EA005419B1

EA005419B1 - Применение ингибиторов интерлейкина-18 для приготовления лекарственного средства для подавления метастазов опухолей

Info

Publication number: EA005419B1
Application number: EA200200189A
Authority: EA
Inventors: Чарльз Динарелло
Original assignee: Арес Трейдинг С.А.
Priority date: 1999-07-22
Filing date: 2000-07-17
Publication date: 2005-02-24
Also published as: TR200200169T2; DE60035049T2; IL131047A0; IL147675A; US7741276B2; KR20020027493A; MXPA02000838A; WO2001007480A3; DE60035049D1; CY1107932T1; JP4827352B2; UA73745C2; PL202477B1; CA2380216A1; BRPI0012675B8; EP1206274A2; HU228780B1; PL353732A1; HUP0202107A3; WO2001007480A2

Abstract

Изобретение относится к профилактике метастазов опухоли путем подавления продуцирования и/или действия интерлейкина-18 (IL-18, или ИЛ-18). В качестве ингибитора действия ИЛ-18 изобретение предлагает применение антител к ИЛ-18, антител к любой из субъединиц рецептора ИЛ-18, ингибиторов сигнальных путей рецепторов ИЛ-18, антагонистов ИЛ-18, которые конкурируют с ИЛ-18 и блокируют рецепторы ИЛ-18, связывающих ИЛ-18 белков или их аналогов или фрагментов, обладающих той же самой активностью. В качестве ингибитора продуцирования ИЛ-18 изобретение предлагает применение ингибитора каспазы-1. Изобретение раскрывает применение вектора экспрессии, кодирующего ингибитор ИЛ-18, для приготовления лекарственного средства для подавления метастазов опухолей.

Description

Область изобретения

Данное изобретение относится к средствам подавления метастазов опухолей. Более конкретно, данное изобретение относится к профилактике метастазов опухоли путем подавления продуцирования и/или действия интерлейкина-18 (1Ъ-18, или ИЛ-18).

Предпосылки создания изобретения

Адгезия циркулирующих раковых клеток на эндотелии капилляров является решающей стадией возникновения метастазов (1,2). Молекула-1 адгезии на клетках сосудов (УСАМ-1, или М-1АСК), представитель суперсемейства иммуноглобулинов, опосредует адгезию гематопоэтических клеток и активированных лейкоцитов на активируемых цитокином провоспалительных эндотелиальных клетках (3-5). Однако адгезивная функция М-1АСК может быть присвоена животным и человеческим раковым клеткам для усиления экспериментального распространения метастазов (6).

Например, ИЛ-1 β и ФНО-α, как известно, усиливают метастазы клеток меланомы, экспрессирующих УЪА-4, в ткани легких с помощью механизма, который включает активацию экспрессии М-1АСК эндотелиальными клетками (7-9). Было также показано, что ИЛ-1 и ФНО-α значительно способствуют колонизации печени клетками В16М как у нормальных мышей, так и у мышей, получавших липополисахариды (7, 8, 10-20). Кроме того, активация клеток синусоидального эндотелия печени (Н8Е, или СЭП), опосредуемая маннозными рецепторами, включает аутокринную опосредуемую ИЛ-1в экспрессию М1 АСК клетками СЭП, приводящую к повышенной адгезии клеток В16М и метастазам (21). Было также показано, что активированные ИЛ-1в клетки СЭП выделяют УЪА-4-стимулирующие факторы, которые усиливают адгезию В16М на клетках СЭП (11). Таким образом, ΗΤ-1β индуцирует экспрессию М-1АСК и выделение стимулирующего УЪА-4 фактора клетками СЭП, что придает им способность создавать прометастазное микроокружение для некоторых интрасинусоидально задержавшихся экспрессирующих УЪА-4 раковых клеток.

Однако блокирование ИЛ-1 β и ФНО-α приводит только к частичному устранению метастазов, показывая, что в этом также участвуют и другие факторы, или компенсирующие их отсутствие, или действующие альтернативными метаболическими путями. Кроме того, большинство метастазирующих раковых клеток и тканей-мишеней не способны продуцировать эти провоспалительные цитокины. Более того, концентрация лигандов эндотоксиновых или маннозных рецепторов обычно повышается недостаточно для того, чтобы вызвать выделение провоспалительного цитокина. В результате многочисленные медиаторы, которые вызывают активацию М-1АСК, и их участие во время прохода раковых клеток по капиллярам все ещё не полностью выяснены.

ИЛ-18 (индуцирующий ΙΡΝγ (или γ-ИФН) фактор) является новым цитокином, который имеет общие структурные признаки с семейством белков ИЛ-1 (22) и общие функциональные свойства с ИЛ-12 (23). Сообщалось, что продуцирование ИЛ-18 куппферовскими клетками активирует опосредуемые как ФНО-α так и РА8 лигандами гепатотоксические метаболические пути при поражении печени, вызываемом эндотоксинами (24). Совсем недавно было обнаружено, что ИЛ-18 также обладает провоспалительными свойствами посредством прямой стимуляции экспрессии гена и синтеза ФНО-α из СИЗ '/СИ4' и естественных клеток-киллеров с последующим продуцированием ИЛ-1 β и ИЛ-8 из популяции СИ 14'. тем самым выявляя неожиданное центральное положение ИЛ-18 в иерархии цитокинов (25). Однако его возможная роль в метастазировании рака еще не была выяснена.

