ES2237959T3

ES2237959T3 - Inhibicion de la actividad del tnf con composiciones que comprenden heparina y receptores solubles del tnf.

Info

Publication number: ES2237959T3
Application number: ES99961268T
Authority: ES
Inventors: Dan Aderka; Eshed (Englender), Talma
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Priority date: 1998-12-30
Filing date: 1999-12-30
Publication date: 2005-08-01
Anticipated expiration: 2019-12-30
Also published as: PT1058544E; JP2002534375A; CA2322229C; DK1058544T3; ATE289506T1; DE69923832D1; US6608044B1; EP1058544B1; EP1058544A1; WO2000040225A2; IL127851A0; DE69923832T2; AU1796100A; IL138024A; AU780203B2; WO2000040225A3; CA2322229A1

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de heparina y/o un derivado de la misma, en combinación con al menos un receptor soluble de TNF (sTNF- R).

Description

Inhibición de la actividad del TNF con composiciones que comprenden heparina y receptores solubles del TNF.

Campo de la invención

La presente invención está dirigida a un método y a composiciones farmacéuticas para inhibir la actividad del factor de necrosis tumoral (TNF, en su abreviatura inglesa).

Antecedentes de la invención

El factor de necrosis tumoral (TNF) es una citoquina pro-inflamatoria producida por una extensa gama de células. Desempeña un papel clave en la defensa del hospedador, mediando complejas respuestas celulares de naturaleza diferente e, incluso, opuesta (Aggarwal et al., 1996). En exceso, el TNF puede tener efectos sistémicos perjudiciales. Dos receptores en la superficie celular de alta afinidad específica, el receptor de TNF p55 (TNF-R p55) y el receptor de TNF p75 (TNF-R p75), actúan como elementos de transducción, proporcionando la señal intracelular para las respuestas celulares al TNF. Las partes extracelulares de los receptores de TNF, conocidas como receptores solubles de TNF, se denominaron anteriormente TBP-I y TBP-II, respectivamente (véanse Wallach, patente de EE.UU. 5.359.037 y Tartaglia et al., 1992; Loetscher et al., 1991).

Los efectos biológicos del TNF dependen de su concentración y del sitio de producción. A concentraciones bajas, el TNF puede producir funciones homeostáticas y de defensa deseables. Por ejemplo, estos efectos pueden destruir células tumorales o células infectadas por virus, aumentando las actividades antibacterianas de los granulocitos. De esta forma, el TNF contribuye a la defensa del organismo contra agentes infecciosos y a la recuperación de lesiones. Sin embargo, a concentraciones superiores, de forma sistémica o en ciertos tejidos, el TNF puede actuar en sinergia con otras citoquinas, especialmente con la interleuquina-1, para agravar muchas respuestas inflamatorias. Adicionalmente, se sabe ahora que los efectos del TNF-\alpha, principalmente sobre el sistema vascular, constituyen una causa importante de choque séptico (Tracey et al., 1986). En algunas enfermedades, el TNF puede provocar una pérdida excesiva de peso (caquexia) al suprimir las actividades de los adipocitos y generando anorexia.

Se ha puesto de manifiesto que el TNF induce las siguientes actividades (junto con la interleuquina-2): fiebre, sueño de ondas lentas (no-REM), choque hemodinámico, incremento de la producción de proteínas de fase aguda, reducción de la producción de albúmina, activación de células endoteliales, aumento de la expresión de las principales moléculas de los complejos de histocompatibilidad, disminución de la lipoproteína lipasa, descenso del citocromo P450, reducción del cinc y hierro en plasma, proliferación de fibroblastos, aumento de la colagenasa de las células sinoviales, incremento de la actividad de la ciclo-oxigenasa, activación de células T y células B, e inducción de la secreción de las citoquinas, incluido el propio TNF, interleuquina-1 e interleuquina-6.

Debido a sus efectos pleiotrópicos, se ha implicado al TNF en una serie de estados patológicos en muchos órganos diferentes del cuerpo. En los vasos sanguíneos, el TNF estimula el choque hemorrágico, regula negativamente la trombo-modulina de las células endoteliales, y potencia una actividad pro-coagulante. Causa la adhesión leucocitaria y, probablemente, también plaquetaria, a las paredes de los vasos sanguíneos, pudiendo provocar, de esta forma, procesos que conducen a la aterosclerosis, así como a la vasculitis.

El TNF activa las células sanguíneas y determina la adhesión de neutrófilos, eosinófilos, monocitos/macrófagos y linfocitos T y B. Mediante la inducción de interleuquina-6 e interleuquina-8, el TNF aumenta la quimiotaxia de las células inflamatorias y su penetración en los tejidos. De este modo, el TNF desempeña una función en el daño de tejidos en enfermedades autoinmunes, alergias y rechazo de injertos.

El TNF se ha denominado también caquexina, porque modula las actividades metabólicas de los adipocitos y contribuye al deterioro y a la caquexia que acompañan al cáncer, infecciones crónicas, insuficiencia cardiaca crónica e inflamación crónica. Asimismo, el TNF puede tener alguna función en el daño de tejidos generado por enfermedades autoinmunes, alergias y rechazo de injertos.

Del mismo modo, el TNF ejerce efectos metabólicos sobre el músculo esquelético y cardiaco. También tiene efectos marcados sobre el hígado: reduce el metabolismo de la albúmina y del citocromo P450 y aumenta la producción de fibrinógeno, de la glucoproteína ácido \alpha (AGP) y otras proteínas de fase aguda. Puede provocar necrosis intestinal.

En el sistema nervioso central, el TNF atraviesa la barrera hematoencefálica e induce fiebre, aumento del sueño y anorexia. Se asocia, asimismo, la alta concentración de TNF a la esclerosis múltiple. También causa hemorragia suprarrenal y afecta a la producción de hormonas esteroides, potencia la colagenasa y la PGE-2 en la piel y determina la degradación del tejido óseo y del cartílago por la activación de osteoclastos.

De esta forma, el TNF interviene en la patogenia de muchos trastornos inflamatorios indeseables, en las enfermedades autoinmunes, el rechazo de injertos, la vasculitis y la aterosclerosis. Parece tener un papel en la insuficiencia cardiaca, en la respuesta al cáncer y en la anorexia nerviosa. Por estas razones, se han investigado medios para inhibir la actividad del TNF como forma para controlar una diversidad de enfermedades.

Durante la exploración de vías para antagonizar el potencial destructivo del TNF en determinados trastornos clínicos, los investigadores analizaron inhibidores naturales del TNF (Engelmann et al., 1989; Engelmann et al., 1990; Seckinger et al., 1989; Olsson et al., 1989). Estos agentes, detectados por primera vez en la orina, eran estructuralmente idénticos a los dominios extracelulares que fijan citoquinas de los dos receptores de TNF (TNF-R) asociados a membrana (Nophar et al., 1990). Estos TNF-R solubles excretados (sTNF-R) pueden competir por el TNF con los receptores de la superficie celular, bloqueando de esta forma la actividad de la citoquina.

