CN1197587C - N－位脱硫酸肝素在预防和治疗炎症中的应用 - Google Patents

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Abstract

N-位脱硫酸肝素在预防和治疗炎症中的应用，是基于动物急性腹腔炎模型和动物流血模型实验结果，N-位脱硫酸肝素的抗炎活性优于或相当于低分子量肝素，且具有低抗凝血活性。并从一系列N位不同含硫量的N-位脱硫肝素中筛选得到具有最佳抗炎活性和最低抗凝血活性的样品。本发明的应用解决了肝素治疗炎症时引起内出血的副作用这一难题，为临床应用肝素预防和治疗炎症提供了新的途径。

Description

N-位脱硫酸肝素在预防和治疗炎症中的应用
本发明涉及药物的应用，尤其是关于采用具有显著降低肝素的抗凝血活性，但保留其抗炎活性的N-位脱硫酸肝素在预防和治疗炎症中的应用。
肝素是一种高度硫酸化的天然多糖化合物，作为抗凝剂在临床上应用已超过50年，1916年首先由Mclean发现[McLean，Circulation 19，75-78(1959)]。肝素结合在丝甘蛋白链上并以蛋白聚糖的形式在内质网上合成[Toledo and Dietrich，Biochim.Biophys.Acta 498，114-122(1977)]。肝素是一种胞内产物，常与碱性蛋白形成复合物储存在肥大细胞的分泌颗粒中，在特定的外界信号刺激下，由肺、小肠和肝脏的肥大细胞通过脱粒作用释放出来。分泌的可溶性肝素带有大量的负电荷，现已知能与包括众多生长因子和趋化因子在内的一百多种蛋白结合。肝素可通过相对廉价的方式从高度血管化的组织中分离得到，如猪和牛的小肠粘膜，或者少数情况下从牛的肺组织中提取[Conrad，Heparin-BindingProteins，Academic Press，San Diego(1998)]。
肝素是由重复二糖单位构成的、长短不一、结构类似、无分枝的多聚物组成的混合物。二糖单位由糖醛酸(α-L-艾杜糖醛酸，IdoA和β-D-葡萄糖醛酸，GlcA)和己糖胺(α-D-葡萄糖胺，GlcN)以及它们的衍生物(乙酰化、硫酸化)组成，并通过1，4-糖甘键连接。艾杜糖醛酸残基的2-O-位和葡萄糖胺2-N、6-O-位是硫酸基团主要存在位点。另外，少数情况下在葡萄糖醛酸的2-O-位和已硫酸化的葡萄糖胺残基的3-O-位也有硫酸化修饰[Tyrrell et al.，Adv.Pharmacol.46，151-208(1999)]。线性的糖胺聚糖链共价结合在核心蛋白的丝氨酸残基上。肝素多聚物的每条多糖链可能含有20-100个单糖单位，由于丝甘核心蛋白序列上含有很长的(ser-gly)n重复单位，因此可以结合高密度的肝素链[Ruoslahti，J.Biol.Chem.264，13369-13372(1989)]，但糖胺聚糖链的数目和结合位置随着核心蛋白的不同而异。
除肝素外，自然界还含有另一种硫酸化的多糖化合物—硫酸肝素，它的结构与肝素类似并含有肝素链上存在的所有结构基元(Motifs)。与肝素不同，硫酸肝素通常由细胞分泌。硫酸肝素普遍存在于绝大多数动物细胞的表面，并且是细胞外基质中基底膜的主要组分。肝素和硫酸肝素是被称作糖胺聚糖或粘多糖(Glycosaminoglycans or GAGs)多糖家族的成员[Hk et al.，Annu.Rev.Biochem.53，847-869(1984)]。另外，这一家族还包括硫酸软骨素、硫酸皮肤素和透明质酸。