Связывающий интерлейкин-18 белок (1Ъ-18ВР, или ИЛ-18СБ) был выделен из мочи и очищен хроматографией на бусинах с ИЛ-18, секвенирован, клонирован и экспрессирован в клетках СО87. ИЛ-18СБ устранял индукцию интерферона-γ (ИФН-γ) ИЛ-18, ИЛ-8 и активацию ΝΡ-кВ ίη νίίτο. Введение ИЛ-18СБ мышам прекращало циркуляцию ИФН-γ после ЛПС. Таким образом, ИЛ-18СБ функционирует как ингибитор раннего Т111 цитокинового ответа. ИЛ-18СБ, в основном, экспрессируется в селезенке, принадлежит к суперсемейству иммуноглобулинов и обладает ограниченной гомологией к рецептору ИЛ-1 типа

II. Его ген локализован на человеческой хромосоме 11η13, но не обнаружено экзона, кодирующего трансмембранный домен, в 8,3 кЬ геномной последовательности. Некоторые поксвирусы кодируют предполагаемые высокогомологичные ИЛ-18СБ белки, что наводит на мысль о том, что вирусные продукты могут ослаблять ИЛ-18 и мешать цитотоксическому Т-клеточному ответу (28 и XVО 99/09063) . Как более подробно описано в νθ 99/09063, ИЛ-18СБ и мутеины, слитые белки, функциональные производные, активные фракции или циклически пермутированные производные и их смеси способны к связыванию с ИЛ-18 и/или способны к модулированию активности ИЛ-18, и/или способны к блокированию активности ИЛ-18.

Краткое изложение изобретения

Данное изобретение представляет применение ингибиторов продуцирования и/или действия ИЛ-18 для приготовления лекарственного средства для подавления метастазов опухолей.

Ингибиторами продуцирования ИЛ-18 являются, например, ингибиторы каспазы-1.

Ингибитор действия ИЛ-18 выбран из антител к ИЛ-18, антител к любой из субъединиц рецептора ИЛ-18, ингибиторов сигнальных путей рецепторов ИЛ-18, антагонистов ИЛ-18, которые конкурируют с

-1005419

ИЛ-18 и блокируют рецепторы ИЛ-18, связывающих ИЛ-18 белков или их аналогов или фрагментов, обладающих той же самой активностью.

Предпочтительно, используемым ингибитором действия ИЛ-18 является связывающий ИЛ-18 белок или его аналог или фрагмент, обладающие той же самой активностью.

Данным изобретением представлено также применение фармацевтической композиции, содержащей ингибитор продуцирования и/или действия ИЛ-18, с целью подавления метастазов опухолей.

Другим путем подавления продуцирования ИЛ-18 и/или действия на подавление метастазов опухоли является введение в организм вектора экспрессии, содержащего последовательность, кодирующую ингибитор продуцирования и/или действия ИЛ-18, такого как ИЛ-18СБ.

Краткое описание рисунков

Фиг. 1. Экспериментальная колонизация печени после внутриселезеночной инъекции клеток В16М мышам дикого типа, ΠΠ-1β^-/- и ИПФ^-/- (1СЕ^-/-). Печень удаляли на 10 день после инъекции клеток В16М и фиксировали в фосфатно-буферном физиологическом растворе с 10% формальдегида. Почти все экспериментальные метастазы (черные меланотиновые узелки) устранялись из печени ΗΗ-1β и ИПФ^-/- мышей.

Фиг. 2. Действие необратимого ингибитора ИПФ и антимышиных антител к ИЛ-18 на адгезию клеток В16М на клетках СЭП, и продуцирование ΠΠ-1β и ФНО-α необработанными и обработанными В16М-КС (В16М-СМ) клетками СЭП. Культивированные клетки СЭП инкубировали в присутствии В16М-КС в течение 10 ч. При некоторых экспериментах, как необработанные, так обработанные клетки СЭП подвергали действию 10 мкМ ИПФи или 10 мкг/мл антимышиных антител к ИЛ-18 перед В16МКС. Процент клеток В16М, адгезированных на СЭП субстрате, рассчитывали как относительное значение по отношению к первоначальному числу добавленных клеток. Кроме того, супернатанты культуры отбирали перед адгезией для определения концентрации ΠΠ-1β и ФНО-α с помощью ТИФА (ЕЫ8А). Данные представляют собой среднее значение ± СО по четырем отдельным экспериментам, каждый в шести повторностях (п = 24). Увеличение адгезии клеток В16М на СЭП, обработанных В16М-КС, и продуцирования ΚΠ-1β или ФНО-α по отношению к необработанным СЭП (*Р<0,01) было статистически значимым по двустороннему непарному ΐ-критерию Стьюдента. Происходили статистически незначимые изменения продуцирования ΠΠ-1β или ФНО-α и в адгезии клеток В16М на клетках СЭП, когда их обрабатывали ИПФи или анти-ИЛ-18 антителами в отсутствие В16М-СМ (данные не показаны).