No obstante, las interacciones entre los TNF-R y su ligando son mucho más complejas que lo que se pensaba inicialmente. A concentraciones fisiológicas, las moléculas trímeras y bioactivas del TNF se degradan, disociándose en formas monómeras inactivas (Petersen et al., 1989; Aderka et al., 1992). La adición de sTNF-R a los trímeros de TNF potencia la formación de complejos entre ellos, lo que puede prevenir y evitar la degradación de las formas trímeras, activas, de TNF (Aderka et al., 1991; De Groote et al., 1993). Este TNF bioactivo se puede disociar de este complejo para reemplazar al TNF libre que se ha degradado, manteniendo de este modo una concentración constante de la citoquina libre, bioactiva y trímera. Esta interacción reversible entre los receptores solubles y sus ligandos amplía las funciones atribuibles a los receptores de RNF. En su forma soluble, los TNF-R pueden actuar como:

(a): antagonistas de TNF (cuando se hallan presentes en gran exceso en relación con el TNF);

(b): proteínas portadoras de TNF (entre compartimientos del organismo);

(c): depósitos de liberación lenta de TNF bioactivo;

(d): estabilizadores de la forma bioactiva de TNF (que pueden prolongar también la semivida del TNF); y

(e): "tampones" de TNF, al inhibir los efectos de las concentraciones elevadas de TNF y presentarlo a niveles bajos y bien controlados a las células (Aderka et al., 1992).

Las funciones de los receptores de TNF, por lo tanto, no están limitadas a señalar la transducción, sino que incluyen, en sus formas solubles, funciones reguladoras extracelulares que afectan a la disponibilidad local y sistémica de TNF bioactivo.

TNF y enfermedades

El examen de pacientes con choque séptico debido a la presencia en sangre de meningococos reveló que la relación de TNF/sTNF-R fue superior en pacientes con un desenlace fatal, en comparación con los pacientes que se recuperaron, lo que sugiere un desequilibrio crítico entre el ligando y sus inhibidores (Girardin et al., 1994). La siguiente etapa preferida pareció ser la neutralización del exceso de TNF.

De hecho, se observó que las construcciones de fusión Fc del sTNF-R p55, pero no del sTNF-R p75, protegen a los ratones contra dosis letales de LPS (Evans et al., 1994), si se administran no más tarde de 1-3 horas después de la LPS (Peppel et al., 1991; Moler et al., 1993; Ashkenazi et al., 1991; Lesslauer et al., 1991). Esto sugiere que las manifestaciones del choque séptico se producen si las concentraciones altas iniciales de TNF generadas no se tamponan mediante concentraciones adecuadas de receptor soluble durante este reducido período de tiempo.

Para agravar la creciente confusión, la neutralización de TNF con anticuerpos (Ab) monoclonales anti-TNF (Abraham et al., 1995; Kaul et al., 1996), o IgGI de sTNF-R p55 (Leighton et al., 1996) en pacientes con sepsis grave o choque séptico, proporcionó resultados contradictorios. En un estudio, los anticuerpos demostraron ser ineficaces (Abraham et al., 1995), en tanto que en el otro, la administración de los anticuerpos benefició sólo a aquellos pacientes con
niveles iniciales de interleuquina-6 mayores que 1000 pg/ml, pero elevó la mortalidad en los que presentaban niveles más reducidos de interleuquina-6 (Kaul et al., 1995). En otro ensayo aleatorio, los pacientes con sepsis que recibieron un dímero recombinante consistente en sTNF-R/porción Fc de IgGI tuvieron una mortalidad superior (48-53%) comparados con los pacientes tratados con placebo (30%) (Suffredini et al., 1994; Fisher et al., 1996). Es interesante desta-
car que mientras más alta fue la dosis de sTNF-R administrada, mayor fue la mortalidad de los pacientes (Fisher et al., 1996). Se sospechó que la eliminación efectiva de TNF circulante puede tener como consecuencia una exacerbación de la infección sistémica (Fisher et al., 1996). Por el contrario, en un estudio reciente, la administración de construcciones similares de receptor de Fc soluble benefició aparentemente a los pacientes con sepsis, independientemente de sus concentraciones séricas de interleuquina-6, con una reducción de la mortalidad de 36% en comparación con los individuos tratados con placebo (Leighton et al., 1996). Estos datos contradictorios dan la impresión de que la administración de sTNF-R puede tener un índice terapéutico muy estrecho, que sería difícil de individualizar a pie de cama. Un exceso de receptores puede neutralizar por completo el TNF, exacerbando la infección sistémica, en tanto que una cantidad excesivamente pequeña de receptores puede no neutralizar suficiente TNF, dando lugar a un choque séptico y a la muerte del paciente. El verdadero desafío consiste en ajustar la dosis de sTNF-R para permitir que niveles bajos de TNF ejerzan sus efectos protectores. De este modo, paradójicamente, dosis menores de sTNF-R que las empleadas anteriormente (Fisher et al., 1996), y no mayores, podrían resultar beneficiosas en el paciente con choque séptico.

Puesto que la neutralización del TNF no debe ser completa, sino que debe dirigirse a dejar bajas cantidades de TNF bioactivo para ejercer los efectos beneficiosos deseados, los receptores solubles de TNF naturales pueden ser especialmente adecuados para este objetivo.

El TNF es, asimismo, una citoquina clave en la patogenia de la Enfermedad de Crohn, un trastorno crónico e incapacitante del intestino y, por consiguiente, representa una diana principal de la terapia inmunológica específica (Braegger et al., 1992; MacDonald et al., 1990; Breese et al., 1994). De hecho, el tratamiento de pacientes con Enfermedad de Crohn con anticuerpos monoclonales anti-TNF quiméricos indujo una remisión espectacular en pacientes que no respondían a terapias convencionales (van Dullemen et al., 1995). Falta por establecer si las preparaciones de liberación retardada de sTNF-R (Eliaz et al., 1996) tendrán efectos idénticos sobre la evolución de esta enfermedad.

En otra enfermedad autoinmunológica, la artritis reumatoide, se ha demostrado que los sTNF-R séricos pueden ser de utilidad para monitorizar la actividad de la enfermedad (Cope et al., 1992; Roux-Lombard et al., 1993). Se ha demostrado que, a pesar de la presencia de niveles elevados de inhibidores del TNF en articulaciones afectas de artritis reumatoide, estos inhibidores eran insuficientes para neutralizar la actividad del TNF (Cope et al., 1992). En un ensayo doble ciego y aleatorio, en el que se comparó la administración de anticuerpos monoclonales anti-TNF quiméricos a pacientes con artritis reumatoide, dio como resultado una impresionante remisión clínica (Levine et al., 1994). Recientemente, se ha demostrado que la incorporación de los sTNF-R a sistemas polímeros, tales como copolímeros de etileno-acetato de vinilo o al poli(ácido láctico-glicólico) y a sus inyecciones subcutáneas, puede proporcionar sTNF-R p55 sistémico natural a concentraciones elevadas, a una velocidad constante durante períodos prolongados (más de un mes) (Eliaz et al., 1966). Por lo tanto, es posible que los sTNF-R demuestren ser terapéuticamente eficaces también en el tratamiento de la artritis reumatoide.

TNF, TNF-R y el corazón

Se han detectado concentraciones elevadas de TNF y de sus receptores solubles en el suero de pacientes con insuficiencia cardiaca (Levine et al., 1990). El TNF puede contribuir a la contracción miocárdica alterada en este trastorno, puesto que se demostró que producía una depresión significativa de la contracción miocítica (Cunnion, 1990). Adicionalmente, corazones enteros prefundidos con suero de animales tratados con TNF 18 a 22 horas antes, exhibieron alteraciones importantes y un ritmo reducido de relajación, comparados con los controles (Demueles et al., 1992). Efectos similares de depresión del miocardio se pueden producir, posiblemente, por la exposición continua del corazón a TNF circulante en pacientes con insuficiencia cardiaca (Levine et al., 1990). La neutralización de la citoquina con sTNF-R puede ser de utilidad en el tratamiento de la insuficiencia cardiaca.

