ITLO20130005A1 - Derivati di glucosamminoglicani n-desolfatati e loro uso come farmaci - Google Patents
Derivati di glucosamminoglicani n-desolfatati e loro uso come farmaciInfo
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Description
DERIVATI DI GLUCOSAMMINOGLICANI N-DESOLFATATI
E LORO USO COME FARMACI
Sommario
[0001] L’invenzione riguarda derivati di glucosamminoglicani N-desolfatati, particolarmente derivati di glucosamminoglicani N-desolfatati ed opzionalmente 2-O-desolfatati, in cui almeno una parte dei dioli adiacenti e OH/NH2adiacenti sono stati convertiti nelle aldeidi corrispondenti, le quali a loro volta sono state ridotte nei corrispondenti alcoli. Tali prodotti sono dotati di attività inibitoria dell’eparanasi e di attività anti tumorale. Detti derivati di glucosamminoglicani N-desolfatati sono ottenuti da glucosamminoglicani naturali o sintetici, preferibilmente da eparina non frazionata, eparine a basso peso molecolare (LMWHs), eparansolfato o loro derivati. Glucosamminoglicani naturali possono essere ottenuti da qualsiasi fonte animale (possono essere impiegate specie ed organi di animali diversi).
[0002] L’invenzione concerne inoltre il processo per la preparazione di detti derivati e anche il loro uso come principi attivi di farmaci, utili in condizioni patologiche. In particolare, dette condizioni patologiche comprendono il mieloma multiplo e altre neoplasie (sarcomi, carcinomi, neoplasie ematologiche), incluse le loro forme metastatiche. I derivati di glucosamminoglicani dell’invenzione possono opzionalmente essere utilizzati come medicinali in combinazione con altre terapie, oncologiche e non. Inoltre, l’invenzione riguarda l’uso di detti derivati di glucosamminoglicani N-desolfatati ed opzionalmente 2-O-desolfatati, preferibilmente ottenuti da eparine ed eparine a basso peso molecolare (LMWHs), in qualsiasi indicazione terapeutica che ricavi beneficio dall’inibizione dell’eparanasi (nefropatia diabetica, malattia infiammatoria intestinale, coliti, artriti, psoriasi, sepsi, aterosclerosi), anche in combinazione con farmaci o trattamenti noti e consolidati.
[0003] L’invenzione riguarda anche composizioni farmaceutiche contenenti come principio attivo almeno uno di detti derivati di glucosamminoglicani N-desolfatati ed opzionalmente O-desolfatati, in cui almeno una parte dei dioli adiacenti e OH/NH2adiacenti subiscono conversione in aldeidi corrispondenti, seguita da riduzione nei corrispondenti alcoli. Opzionalmente l’invenzione riguarda composizioni farmaceutiche contenenti come principio attivo almeno uno di detti derivati di glucosamminoglicani in combinazione almeno un altro principio attivo, più preferibilmente un chemioterapico. Preferibilmente detti derivati di glucosamminoglicani sono derivati di eparine o eparine a basso peso molecolare (LMWHs).
Contesto
[0004] Il mieloma multiplo è la seconda neoplasia ematologica più comune, rappresentando più del 10% di tutte le neoplasie ematologiche negli Stati Uniti, con circa 20.000 nuovi casi ogni anno e una mortalità superiore al 50% (Graham-Rowe D., 2011, Multiple myeloma outlook. Nature 480, s34-s35).
[0005] Negli ultimi anni, sono state sviluppate promettenti terapie, tra cui la somministrazione di un inibitore del proteasoma (Velcade), bifosfonati, talidomide e altri. L’efficacia di questi agenti è, almeno in parte, dovuta al loro impatto sul microambiente tumorale del mieloma.
[0006] Nonostante l’efficacia di questi agenti contro il mieloma sia stata dimostrata, rimane la necessità di trovare nuovi e più efficaci farmaci per il suo trattamento e per il trattamento di altri tumori.
[0007] L’eparanasi è una endo-β-glucuronidasi che taglia le catene di eparansolfato (HS) dei proteoglicani (PG-HS), quali il sindecano-1, favorendo il rilascio di fattori di crescita associati allo HS.
[0008] Nell’uomo, si conosce un’unica forma funzionale dell’enzima eparanasi capace di tagliare lo HS. L’eparanasi è espressa da molti tumori umani, dove aumenta significativamente il potenziale sia angiogenico sia metastatico delle cellule tumorali. Elevati livelli di eparanasi, sono stati correlati con la crescita elevata e la formazione di metastasi in molti tipi di tumori. Per esempio, un alto livello di eparanasi è associato a un più breve tempo di sopravvivenza post-operatorio dei pazienti. Un evidente ruolo dell’eparanasi nelle metastasi tumorali è stato dimostrato nei laboratori dei Prof. Vlodavsky e Sanderson, dove i nostri innovativi inibitori sono stati testati.
[0009] In aggiunta alle sue funzioni enzimatiche, che includono il rilascio di fattori di crescita associati allo HS e la degradazione della matrice extracellulare (ECM) ad opera delle cellule invasive, l’eparanasi ha anche una funzione non enzimatica che può avere un impatto sul comportamento del tumore e sul suo microambiente. Il gruppo di Sanderson ha aperto la strada dello studio dell’eparanasi e del sindecano-1 nel mieloma, stabilendo che l’eparanasi agisce come il regolatore principe del suo fenotipo tumorale aggressivo. Ciò avviene promuovendo la sovra espressione di VEGF e MMP-9, che insieme stimolano la crescita del tumore, la distruzione ossea metastatica e osteolitica. E’stato infatti dimostrato in vivo che l’eparanasi favorisce la crescita di mielomi e la formazione di metastasi spontanee nelle ossa, e che l’espressione dell’eparanasi da parte delle cellule tumorali alimenta un’osteolisi aggressiva, almeno parzialmente dovuta all’aumento dell’espressione di RANKL. L’effetto dell’eparanasi nel favorire l’osteolisi può essere di grande importanza perché fattori di crescita associati all’osso sono rilasciati quando l’osso si degrada. In aggiunta, gli osteoclasti possono rilasciare fattori, come HGF, che favoriscono la crescita del tumore. Questi fattori insieme possono favorire la formazione di cavità nel midollo osseo che supportano l’impianto delle cellule tumorali e la loro successiva crescita (Fux, L., et al. 2009, Heparanase: busy at the cell surface. Trends Biochem Sci 34 (10): 511-519; Sanderson R.D., and Yang Y., 2008, Sndecan-1: a dynamic regulator of the myeloma microenvironment. Clin Exp Metastasis 25:149-59; Ilan N., et al. 2006. Regulation, function and clinical significance of heparanase in cancer metastasis and angiogenesis. Int. j. Biochem. Cell. Biol. 38: 2018-2039). L’inibizione dell’eparanasi è quindi un obiettivo realizzabile della terapia del mieloma, supportato dal fatto che esiste una unica eparanasi enzimaticamente attiva e che la sua espressione in tessuti normali è rara. Inoltre, è stato mostrato che i topi knock-out per eparanasi sono vitali e non mostrano disturbi visibili. Ciò indica che da una strategia di inibizione dell’eparanasi possono derivare solo piccoli o nessun effetto collaterale (Casu B., et al.