Фиг. 3. Действие ИПФи на адгезию клеток В16М на обработанных В16М-КС клетках СЭП ίη уйго. Клетки СЭП инкубировали с основной средой или В16М-КС в течение 8 ч. Некоторые клетки СЭП подвергались действию 10 мкМ ИПФи в течение 18 ч перед В16М-СМ. Кроме того, к некоторым клеткам СЭП добавляли также ΠΠ-1β вместе с В16М-КС на 8 ч. В других экспериментах клетки СЭП подвергали воздействию 1 нг/мл мышиного ΗΗ-1β или 100 пг/мл ФНО-α в течение 6 ч, и добавляли или нет 10 мкг/мл кроличьих поликлональных антител против мышиного ИЛ-18 за 1 ч перед обработкой цитокином. К необработанным и обработанным цитокином клеткам СЭП добавляли также неспецифические 1дС поликлональные антитела. Затем клетки СЭП промывали и добавляли меченные ВСЕЕСЕ-АМ клетки В16М и затем снова промывали через 8 мин. Процент клеток В16М, адгезированных на субстрате СЭП, рассчитывали как относительное значение по отношению к первоначальному числу добавленных клеток. Результаты представляют среднее арифметическое ± СО по трем отдельным экспериментам, каждый в шести повторностях (п = 18). Различия в степени адгезии по отношению к необработанным СЭП (*) и обработанным ΠΠ-1β или ФНО-α СЭП (**) были статистически значимыми (Р<0,01) по двустороннему непарному 1-критерию Стьюдента. Статистически незначимыми были изменения адгезии клеток В16М на других обработанных ИПФи контрольных СЭП, на которые дополнительно воздействовали или не воздействовали 1 нг/мл мышиного ΠΠ-1β в течение 8 ч (данные не показаны).

Фиг. 4. Адгезия клеток В16М на обработанных ИЛ-18 СЭП ίη νίίτο. Клетки СЭП инкубировали с 1 нг/мл рекомбинантного мышиного ИЛ-18 в течение 6 ч. При некоторых экспериментах за 10 мин до ИЛ18 добавляли 10 мкг/мл ФНО-рР р55 (ΤΝΕ-δΚρ55) или 100 нг/мл ИЛ-1Ра. При других экспериментах за 30 мин перед добавлением клеток В16М к клеткам СЭП добавляли 10 мкг/мл анти-М-1АСК антител или в такой же концентрации неспецифический антимышиный 1§С. Затем определяли процент адгезии клеток В16М, как описано в примерах здесь, ниже. Результаты представлены средним арифметическим ± СО по трем отдельным экспериментам, каждый в шести повторностях (п = 18). Различия в степени адгезии по отношению к СЭП, обработанным основной средой (*) и СЭП, обработанным ИЛ-18 (**) были статистически значимыми (Р<0,01), по двустороннему непарному 1-критерию Стьюдента.

Детальное описание изобретения

Некоторые провоспалительные цитокины, включая интерлейкин (ИЛ)-1 β и фактор некроза опухоли-альфа (ФНО-α), стимулируют адгезию раковых клеток на клетках эндотелия, приводя тем самым к метастатическому распространению опухолей. Эти провоспалительные цитокины способствуют адгезии и метастазированию, возможно, путем стимуляции молекул-1 адгезии сосудистых клеток (М-1АСК). Данное изобретение демонстрирует, что обработка первичных культивированных мышиных клеток СЭП кондиционированной средой (КС) от культур клеток (В16М-КС, или В16М-СМ) меланомы В16 (В16М)

-2005419 способствует адгезии между клетками В16М и СЭП ίη νίίτο. В16М-КС вызывает также продукцию ИЛ13 и ФНО-α клетками СЭП ίη νίίτο. В16М-КС индуцирует также продукцию ИЛ-Ιβ и ФНО-α клетками СЭП ίη νίίτο. Однако было четко продемонстрировано, что метастазирование опухоли несомненно опосредуется ИЛ-Ιβ и ФНО-α.

Данное изобретение показывает, что В16М-КС индуцирует продуцирование ИЛ-18 клетками СЭП, и что ИЛ-18 является цитокином, способствующим повышенной адгезии клеток В16М на клетках СЭП. ИЛ-18 усиливает адгезию путем активации экспрессии М-1АСК на клетках СЭП без участия ФНО-α или ИЛ 1 β. Инкубация клеток СЭП со специфическим ингибитором каспазы-1 (10 мкМ, 18 ч) полностью устраняет вызванную В16М-КС адгезивность без снижения продуцирования ФНО-α, и эффект является необратимым при добавления мышиного ИЛ-1 β. Добавление антимышиных ИЛ-18 антител к клеткам СЭП предотвращает индуцированную В16М-КС адгезивность без вмешательства в индукцию В16М-КС выработки ИЛ-1 β и ФНО-α. Подобным же образом недавно клонированный связывающий ИЛ-18 белок (ИЛ18СБ) также предотвращает вызванную В16М-КС адгезивность В16М на клетках СЭП ίη νίίτο. Ингибиторы ФНО-α и ИЛ-1 β, такие как растворимые рецепторы ФНО р55 или антагонист рецепторов ИЛ-1, были неспособны устранять эту индуцированную ИЛ-18 адгезию. Таким образом, данное изобретение представляет ингибиторы продуцирования и действия ИЛ-18 в качестве средств для подавления метастазов опухоли. Ингибиторы продуцирования ИЛ-18 включают ингибиторы каспазы-1. Ингибиторы действия ИЛ-18 выбираются из группы, состоящей из антител, направленных против ИЛ-18, антител, направленных против одной из двух известных субъединиц рецептора ИЛ-18, ингибиторов сигнальных метаболических путей рецепторов ИЛ-18, антагонистов ИЛ-18, которые конкурируют с ИЛ-18 и блокируют рецепторы ИЛ-18 и связывающих ИЛ-18 белков, которые связывают ИЛ-18 и блокируют его биологическую активность.