Inhibición del TNF

Se ha informado de que la heparina fija TNF (Lantz et al., 1991). Sin embargo, nunca se ha examinado la importancia de esta observación. Los efectos de la heparina parecen ser exactamente opuestos a los del TNF, como se demuestra en la Tabla I de Lantz et al.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona el uso de heparina, y/o un derivado de la misma, en combinación con un receptor soluble de TNF, en la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la bioactividad del TNF.

La presente invención proporciona, igualmente, composiciones farmacéuticas, que comprenden heparina y/o un derivado de la misma, en combinación con al menos un receptor soluble de TNF, para inhibir la bioactividad del TNF.

La invención proporciona, adicionalmente, un kit para la administración simultánea o secuencial de dicha composición, que comprende los ingredientes activos junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, e instrucciones para su uso.

Se ha observado que la heparina y las heparinas de bajo peso molecular inhiben la bioactividad de la citoquina TNF, en particular cuando actúan con otra proteína que se une al TNF. La heparina es una proteína natural de fijación al TNF y, probablemente, reticula el TNF a sus receptores TNF p55 y TNF p75. Esto inhibe la bioactividad de la citoquina TNF al interferir, presuntamente, con la trimerización de los receptores de TNF. Los presentes inventores utilizan la anterior teoría de acción, sin estar limitados por ella. Por consiguiente, mediante la administración de heparina o un derivado de la misma, junto con un receptor soluble de TNF, se inhibe la bioactividad del TNF y resulta posible tratar con éxito los trastornos causados por un exceso de TNF. La heparina, o su derivado, se puede administrar simultáneamente con el receptor de TNF, ya sea en composiciones separadas o en composiciones que contienen tanto heparina o un derivado de la misma, y al menos un receptor soluble de TNF.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A y 1B son gráficos que muestran la inhibición de la actividad de TNF mediante heparina (Fig. 1A) y Clexane® (Fig. 1B).

La Figura 2 es un gráfico que muestra el efecto del tratamiento previo de células con heparina sobre la citotoxicidad del TNF, en función del tiempo que las células estuvieron expuestas a heparina antes de la adición de TNF a la heparina.

Las Figuras 3A y 3B muestran la influencia de la separación del sobrenadante sobre el efecto citotóxico del TNF.

La Figura 4A muestra las interacciones de heparina con sTNF-R p55 y TNF.

La Figura 4B muestra las interacciones de Clexane® con sTNF-R p55 y TNF.

La Figura 5A muestra la interacción de heparina con sTNF-R p75 y TNF.

La Figura 5B muestra las interacciones de Clexane® con sTNF-R p75 y TNF.

La Figura 6A muestra el efecto de la adición de heparina a diferentes tiempos tras la aplicación de TNF.

La Figura 6B muestra el efecto de la adición de Clexane® a diferentes tiempos tras la aplicación de TNF.

La Figura 7 ilustra las interacciones entre TNF, receptores solubles de TNF y heparina o heparina de bajo peso molecular.

La Figura 8 muestra el equilibrio entre TNF y sus receptores solubles.

Descripción detallada de la invención

Se ha descubierto que la heparina o la heparina de bajo peso molecular es capaz de potenciar el efecto de los sTNF-R, aparentemente de forma sinérgica y no solamente aditiva.

La heparina es un glicosaminoglicano, un mucopolisacárido altamente sulfatado, consistente en una serie heterogénea de unidades repetidas de disacáridos, compuestas por ácido D-glucurónico o L-idurónico, en un enlace 1,4-glicosídico a la glucosamina. Cada una de las unidades repetidas contiene dos ésteres sulfato y un grupo N-sulfato. La heparina es la sustancia ácida orgánica con carga aniónica más potente jamás aislada de un sistema biológico vivo. La heparina se presenta en muchos tejidos diferentes del organismo, pero los pulmones, el tracto intestinal, el hígado y los mastocitos son particularmente ricos en heparina. La heparina es una familia de polímeros lineales que difieren en longitud de cadena y peso molecular, y se desconoce su composición completa precisa.

Comercialmente, la heparina se extrae de tejidos animales, muy frecuentemente de pulmones bovinos y de la mucosa intestinal de las especies bovina, ovina, porcina y caprina. En cualquier vial de heparina empleada en terapia, hay presente una amplia gama de especies moleculares, que van desde 2.000 hasta 25.000 daltons. La potencia de la heparina se define en unidades, siendo una unidad la cantidad de heparina que impedirá la coagulación de sangre de oveja por un proceso de recalcificación. Diversos extractos de heparina pueden variar en potencia, es decir, 1 mg en peso puede variar en potencia desde 80 hasta 170 unidades. La Organización Mundial de la Salud conserva los estándares de referencia para la heparina.

La heparina muestra un efecto inhibitorio sobre la cascada de coagulación de la sangre por medio de al menos dos mecanismos diferentes. En primer lugar, cuando la heparina forma complejos con residuos de lisina de la antitrombina III de alta afinidad, en una manera estequiométrica 1:1, el efecto inhibitorio de la serin-proteasa de la antitrombina III se potencia varias veces. En segundo lugar, debido a su elevada densidad de carga polianiónica, la heparina es capaz de neutralizar el efecto de las serina-proteasas coagulantes de la glucoproteína activada, con carga positiva. La heparina induce también la lipoproteína lipasa y la degradación por histaminasa de la histamina, poseyendo, asimismo, propiedades antiinflamatorias.

La heparina se ha utilizado extensamente desde mediados de la década de 1940 para la prevención profiláctica y el tratamiento de enfermedades trombóticas tales como trombosis venosa profunda, embolia pulmonar e infarto de miocardio. Otro empleo principal de la heparina consiste en la prevención de la coagulación de la sangre en sistemas extra-corpóreos, haciendo posible, de esta forma por ejemplo, la diálisis renal; la cirugía de by-pass cardiaco; los trasplantes de corazón, pulmón, hígado y riñón; la oxigenación de by-pass pulmonar extra-corpórea; y la ultrafiltración de membrana circulatoria extra-corpórea. Se utilizan dosis bajas de heparina de bajo peso molecular en la prevención profiláctica de la formación de trombos intravasculares. Se han utilizado, asimismo, fragmentos, péptidos y péptidos preparados sintéticamente de heparina.

En modelos animales, se ha demostrado que la heparina reduce la capacidad de los linfocitos T autoinmunes para alcanzar su órgano diana (Lider et al., 1990). También se ha demostrado que la heparina suprime enfermedades autoinmunes experimentales en la rata y que prolonga la supervivencia de los aloinjertos en un modelo de trasplante de piel en el ratón, cuando se le utiliza a dosis bajas de aproximadamente 5 microgramos en el ratón y de 20 microgramos en la rata, inyectadas una vez al día (Lider et al., 1989).

Se estima que los mecanismos subyacentes a los efectos observados de la heparina implican la inhibición de la liberación por parte de los linfocitos T de la o las enzimas necesarias para la penetración en la pared vascular, fundamentalmente la enzima heparanasa, que ataca específicamente el resto glicosaminoglicano de la matriz extracelular sub-endotelial, que reviste los vasos sanguíneos (Naparstek et al., 1984). La expresión de la enzima heparanasa se asocia con la capacidad de los linfocitos T autoinmunes para penetrar en las paredes de los vasos sanguíneos y para atacar el cerebro en el modelo de enfermedad experimental de la encefalomielitis autoinmune.