在糖胺聚糖家族，肝素和硫酸肝素的结构变化最多。典型的硫酸肝素含有较低水平的N-位和O-位的硫酸基团，而含较多的N-乙酰葡糖胺和葡萄糖醛酸残基。与肝素相比较，通常情况下与一系列核心蛋白结合形成粘多糖的硫酸肝素链较少且短，并多与硫酸软骨素一起结合在核心蛋白上[Kjellěn and Lindahl，Ann.Rev.Biochem.60，443-475(1991)]。硫酸肝素还可以直接连接在细胞表面(通过核心蛋白的跨膜结构域或磷脂酰肌醇连接)或者可能与细胞表面特异受体结合[Gallagher，Curr.Opin.Cell Biol.1，1201-1218(1989)]。有报道不同种类的细胞表达截然不同亚型的硫酸肝素链，这提示一种可能：硫酸肝素在介导细胞之间相互作用过程中发挥重要作用[Kim et al.，Mol.Biol.Cell 5，797-805(1994)；Engelmann et al.，Biochim.Biophys.Acta Mol.Cell Res.1267，6-14(1995)；Archer et al.，J.Anat.189，23-35(1996)]。
与硫酸肝素相比，肝素的硫酸化程度更高并含有较高比例的艾杜糖醛酸残基(由葡萄糖醛酸异构化得到)。由于二者在组成和硫酸化程度上的不同，肝素比硫酸肝素带有更多的负电荷。肝素链中较多的艾杜糖醛酸残基相对增加了多聚物结构的柔性，据推测这种柔性的增加伴随着静电相互作用的增强使得含艾杜糖醛酸的粘多糖比含葡萄糖醛酸的粘多糖生物活性更强[Casu et al.，Trends Biochem. Sci.13，221-225(1988)]。
肝素最被普遍接受和商业开发的功能是作为一种抗凝剂，肝素的这种作用归功于其调节一种内源性的凝血辅助因子—抗凝血酶III(Antithrombin-III，AT-III)的活性，它能够抑制凝血级联放大过程中的多种丝氨酸蛋白酶活性[Bourin and Lindahl，Biochem.J.289，313-330(1993)]。肝素通过其链上的特异高亲和性五糖序列与抗凝血酶-III结合形成复合物，这种复合物抑制凝血酶和凝血因子Xa的能力比单独的抗凝血酶III强。此外，肝素还与一种丝氨酸蛋白酶抑制剂—肝素辅助因子II(Heparin cofactor II，HC-II)的相互作用进一步加强了对凝血酶的抑制。
除了上述的抗凝血活性已被详细认识外，肝素和硫酸肝素还具有其它一些非抗凝血的生物活性，如抗炎症作用，包括阻止白细胞的粘附[Tangelder and Arfors，Blood 77，1565-1571(1991)；Ley et al.，Am.J.Physiol.260，H1667-H1673(1991)；Arfors and Ley，J.Lab.Clin.Med.，121，201-202(1993)；Teixeira and Hellewell，Br.J.Pharmacol.110，1496-1500(1993)；Nelson et al.，Blood.82，3253-3258(1993)；Seeds et al.，J.Lipid Mediators 7，269-278(1995)；Kitamura et al.，Eur.Surg.Res.28，428-435(1996)；Weber et al.，J.Cereb.BloodFlow Metab.17，1221-1229(1997)；Giuffrèet al.，J.Cell Biol.136，945-956(1993)]，激活[Pasini et al.，Thromb.Res.35，527-537(1984)；Bazzoni et al.，J.Lab.Clin.Med.121，268-275(1993)；Riesenberget al.，Br.Heart J.73，14-19(1995)；Ahmed et al.，Am.J.Respir.Crit.Care Med.155，1848-1855(1997)]，或抑制补体的激活[Weiler etal.