Данное изобретение относится к возможной роли ИЛ-18 в провоспалительной, опосредуемой цитокином активации экспрессии М-1АСК, его возможному взаимодействию с другими цитокинами и средствам для предотвращения этой индукции М-1АСК. В соответствии с данным изобретением было обнаружено, что ИЛ-18 действует при инициации провоспалительных явлений, приводящих к активации М1 АСК в синусоидальной стенке в печени и, следовательно, содействию адгезии раковых клеток и метастазированию. В качестве модели зависимой от раковых клеток активации эндотелиальных клеток использовали первично культивированные мышиные клетки СЭП, обработанные В16М-КС для исследования роли индуцированного клетками В16М ИЛ-18 в механизме адгезии клеток В16М на клетках СЭП путем зависимого от М-1АСК механизма. Специфическую роль ИЛ-18 изучали в условиях специфической блокады рецепторов ИЛ-1 с использованием подавления секреции ИЛ-1Ра, зрелого ИЛ-1 β и ИЛ-18, применяя необратимый ингибитор фермента превращающего ИЛ-1 (ИПФи, или 1СЕ1), блокаду ФНО, применяя растворимые рецепторы ФНО р55 (ФНО-рР р55, или ΤΝΡ-δΚ. р55) и блокаду функции ИЛ-18, применяя анти-ИЛ-18 антитела и связывающий ИЛ-18 белок. Кроме того, клетки В16М вводили путем инъекции в селезенку ИПФ^-/- и ИЛ-1 β мышам. Низкая плотность метастазов, наблюдаемая у дефицитных мышей по сравнению с нормальными контролями, говорит об участии ИЛ-1 β и, возможно, ИЛ-18 в прометастазной роли воспаления (табл. 1).

Проведенные эксперименты ίη νίίτο демонстрируют, что продуцированная ИЛ-18 ответственна за эффекты, индуцированные супернатантами, полученными от клеток В16М. Так как активация М-1АСК ответственна за всю стимулирующую адгезию активность СЭП, обработанных В16М-КС, данные показывают что ИЛ-18 опосредует экспрессию М-1АСК индуцированными цитокином СЭП. Кроме того, антитела к ИЛ-18 снижали индуцированную В16М-КС адгезию клеток без влияния на продуцирование ФНО-α и ИЛ-1 β клетками СЭП. Следовательно, продуцированная ИЛ-1 β и ФНО-α клетками СЭП была независимой от ИЛ-18 и не способствовала адгезии. И наоборот, ни ФНО-рР р55, ни ИЛ-1Ра не были способны подавлять повышение адгезии у клеток СЭП, обработанных ИЛ-18, подтверждая, что ни аутокринный ФНО-α, ни ИЛ-1 β не ответственны за индуцированную ИЛ-18 адгезивность СЭП.

Результаты для клеток СЭП контрастируют с результатами, полученными для других клеточных систем, таких как, например, «не ^-СИ14⁺» мононуклеарные клетки крови человека (25), где ИЛ-18 индуцировал ИЛ-1 β через продуцирование ФНО-α. Вероятно, существует специфическая для СЭП иерархия провоспалительных цитокинов, в которой ФНО-α и ИЛ-1 β являются независимыми от регуляции ИЛ-18, но ИЛ-18 используется в качестве прямого медиатора активации М-1АСК.

В отличие от мышиных клеток СЭП, клетки В16М не экспрессируют ген ИЛ-18, что проверено с помощью метода ПЦР с ревертированием (К.Т-РСК.), и инкубация с ИПФн в течение 18 ч не устраняла стимулирующее продукцию цитокинов и адгезию действием В16М-КС на клетки СЭП. Однако локальное продуцирование ИЛ-18 может влиять на поведение клеток В16М во время их прохождения или остановки в микрососудах печени. Дополнительной находкой было то, что инкубация клеток В16М с 1 нг/мл мышиного ИЛ-18 в течение 6 ч двукратно повышала их адгезию на необработанных СЭП, а добавление к СЭП анти-М-1АСК антител снижало опосредуемую ИЛ-18 адгезию на 80%, наводя на мысль о том, что здесь участвует взаимодействие М-1АСК/УЪА-4. Подобным же образом, у клеток В16М, получивших воздействие супернатанта от СЭП, обработанных В16М-КС, в течение 6 ч также значительно (Р<0,01),

-3005419 двукратно, повышалась адгезия на СЭП путем зависимого от М-1АСК механизма, а анти-ИЛ-18 антитела устраняли это стимулирующее адгезию действие.

Данные, полученные по данному изобретению, говорят о том, что ИЛ-18 является новой связью между выделением в печени провоспалительных цитокинов и развитием метастазов. Их выработка активированными опухолью клетками СЭП определяется двумя комплементарными механизмами, участвующими в регуляции адгезии клеток меланомы на клетках СЭП: аутокринным механизмом в СЭП, который регулирует активацию М-1АСК, опосредованную ФНО-а/ИЛ-Ιβ, и паракринным механизмом в клетках В16М, который активирует УЪА-4 меланомной клетки, потенцируя её зависимую от М-1АСК способность к адгезии. Эта одновременная молекулярная активация обоих дубликатов клеточной адгезии делает высоко значимыми метаболические пути взаимодействия раковых и эндотелиальных клеток капилляров.