Las heparinas de bajo peso molecular, con un peso molecular medio de 3000-6000, tales como, por ejemplo, las heparinas de bajo peso molecular descritas en la Patente Europea EP0014184, derivan de la heparina. Algunas heparinas de bajo peso molecular están disponibles en el comercio bajo diferentes marcas comerciales, tales como Fragmin®, véase la Patente de EE.UU. No. 4.303.651, Fraxiparin®, Fraxiparine®, véanse las Patentes de EE.UU. Nos. 4.486.420 y 4.692.435, Lovenox®, véase la Patente Europea 40144, y Clexane®, véase la Patente de EE.UU. No. 3.948.917.

Las heparinas de bajo peso molecular se pueden producir por diferentes formas: enriquecimiento por fraccionamiento por etanol y/o criba molecular, por ejemplo, filtración sobre gel o filtración de membrana de la heparina de bajo peso molecular presente en la heparina estándar, y depolimerización química (por ácido nitroso, eliminación de wbw u oxidación con peryodato) o enzimática (por heparinasa) controlada. Las condiciones para la depolimerización se pueden controlar cuidadosamente para proporcionar productos con pesos moleculares deseados. Con frecuencia, se utiliza la depolimerización por ácido nitroso. Asimismo, el éster bencílico de heparina se puede depolimerizar por eliminación de wbw, que ofrece el mismo tipo de fragmentos que la depolimerización enzimática que utiliza heparinasas. Se puede preparar heparina de bajo peso molecular, con baja actividad anticoagulante, que conserva la estructura química básica de la heparina, por depolimerización utilizando oxidación por peryodato, o mediante la separación de la fracción que se fija a la antitrombina de la heparina de bajo peso molecular, preparada por otros métodos, empleando antitrombina inmovilizada para adsorción.

Fragmin® es una heparina de bajo peso molecular, con un peso molecular en el intervalo de 4000-6000 daltons, producida por depolimerización con ácido nitroso de la heparina sódica obtenida de la mucosa intestinal porcina. La fabrica Kabi Pharmacia, Suecia, bajo la marca Fragmin® para ser utilizada como agente antitrombótico, como soluciones salinas inyectables en jeringuillas monodosis de 2500 UI/0,2 ml y 5000 UI/0,2 ml, correspondientes a aproximadamente 16 mg y 32 mg, respectivamente.

Fraxiparin® y Fraxiparine® son heparinas de bajo peso molecular con un peso molecular medio de aproximadamente 4500 daltons, preparadas por fraccionamiento o depolimerización por ácido nitroso controlada, respectivamente, de heparina cálcica procedente de la mucosa intestinal porcina. Estas heparinas de bajo peso molecular están fabricadas por Sanofi (Choay Laboratories) y se utilizan como agentes antitrombóticos a dosis únicas que comprenden aproximadamente 36 mg, correspondientes a 3075 UI/0,3 ml de agua.

Lovenox® (enoxaparín/a), un fragmento de heparina de bajo peso molecular, producida por depolimerización de heparina sódica procedente de la mucosa intestinal porcina, empleando la eliminación de wbw, está fabricada por Pharmuka SF, Francia, y distribuida por Rhône-Poulenc bajo las marcas Clexane® y Lovenox®. Se las utiliza como agentes antitrombóticos en jeringuillas monodosis que comprenden 20 mg/0,2 ml y 40 mg/0,4 ml de agua.

Las heparinas de bajo peso molecular, preparadas por fraccionamiento o depolimerización controlada de heparinas, muestran un mejor rendimiento antitrombótico, así como diferentes propiedades farmacocinéticas en comparación de la heparina. La semivida se duplica y la biodisponibilidad es mayor con respecto a su efecto anticoagulante tras la inyección subcutánea (Bratt et al., 1985; Bone et al., 1987).

Las propiedades de las heparinas de bajo peso molecular anteriormente descritas son una característica común de todas las heparinas de bajo peso molecular, independientemente del procedimiento de fabricación, de las diferencias estructurales (creadas por depolimerización o las dependientes de variaciones en la heparina utilizada como materia prima), o de la actividad anticoagulante, siempre que la heparina de bajo peso molecular usada sea capaz de inhibir la secreción de TNF in vitro por parte de células T y/o macrófagos en reposo, en respuesta a la activación por el contacto con antígenos específicos, mitógenos, una matriz extracelular degradada o sus componentes proteicos, tales como fibronectina o laminina.

Para ensayar la eficacia inhibitoria de la actividad del TNF (véanse los Ejemplos 1 y 2), se sembraron células WISH a una concentración de 30.000 células por pocillo en 100 \mul de medio. 16 horas más tarde, cuando las células habían alcanzado una confluencia de aproximadamente 90%, se agregaron a los pocillos TNF, receptores, heparina, o Clexane®. Las concentraciones finales agregadas a los correspondientes pocillos fueron las siguientes:

: TNF, 0,5 ng/ml,

: Heparina, 1 unidad/ml,

: Clexane®, 1 unidad/ml

: TBPI (receptor de TNF p55), 5 ng/ml,

: TBPII (receptor de TNF p75), 10 ng/ml.

Las diferentes combinaciones se mezclaron en un tubo de Eppendorf, alcanzando un volumen final de 300 \mul. Seguidamente, se agregaron 50 \mul al correspondiente pocillo. En caso de requerirse incubación, ésta se llevó a cabo en el tubo de Eppendorf durante 30 min a 37ºC, en mezcla o por separado. Después de la adición de cada una de las diferentes combinaciones, se agregaron 50 \mul de cicloheximida a cada pocillo. 16 horas más tarde, se descartaron los sobrenadantes celulares y se agregó tinción de rojo neutro durante 1 hora a 37ºC. La tinción se extrajo de las células supervivientes con una solución de Sorensen y los resultados se determinaron en un lector de ELISA.

La adición de 1 unidad/ml de heparina a 0,5 ng/ml de TNF demostró que tenía aproximadamente 25% de la biodisponibilidad de TNF (es decir, una reducción de la citotoxicidad desde 49% a 37%), como se muestra en la Fig. 1A. Clexane® tuvo un efecto muy similar, como se ve en la Fig. 1B. Por consiguiente, tanto la heparina como Clexane®, una heparina de bajo peso molecular, inhibieron la toxicidad de TNF.

Se cree que la heparina interfiere con la fijación celular del TNF. Como se detalla en el Ejemplo 3, se pretrataron células WISH con heparina entre 0 y 30 min antes de la adición de TNF. Este pretratamiento inhibió de manera sustancial la citotoxicidad del TNF, como se ve en la Fig. 2. El efecto inhibitorio de la heparina se expresó de inmediato (en el tiempo 0), lo que sugiere que no se debe a un efecto metabólico que induce resistencia celular al TNF.

Las posibles explicaciones de este fenómeno son:

(1): la heparina puede unirse a receptores de TNF (receptores en la superficie celular o solubles), interfiriendo con la fijación del TNF a sus receptores.

(2): La heparina no afecta a los receptores de TNF. Puede formar complejos con el TNF en el momento en que se aplica, y/o puede interferir con la fijación de ligandos a receptores asociados a las células, impidiendo que el TNF induzca la trimerización de los receptores, que es un requisito previo para la transducción de señales.