，J.Immunol.148，3210-3215(1992)；Teixeira et al.，J.LeukocyteBiol.59，389-396(1996)]，保持内皮细胞壁的感应性和完整性，保护血管内皮细胞免遭一些破坏物质如：趋化因子、组织胺、缓激肽、细菌内毒素、溶酶体阳离子蛋白和氧自由基的损伤[Engelberg，Semin.Thromb.Hemost.11，48-55(1985)；Hiebert and Liu，Semin.Thromb.Hemost.17(suppl 1)，42-46(1991)；Tanaka et al.，Nature 361，79-82(1993)；Webb et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，7158-7160(1993)]。
例如：现已知肝素和硫酸肝素能够与P-选择素、L-选择素和Mac-1(CD11b/CD18)结合，从而抑制由这些细胞粘附分子介导的白细胞粘连[Skinner et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.164，1373-1379(1989)；Skinner et al.，J.Biol.Chem 266，5371-5374(1991)；Nelson et al.，Blood.82，3253-3258(1993)；Norgard-Sumnicht etal.，Science.261，480-483(1993)；Diamond et al.，J.Cell Biol.130，1473-1482(1995)；Giuffrèet al.，J.Cell Biol.136，945-956(1997)；Koenig et al.，J.Clin.Invest.101，877-889(1998)]。由内皮细胞合成的硫酸肝素[Giuffrèet al.，J.Cell Biol.136，945-956(1997)；Koenig et al.，J.Clin.Invest.101，877-889(1998)]能够结合多种趋化因子从而使趋化性的细胞因子获得最佳定位[Tanakaet al.，Nature 254，79-82(1993)；Furie and Randolph，Am.J.Pathol.146，1287-1301(1995)]。肝素和硫酸肝素能结合一些内皮细胞表面的生化组分使内皮细胞表面集聚负电荷从而中和由正电荷引起的组织损伤[Engelberg，Semin.Thromb.Hemost.11，48-55(1985)；Hiebert andLiu，Semin.Thromb.Hemost.17(suppl 1)，42-46(1991)]。
据文献报道，肝素可以通过多种方法进行化学修饰，如高碘酸盐氧化作用、N-位脱硫酸根、N-位再乙酰化、N-位非替代肝素类似物的修饰、2-O和6-O-位脱硫酸根、羧基的还原、衍生和异构化以及硫酸基团的转移和过硫酸化作用。这些修饰肝素对研究肝素的结构和功能具有重大价值[Conrad，Heparin-Binding Proteins，Academic Press，San Diego(1998)]。
Tiozzo et al.等报道，关于肝素抗凝血活性与肝素N-位脱硫酸基团的关系研究(Tizzo et al.，Thromb.Res.70，99-106(1993))，N-位脱硫酸肝素与未分级分离的肝素相比较，前者的抗凝血活性显著降低，但抗凝血活性与N-位硫酸基团含量不呈严格的线性关系。
有实验表明通过化学修饰方法得到的非抗凝性肝素可以抑制大鼠动脉平滑肌的增生[Guyton et al.，Circ.Res.46，625-634(1980)]。2-O和3-O-位脱硫酸根肝素的抗凝血活性降低并保留肝素酶抑制、血管生成抑制、抗肿瘤和转移的性质[Masayuki et al.，US Patent 5,795,875(1997)；Lapierre et al.，Glycobiology 6，355-366(1996)]，