Вызванная ИЛ-18 адгезия клеток В16М устраняется ингибиторами продуцирования и/или действия ИЛ-18. Ингибиторы продуцирования ИЛ-18 включают ингибиторы каспазы-1. Ингибиторы действия ИЛ18 выбираются из группы, состоящей из антител, направленных против ИЛ-18, антител, направленных против любого одной из двух известных субъединиц рецептора ИЛ-18, ингибиторов сигнальных путей рецепторов ИЛ-18, антагонистов ИЛ-18, которые конкурируют с ИЛ-18 и блокируют рецепторы ИЛ-18, и белков, связывающих ИЛ-18, которые связывают ИЛ-18 и блокируют его биологическую активность.

В дополнение к прямому использованию ингибиторов продуцирования и/или действия ИЛ-18 в данном изобретении рассматривается также интродукция в клетки, где желателен эффект подавления продуцирования и/или действия ИЛ-18. Для этой цели необходима система для специфической интродукции, например, ДНК, кодирующей ИЛ-18СБ в клетки. Например, в клетки может быть введен подходящий вектор, несущий вышеуказанную ДНК, причем данный вектор способен влиять на встраивание ДНК в клетки таким образом, что ДНК экспрессируется в данных клетках. Способы доставки в клетки описаны, среди прочих, например, в патенте США 5910487, УО 99/29349 и других.

Фармацевтические композиции по данному изобретению для подавления продуцирования и/или действия ИЛ-18 являются теми, которые включают в качестве активного ингредиента ингибитор, выбранный из ингибитора каспазы-1, антител к ИЛ-18, антител к любой из субъединиц рецептора ИЛ-18, ингибитора сигнальных путей рецепторов ИЛ-18, антагониста ИЛ-18, который конкурирует с ИЛ-18 и блокирует рецепторы ИЛ-18, ИЛ-18СБ или их аналоги или фрагменты, обладающие той же самой активностью.

Антитела к ИЛ-18 и ИЛ-18СБ являются предпочтительными активными ингредиентами фармацевтических композиций.

Фармацевтические композиции могут также включать обычные носители, наполнители и другие ингредиенты, известные в данной области, зависящие от их способа применения, т. е. инъекцией, пероральным или любым другим путем, известным специалистам.

Конкретная дозировка будет зависеть от способа применения, веса тела пациента и других факторов и будет, в любом случае, определяться врачом.

Теперь после описания изобретения его будет более легко понять посредством обращения к следующим примерам, которые представлены для иллюстрации и не предназначены для ограничения данного изобретения.

Примеры

Реагенты:

Крысиные против мышиного 1дС и крысиные против мышиного М-1АСК моноклональные антитела были получены от 8его1ес Ыб. (ОхГогб, Епд1апб). Рекомбинантный мышиный ΗΠ-1β был получен от Κ.&Ό §у81еш 1пс. (М1пиеарок8, ΜΝ). Антагонист рецепторов рекомбинантного человеческого ИЛ-1 (ИЛ1Ра, или 1Ь-1Ва) был любезно предоставлен Ир)окп Со., Как-ипа/оо, ΜΙ и растворимые рецепторы для человеческого ФНО р55 (ФНОрР р55, или ΤΝΡδΚ. р55) были любезно представлены от Зегопо 1пс., Когтее11, МА. Ингибитор фермента, превращающего ИЛ-1 β (ИПФи, или 1СЕ1) был получен от А1ех18 Со. (Зап П1едо, СА). Рекомбинантный мышиный ИЛ-18 и кроличьи против мышиного ИЛ-18 поликлональные антитела 1дС были закуплены у РерФТеск ЕС Ыб. (Ьопбоп, ИК) . Белок, связывающий ИЛ-18 (ИЛ-18СБ), был получен, как описано (28).

Культура клеток В16М. Клетки В16М культивировали, сохраняли и пассировали, как описано ранее (11). Кондиционированную к В16М среду (В16М-КС) готовили следующим образом: 5х10⁵ клеток помещали в 25 см² Т-образную колбу и культивировали в течение 24 ч. После чего клетки культивировали в течение дополнительного периода, равного 24 ч в 5 мл бессывороточной среды (конечная плотность клеток равна 6х10⁴ клеток/см²). Супернатанты собирали, разбавляли 3:1 свежей бессывороточной средой и пропускали через фильтр 0,22 мкм.

Анализ цитокинов. Выделение цитокинов из первичных культивированных клеток СЭП и клеток В16М оценивали, используя специфические наборы для ТФИФА (твердофазный иммуно-ферментный анализ) (ЕЫ8А) на основе антимышиных ΙΚ-1β и ФНО-α моноклональных антител, как предложено производителем (Κ.&Ό Зуйетк, МшиеароШ, ΜΝ).

-4005419

Пример 1. Количественная адгезия клеток В16М на первичных культурах СЭП.

СЭП выделяли от сингенных мышей, идентифицировали и культивировали, как описано ранее (26). Клетки В16М метили раствором 2',7'-бис(2-карбоксиэтил)-5,6-карбоксифлуоресцеинацетоксиметилового сложного эфира (БКЭКФ-АМ (ВСЕСТ-АМ), Мо1еси1аг РгоЬез, Еидепе, ОК), как сообщалось (16). Затем добавляли 2х10⁵ клеток на ячейку культивированных СЭП в 24-ячеечную планшету и через 8 мин ячейки промывали три раза свежей средой. Число адгезированных клеток определяли, применяя количественный метод на основе описанной ранее системы для флуоресцентного определения (16) . При некоторых экспериментах клетки СЭП предварительно инкубировали с В16М-КС в течение нескольких часов перед добавлением клеток В16М.