2008Non-anticoagulant heparins and inhibition of cancer. Pathophysiol Haemost Thromb.
36: 195-203; Vlodavsky I., et al. 2007. Heparanase: structure, biological functions, and inhibition by heparin-derived mimetics of heparan sulfate. Curr Pharm Des. 13: 2057-2073; Naggi A., et al. 2005. Modulation of the Heparanase-inhibiting Activity of Heparin through Selective Desulfation, Graded N-Acetylation, and Glycol Splitting. J. Biol. Chem.
280: 12.103-12.113).
[0010] L’eparina è un polisaccaride solfatato lineare polidisperso della famiglia dei glucosamminoglicani, dotato di attività anticoagulante e antitrombotica. Le catene saccaridiche dell’eparina consistono di residui di acido uronico alternati a residui di D-glucosammina. L’unità ripetitiva prevalente è il disaccaride acido L-iduronico 2-O-solfatato (IdoA2S)α(1 → 4) e D-glucosammina N-, 6-O-solfatata (GlcN6S). Costituenti minori sono l’acido D-glucuronico e acido L-iduronico non solfatato, insieme a N-acetil D-glucosammina e D-glucosammina N-, 3-O-, 6-O-trisolfatata (Casu B., 2005. Structure and active domains of heparin. In: Chemistry and Biology of Heparin and Heparin Sulfate. Amsterdam: Elsevier. 1-28; Casu B. and Lindahl U. 2001, Structure and Biological Interactions of heparin and heparin sulfate. Adv Carbohydr Chem Biochem 57: 159-206). L’eparina, che strutturalmente è simile allo HS, è in grado di inibire efficacemente l’eparanasi, ma il suo utilizzo a dosi elevate, per una strategia di inibizione dell’eparanasi, è tuttavia improponibile a causa della sua attività anticoagulante.
[0011] E’ interessante osservare che eparine a basso peso molecolare (LMWHs), maggiormente biodisponibili e meno anticoagulanti dell’eparina, sembrano prolungare la sopravvivenza dei malati di cancro, probabilmente attraverso un effetto diretto sulla crescita del tumore e delle metastasi. Ciò può essere dovuto, almeno in parte, all’inibizione dell’attività enzimatica dell’eparanasi (Zacharski L.R., and Lee, A.Y. 2008, Heparin as an anticancer therapeutic. Expert Opin Investig Drugs 17: 1.029-1.037; Yang Y. et al., 2007, The syndecan-1 heparan sulfate proteoglycan is a viable target for myeloma therapy. Blood 110: 2.041-2.048).
[0012] Efficaci inibitori dell’attività enzimatica dell’eparanasi sono stati selezionati nell’arte precedente studiando l’inibizione dell’eparanasi con derivati di eparine non anticoagulanti, molte delle quali contengono residui di acido uronico non solfatato modificato mediante apertura dell’anello glucosidico in corrispondenza del legame 2-3 (glycol splitting). Tali inibitori si differenziano per il grado di O-solfatazione, di N-acetilazione e di glycol splitting sia dei residui di acido uronico non solfatato preesistenti che di quelli generati per 2-O-desolfatazione controllata (Naggi A., 2005, “Glycol-splitting as a device for modulation inhibition of growth factors and heparanase inhibition by heparin and heparin derivative.” In: Chemistry and Biology of Heparin and Heparane Sulfate. Amsterdam: Elsevier 461-481).
[0013] Il termine “glycol split” (gs) si riferisce convenzionalmente a polisaccaridi che presentano l’apertura di alcuni residui monosaccaridici dovuta alla rottura (glycol splitting) di un legame tra due atomi di carbonio adiacenti, ognuno dei quali recante un gruppo idrossilico. La prima generazione di glycol split eparine, cioè le cosiddette “ossieparine ridotte” (eparine RO), consisteva largamente di blocchi polisolfatati non modificati, occasionalmente interrotti da residui glycol split derivanti da unità di acido glucuronico/iduronico non solfatati che erano presenti nelle catene originali (Naggi A., 2005, “Glycol splitting as a device for modulating inhibition of growth factors and heparanase inhibition by heparin and heparin derivative.” In: Chemistry and Biology of Heparin and Heparan Sulfate. Amsterdam: Elsevier 461-481). Questa operazione chimica fatta sull’eparina, modificando i residui di acido glucuronico incluso nel sito di legame di ATIII, riduce o abolisce la sua attività anticoagulante, consentendone l’utilizzo ad alti dosaggi.
[0014] WO 92/17188 riporta l’attività antiproliferativa, su cellule muscolari lisce, di un tipo di eparina non anticoagulante. Detta eparina è preparata mediante N-deacetilazione dei residui di N-acetil glucosammina, che sono una componente minoritaria delle catene di eparina naturale, con un agente contenente idrazina, seguita da ossidazione con periodato dei dioli o dei gruppi OH/NH2adiacenti, a generare le aldeidi corrispondenti. L’ossidazione è seguita dalla riduzione delle aldeidi ad alcoli, senza sostanziale frammentazione dei glucosamminoglicani. Le unità N-solfatate non sono influenzate dall’ossidazione-riduzione.
[0015] Eparine N-desolfatate (Chemical Abstract Registry number 53260-52-9), note anche come “eparamine” nel Merck Index (14<th>Editor, 2006), sono note per essere dotate di svariati effetti: una ridotta attività anticoagulante, qualche attività contro le metastasi del cancro gastrico nei topi, per inibizione dell’espressione di VEGF e dell’angiogenesi (Chen-J-L et al., 2007, World J Gastroenterol 21, 457-461) e prevenzione di danni epatici/renali indotti da ischemia e riperfusione (Chen-J-L et al., 2002, World J Gastroenterol 8, 897-900). Le eparine N-desolfatate sono anche note come intermedi per la sintesi di varie eparine N-acilate. Il grado di N-desolfatazione può andare dal 10% fino al 100% di residui delle glucosammine N-solfatate presenti nelle eparine (Huang L. and Kerns R.J., 2006, Bioorg Med Chem, 14, 2.300-2.313).