另外，Ahmed及其同事报道：通过偶联有抗凝血酶III的亲和层析柱，收集低抗凝性组分得到完好的、非化学修饰的非抗凝性肝素。这种非抗凝性肝素可以抑制由抗原诱导的急性支气管收缩、呼吸道超敏反应和肥大细胞的脱粒作用[Ahmed et al.，Am.J.Respir.Crit.Care Med.155，1848-1855(1997)]。
未分级分离的肝素(UFH)和低分子量肝素(LMH)可用于治疗免疫性炎症，但由于其抗凝血活性高，大剂量应用会有引起内出血的副作用，这从根本上限定了肝素抗炎症的应用前景。国际上有报道应用2-O-位脱硫酸肝素来治疗炎症，(US 5795875(1997))但其抗凝血活性仍然较高，因2-O-位脱硫酸肝素的抗凝血活性仅略有降低。
已知N-位脱硫酸肝素对抗凝血活性有显著降低的影响，而其对抗炎活性的影响未见有报道，因此对N-位脱硫酸肝素的抗炎活性的研究，尤其在预防和治疗炎症中的应用研究，是很有实用意义的。
为此，本发明的目的是提供一种N-位脱硫酸肝素在预防和治疗炎症中的应，N-位脱硫酸肝素的抗炎活性优于或相当于低分子量肝素，并且抗凝血活性显著降低，为更好地应用肝素预防和治疗炎症开辟一条新路。
本发明N-位脱硫酸肝素在预防和治疗炎症中的应用，它是基于采用化学修饰方法，通过脱去肝素N-位的部份硫酸根，综合动物急性腹膜炎模型和动物流血模型实验结果，显示出N-位脱硫酸肝素在N-位上的硫含量对抗凝血活性和抗炎活性的影响，N-位脱硫酸肝素的抗炎活性优于或相当于低分子量肝素，抗凝血活性也显著降低，且从中筛选出最佳样品。因此，N-位胶硫酸肝素解决了低分子量肝素由于抗凝血活性高而具有潜在的引起内出血付作用的这一难题，使之能成为临床药物，用于预防和治疗各种炎症。
参考文献(Nagasawa et al.，Carbohydr.Res.36，265-271，1976；Inoue andNagasawa，Carbohydr.Res.46，87-95(1976))对肝素进行化学修饰N-位脱硫酸根，获得N-位上有不同硫含量的N-位脱硫酸肝素。并对肝素、低分子量肝素及在N-位上有不同的抗凝血活性进行了测定。表1显示肝素、低分子量肝素和不同硫含量的N-位脱硫酸肝素样品的N-位上硫绝对含量和相对含量以及激活部份凝血活酶时间的检测结果。
                               表1
肝素样品 N位硫绝对含量(％) N位硫相对含量(％) 2APTT(微克/毫升)
UFH  3.25  100  0.56
LMH  3.54  109.1  3.3
①  0.62  19.0  20.5
②  0.55  17.0  34.8
③  1.50  46.2  9.0
④  0.36  11.0  115
⑤  1.99  61.2  2.3
⑥  2.31  71.0  6.5
⑦  2.80  86.2  1.7
⑧  2.08  64.0  6.4
UFH：未分级分离肝素；LMH：低分子量肝素
APTT：激活部分凝血活酶时间
表1检测结果表明，不同硫含量的N-位脱硫酸肝素的抗凝血活性比肝素和低分子量肝素的抗凝血活性都有显著的降低。3、5、6、7、8号样品的N-位硫酸根含量分别为46.2％、61.2％、71.0％、86.2％、64.0％，抗凝血活性相当于肝素的1/16、1/4、1/12、1/3、1/11。1、2、4号样品的N-位硫酸根含量分别为19.0％、17.0％、11.0％、抗凝血活性降低为肝素的1/37、1/62、1/205。值得注意的是，4号样品的抗凝血活性降低为肝素的1/205，它具有很低或无抗凝血活性。