Пример 2. Определение метастазов в печени.

Мышей-самцов С57ВБ/61 дикого типа ΙΚ-1 β ^{7 -} и ИПФ^-/--получали, как описано ранее (27). Использовали шести-восьминедельных мышей, размещенных по пять штук на клетку. Метастазы в печени получали путем инъекции в селезенку мышам под анестезией (нембутал, 50 мг/кг, внутрибрюшинно) 3х10⁵живых клеток меланомы В16, суспендированных в 0,1 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса. Мышей забивали под анестезией на 10-й день после инъекции раковых клеток. Ткани печени обрабатывали для гистологии. Денситометрический анализ переведенных в цифровую форму микроскопических изображений использовали для дифференциации метастазов В16М от нормальной ткани печени и плотность метастазов в печени, которая является числом метастазов на 100 мм³ печени (по среднему числу центров формирования, обнаруженных в пятнадцати срезах 10x10 мм² на печень), рассчитывали, применяя ранее описанные стереологические процедуры (17).

Пример 3. Сниженное метастазирование и рост В16М клеток, инъецированных мышам с дефицитом ΙΣ-1β и ИПФ.

Было выполнено два независимых эксперимента с интервалом в один год с использованием двух разных серий одних и тех же клеток В16М, которые вводили с помощью инъекции в селезенку взрослых мышей С57В1/61 дикого типа, ИПФ^-/- и ИЛ-1|3 . Исследование после вскрытия показало видимые меланотические опухоли в селезенках от всех исследованных мышей без значительных различий в размере, что оценивалось по весу селезенки (табл. 1). В противоположность этому заметное снижение метастазов происходило у ΙΕ-1β^_/ и, особенно, ИПФ^-/-выживших мышей по сравнению с выжившими мышами дикого типа (фиг. 1). Производили количественный гистологический анализ по числу и размеру очагов метастазов для определения плотности метастазов (как число очагов/100 мм³) и параметров объема (процент поражения органа) в исследованной печени мышей. По сравнению с мышами дикого типа (табл. 1), плотность метастазов в печени значительно снижалась (Р<0,01) в печени мышей ИПФ^-/- и ИЛ-1 β , на от 84 до 90%, показывая, что большая часть инъецированных клеток В16М были неспособны имплантироваться в ткань печени этих мышей. К тому же объем метастазов также значительно снижался (Р<0,01) в печени мышей ИЛ-1 β ^/ и ИПФ^-/-, 6-7-кратно по сравнению со значениями для печени мышей дикого типа, показывая, что клетки В16М успешно колонизирующие печень, имели также сниженную скорость роста. Мы также наблюдали различие в параметрах для этих метастазов между печенью мышей ΙΕ-1β^_/ и ИПФ^-/-, приводящее к подавлению метастазов в печени почти всех мышей ИПФ^-/- из эксперимента I (фиг. 1).

Таблица 1. Количественный гистологический анализ по экспериментальной колонизации печени у мышей ΙΚ-1 β^-/- и ИПФ^-/-после инъекции в селезенку клеток В16М.

Данные представляют средние значения ± СО по двум независимым экспериментам (использовали

7-15 мышей на экспериментальную группу).

* Показаны различия, которые были статистически значимыми (двусторонние, р<0,01), в отношении дикого типа мышей при применении дисперсионного анализа (АЫОУА) и Т-критерия Шеффе.

Пример 4. Аутокринный ИЛ-18 опосредует индуцированную ФНО-α и ΠΠ-1β адгезивность у активированных В16М-КС СЭП.

-5005419

В16М-КС значительно (Р<0,01) повышал продукцию ФНО-α и ИЛ-Ιβ клетками СЭП и их адгезивность в отношении других клеток В16М ίη νίίτο (фиг. 2). Инкубация СЭП с 10 мкМ ИПФи в течение 18 ч полностью устраняла индуцированную В16М-КС адгезивность без снижения продуцирования ФНО-α у СЭП. Экзогенно добавленный мышиный ИЛ-1 β не компенсировал блокирующий эффект ИПФи на СЭП, что контрастирует со значительным повышением адгезии клеток В16М у обработанных ИЛ-1 β контрольных СЭП (фиг. 3). Тот факт, что индуцированное В16М-КС повышение адгезии устранялось в присутствии повышенных концентраций эндогенно продуцируемого ФНО-α и экзогенно добавляемого ИЛ1β, показывает что ни один из этих цитокинов прямо не активирует адгезивность СЭП. Важно, что наличие антител против мышиного ИЛ-18, добавленных к СЭП перед стимуляцией В16М-КС, предотвращало индуцируемую В16М-КС адгезивность без влияния на продуцирование индуцированных ИЛ-1 β и ФНОα клетками СЭП (фиг. 2). Кроме того, антитела против ИЛ-18 также предотвращали стимулирующее адгезию действие мышиных ИЛ-1 β и ФНО-α на СЭП (фиг. 3), указывая на то, что проадгезивное действие этих цитокинов на СЭП, в обоих случаях, опосредуется ИЛ-18. ЯТ-РСЯ подтверждала, что клетки СЭП экспрессировали ген ИЛ-18 (данные не показаны). И наоборот, мышиный ИЛ-18 значительно (Р<0,01) повышал адгезию клеток В16М на СЭП (фиг. 4), и ни ФНО-рР р55, ни ИЛ-1Ра не были способны подавить его, подтверждая, что ни аутокринный ФНОα, ни ИЛ-1 β не отвечают за индуцированную ИЛ-18 адгезивность СЭП. Однако, как показано на фиг. 4, антитела к М-1АСК полностью подавляли адгезию клеток В16М к обработанным ИЛ-18 клеткам СЭП. Контрольный неспецифический 1д6 не влиял на усиление адгезии В16М клеток на обработанных ИЛ-18 СЭП.