[0016] WO 01/55221 riporta glucosamminoglicani con un grado di 2-O-desolfatazione non superiore al 60% delle unità di acido uronico totale. Detti glucosamminoglicani sono privi di attività anticoagulante e mostrano attività antiangiogenica basata sull’inibizione di FGF. Nessuna attività è prevista per l’inibizione di eparanasi.
[0017] US 2008/0051567 riporta un composto corrispondente a una eparina 100% N-acilata e 25% glycol split, che esercita una piccola o nessuna attività anticoagulante e un basso rilascio di fattori di crescita dalla matrice extracellulare, capace di inibire l’eparanasi, la crescita tumorale, l’angiogenesi e l’infiammazione in modelli sperimentali animali, inclusi i modelli di mieloma di Sanderson.
[0018] Nonostante questo, rimane la necessità di fornire composti migliorati in termini di attività inibente dell’eparanasi, selettività, biodisponibilità, ed efficacia nel trattamento di patologie legate all’eparanasi, come mieloma e altri tumori.
Breve descrizione delle figure
[0019] Figura 1: Strutture prevalenti generate mediante ossidazione con periodato e riduzione con boroidruro di un glucosamminoglicano.
(1) unità disaccaridica di un polimero glucosamminoglicano comprendente un acido uronico (iduronico e/o glucuronico) e una glucosammina (2-N-acetilata, 2-N-non sostituita e/o 2-N-solfatata); il cui gruppo idrossile (R4) può essere libero o sostituito da un gruppo solfato. Dopo la N-desolfatazione, i polimeri glucosamminoglicani possono contenere unità disaccaridiche aventi glucosammine 2-N-acetilate (2) e glucosammine 2-NH2(naturali e/o N-desolfatate) (3). L’ossidazione con periodato e la riduzione con boroidruro portano alla conversione dei dioli adiacenti di acidi uronici 2-O-non solfatati (5, 6, 8) e dei gruppi OH/NH2adiacenti di glucosammine 2-N- e 3-O-non solfatate (7, 8) nelle corrispondenti aldeidi (per ossidazione) e quindi nei corrispondenti alcoli (per riduzione). Si noti che in unità disaccaridiche contenenti una glucosammina N-desolfatata e un acido uronico 2-O-non solfatato entrambi i residui sono convertiti in dialdeidi e quindi in dioli ad anello aperto (8).
Descrizione dell’invenzione
[0020] La presente invenzione riguarda nuovi glucosamminoglicani chimicamente modificati, in particolare eparina e LMWHs, che inibiscono efficacemente l’eparanasi e la sua attività degradativa dell’eparansolfato.
[0021] I composti innovativi della presente invenzione, dotati di attività inibitoria dell’eparanasi, sono derivati di glucosamminoglicani N-desolfatati ed opzionalmente 2-O-desolfatati, in cui almeno una parte dei dioli adiacenti e OH/NH2adiacenti sono stati convertiti nelle aldeidi corrispondenti, le quali a loro volta sono state ridotte nei corrispondenti alcoli. La conversione in aldeidi viene eseguita preferibilmente con l’impiego di periodato, in condizioni tali da rompere sia il legame tra i dioli adiacenti degli acidi uronici che il legame tra C2e C3della glucosammina, recanti rispettivamente i sostituenti ammino e idrossile. I composti di partenza possono contenere anche residui di acidi uronici 2-O-non solfatati presenti naturalmente. In particolare, la N-desolfatazione avviene sui residui di glucosammina N-solfatata, mentre la O-desolfatazione riguarda i residui di acido uronico 2-O-solfatato.
[0022] Preferibilmente, i derivati di glucosamminoglicano della presente invenzione sono ottenuti da glucosamminoglicani naturali o sintetici, questi ultimi preparati chimicamente o enzimaticamente (Naggi A. et al., 2001, “Toward a biotechnological heparin through combined chemical and enzymatic modification of the Escherichia coli K5 polysaccharide.” Seminars in thrombosis and hemostasis, 27, 5437), quali eparine non frazionate, eparine a basso peso molecolare (LMWHs), eparansolfati o loro frazioni; più preferibilmente i derivati di glucosamminoglicani derivano da eparine e LMWHs, naturali o sintetiche.
[0023] La N-desolfatazione specifica dei residui di glucosammine N-solfatate rende questi residui suscettibili alla conversione nelle corrispondenti aldeidi (e successivamente nei corrispondenti alcoli) purché detti residui non siano 3-O-solfatati. In Figura 1 sono mostrate in modo schematico tutte le unità disaccaridiche che possono essere presenti nella catena di un glucosamminoglicano e la loro trasformazione dopo le reazioni di N-desolfatazione, ossidazione e riduzione.
[0024] Ad esempio, le catene di eparina possono naturalmente contenere residui di acido uronico 2-O-non solfatato da circa 5% a circa 35%, residui di glucosammina N-acetilata da 0% a 50% e residui di glucosammina N-non sostituita (né N-solfatata, né N-acetilata) da circa 0% a 6%. Composizioni differenti dipendono dalla fonte di eparina (specie animali, tipo di organi) e dalle procedure di estrazione.
[0025] Ogni residuo non solfatato, né sul carbonio 2 né sul carbonio 3, di glucosamminoglicano è suscettibile alla conversione in dialdeide. Di conseguenza, la N-desolfatazione estensiva compresa nel processo della presente invenzione fornisce ulteriori residui suscettibili a detta conversione rispetto alla percentuale di unità che sono suscettibili nei glucosamminoglicani naturali, con un aumento della percentuale di unità in cui OH/NH2adiacenti sono convertiti nelle aldeidi corrispondenti (e quindi nei corrispondenti alcoli), preservando però il contenuto naturale dei residui di acido iduronico 2-O-solfatato. Opzionalmente, una 2-O-desolfatazione dei glucosamminoglicani chimicamente indotta permette di modulare il rapporto tra i residui di glucosammina e acido uronico suscettibili alle reazioni di ossidazione e riduzione secondo la presente invenzione.
[0026] L’invenzione riguarda detti derivati di glucosamminoglicani N- ed opzionalmente 2-O-desolfatati, in cui dioli adiacenti e OH/NH2adiacenti sono stati convertiti nelle aldeidi corrispondenti con apertura dell’anello, le quali aldeidi a loro volta sono state ridotte nei corrispondenti alcoli. L’invenzione riguarda inoltre un processo per preparare detti derivati di glucosamminoglicani ed anche il loro utilizzo come principi attivi di medicinali per il trattamento di alcune patologie, quali mieloma multiplo e altre neoplasie, incluse le loro forme metastatiche. L’invenzione riguarda inoltre l’uso di detti derivati di glucosamminoglicani in qualsiasi indicazione terapeutica che beneficia dell’inibizione dell’eparanasi. L’invenzione riguarda inoltre composizioni farmaceutiche contenenti detti derivati di glucosamminoglicani N- ed opzionalmente 2-O-desolfatati, in cui dioli adiacenti e OH/NH2adiacenti sono stati convertiti nelle aldeidi corrispondenti con apertura dell’anello, le quali a loro volta sono state ridotte nei corrispondenti alcoli.
