫酸基を含む二糖含量が 75〜95%、

(3) 重量平均分子量が 4， 000〜30, 000ダルトン、

(4) 抗トロンビン活性が 20UZm.g〜l 50 U/m g, 及び

を有することを特徴とする選択的に脱硫酸化されたへパリン。

12. 脱硫酸化へパリンが請求の範囲第 1〜10項のいずれかに記載の方法によって得られるものである請求の範囲第 1 1項記載の脱硫酸化されたへパリン。

1 3 . 請求の範囲第 1 1項または第 1 2項に記載の脱硫酸化へパリンを有効成分として含有することを特徴とする塩基性繊維芽細胞増殖因子活性促進剤。

1 4 . 請求の範囲第 1 1項または第 1 2項に記載の脱硫酸化へパリン及び塩基性繊維芽細胞増殖因子を含有することを特徴とする塩基性繊維芽細胞増殖因子の細胞増殖に対する活性が促進された組成物。