在腹腔注射巯基乙酸诱导急性腹膜炎的小鼠模型实验中，尾静脉注射低分子量肝素和N-位不同硫含量的N-位脱硫酸肝素样品后，检测其对总量白细胞、淋巴细胞、单核细胞、颗粒细胞向腹腔内渗出的抑制作用，检测结果见图1。
图1显示出N-位脱硫酸肝素的抗炎活性是优于或相当于LMH的抗炎活性，综合表1与图1的结果，N-位脱硫酸肝素中N-位硫相对含量为0.1-99.9％都可在制造预防和治疗炎症用药物中应用。
又采用小鼠尾静脉分别注射低分子量肝素和N-位不同硫含量的N-位脱硫酸肝素样品观察其对小鼠流血时间的影响。实验结果见图2，结果表明在每个小鼠尾静脉注射120微克(7.5mg/kg)样品条件下，1、2、4号样品的动物体内的抗凝血活性低于低分子量肝素，而3、5、6、7、8号样品的动物体内的抗凝血活性强于或相当于低分子量肝素。
又通过对小鼠尾静脉分别注射N-位脱硫酸肝素4号样品和低分子量肝素作对小鼠流血时间影响的浓度梯度实验，实验结果见图3，结果表明，随着小鼠静脉给药量从12，40，120，360微克的增加，低分子量肝素组小鼠流血时间逐渐延长，而4号样品对小鼠流血时间无明显的延长，故可以得出结论：4号样品具有很低或无抗凝血活性。
本发明是应用N-位脱硫酸肝素预防和治疗各种急性、亚急性和慢性炎症，这些炎症的特征是白细胞侵入和滞留在损伤部位，从而造成组织和器官的损伤，并最终导致功能衰竭。
本发明提供了通过供给具有药效量的N-位脱硫酸肝素以达到治疗炎症目的的一种应用。其中“具有药效的量”意味着：无论共同、连续或间断给药，足以表现出对病人有显著疗效的N-位脱硫酸肝素的总量即以白细胞侵入和聚集为特征的病理症状的消失或愈合机率的提高。
在本发明应用过程中，可给与患有疾病的哺乳动物具有药效量的N-位脱硫酸肝素。这些疾病包括一些炎症紊乱症如：各种关节炎、气喘、皮炎和牛皮癣、急性呼吸窘迫综合症、局部缺血-再灌注后组织损伤(包括心肌、肾、骨骼肌、小肠、大脑和肺的局部缺血-再灌注后组织损伤)、休克、严重创伤和移植排斥。
在本发明应用的过程中，N-位脱硫酸肝素可单独给药，也可以与其它治疗药物联合使用。例如：低抗凝性肝素最好与特定的细胞因子、淋巴因子或造血细胞生长因子—巨噬细胞集落刺激因子、粒性白细胞-巨噬细胞集落刺激因子、自然杀伤细胞集落刺激因子、白介素-1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12、粒性白细胞集落刺激因子、巨核细胞集落刺激因子以及促红细胞生成素等共同使用治疗炎症。值得注意的是：这种联合治疗应用可使低抗凝性肝素与细胞因子、淋巴因子或造血细胞生长因子产生协同作用，从而增强抗炎效果；而且这种应用可使N-位脱硫酸肝素最大限度地降低由细胞因子、淋巴因子或造血细胞生长因子引起的潜在的副作用。
在本发明应用的过程中，药物除含有N-位脱硫酸肝素外，还可包括药理学上已被接受的载体、溶剂、填充物、盐、缓冲液、稳定剂、和/或其它已被普遍接受的物质。所谓“药理学上可接受的”是指不影响N-位脱硫酸肝素生物活性的无毒物质。载体和一些其它物质特性的选择取决于不同的给药途径。
在本发明应用的过程中，N-位脱硫酸肝素可通过一系列传统的方式给药，如：口服、肺吸入或表皮、皮下注射或静脉注射，其中应优先考虑静脉注射。
在经口腔给予有疗效的N-位脱硫酸肝素时，可制成片剂、胶囊、粉末或溶液的形式。当用片剂给药时药物应另外包含固相载体(如明胶或辅药)。片剂、胶囊、粉末含有5-95％的N-位脱硫酸肝素，最好含有25-90％。当以液体形式给药时，应加入一种液相载体如：水、动物或植物油(花生油、大豆油或合成油)，还可包含生理盐水、葡萄糖或其它糖类溶液、醇类(乙二醇、丙二醇、聚乙二醇)，N-位脱硫酸肝素的质量含量为0.5-90％，优先考虑1-50％的量。