[0027] I derivati di glucosamminoglicani N- ed opzionalmente 2-O- desolfatati della presente invenzione sono ottenibili mediante un processo comprendente:
a) N-desolfatazione dal 25% al 100%, preferibilmente dal 30% al 90%, più preferibilmente dal 45% all’80% dei residui di glucosammina N-solfatatati di un glucosamminoglicano; opzionalmente il processo comprende anche la 2-O-desolfatazione fino al 50%, preferibilmente fino al 25%, di residui 2-O-solfatati di un glucosamminoglicano; il prodotto ottenuto preferibilmente comprende da 0% a 50% di residui di glucosammina N-acetilata, da 50% a 100% di residui di glucosammina N-non solfatata;
b) conversione, preferibilmente mediante ossidazione con periodato, degli OH/NH2adiacenti dei residui di glucosammina 2N-, 3-O-non solfatata e dei dioli adiacenti dei residui di acido uronico 2-O-non solfatato (chimicamente desolfatato così come naturalmente non solfatato presente lungo la catena originale) in aldeidi corrispondenti; i residui di glucosammina 2N-, 3-O-non solfatata possono essere presenti dal 25% al 100%
c) riduzione di dette aldeidi, preferibilmente mediante boroidruro di sodio, nei corrispondenti alcoli.
[0028] Opzionalmente, il processo comprende anche la parziale o la totale deacetilazione dei residui N-acetilati del glucosamminoglicano.
[0029] In metodi di realizzazione preferiti, i derivati di glucosamminoglicano della presente invenzione, sono ottenuti da glucosamminoglicani naturali o sintetici (preparati chimicamente o enzimaticamente), preferibilmente da eparine non frazionate, LMWHs, eparansolfato e loro derivati. Più preferibilmente, i derivati di glucosamminoglicani della presente invenzione sono ottenuti da eparine o LMWHs.
[0030] In un metodo di realizzazione preferito, l’ossidazione, preferibilmente con l’impiego con periodato, viene eseguita in condizioni tali da tagliare sia il legame tra i dioli adiacenti degli acidi uronici che il legame tra C2e C3della glucosammina, recanti rispettivamente i sostituenti ammino e idrossile.
[0031] In un metodo di realizzazione preferito, campioni di glucosamminoglicani modificati, preferibilmente eparina o LMWHs modificate, dotati di differenti gradi di N-desolfatazione, sono soggetti ad ossidazione con periodato e riduzione con boroidruro di sodio in un mezzo acquoso, eseguito mediante modificazione di metodi noti. L’ossidazione con periodato può essere eseguita in presenza di NTA (acido nitrilotriacetico), un agente chelante e sequestrante usato per ridurre la depolimerizzazione, in presenza di NaHCO3o piridina per alcalinizzare la soluzione, o in presenza di MnCl2con o senza NTA. Preferibilmente, l’ossidazione con periodato viene eseguita in presenza di NTA. Preferibilmente, l’ossidazione viene eseguita ad un pH compreso tra 5.5 e 10.0, più preferibilmente compreso tra 6.0 e 9.0.
[0032] La presente invenzione riguarda inoltre un processo per la rottura del legame C2-C3di residui di glucosammina di un glucosamminoglicano, comprendente: ossidazione, preferibilmente mediante periodato, ad un pH compreso tra 5.5 e 10.0, più preferibilmente compreso tra 6.0 e 9.0, di detto glucosamminoglicano.
[0033] Preferibilmente, i residui di glucosammina in cui i gruppi OH/NH2adiacenti sono stati convertiti nelle aldeidi corrispondenti, le quali a loro volta sono state ridotte nei corrispondenti alcoli, sono dal 25% al 100%, più preferibilmente dal 50% al 100%, ancor più preferibilmente dal 60% al 90%, dei residui di glucosammina del glucosamminoglicano.
[0034] I composti derivati di glucosamminoglicani ottenibili mediante il processo sopra descritto hanno preferibilmente un peso molecolare da 800 a 30.000 Da, a seconda delle condizioni di processo e del glucosamminoglicano di partenza. Quando vengono utilizzate eparine non frazionate come materiale di partenza, i composti derivati di glucosamminoglicano ottenibili mediante il processo sopra descritto hanno preferibilmente un peso molecolare da 3.000 a 20.000 Da, più preferibilmente da 3.500 a 12.000 Da.
[0035] Gli innovativi derivati di glucosamminoglicani della presente invenzione hanno inaspettatamente mostrato di essere efficienti inibitori dell’eparanasi in vitro e di inibire il mieloma in modelli animali.
[0036] I prodotti con un maggior numero di unità in cui dioli adiacenti e OH/NH2adiacenti sono stati convertiti nelle aldeidi corrispondenti, a loro volta ridotte nei corrispondenti alcoli, sono anche meno solfatati rispetto ai glucosamminoglicani naturali e ai loro RO derivati, perciò si prevede che essi mostrino minori interazioni con proteine e una farmacocinetica più favorevole rispetto ai loro analoghi recanti meno residui modificati.
[0037] La presente invenzione riguarda inoltre i composti ottenibili mediante i processi sopra descritti per l’uso come medicamenti.
[0038] In particolare, la presente invenzione i composti ottenibili mediante i processi sopra descritti per l’uso come anti metastatici, antitumorali, preferibilmente antimieloma.
[0039] I derivati di eparina e di eparina a basso peso molecolare preparati secondo la presente invenzione hanno dimostrato, nonostante il basso grado di solfatazione, una efficace inibizione dell’attività dell’eparanasi, sia in vitro che in vivo in un modello sperimentale di mieloma multiplo.
[0040] Inoltre i derivati della presente invenzione, anche a pesi molecolari bassi (vedere esempi 5, 6 e 8), hanno mostrato una attività inibente l’eparanasi superiore a quella di RO eparine ottenute da eparine 2-O-desolfatate di analogo peso molecolare. Queste ultime sono mostrate in tabella 1.
[0041] Tabella 1: i dati mostrano una generale tendenza alla riduzione dell’attività inibente l’eparanasi con il decrescere del peso molecolare delle eparine glycol split di tipo RO.