Como se ve en el Ejemplo 4, la eliminación de la heparina o de la heparina de bajo peso molecular del sobrenadante, elimina de inmediato su efecto protector contra la citotoxicidad del TNF. De este modo, la presencia de heparina o de heparina de bajo peso molecular es necesaria para inhibir la actividad del TNF. Los polisacáridos no generan un estado metabólico de resistencia en las células pretratadas con estos polisacáridos. No existe afinidad entre la heparina o la heparina de bajo peso molecular y los elementos de la membrana celular, tales como los receptores de TNF, puesto que el simple lavado mecánico la elimina prácticamente por completo y anula los efectos inhibitorios sobre el
TNF.

Por lo tanto, se puede suponer que, dado que el "efecto celular" de la heparina se puede eliminar, es probable que el efecto inhibitorio del TNF de la heparina se deba a su adherencia al TNF, impidiendo su asociación con los TNF-R de la membrana celular o interfiriendo con ella.

Como se explica en el Ejemplo 5, el examen de la unión de la heparina o de Clexane® a los receptores solubles de TNF o al complejo de TNF/TNF-R, puso de manifiesto lo siguiente en relación con las Figs. 4 y 5:

(1) La preincubación de TNF con heparina o Clexane® durante 30 min, y su aplicación a células WISH, potenció adicionalmente su efecto inhibitorio del TNF, en comparación con sus aplicaciones sin preincubación (véanse las Figs. 4A, 4B, 5A, 5B, columnas 3 frente a 6). Parece existir un fenómeno de interferencia. Tras la preincubación con heparina o heparina de bajo peso molecular, se fija más TNF al polisacárido, lo que puede interferir con la fijación de TNF a sus receptores asociados a las células. Una explicación alternativa es que la heparina puede estimular la disociación del trímero activo en monómeros inactivos.

(2) En tanto que sTNF-R p55 o sTNF-R p75, por sí solos, pudieron inhibir aproximadamente 8-15% de la bioactividad de TNF, la adición de heparina o de Clexane® al TNF y a ambos receptores potenció la inhibición, por parte de los receptores, en 3-4 veces (60% de inhibición). Véanse las Figs. 4 y 5, columnas 2, 4 y 5.

De esta forma, la heparina o la heparina de bajo peso molecular puede aumentar la fijación de TNF-R soluble a TNF, potenciando tres o cuatro veces el efecto neutralizante de sTNF-R p55 y sTNF-R p75. Parece ser que el polisacárido reticula el TNF a sus receptores. Aunque la conclusión de que la heparina evita la fijación del TNF a sus receptores asociados a las células, y la conclusión de que la heparina aumenta esta fijación a los receptores solubles, parece contradictoria y paradójica, ambas situaciones dan como consecuencia una inhibición de la bioactividad del TNF y pueden coexistir.

(3) La preincubación simple de sTNF-R p55 con TNF, a diferencia de su preincubación con sTNF-R p75, dio como resultado una inhibición superior de TNF, como se demuestra en las Figs. 4A y 5A, y 4B y 5B, comparando las columnas 4 y 7. Esto puede estar relacionado con efecto de "paso de ligandos" del sTNF-R p75.

(4) Una preincubación de 30 min de TNF con sTNF-R p55/sTNF-R p 75 y heparina/Clexane® tuvo como consecuencia prácticamente la misma inhibición de TNF que se observó cuando se aplicaron los tres componentes sobre células sin preincubación (véanse las Figs. 4 y 5, comparando las columnas 5 a 8). En base a este hecho, es posible concluir que la interacción entre TNF, receptor soluble y heparina es instantánea, a diferencia de la interacción de TNF-heparina, que aumenta con el tiempo, como se ha demostrado anteriormente. Esto indica que la tendencia natural del TNF a unirse instantáneamente a su receptor puede ir seguida de una rápida reticulación del complejo formado por heparina/Clexane®.

(5) Se preincubó TNF con heparina/Clexame® durante 30 min e, inmediatamente antes de su aplicación a las células, se agregó sTNF-R p55 o sTNF-R p75, respectivamente. La citotoxicidad de TNF observada fue superior en comparación con la preincubación simultánea de los tres componentes, como se ve en las Figs. 4 y 5, comparando las columnas 8 a 9. Una posible explicación es que, durante la incubación de TNF+heparina/Clexane®, el polisacárido formó un complejo con el TNF, interfiriendo con su fijación a los receptores solubles tras su adición posterior. Puesto que el TNF libre, la heparina y sus complejos se encontraban en equilibrio, la eliminación de TNF libre mediante la adición de receptores solubles dio como resultado la disociación de los complejos de TNF/polisacárido con el fin de recuperar el equilibrio, y el TNF libre tuvo la misma oportunidad de fijarse a los receptores solubles que a los receptores celulares, y activarlos. La hipótesis de la interferencia de heparina/Clexane® con la fijación de TNF a sus receptores se refuerza al comparar la columna 9 con la columna 5 en las Figs. 4 y 5.

(6) La preincubación durante 30 min de sTNF-R p55 o sTNF-R p75 con heparina/Clexane® y la adición de TNF inmediatamente antes de su aplicación a las células, como se muestra en las Figs. 4A y 5A, y 4B y 5B, dio como resultado una inhibición de TNF idéntica a la obtenida por la adición simultánea de los tres componentes a las células (columna 5), o tras su preincubación conjunta durante 30 min (columna 8). Se puede concluir de ello que el polisacárido no interfiere con la fijación del receptor de TNF al TNF, y que carece de afinidad por el receptor de TNF "desnudo". Sin embargo, heparina/Clexane® muestran una fuerte afinidad por el complejo de TNF/receptor de TNF, al que reticula de forma potente. De este modo, dado que heparina/Clexane® carecen de afinidad por los receptores de TNF solubles "desnudos", la posibilidad de eliminar el "efecto celular" de heparina/Clexane®, que se muestra en la Fig. 2, es consistente con la conclusión de que heparina/Clexane® carece de afinidad también por los receptores "desnudos" asociados a las células.

(7) La inhibición de TNF tras su preincubación con su sTNF-R p55 y la adición de heparina/Clexane® inmediatamente antes de su aplicación a las células, fue mejor (Figs. 4A y 4B, columna 11) que la inhibición obtenida tras la preincubación de TNF con sTNF-R p55 solo, como se demuestra por una comparación de las Figs. 4A y 4B, columnas 7 y
11. Ello sugiere que heparina/Clexane® facilitan, adicionalmente, la inhibición de TNF por sTNF-R p55, probablemen-
te por su reticulación. Es de destacar que tras la adición de heparina/Clexane®, la inhibición de TNF por sTNF-R p75 fue mejor (20-25%) que la inhibición por sTNF-R p55 (15%). Esto se puede ver comparando las Figs. 4A y 4B, colum-
nas 7 y 11, con las Figs. 5A y 5B, columnas 7 y 11. Heparina/Clexane® potencian la fijación del TNF a sus sTNF-R p55 y sTNF-R p75. La mayor inhibición de TNF con sTNF-R p75, en presencia del polisacárido, puede estar relacio-
nada con la prevención del "paso de ligandos" mediante sTNF-R p75 cuando heparina/Clexane® lo reticulan a TNF.