在通过表皮、皮下或静脉注射给药时，更好的药物成分除含有N-位脱硫酸肝素，还应含有一种等渗介质如：氯化钠注射液、格林注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、乳酸格林注射液以及其它已知的注射液。在本发明应用过程中，药物组分还包括稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂等其它已知的类似物质。
在本发明应用过程中，药物成分中N-位脱硫酸肝素的量取决于疾病的性质和程度以及病人已接受治疗的情况。最终由处方医生决定给予病人多少剂量的N-位脱硫酸肝素。应注意的是：每千克体重可使用0.1微克-100毫克的药量。
在本发明应用的过程中，静脉给药的时间间隔可以不同，并视疾病的程度、病人的身体状况和特异反应而定。应注意的是：静脉注射N-位脱硫酸肝素的时间间隔为12-24小时，并由处方医生决定静脉治疗的合适时间间隔。
关于N-位脱硫酸肝素的毒理学实验正在进行中。
本发明优点
本发明是基于动物急性腹膜炎模型和动物流血模型的实验结果，结果显示N-位不同含硫量的N-位脱硫酸肝素的白细胞总数的抑制率介于52.1～70.9％之间(LMH的白细胞总数抑制率为54.4％)。N-位脱硫酸肝素的抗炎活性是优于或相当于低分子量肝素的抗炎活性，且具有低抗凝活性，从而提出N-位脱硫酸肝素在预防和治疗炎症中的应用。并从一系列N-位不同硫含量的N-位脱硫酸肝素中筛选得到具有最佳抗炎活性和最低抗凝血活性的样品，其抗炎活性显著优于国际上广泛采用的低分子量肝素，并且抗凝活性显著降低，这样就解决了临床上应用肝素或低分子量肝素来治疗炎症会引起病人的内出血的付作用这一难题，为临床上应用肝素类物质治疗各种炎症开辟了一条崭新的道路。
附图说明：
图1是急性腹膜炎的小鼠模型实验中进入小鼠腹腔的白细胞总数，淋巴细胞总数，单核细胞总数及颗粒细胞总数以及不同样品对炎症细胞渗出抑制情况示意图。
-  生理盐水组
+  阳性对照组
LMH低分子量肝素组
1，2，3，4，5，6，7，8是分别注射N-位硫相对含量为19.0％、17.0％、46.2％、11.0％、61.2％、71.0％、86.2％、64.0％的N-位脱硫酸肝素样品。
图2是小鼠流血模型实验检测抗凝血活性结果
Saline生理盐水组
LMH低分子量肝素组
1，2，3，4，5，6，7，8是分别注射N-位硫相对含量为19.0％、17.0％、46.2％、11.0％、61.2％、71.0％、86.2％、64.0％的N-位脱硫酸肝素样品。
图3是N-位脱硫酸肝素4号样品和低分子量肝素的抗凝血活性的浓度梯度实验图。
本发明通过下面的实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。
实施例1、肝素的化学修饰：
①，肝素N-位部分脱硫酸基团
肝素钠盐100mg首先充分溶解在250ul双蒸水(去离子)中，加入4.75ml的二甲基亚砜，50℃分别水浴2小时(样品4号)和1小时(样品1号)，20℃水浴3小时(样品3号)，反应结束加入同体积的双蒸水，然后用0.1N NaOH调pH至7.0终止反应[参阅Nagasawa and Inoue，Carbohydr.Res.36，265-271(1976)；Inoue and Nagasawa，Carbohydr.Res.46，87-95(1976)]。