Esempi
[0042] Preparazione dei composti
La N-desolfatazione di eparina non frazionata (qui UFH) descritta nei seguenti esempi è stata ottenuta mediante modificazione di metodi noti (Inoue Y. e Nagasawa K., 1976, “Selective N-desulfation of heparin with dimethyl sulfoxide containing water or methanol.” Carbohydr Res, 46 (1), 87-95). Il grado di N-desolfatazione è stato determinato mediante<13>C-NMR (Naggi A. et al., 2001, “Generation of anti-factor Xa active, 3-O-sulfated glucosamine-rich sequences by controlled desulfation of oversulfated heparins.” Carbohydr Res., 336, 4, 283-290).
[0043] Campioni di eparine modificate, dotate di diversi gradi di N-desolfatazione, sono stati soggetti a ossidazione con periodato a dare unità ad anello aperto con due gruppi aldeidici e riduzione con boroidruro di sodio (NaBH4) in un mezzo acquoso a dare i derivati di eparina finali; entrambe le reazioni sono state eseguite mediante modificazione di metodi noti. L’ossidazione con periodato è stata eseguita preferibilmente in presenza di NaHCO3, piridina, MnCl2o MnCl2con NTA. La 2-O-desolfatazione controllata di UFH è stata eseguita seguendo modificazioni di metodi noti (Jaseja M. et al., 1989, “Novel regio- and stereo-selective modifications of heparin in an alkaline solution. Nuclear magnetic resonance spectroscopic evidence.” Canad J Chem, 67, 1.449-1.455; R. N. Rej Arthur S. Perlin, 1990, “Base-catalyzed conversion of the α-L-iduronic acid 2-sulfate unit of heparin into a unit of α-L-galacturonic acid, and related reactions.” Carbohydr Res, 200, 25, 437-447; Casu B. et al. 2004 Undersulfated and Glycol-Split Heparins Endowed with Antiangiogenic Activity J. Med. Chem., 47, 838-848). Qui “RO” indica la percentuale di residui, in cui dioli adiacenti e OH/NH2adiacenti sono stati convertiti in aldeidi corrispondenti e quindi nei corrispondenti alcoli, sul totale dei residui dei glucosamminoglicani.
[0044] Analisi in vitro
Sulla base degli studi precedenti di Bisio et al. (Bisio A. et al., 2007, “High-performance liquid chromatographic/mass spectrometric studies on the susceptibility of heparin specie to cleavage by heparanase.” Sem Thromb hemost, 33, 448-495) l’attività inibitoria dell’eparanasi è stata determinata in vitro dal gruppo del Professor Vlodavsky all’Università di Haifa, Israele, secondo il metodo descritto da Hammond et al. (Hammond et al., 2010, “Development of a colorimetric assay for heparanase activity suitable for kinetic analysis and inhibitor screening.” Anal Biochem 396, 112-6). In breve, l’eparanasi può tagliare il pentasaccaride sintetico Fondaparinux, che è un farmaco antitrombotico, strutturalmente corrispondente al sito di legame per l’antitrombina dell’eparina. Dopo l’idrolisi ad opera dell’eparanasi, si ottengono un trisaccaride ed un disaccaride riducente. Quest’ultimo può essere facilmente quantificato in modo da stimare l’attività dell’eparanasi. Negli esempi seguenti, la soluzione in esame contiene (100µl) di tampone di acetato di sodio pH 5.0 40 mM e Fondaparinux 100 mM (GlaxoSmithKline), con o senza inibitore. L’eparanasi è stata aggiunta ad una concentrazione finale di 140 pM all’inizio del test. Le piastre sono state sigillate con nastro adesivo ed incubate a 37°C per 2-24 ore. I test sono stati fermati mediante aggiunta di 100µL di una soluzione di 1,69 mM di 4-[3-(4-iodofenil)-1H-5 tetrazolio]-1,3-benzene disulfonato (WST-1, Aspep, Melbourne, Australia) in NaOH 0,1M. Le piastre sono state risigillate con nastro adesivo e sviluppate a 60°C per 60 minuti. L’assorbanza è stata misurata a 584 nm (Fluostar, BMG, Labtech). In ogni piastra, una curva costruita con D-galattosio come zucchero riducente standard, a concentrazioni comprese tra 2 e 100 µM, è stata preparata nello stesso tampone e volume. Il valore IC50è stato determinato. I risultati ottenuti utilizzando il sopra citato test colorimetrico sono stati validati usando un diverso test che utilizza una matrice extracellulare (ECM) marcata con solfato radioattivo come substrato dell’eparanasi. In breve, il substrato ECM è depositato mediante cellule endoteliali corneali coltivate e quindi molto somigliante alla membrana basale subendoteliale nella sua composizione, funzione biologica e proprietà barriera. Informazioni dettagliate riguardo la preparazione di ECM marcate con solfato e loro uso per il saggio di eparanasi possono essere trovate in: Vlodavsky, I., Current Protocols in Cell Biology, Chapter 10: Unit 10.4, 2001.
[0045] Attività in vivo
L’attività antimieloma in vivo è stata testata seguendo sostanzialmente la procedura descritta da Yang Y. et al. (Yang Y., et al., 2007, “The syndecan-1 heparan sulfate proteoglycan is a viable target for myeloma therapy.” Blood, 110, 2.041-2.048). In breve, topi CB17 scid/scid da 5 a 6 settimane di vita sono stati ottenuti da Arlan (Indianapolis, IN) o Charles River Laboratories (USA). I topi sono stati collocati e monitorati nello stabulario dell’Università dell’Alabama a Birmingham. Tutte le procedure e i protocolli sperimentali sono stati approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee. 1x10<6>cellule di mieloma CAG esprimenti eparanasi (ad alta o bassa espressione) sono state iniettate sottocute nel fianco sinistro di ogni topo. Dieci giorni dopo l’iniezione delle cellule tumorali, ai topi sono state impiantate delle pompe osmotiche Alzet (Durect Corporation, Cupertino, CA) sul fianco destro. Le pompe contenevano una soluzione dei composti da testare (nuovi derivati di eparina) o tampone fosfato (PBS) come controllo. La soluzione è stata somministrata in modo continuato per 14 giorni. Dopo 14 giorni, gli animali sono stati sacrificati e il peso umido dei tumori sottocutanei e il livello medio di kappa nel siero sono stati valutati e confrontati tra i gruppi sperimentali mediante test log-rank (p<0,05 è stato considerato statisticamente significativo).
[0046] L’immagine settimanale di bioluminescenza della luciferasi fornisce dati quantitativi sui tumori primari ed evidenzia le metastasi all’interno delle ossa così come nei tessuti molli. Va notato che, il modello SCID-hu è unico poiché le cellule tumorali umane sono iniettate direttamente in piccoli frammenti di osso fetale umano successivamente impiantati sottocute in topi SCID, quindi riproducendo strettamente il mieloma umano.