Heparina/Clexane® potencian la fijación de TNF a sus receptores solubles, aumentando de esta forma su efecto inhibitorio de TNF. Sin embargo, cabría esperar que una fijación potenciada de manera similar a los receptores asociados a las células, que se muestra en las Figs. 4 y 5, comparación de la columna 2 con 3, diera como resultado una citotoxicidad aumentada de TNF. En la práctica, no obstante, la citotoxicidad del TNF resultó inhibida.

Una explicación teórica de esta aparente paradoja es que heparina/Clexane® potencian la reticulación del trímero de TNF bioactivo a sólo uno o dos receptores de TNF, interfiriendo de este modo con la fijación del tercer receptor al mismo. La estimulación de esta fijación a receptores solubles de TNF neutraliza la bioactividad de TNF. Evidentemente, el estímulo de la fijación de TNF a sólo uno o dos receptores de la superficie celular, mientras se interfiere con la agregación final de receptores en trímeros, explica la paradoja anterior, puesto que la transducción de señales se genera de forma óptima tras la agregación de tres receptores de la superficie celular. Después de la reticulación de un receptor de la superficie celular a TNF por medio de heparina/Clexane®, el polisacárido puede quedar interpuesto, de forma que pueda evitar la posterior trimerización de receptores de TNF de la superficie celular. Por otra parte, si el TNF hubiera inducido ya la trimerización de los receptores, la heparina no es capaz de reticular este complejo ni de interferir con su función. Esta puede ser la clave para la inhibición del TNF por medio de este polisacárido.

En apoyo de la explicación anterior, se observó la existencia de un efecto paradójico en los experimentos. En los ensayos en los que se utilizaron cantidades menores de receptores solubles, caracterizados por una mínima (menos de 10%) inhibición del TNF, el efecto potenciador de heparina/Clexane® fue máximo (más de 60% de inhibición). En experimentos en los que los receptores provocaron una inhibición de 50%, heparina/Clexane® tuvieron un efecto potenciador marginal.

Parece ser que con cantidades muy bajas de receptores solubles, la mayoría de los trímeros de TNF pueden producir complejos con sólo un receptor soluble. Estos complejos son la diana probable de la reticulación de heparina/Clexane® que tiene como consecuencia una marcada inhibición de TNF. Si la cantidad de receptores solubles es mayor, dos o más receptores solubles pueden unirse al TNF, impidiendo la reticulación efectiva de estos complejos por el polisacárido. Falta por demostrar si estos complejos no resultan estabilizados por heparina/Clexane® en la misma medida que lo son los complejos de TNF y los receptores solubles monómeros.

La comparación de las columnas 5 a 11 de las Figs. 4 y 5 aportan importantes pruebas de apoyo a que la reticulación de heparina/Clexane® puede estar limitada a complejos de TNF con uno o, como máximo, dos receptores. Si se alcanza un equilibrio entre TNF+sTNF-R p55 con la formación de complejos de TNF con uno, dos o tres receptores, agregando seguidamente heparina/Clexane® (columna 11), la citotoxicidad de TNF se potencia en comparación con la adición simultánea del TNF, sus receptores y heparina sobre las células (columna 5). Una posible explicación de esto es que, en esta última situación, el TNF se pudo fijar inicialmente a un solo receptor. Este complejo sería reticulado de inmediato con heparina/Clexane®, evitando que el TNF se fije a un segundo o tercer receptor.

Es posible encontrar pruebas adicionales de apoyo en el experimento realizado para determinar si heparina/
Clexane® pueden inhibir la bioactividad del TNF mediante la adición de heparina/Clexane® tras la aplicación de TNF. Si se aplica heparina/Clexane® en diferentes períodos de tiempo tras la aplicación de TNF, su actividad inhibitoria sigue siendo significativa después de 15 min, persistiendo de manera marginal después de una hora. Sorprendentemente, en dos ensayos, la actividad inhibitoria de heparina/Clexane® fue de aproximadamente 7-15% en el tiempo 0, aumentó a 25% al aplicarlas 5-15 min después del TNF, y disminuyó a 19% después de una hora (Fig. 6).

Una explicación de este incremento paradójico, si la adición de heparina/Clexane® se realiza 5-15 min después de la del TNF, es que heparina/Clexane® se fijan fuertemente tan sólo a un receptor monómero de un TNF trímero. La fijación interfiere con la posterior trimerización de receptores, de la que se sabe que va seguida de la transducción de señales.

Es posible considerar la unión del TNF a sus receptores como un proceso durante el cual, al comienzo, el TNF se fija a un receptor, con el tiempo se une a un segundo receptor y, con tiempo adicional, lo hace a un tercer receptor. El hecho de que heparina/Clexane® sigan siendo capaces de inhibir el TNF, incluso después de una hora después de su aplicación, indica que puede interferir en esta etapa tardía con la trimerización de los escasos últimos receptores. Las moléculas de TNF pueden estar combinadas en esta etapa posterior con uno o dos receptores, y heparina/Clexane® interfieren con la fijación al tercero, lo que, de lo contrario, induciría la transducción de señales.

Este mecanismo podría explicar la paradoja de que la adición de heparina/Clexane® 15 min después de la aplicación de TNF tiene como resultado una mejor inhibición del TNF que cuando se aplican simultáneamente. En el tiempo 0, heparina/Clexane® fijan parte del TNF y pueden interferir ligeramente con su unión a los receptores celulares, como se ha señalado anteriormente. Si se aplican concentraciones bajas de TNF varios minutos antes de heparina/Clexane®, el TNF tiene la oportunidad de unirse a sus receptores sin ninguna interferencia, y la aplicación de la heparina reticulará ahora, de manera opcional, el TNF unido a los monómeros receptores.

Por consiguiente, se puede ver que el tratamiento de un paciente con heparina y/o una heparina de bajo peso molecular puede inhibir la bioactividad del TNF. El efecto de la heparina o de derivados de la misma se puede potenciar mediante la administración de sTNF-R p55 o sTNF-R p75 en combinación con la heparina o su derivado. La heparina y los receptores solubles se pueden administrar simultáneamente, o durante un intervalo de aproximadamente 15-30 min. De forma alternativa, se administran la heparina o su derivado y, aproximadamente 15-60 min más tarde, se administra sTNF-R p55 o sTNF-R p75.

Aun cuando se puede administrar heparina como tal, la heparina de bajo peso molecular, producida por fraccionamiento o depolimerización controlada de heparinas, posee un rendimiento antitrombótico mejorado, así como diferentes propiedades farmacocinéticas en comparación con la heparina, La semivida de las heparinas de bajo peso molecular se duplica. Sin embargo, aunque Bratt et al. (1985) encontraron que su biodisponibilidad es mayor con respecto a su efecto anticoagulante tras la inyección subcutánea, se debe señalar, basándose en las Figs. 4 y 5, que la heparina y Clexane® interactúan con sTNF-R p55, sTNF-R p75 y TNF aproximadamente de la misma forma. De este modo, se puede utilizar cualquier heparina de bajo peso molecular en lugar de heparina para los propósitos de la presente invención.

Las heparinas de bajo peso molecular que se pueden utilizar, preferentemente, en la presente invención incluyen Clexane®, como se ha descrito anteriormente, así como Fragmin®, una heparina de bajo peso molecular con un peso molecular medio en el intervalo de 4000-6000 daltons, producida por depolimerización con ácido nitroso controlada de heparina sódica procedente de la mucosa intestinal porcina, fabricada por Kabi Pharmacia, Suecia. También resultan útiles Fraxiparin® y Fraxiparine®, heparinas de bajo peso molecular, con un peso molecular medio de aproximadamente 4500 daltons, producidas por fraccionamiento o depolimerización con ácido nitroso controlada, respectivamente, a partir de heparina cálcica de la mucosa intestinal porcina, fabricadas por Sanofi (Choay Laboratories).