Пример 5. ИЛ-18СБ предотвращает адгезию клеток меланомы В16, индуцированную кондиционированной В16 средой.

Как показано в табл. 2, добавление ИЛ-18СБ к СЭП, стимулированными В16М-КС, снижало процент адгезированных клеток с 35% до 8,70% (р<0,01). Это представляет 100% подавление, так как уровень адгезии был ниже уровня адгезированных клеток при использовании основной среды. Этот результат наводит на мысль о том, что эндогенный ИЛ-18 из СЭП может быть эндогенным источником ИЛ-18 в дополнение к тому, который присутствует в В16М-КС.

Таблица 2. Подавляющее действие ИЛ-1СБ на индуцированную кондиционированной В16 средой адгезию клеток меланомы В16 на синусоидальных эндотелиальных клетках печени (СЭП)

	% адгезии клеток меланомы
Основная среда	10,15±1,5
В16М-КС	35,10±4,4
В16М-КС/ИЛ-18СБ (1нг/мл)	15,00+2,5**
В16М-КС/ИЛ-18СБ (10 нг/мл)	8,70+1,1**

Данные представляют средние значения ± СО по 2 независимым экспериментам, сделанным в шести повторностях (N=12) ** Показаны различия, которые были статистически значимыми (двустороннее, р<0,01) в отношении В16М-КС при применении дисперсионного анализа (ΑΝΟνΑ) и Р-критерия Шеффе.

Библиография

1. Κοίιιι, Е. С, апб Ьюйа, Ь. Α. (1995) Сапсег Яез 55(9), 1856-62.

2. ΝκοΝοη, 6. Ь., апб \\'тке111аке, 1. Ь. (1975) №Фге 255, 230-232.

3. Ргеебтап, Α., Мипго, М., К1се. 6. Е., Веν^1ас^иа, М. Р., ΜοπιιιοΙο, С, Мс1п1уге. В. ЯНупНаП, Κ.,

Ροΐ^τ, 1. 8., апб №1б1ег, Ь. М. (1990) 8с1епсе 249, 1030-1033.

4. М1уаке, М., ΡποΗμοΙο, 8., 1^адак1, Н., Ма18иЬага, Ν., Ебатайи, Я., НйатаБи, М., апб ОгНа, Κ. (1991) Яез. Сотт. СЬет. ΡπίΡοΙ. РЬя^аток 71, 293-307.

5. 8^ттοη5. Р. 1., Ма8^ηον8ку, В., ^οηдеηеске^, В. М., Вегепюп, Я., Τογο1<-81ογΚ В., апб Са11абп, \. М. (1992) Β1οο6 80(2), 388-95.

6. Я1се, 6. Е., апб Веν^1ас^иа, М. Р. (1989) 8с1епсе 246, 1303-1306.

7. Окайага, Н., Уадйа, Н., М1уаке, Κ., апб Окитига, Κ. (1994) Сапсег Яез 54, 3233-3236.

8. багоЕак, Α., Οιίπνί. Я. 6. 8, Εοβ^πί, С., Р^р Я., Мο^ιа^^т. Я., Майш-Рабига, I., ЛшсЫпк Α., Сеагтд, Α. 1., 8апс11ех-Мабпб, Р., И/апа, Е., апб С1а\'аххк Я. (1995) Сапсег Яез 55,414-419.

9. Магбп-Рабига, I., Мο^ιа^^η^. Я., Ьаип, Ό., Ве^ηа5сοη^. 8., 8апс11ех-Мабпб, Р., Ратиапк 6., МапФνΗ^, Α., ΑΦ^ω, Α., апб И/апа, Е. (1991) Сапсег Яез 51, 2239-2241.

10. Ьаип, Ό., ВегЮтеи, М.-С, апб Огг, Р. \. (1990) С1т Ехр Ме1а81а818 8, 27-32.

11. Αηа8ада8ΐ^, М, 1., Α1νа^еζ, Α., Майш, 1. 1., Меηбοζа, Ь., апб V^ба1-Vаηас1οсйа, Р. (1997) НераФФду 25, 840-846.

12. Ваш, М. Я. , 6ηγο131ο, Α., 8сапх1апк Е., апб 6^аνаζζ^, Я. (1991) 1. Νηϊ1. Сапсег ЕЛ. 83, 119-123.

13. ВегЮтеи, М. С, 6η11ο, 8., Ьаип, Ό., Нааз, Т. Α., Огг, Р. Вазбба, Е., апб ВисЬапап, М. Я. (1993) С1ш Ехр Ме1а51а518 11, 243-250.