[0047] Procedura generale delle analisi NMR
Gli spettri sono stati registrati a 25°C con uno spettrometro Bruker Avance 500 (Karlsruhe, Germany) munito di criosonda TCI da 5 mm o di sonda BBO da 10 mm. L’integrazione dell’area o dei volumi dei picchi nello spettro è stata fatta utilizzando un software standard Bruker TopSpin 2.0.
[0048] N-DESOLFATAZIONE DI EPARINA NON FRAZIONATA
[0049] ESEMPIO 1 (G8220)
UFH (4,01 g, lot. G3378) è stata sciolta in acqua (32 ml) e trattata sotto agitazione con Amberlite IR 120 (H+, 144 ml). La soluzione acida filtrata è stata portata a pH 7 con piridina, poi concentrata a pressione ridotta fino all’essicazione. Il risultante sale di piridinio è stato sciolto in 40 ml di una miscela di DMSO: H2O (95:5 in volume), poi agitata a 25°C per 48 ore. Dopo la diluizione con 40 ml di acqua, la soluzione è stata dializzata a 4°C per 16 ore contro acqua distillata in membrana (cut-off: 3.500 Da). Concentrazione a pressione ridotta e liofilizzazione davano: G8220 (2,7 g), resa= 67% w/w, MW= 19.100 Da, grado di N-desolfatazione determinato mediante<13>C-NMR = 74,7% dei residui di glucosammina totali, acido uronico 2-O-solfatato determinato mediante<13>C-NMR = 18% dei monosaccaridi totali.
[0050] ESEMPIO 2 (G8343)
Seguendo le procedure descritte nell’Esempio 1, un campione di UFH (0,25 g, lot. G3378) è stato convertito nel corrispondente sale di piridinio, il quale è stato N-desolfatato in una miscela di DMSO: MeOH (95:5 in volume). Dopo 2 ore in agitazione a 25°C, la miscela di reazione è stata processata, seguendo la stessa procedura finale descritta nell’Esempio 1, per dare G8343 (0,172 g), resa= 69% w/w, MW= 18.000 Da, grado di N-desolfatazione determinato mediante<13>C-NMR =63,3% dei residui di glucosammina totali, acido uronico 2-O-solfatato determinato mediante<13>C-NMR = 19% dei monosaccaridi totali.
[0051] ESEMPIO 3 (G8516)
Partendo da un campione di UFH (0,25 g, lot. G3378) e seguendo la procedura descritta nell’Esempio 2, ma riducendo a 40 minuti il tempo della reazione di N-desolfatazione, è stato ottenuto G8516 (0,17 g), resa= 68%, grado di N-desolfatazione determinato mediante<13>C-NMR = 49,7% dei residui di glucosammina totali, acido uronico 2-O-solfatato determinato mediante<13>C-NMR = 17% dei monosaccaridi totali.
[0052] ESEMPIO 4 (G8147)
UFH (2,5 g, lot. G3378) è stata sciolta in acqua (20 ml) e trattata in agitazione con Amberlite IR 120 (H+, 90 ml). La soluzione acida filtrata è stata portata ad un pH pari a 7 con piridina, poi concentrata a pressione ridotta fino all’essicazione. Il risultante sale di piridinio è stato sciolto in 25 ml di una miscela di DMSO: MeOH (90:10 in volume), poi agitato a 25°C per 18 ore. Dopo la diluizione con 25 ml di acqua, la soluzione è stata dializzata a 4°C per 16 ore contro acqua distillata in membrana (cut-off: 3.500 Da). Concentrazione a pressione ridotta e liofilizzazione davano: G8147 (1,9 g), resa= 76% w/w, MW= 18.200 Da, grado di N-desolfatazione determinato mediante<13>C-NMR = 60% dei residui di glucosammina totali.
[0053] ESEMPIO 5 (G9416)
UFH (5 g, lot. G3378) è stata sciolta (40 ml) e trattata con Amberlite IR 120 (H+, 90 ml) in agitazione. La soluzione acida filtrata è stata portata ad un pH pari a 7 con piridina, poi concentrata a pressione ridotta fino all’essicazione . Il risultante sale di piridinio è stato sciolto in 100 ml di una miscela di DMSO: MeOH (95:5 in volume), poi agitato a 25°C per 18 ore. Dopo la diluizione con 100 ml di acqua, la soluzione è stata dializzata a 4°C per 16 ore contro acqua distillata in membrana (cut-off: 3.500 Da). Concentrazione a pressione ridotta e liofilizzazione davano: G9416 (3.65 g), resa= 73% w/w, MW=18.800 Da, grado di N-desolfatazione determinato mediante<13>C-NMR =77% dei residui di glucosammina totali.
[0054] ESEMPIO 6 (G8079)
UFH (1 g, lot. G3378) è stata sciolto in acqua (8 ml) e trattata con Amberlite IR 120 (H+, 36 ml) per 30 minuti in agitazione. La soluzione acida filtrata è stata portata d un pH pari a 7 con piridina, poi concentrata a pressione ridotta fino all’essicazione. Il risultante sale di piridinio è stato sciolto in 10 ml di una miscela di DMSO:MeOH (95:5 in volume), poi agitato a 25°C per 16 ore. Dopo una diluizione con 10 ml di acqua, la soluzione è stata dializzata per 3 giorni contro acqua distillata in membrana (cut-off: 3.500 Da). Concentrazione a pressione ridotta e liofilizzazione davano: G8079 (1 g), resa= 100%, grado di N-desolfatazione determinato mediante<13>C-NMR = 60% dei residui di glucosammina totali.
[0055] OSSIDAZIONE CON PERIODATO E RIDUZIONE CON BOROIDRURO DI SODIO DI EPARINE N-DESOLFATATE
[0056] ESEMPIO 7 (G8340)
A un campione di G8220 dell’Esempio 1 (0,25 g, 74,7% di residui di eparina N-desolfatati), sciolto in acqua (7,3 ml) e raffreddato a 4°C, è stato aggiunto un volume equivalente di NaIO40,2 M. Il pH è stato aggiustato a 6.8 con NaHCO32M (circa 2,1 ml) e alla soluzione, sotto agitazione al buio a 4°C, è stato aggiunto acido nitrilotriacetico 0,08M (NTA, 10 ml). Il pH è stato portato da 4.0 a 6.6 aggiungendo NaHCO32M e la miscela di reazione è stata tenuta in agitazione a 4°C per 8 ore. L’eccesso di periodato è stato eliminato aggiungendo etilenglicole (0,73 ml); dopo 1 ora la miscela di reazione è stata desalata mediante dialisi contro acqua distillata in membrana (cut-off: 3.500 Da) a 4°C per 16 ore. La soluzione desalata è stata trattata con NaBH4(0,164 g, 3,4 mmoli), agitata per 3 ore a 25°C, poi il pH è stato portato a 4 con HCl 1N per eliminare l’eccesso di NaBH4e, dopo 10 minuti di agitazione, neutralizzato con NaOH 0,1N. Dopo la dialisi contro acqua distillata a 4°C per 16 ore in membrana (cut-off: 3.500 Da), concentrazione a pressione ridotta e liofilizzazione, 0,202 g di G8340 sono stati ottenuti, resa= 90% w/w, MW= 8.400 Da. Le percentuali, sul totale dei residui monosaccaridici, di RO (53%), IdoA2S (35%), GlcNAc (9%) e GlcNH2(12%) sono state determinate mediante<13>C-NMR. Test in vitro e in vivo del prodotto inventivo hanno dato i seguenti risultati:
Inibizione di eparanasi in vitro: IC50= 20 ng/ml.