A los efectos de la presente invención, se puede utilizar heparina como tal, tanto sola como en combinación con una heparina de bajo peso molecular, independientemente del procedimiento de fabricación, las diferencias estructurales (generadas por depolimerización, o las que dependen de variaciones de la heparina usada como materia prima), o de la actividad anticoagulante. De forma alternativa, se puede utilizar una heparina de bajo peso molecular
sola.

Los trastornos que se pueden tratar mediante la inhibición de la actividad del TNF, según la presente invención, son, todos ellos, trastornos relacionados con la presencia de TNF y que responden a la inhibición de la bioactividad del TNF. Entre estos trastornos se hallan la aterosclerosis, vasculitis y procesos patológicos relacionados con las mismas; enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide, diabetes mellitus tipo I; alergias; rechazo de injertos; enfermedades inflamatorias agudas y crónicas tales como uveítis e inflamación intestinal; anorexia nerviosa; choque hemorrágico causado por septicemia; e infecciones oportunistas en pacientes con SIDA.

La heparina o la heparina de bajo peso molecular, o sus mezclas, se incorpora en composiciones farmacéuticas, por ejemplo, como soluciones acuosas que comprenden, posiblemente, cloruro sódico, estabilizadores y otros ingredientes inactivos adecuados. El método preferido de administración es por inyección, subcutánea o intravenosa, pero la invención comprende cualquier otra vía adecuada de administración.

Del mismo modo, se incorporan los receptores solubles de TNF, sTNF-R p55 y sTNF-R p75, en composiciones farmacéuticas, ya sea solos o en combinación con heparina y sus derivados. Las cantidades de heparina o sus derivados administradas dependen del modo de administración. Si se utiliza una preparación de liberación lenta, las cantidades administradas serán mucho menores que si se administra por vía intramuscular o intravenosa.

Las composiciones farmacéuticas que se administran de acuerdo con la presente invención pueden comprender al menos una heparina o un derivado de la misma, y al menos un receptor soluble de TNF, juntos, en una forma de administración farmacéuticamente aceptable, combinada con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones se pueden administrar por cualquier medio que alcance los propósitos previstos. Las cantidades y posologías para la administración de una composición según la presente invención se pueden determinar fácilmente por parte de los expertos en la técnica del tratamiento de trastornos relacionados con una bioactividad excesiva de TNF.

Por ejemplo, la administración se puede llevar a cabo por vía parenteral tal como subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transcutánea, o bucal. De forma alternativa o simultánea, la administración se puede efectuar por vía oral. La dosificación administrada depende de la edad, estado de salud y peso del receptor, tipo de tratamientos previos o simultáneos, en caso de haberlos, frecuencia del tratamiento y de la naturaleza del efecto deseado.

Las composiciones incluidas en el alcance de esta invención comprenden cualquier composición que contenga al menos una heparina o derivado de la misma, administrada en combinación con al menos un receptor soluble de TNF, en una cantidad eficaz para alcanzar su propósito previsto. Aun cuando las necesidades individuales varían, la determinación de los intervalos óptimos de las cantidades eficaces de cada componente se establece de acuerdo con la experiencia en la técnica. Dosificaciones típicas comprenden desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal.

Los siguientes Ejemplos ayudarán a explicar la presente invención.

Ejemplo 1 Inhibición de la actividad de TNF con heparina

Se sembraron células WISH a una concentración de 30.000 células por pocillo en 100 \mul de medio. 16 horas más tarde, se agregó medio (control), heparina, TNF o una combinación de TNF más heparina. Las concentraciones finales de cada uno de estos componentes en los respectivos pocillos fueron las siguientes: TNF 0,5 ng/ml; heparina 1 unidad/ml. Después de las diversas adiciones, se agregó ciclohexamida a cada pocillo (50 \mul) hasta una concentración final de 25 \mug/ml en el pocillo. 16 horas después, se descartaron los sobrenadantes y se agregó tinción de rojo neutro durante una hora. Después de una hora de incubación, la tinción se extrajo con una solución de Sorensen y los resultados se visualizaron en un lector de ELISA. Los resultados se correlacionan directamente con el porcentaje de lisis celular. Los resultados se muestran en la Fig. 1A. Se puede ver que la adición de TNF inhibe aproximadamente 25% de la bioactividad de TNF (reducción de la citotoxicidad desde 49% a 37%).

Ejemplo 2 Inhibición de la actividad de TNF con Clexane®

Se repitió el mismo procedimiento del Ejemplo 1, sustituyendo la heparina por Clexane®. Los resultados se muestran en la Fig. 1B. Se puede ver que se obtuvieron efectos inhibitorios sustancialmente similares.

Ejemplo 3 Efecto del pretratamiento con heparina sobre la citotoxicidad de TNF

Se repitió el mismo procedimiento del Ejemplo 1, excepto que las células WISH se trataron con heparina entre 0-30 min antes de la adición de TNF. Los resultados se muestran en la Fig. 2. Se puede ver que se obtuvieron efectos inhibitorios sustancialmente idénticos en el curso del tiempo.

Ejemplo 4 Efecto de la eliminación de heparina por lavado

Se sembraron células WISH a una concentración de 30.000 células por pocillo en 100 \mul de medio. 16 horas después de la siembra de las células, se agregó heparina o Clexane® a los correspondientes pocillos, en tanto que a los pocillos de control se agregó medio solamente. La heparina o Clexane® se agregó a una concentración final de 1 unidad/ml. 6 horas más tarde, parte de los pocillos pretratados con heparina o Clexane®, o con medio sólo, se lavaron tres veces con medio fresco, y se agregó TNF a una concentración final de 0,5 ng/ml. Los resultados se muestran en la Fig. 3A para la heparina y en la Fig. 3B para Clexane®. Se puede ver que el pretratamiento con heparina/Clexane® redujo la citotoxicidad del TNF en 33%, como se esperaba (desde 60% a 40%) (véanse las columnas 2 a 4 en las Figs. 3A y 3B). Sin embargo, el simple lavado de las células tratadas con medio dio lugar a una reducción de 25% de la susceptibilidad celular al TNF. Las células pretratadas con heparina o Clexane®, cuyos sobrenadantes se lavaron antes de la adición de TNF, tuvieron una lisis idéntica debida a TNF (véanse las columnas 3 a 5 de las Figs. 3A y 3B). Por lo tanto, la eliminación de heparina o Clexane® a partir de los sobrenadantes elimina instantáneamente su efecto protector contra la citotoxicidad del TNF.

La retirada de los sobrenadantes, el lavado de las células y la adición de nuevo medio eleva la resistencia celular al TNF en 20%. Es posible que los sobrenadantes retirados contengan un factor que facilite la citotoxicidad del TNF, y su eliminación reduzca el efecto del TNF. Otra posibilidad es que, tras la retirada de los sobrenadantes, se produzca una rápida eliminación de los receptores de TNF en la superficie celular, como se ha observado anteriormente (Aderka, en prensa), lo que puede provocar una cierta desensibilización transitoria al TNF.