14. Вигго\\'5, Р. 1., Назкагб, Ό. О., Най, I. Я., МагзЬаИ, 1. Р., 8е1кнк, 8., Ροο1е, 8., апб Т1югре, Р. Е. (1991) Сапсег Яез 51, 4768-4775.

-6005419

15. ΟιίπνΓ К. С, 8., Сагока1о, А., Рабига, I. М., Мап1оуаш, А., апб С1а\'аххг К. (1993) СапсегКек 53, 5051-5054.

16. У1ба1-Уапас1осЬа, Р., Атеζада, С., Акитепб1, А., Кар1апкк1, С., апб Отагс11о. С. А. (1994) Сапсег Кек 54, 2667-2672.

17. У1ба1-Уапас1осЬа, Р., А1νа^еζ, А., Акитепб1, А., Игсе1ау, В., Тошпо, Р., апб Пшаге11о, С. А. (1996) 1 №111 Сапсег 1пк1 88, 198-205.

18. Ма11к, 8. Т., №ау1ог, М. 8., Еак1, Ν, Θ1ίίί, А., апб Ва1кЩ11, Р. К. (1990) Еиг 1 Сапсег 26, 1031-1034

19. Огок/, Р., ЕсНепасЬег, В., Ра1к, КиксЬоТТ, 1., ^еЬег, Ό., апб Маппе1, Ό. N. (1993) 1 Ехр Меб 177, 1391-1398.

20. Θιόκζ, Р., Кгидег, А., НиЬЬе, М., КиксЬоТТ, 1., Уоп Ноедеп, Р., апб Маппе1, Ό. N. (1995) 1п1. 1. Сапсег 60, 867-871.

21. Мепбоζа, Ь., 01ако, Е., Апакадакб, М. 1., Риеп1ек, А., апб У1ба1-Уапас1осЬа, Р. (1998) 1 Се11 РЬук1о1 174, 322-330.

22. Вахап, 1. Р., Т1тапк, 1. С, апб Как1е1ет, К. А. (1996) №11иге 379 (6566), 591.

23. Окатига, Н., Тки1кш, Н., Кота1ки, Т., Уийибо, М., Накига, А., Татто1о, Т., Топдое, К., Окига, Т., Мбк-аба, Υ., Набоб, К., Акба, К., №атЬа, М., ТапаЬе, Р., КошкЫ., К., Рикиба, 8., апб Кипто1о, М. (1995) №11иге 378, 88-91.

24. Тки1кш, Н., Ма1кш, К., Канаба, Ν., Нуобо, Υ., НауакЫ. Ν., Окатига, Н, , Н1дакЫпо, К., апб №акашкЫ. К. (1997) 1 1ттипо1 159(8), 3961-7.

25. Ригеп, А. 1., Рапίиζζ^, С., Си, Υ., 8и, М. 8.-8., апб Пшаге11о, С А. (1998) 1 С1т !пуек( 101, 711-724.

26. У1ба1-Уапас1осЬа, Р., КосЬа, М., Акитепб1, А., апб ВагЬега-СиШет, Е. (1993) Нера1о1оду 18, 328339.

27. Рапίиζζ^, С., Ригеп, А. 1., Нагбшд, М. ЬМпдкФп, Ό. 1., апб Отаге11о, С. А. (1998) В1ооб 91,

2118-2125.

28. №омск, Ό., К1т, 8-Н., Рапίиζζ^, С., Нех^кот, Ь.Ь., СЬаг1ек А. Птаге11о, С.А., апб КиЬшк1ет, М. (1999) 1ттипИу 10, 127-136.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Применение ингибиторов продуцирования и/или действия ИЛ-18 для приготовления лекарственного средства для подавления метастазов опухолей.
2. Применение по п.1, согласно которому ингибитором продуцирования ИЛ-18 является ингибитор каспазы-1.
3. Применение по п.1, согласно которому ингибитор действия ИЛ-18 выбран из антител к ИЛ-18, антител к любой из субъединиц рецептора ИЛ-18, ингибиторов сигнальных путей рецепторов ИЛ-18, антагонистов ИЛ-18, которые конкурируют с ИЛ-18 и блокируют рецепторы ИЛ-18, связывающих ИЛ-18 белков или их аналогов или фрагментов, обладающих той же самой активностью.
4. Применение по п.3, согласно которому ингибитором действия ИЛ-18 являются антитела к ИЛ-18.
5. Применение по п.3, согласно которому ингибитором действия ИЛ-18 является связывающий ИЛ18 белок или его аналог или фрагмент, обладающие той же самой активностью.
6. Применение фармацевтической композиции, содержащей антитела к ИЛ-18, антитела к любой из субъединиц рецептора ИЛ-18, ингибиторы сигнальных путей рецепторов ИЛ-18, антагонисты ИЛ-18, которые конкурируют с ИЛ-18 и блокируют рецепторы ИЛ-18, связывающие ИЛ-18 белки, или их аналоги или фрагменты, обладающие той же самой активностью, для подавления продуцирования и/или действия ИЛ-18 с целью подавления метастазов опухолей.
7. Применение по п.6, согласно которому композиция содержит антитела к ИЛ-18.
8. Применение по п.6, согласно которому композиция содержит связывающий ИЛ-18 белок или его аналог или фрагмент, обладающие той же самой активностью.
9. Применение вектора экспрессии, кодирующего ингибитор продуцирования и/или действия ИЛ-18, для приготовления лекарственного средства для подавления метастазов опухолей.