将1号样品溶解在1N NaOH(终浓度为4％)，60℃水浴4小时后加1N盐酸调pH至中性，得到2号样品。将肝素吡碇盐溶解在1N NaOH中(终浓度为4％)，40℃水浴4小时(5号样品)和60℃水浴4小时(6号样品)。肝素钠盐溶解在1N NaOH溶液(终浓度为4％)，40℃水浴4小时(7号样品)和60℃水浴4小时(8号样品)，然后用1N盐酸调pH至7.0[Tiozzo et al.，Thromb.Res.70，99-106(1993)；Lloyd et al.，Biochem.Pharmacol.20，637-648(1971)]。
②，N-位脱硫酸肝素的纯化
将上述制得的粗品分别通过Amberlite IRA-400(强碱性阴离子交换树脂，Sigma)柱，去除从肝素链上游离的无机硫酸根离子，洗脱液加1NNaOH调pH值至7.0，然后经过Bio-gel P-2(Bio-Rad)分子筛脱盐、在214nm和230nm检测，洗脱液经干燥得到纯品。
实施例2激活部分凝血活酶时间的测定
使用健康志愿者的新鲜血液，3000RPM离心10分钟分离得到血清，然后加入一定量的肝素、低分子量肝素和N-位脱硫酸肝素，使用SilimatTM(bioMěieux sa)作为激活剂进行部分凝血活酶时间的测定(参照SilimatTM使用说明书)。测定6种系列浓度下的APTT值作出标准曲线，得到二倍APTT标准值所对应的肝素样品浓度，浓度越高，样品的抗凝血活性越低。
实施例3  N-位硫元素含量的测定
所用溶液及试剂：5％亚硝酸钠，33％乙酸，3.8％三氯乙酸，氯化钡-明胶试剂(1.0g明胶溶解在100ml双蒸水中，60℃水浴使之充分溶解，4℃放置过夜，再加入0.5g BaCl2充分溶解后过滤，室温放置至少4小时即可使用，一般使用时间不能超过一周)。
在0.5ml各种肝素样品中加入同体积的5％亚硝酸钠溶液和33％的乙酸，37℃反应1小时后加入4.5ml 13.8％三氯乙酸并迅速混匀，接着加入1.5ml氯化钡-明胶试剂并立即震荡片刻。放置20分钟后500nm测浊度。各种N-位脱硫酸肝素的N位硫元素的绝对含量是以K2SO4作为对照得到的；硫元素的相对含量是以未分级分离的肝素N位硫含量为100％计算得到。
实施例4  小鼠急性腹膜炎模型实验检测抗炎活性
Balb/c雄性小鼠，5周龄左右，体重15-16g购自中国科学院上海实验动物中心。阴性对照组8只，小鼠腹腔注射1ml生理盐水，15分钟后尾静脉注射0.2ml生理盐水；阳性对照组(12只)腹腔注射1ml3％巯基乙酸，15分钟后尾静脉注射0.2ml生理盐水；炎症抑制组(7-11只)小鼠腹腔注射1ml 13％巯基乙酸，15分钟后尾静脉注射0.2ml浓度为7.5mg/ml(1.5mg/mouse)的低分子肝素和各种N-位脱硫酸肝素。2小时后，眼球放血并用断头法处死小鼠，用8ml含10U/ml肝素冰浴的PBS清洗腹腔以收集全部的炎症细胞，然后1500转/分钟离心5分钟收集细胞，以血细胞分类计数仪CELL-DYN1700检测出总量白细胞、淋巴细胞、单核细胞、颗粒细胞的浓度，再乘以样品体积得到各种细胞的总数。
实验观察现象：
给予肝素样品的炎症抑制组，小鼠表现较活泼；阳性对照组小鼠呈现明显病态，活动能力差。
在静脉注射给药后，给予4号样品的小鼠尾巴针眼处流血时间短，血流量小。而给予低分子量和其它样品组小鼠尾巴针眼处流血时间长，血流量大：在收集小鼠腹腔内渗出的炎症细胞时，4号样品组无内出血现象，而低分子量肝素和其它样品组具有不同程度的内出血。这直接反映出4号样品在保留抗炎症活性的同时，其抗凝血活性显著降低。
抗炎活性的检测结果见图1。并在下列表2中列出小鼠腹膜炎模型炎症细胞渗出抑制百分率。
表2小鼠腹膜炎模型炎症细胞渗出抑制百分率
LMH(％)  1(％)  2(％)  3(％)  4(％)  5(％)  6(％)  7(％)  8(％)
白细胞总数 54.4  52.8  52.1  68.8  70.9  60.6  69.1  68.0  66.9
淋巴细胞总数 54.9  49.5  62.0  72.1  72.1  59  65.9  68.0  64