Ejemplo 5 Efecto de heparina/Clexane® sobre los receptores de TNF

Se sembraron células WISH a una concentración de 30.000 células por pocillo en 100 \mul de medio. 16 horas más tarde, se agregó medio solo (control), o sTNF-R (ya sea sTNF-R p55 (Figs. 4A y 4B) o sTNF-R p75 (Figs. 5A y 5B)), y heparina (Figs. 4A y 5A) o Clexane® (Figs. 4B y 5B). Las concentraciones finales de cada componente en los respectivos pocillos fueron las siguientes: TNF, 0,5 ng/ml; heparina, 1 unidad/ml; Clexane®, 1 unidad/ml; TBP-1 (receptor de TNF p55), 5 ng/ml; TBP-II (receptor de TNF p75), 10 ng/ml.

Se mezclaron diferentes combinaciones de los ingredientes en un tubo de Eppendorf hasta un volumen final de 300 \mul. A continuación, se agregaron 50 \mul a cada pocillo. En caso de ser necesaria una incubación, ésta se efectuó en un tubo de Eppendorf, en mezcla o por separado, durante 30 min a 37ºC.

Tras la adición de las diferentes combinaciones, se agregó ciclohexamida a cada pocillo (50 \mul) hasta una concentración final de 25 \mug/ml. 16 horas después, se descartaron los sobrenadantes celulares y se agregó durante una hora tinción de rojo neutro. Después de una hora de incubación, la tinción se extrajo con una solución de Sorensen y los resultados se determinaron en un lector de ELISA.

Los resultados se muestran en las Figs. 4A, 4B, 5A y 5B. En cada una de estas figuras, la primera barra del gráfico representa un control en el que el tubo de Eppendorf incluyó solamente 300 \mul de medio. En la segunda barra de cada una de ellas, el tubo de Eppendorf incluyó 2,1 \mul de TNF a una concentración de 2 ng/ml más 20 \mul de medio.

En la barra 3 de cada figura, se agregaron 1,8 unidades de heparina o Clexane® (10 \mul) y 10 \mul de medio al tubo de Eppendorf, junto con la adición de 280 \mul de TNF a una concentración de 2,1 ng/ml. La mezcla se agregó entonces, de inmediato, a los pocillos de células WISH.

Con respecto a la cuarta barra, se agregaron 6 ng de sTNF-R p55 (10 \mul) a 10 \mul de medio y la misma cantidad de TNF antes mencionada, inmediatamente antes de la adición a los pocillos de células WISH. En las Figs. 5A y 5B, se utilizó el doble de cantidad de sTNF-R p75 (12 ng/10 \mul) en lugar de sTNF-R p55.

En relación con la barra 5, se agregaron al tubo de Eppendorf 6 ng de sTNF-R p55 ó 12 \mug de sTNF-R p75 (10 \mul), 1,2 unidades de heparina o Clexane® (10 \mul), y 280 \mul de TNF a 2,1 ng/ml. A continuación, la mezcla se agregó de inmediato a los pocillos de células WISH.

La barra 6 comprende los mismos materiales reseñados anteriormente para la barra 3, con la excepción de que el TNF y la heparina o Clexane® se agregaron de manera simultánea al tubo de Eppendorf y, luego, se incubaron conjuntamente durante 30 min antes de agregarlos a los pocillo de células WISH. De forma similar, la barra 7 es igual a la barra 4 anteriormente descrita, con la excepción de que se mezcló sTNF-R p55 o sTNF-R p75 con el TNF y se incubaron conjuntamente durante 30 min a 37ºC, antes de agregarlos a los pocillos de células WISH. El experimento de la barra 8 es igual al descrito para la barra 5, excepto que el TNF, sTNF-R p55 o sTNF-R p75, y la heparina o Clexane® se mezclaron e incubaron conjuntamente durante 30 min, antes de agregarlos a los pocillos de células WISH.

Para la barra 9, se preincubaron el TNF y heparina o Clexane® juntos durante 30 min antes de la adición de sTNF-R p55 o sTNF-R p75, que se preincubaron por separado, con posterior adición inmediata a los pocillos de células WISH. Para la barra 10, se incubaron sTNF-R p55 o sTNF-R p75 y la heparina o Clexane® conjuntamente durante 30 min, antes de la adición del TNF preincubado, con posterior adición inmediata a los pocillos de células WISH. Para la barra 11, se incubaron TNF y sTNF-R p55 o sTNF-R p75 conjuntamente durante 30 min antes de la adición de heparina o Clexane® preincubada, con posterior adición inmediata a los pocillos de células WISH.

Como se puede ver de la comparación de las diversas barras de las Figs. 4A, 4B, 5A y 5B, la preincubación de TNF con heparina/Clexane® durante 30 min, y su aplicación a las células WISH, potenció adicionalmente su efecto inhibitorio de TNF, en comparación con su aplicación sin preincubación (véanse las barras 3 y 6 de cada una). Además, mientras sTNF-R p55 o sTNF-R p75, por sí solos, pudieron inhibir sólo 8-15% de la bioactividad del TNF, la adición de heparina o Clexane® a TNF y cualquiera de los receptores potenció la inhibición por parte de los receptores entre tres y cuatro veces (60% de inhibición) (véanse las columnas 2, 4 y 5 de las diversas figuras).

Los kits para la administración simultánea o secuencial de heparina y/o un derivado de la misma, y de un receptor soluble de TNF, se preparan de manera convencional. De forma característica, dicho kit comprenderá, por ejemplo, una ampolla de cada uno de los ingredientes activos en un vehículo farmacéuticamente aceptable, una jeringuilla, e instrucciones escritas para la administración simultánea o secuencial. Por ejemplo, si se desea una administración simultánea, el contenido de las ampollas se puede mezclar antes de la inyección en un recipiente adecuado o en la propia jeringuilla.

Se debe entender que la fraseología o terminología empleada en el presente documento tiene el objetivo de descripción y no de limitación. Los medios, materiales y etapas para llevar a cabo las diversas funciones descritas pueden adoptar una diversidad de formas, sin apartarse de la invención. De este modo, las expresiones "medios para..." y "medios de...", o cualquier expresión de una etapa metodológica, como se puede encontrar en la anterior descripción y/o en las siguientes reivindicaciones, seguidas de una declaración funcional, pretenden definir y abarcar cualquier elemento estructural, físico, químico o eléctrico, así como cualquier etapa metodológica actualmente existente o que pueda existir en el futuro, capaz de llevar a cabo las funciones descritas, tanto si son precisamente equivalentes como si no lo son, con la o las realizaciones descritas en la anterior descripción, es decir, se pueden utilizar otros medios o etapas para efectuar la misma función; y se pretende que estas expresiones se interpreten en su sentido más amplio.

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Claims

1. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de heparina y/o un derivado de la misma, en combinación con al menos un receptor soluble de TNF (sTNF-R).

2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que dicho receptor soluble de TNF se selecciona del grupo consistente en sTNF-R p55 o sTNF-R p75.

3. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho derivado de heparina es una heparina de bajo peso molecular.

4. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho derivado de heparina tiene un peso molecular entre 2500 y 6500 daltons.

5. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende, adicionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable.

6. Uso de heparina y/o de un derivado de la misma y un receptor soluble de TNF, tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la actividad del TNF, en el que dicha composición será administrada a un sujeto.

7. Un kit para la administración simultánea o secuencial de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende los ingredientes activos junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, e instrucciones para su uso.