Attività antimieloma in vivo: 60 mg/Kg/giorno per 14 giorni: 75% inibizione di tumore e 60% inibizione di proteina K serica.
[0057] ESEMPIO 8 (G8438)
Partendo da G8343 dell’Esempio 2 (0,171 g, 63,3% di residui di eparina N-desolfatati) e seguendo la stessa procedura descritta nell’Esempio 7, è stato ottenuto G8438 (91,4 mg), resa= 82%, MW= 6.800 Da. Le percentuali di RO (38%), IdoA2S (32%), GlcNAc (8%), GlcNH2(4%), sono state determinate mediante<13>C-NMR. Test in vitro del prodotto inventivo hanno dato i seguenti risultati:
Inibizione di eparanasi in vitro: IC50= 60 ng/ml.
[0058] ESEMPIO 9 (G8588)
Partendo da G8516 dell’Esempio 3 (0,171 g, 44% di residui di eparina N-desolfatati) e seguendo la stessa procedura descritta nell’Esempio 7, è stato ottenuto G8588 (0,136 mg), resa= 80%, MW= 11.000 Da. Le percentuali di GlcNAc (30%), GlcNH2(13%), IdoA2S (34%) e RO (37%) sono state determinate mediante<13>C-NMR.
[0059] ESEMPIO 10 (G9578)
Partendo da G9416 dell’esempio 5, seguendo la procedura dell’Esempio 7 è stato ottenuto G9578, resa = 89 %, MW= 6.300 Da, grado di N-desolfatazione mediante<13>C-NMR= 48% dei residui di glucosammina totali. Le percentuali di RO (45%) e IdoA2S (35%) sul totale dei residui di glucosamminoglicano sono state determinate mediante<13>C-NMR. Test in vitro e in vivo del prodotto inventivo hanno dato i seguenti risultati:
Inibizione di eparanasi in vitro: IC50= 75 ng/ml.
Attività antimieloma in vivo: (60 mg/Kg/giorno per 14 giorni): 63% inibizione di tumore.
[0060] ESEMPIO 11 (G8188)
A un campione di eparina N-desolfatata G8147 dell’Esempio 4 (0,25 g, 60% di residui di eparina N-desolfatati), sciolto in acqua (7,3 ml) e raffreddato a 4°C, è stato aggiunto un volume equivalente di NaIO40,2M. Il pH è stato aggiustato a 6.8 con NaHCO32M (circa 2,1 ml), agitato al buio a 4°C per 16h . L’eccesso di periodato è stato eliminato aggiungendo etilenglicole (0,73 ml) e dopo 1 ora la miscela di reazione è stata desalata mediante dialisi contro acqua distillata in membrana (cut-off: 3.500 Da) a 4°C per 16 ore. La soluzione desalata è stata trattata con NaBH4(0,164 g, 3,4 mmoli), agitata per 3 ore a 25°C poi il suo pH è stato portato a 4 con HCl 1N per eliminare l’eccesso di NaBH4e, dopo 10 minuti di agitazione, è stato neutralizzato con NaOH 0,1N. Dopo la dialisi contro acqua distillata a 4°C per 16 ore in membrana (cut-off: 3.500 Da), concentrazione a pressione ridotta e liofilizzazione, sono stati ottenuti 0,168 g di G8188, resa= 67% w/w, MW= 3.460 Da. Le percentuali di RO (43%), IdoA2S (40%), GlcNAc (6%) e GlcNH2(4%) sul totale dei residui di glucosamminoglicano sono state determinate mediante<13>C-NMR.
[0061] ESEMPIO 12 (G8189)
Un campione di G8147 (0,25 g, 60% di residui di eparina N-desolfatati), sciolto in acqua (7,3 ml) e raffreddato a 4°C, è stato aggiunto ad un volume equivalente di NaIO40,2M. Il pH è stato aggiustato a 6.8 con piridina (5% v/v, circa 730 µl), sotto agitazione al buio a 4°C per 16h . L’eccesso di periodato è stato eliminato aggiungendo etilenglicole (0,73 ml) e dopo 1 ora la miscela di reazione è stata dissalata mediante dialisi contro acqua distillata in membrana (cut-off: 3.500 Da) a 4°C per 16 ore. La soluzione dializzata è stata trattata con NaBH4(0,164 g, 3,4 mmoli), agitata per 3 ore a 25°C, poi il suo valore di pH è stato portato a 4 con HCl 1N per eliminare l’eccesso di NaBH4e, dopo 10 minuti di agitazione, neutralizzato con NaOH 0,1N. Dopo la dialisi contro acqua distillata a 4°C per 16 ore in membrana (cut-off: 3.500 Da), concentrazione a pressione ridotta e liofilizzazione, 0,181 g di G8189 sono stati ottenuti, resa= 72% w/w, MW=5.150 Da. Le percentuali di RO (49%), IdoA2S (39%), GlcNAc (7%) e GlcNH2(7%) sul totale dei residui di glucosamminoglicano sono state determinate mediante<13>C-NMR.
[0062] ESEMPIO 13 (G8217)
Un campione di G8147 (0,25 g, 60% di residui di eparina N-desolfatati), sciolto in acqua (7,3 ml) e raffreddato a 4°C, è stato aggiunto ad un volume equivalente di NaIO40,2M. Il valore pH è stato aggiustato a 6.8 con NaHCO32M (circa 2,1 ml) e 30 ml di MnCl20,05M (la concentrazione finale in soluzione era 0,00001M) sono stati aggiunti con agitazione al buio a 4°C per 16 h. L’eccesso di periodato è stato eliminato aggiungendo etilenglicole (0,73 ml). Durante la notte, il campione è precipitato perché il pH è salito a 8, poi il suo valore di pH è stato portato a 6 con HCl 1N. Dopo 1 ora la miscela di reazione è stata desalata mediante dialisi contro acqua distillata in membrana (cut-off: 3.500 Da) a 4°C per 16 ore. La soluzione dializzata è stata trattata con NaBH4(0,164 g, 3,4 mmoli), agitata per 3 ore a 25°C poi il suo valore di pH è stato portato a 4 con HCl 1N per eliminare l’eccesso di NaBH4e, dopo 10 minuti di agitazione, è stato neutralizzato con NaOH 0,1N. Dopo la dialisi contro acqua distillata a 4°C per 16 ore in membrana (cut-off: 3.500 Da), concentrazione a pressione ridotta e liofilizzazione, 0,230 g di G8217 sono stati ottenuti, resa= 92% w/w, MW= 7.455 Da. Le percentuali di RO (31%), IdoA2S (29%), GlcNAc (8%) e GlcNH2(6%) sul totale dei residui di glucosamminoglicano sono state determinate mediante<13>C-NMR.