单核细胞总数 56.2  64.7  47.6  71.2  76.3  81.7  82  79.9  80.3
颗粒细胞总数 40.3  16.1  11.2  36.9  40.9  4.6  33.4  19.3  10.6
LMH低分子量肝素
1、2、3、4、5、6、7、8同表1中的肝素样品
各种N-位脱硫酸肝素都具有不同程度的抗炎活性，结果显示白细胞总数抑制率介于52.1～70.9％，淋巴细胞总数抑制率介于49.5～72.1％，单核细胞总数抑制率介于47.6％～82％，颗粒细胞总数抑制率介于10.6～40.9％，各种N-位脱硫酸肝素的抗炎活性优于或相当于国际上通用的低分子量肝素，其中，4号样品具有最佳抗炎活性。
实施例5  小鼠流血实验检测抗凝血活性
雄性昆明小鼠(Swiss)，5周龄，体重16克左右购于中国科学院上海实验动物中心，每个实验组9-11只小鼠。因环境温度对流血时间影响较大，所以整个实验过程严格控制在25℃±1条件下进行。小鼠尾静脉分别注射0.2ml 600微克/毫升(120μg/mouse，7.5mg/kg)的低分子量肝素和各种N-位脱硫酸肝素，15分钟后将小鼠固定在鼠笼中并用手术刀垂直切2毫米的尾巴尖，然后将其垂直浸在pH7.4的磷酸盐缓冲液中，并开始计流血时间。血流停止后30秒钟内未见重新流血，以此作为完全凝血的标准，若流血时间超过15分钟，则计时15分钟。结果见图2。结果显示在注射120微克/小鼠条件下，1，2，4样品组的流血时间比LMH组有显著缩短，较之生理盐水组略有延长。
实施例6  四号样品抗凝活性的浓度梯度实验
实验方法和实验条件如实施例5所述。尾静脉分别注射0.75mg/kg、2.5mg/kg、7.5mg/kg和22.5mg/kg的低分子量肝素和四号样品，即每个小鼠12微克、40微克、120微克和360微克。检测不同浓度条件下流血时间的延长情况。结果参见图3，结果表明，随着小鼠静脉给药量从12，40，120，360微克的增加，低分子量肝素组小鼠流血时间逐渐延长，而4号样品对小鼠流血时间无明显的延长，故可以得出结论：4号样品具有很低或无抗凝血活性。

Claims (9)

1、一种N-位脱硫酸肝素在制造预防和治疗炎症用药物中的应用，其特征在于N-位脱硫酸肝素中N-位硫相对含量是0.1-99.9％。
2、如权利要求1所述的应用，其特征在于所述N-位脱硫酸肝素是单独应用。
3、如权利要求1所述的应用，其特征在于所述N-位脱硫酸肝素是与细胞因子、淋巴因子或造血细胞生长因子-巨噬细胞集落刺激因子、粒性白细胞-巨噬细胞集落刺激因子，自然杀伤细胞集落刺激因子、白介素-1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12、粒状白细胞集落刺激因子、巨核细胞集落刺激因子以及促红细胞生成素联合应用。
4、如权利要求1所述的应用，其特征在于药物除含有N-位脱硫酸肝素外，还可包括药理上已被接受的载体、溶剂、填充物、盐、缓冲液和稳定剂。
5、如权利要求1所述的应用，其特征在于所述N-位脱硫酸肝素用于制备口服药物，肺吸入药物，表皮注射、皮下注射或静脉注射用制剂。
6、如权利要求1所述的应用，其特征在于所述N-位脱硫酸肝素用于制备静脉注射制剂。
7、如权利要求5所述的应用，其特征在于所述口服用药可制成片剂、胶囊、粉末或溶液的形式。
8、如权利要求7所述的应用，其特征在于口服用药制成片剂、胶囊、粉末时，含有5-95重量％的N-位脱硫酸肝素。
9、如权利要求7所述的应用，其特征在于口服用药制成溶液时，含有0.5-90重量％的N-位脱硫酸肝素。
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