[0063] ESEMPIO 14 (G8219)
Un campione di G8147 (0,25 g, 60% di residui di eparina N-desolfatati), sciolto in acqua (7,3 ml) e raffreddato a 4°C, è stato aggiunto ad un volume equivalente di NaIO40,2M. Il pH è stato aggiustato a 6.8 con NaHCO32M (circa 1,2 ml) e con agitazione al buio a 4°C, sono stati aggiunti alla soluzione acido nitrilotriacetico 0,08M (NTA, 10 ml) e 31 ml di MnCl20,05M. Il pH da 4.0 è stato portato a 6.3 aggiungendo NaHCO32M e la miscela di reazione è stata mantenuta sotto agitazione a 4°C per 8 ore. L’eccesso di periodato è stato eliminato aggiungendo etilenglicole (0,73 ml) e dopo 1 ora la miscela di reazione è stata desalata mediante dialisi contro acqua distillata in membrana (cut-off: 3.500 Da) a 4°C per 16 ore. La soluzione dializzata è stata trattata con NaBH4(0,164 g, 3,4 mmoli), agitata per 3 ore a 25°C poi il suo valore di pH è stato portato a 4 con HCl 1N per eliminare l’eccesso di NaBH4e, dopo 10 minuti di agitazione, è stato neutralizzato con NaOH 0,1N. Dopo la dialisi contro acqua distillata a 4°C per 16 ore in membrana (cut-off: 3.500 Da), concentrazione a pressione ridotta e liofilizzazione, 0,202 g di G8219 sono stati ottenuti, resa= 90% w/w, MW= 7.330 Da. Le percentuali di RO (54%), IdoA2S (36%), GlcNAc (9%) e GlcNH2(8%) sul totale dei residui di glucosamminoglicano sono state determinate mediante<13>C-NMR.
[0064] ESEMPIO COMPARATIVO 15 (G8092)
Ad un campione di G8079 (1g, eparina N-desolfatata), sciolto in acqua (29,2 ml) e raffreddato a 4°C, è stato aggiunto un volume equivalente di NaIO40,2M (pH 5) e la miscela di reazione è stata tenuta sotto agitazione a 4°C per 8 ore. L’eccesso di periodato è stato eliminato aggiungendo etilenglicole (2,9 ml) e dopo 1 ora la miscela di reazione è stata desalata mediante dialisi contro acqua distillata in membrana (cut-off: 3.500 Da) a 4°C per 16 ore. La soluzione dializzata è stata trattata con NaBH4(0,657 g, 3,4 mmoli), agitata per 3 ore a 25°C, poi il suo valore di pH è stato portato a 4 con HCl 1N per eliminare l’eccesso di NaBH4, e dopo un’agitazione di 10 minuti, neutralizzata con NaOH 0,1N. Dopo dialisi contro acqua distillata a 4°C per 72 ore in membrana (cut-off: 3.500 Da) , concentrazione a pressione ridotta e liofilizzazione, 0,643 g di G8092 sono stati ottenuti, resa= 64% w/w, MW= 6.064 Da. L’analisi mediante<13>C-NMR mostra la presenza di un picco a 95 ppm di glucosammina N-desolfatata. La reazione di ossidazione in condizioni di pH acido non si verifica.
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Processo per la preparazione di un derivato di un glucosamminoglicano inibitore dell’eparanasi, comprendente: a) N-desolfatazione da 25% a 100% dei residui N-solfatati di un glucosamminoglicano; b) ossidazione, preferibilmente mediante periodato ad un pH compreso tra 5.5 e 10.0, da 25% a 100% dei residui di glucosammina 2-N-, 3-O-non solfatata e dei residui di acido uronico 2-O-non solfatato di detto glucosamminoglicano, in condizioni tali da convertire i dioli adiacenti e gli OH/NH2adiacenti in aldeidi; c) riduzione, preferibilmente mediante boroidruro di sodio, di detto glucosamminoglicano ossidato, in condizioni tali da convertire dette aldeidi in alcoli.
- 2. Il processo della rivendicazione 1, comprendente inoltre: d) 2-O-desolfatazione fino a 50%, preferibilmente fino a 25%, di residui 2-O-solfatati di detto glucosamminoglicano, prima o dopo la N-desolfatazione.
- 3. Il processo di qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, comprendente inoltre: e) parziale o totale deacetilazione dei residui N-acetilati di detto glucosamminoglicano, prima o dopo la N-desolfatazione.
- 4. Il processo di qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui il glucosamminoglicano è un glucosamminoglicano naturale o sintetico, preferibilmente in cui il glucosamminoglicano naturale o sintetico è eparina, eparina a basso peso molecolare, eparansolfato o loro frazioni, più preferibilmente in cui il glucosamminoglicano naturale o sintetico è eparina non frazionata o eparina avente peso molecolare da 3.500 a 8.000 Da.
- 5. Processo per la rottura del legame C2-C3di residui di glucosammina non solfatati di un glucosamminoglicano, comprendente: ossidazione, preferibilmente mediante periodato, ad un pH compreso tra 5.5 e 10.0, più preferibilmente compreso tra 6.0 e 9.0, di detto glucosamminoglicano.
- 6. Composti derivati di un glucosamminoglicano ottenibili mediante il processo di una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti.
- 7. I composti derivati della rivendicazione 6 aventi un peso molecolare da 3.000 a 20.000 Da, preferibilmente da 3.500 a 12.000 Da.
- 8. Composti oligosaccaridi ottenibili mediante parziale depolimerizzazione enzimatica o chimica dei composti derivati di glucosamminoglicano delle rivendicazioni 6-7.
- 9. I composti di qualsiasi delle rivendicazioni 6-8 per l’uso come medicamenti.
- 10. I composti della rivendicazione 9 per l’uso come farmaci anti metastatici, antitumorali, preferibilmente per l’uso come farmaci antimieloma.
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