BRPI0012675B1 - Uso de anticorpos contra il-18 e il-18bp, assim como uso de um vetor de expressão codificando para ditos anticorpos contra il-18 e il-18bp - Google Patents

Abstract

patente de invenção: "uso de inibidores de il-18". descreve-se o uso de inibidores de il-18 em metástase de tumor.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE ANTICORPOS CONTRA IL-18 E IL-18BP, ASSIM COMO USO DE UM VETOR DE EXPRESSÃO CODIFICANDO PARA DITOS ANTICORPOS CONTRA IL-18 E IL-18BP".

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a metástase de tumor e pretende inibi-los. Mais especificadamente, a invenção refere-se a prevenção de metástase de tumor inibindo-se a produção e/ou ação da interleucina-18 (IL-18). Fundamento da Invenção A adesão de células de câncer de circulação para endotélio capilar é uma etapa crítica na gênese de metástase (1,2). A molécula-1 de adesão de células vasculares (VCAM-1), um membro da superfamília de imunoglobulina, media a adesão de células hematopoiéticas e leucócitos ativados para células endoteliais ativadas por citocina pró-inflamatória (3-5). Entretanto, a função adesiva de VCAM-1 pode ser usurpada pelas células de câncer humano e animal para potencializar a dilatação metastática da experiência (6).

Por exemplo, IL-1 B e TNF-α são conhecidos por potencializar a metástase de células de melanoma expressando VLA-4 no tecido do pulmão por um mecanismo que envolve a super-regulagem da expressão VCAM-1 por células endoteliais (7-9). Foi também demonstrado que IL-1 e TNF-a significantemente contribui com a colonização hepática de ambas células B16M em camundongos normais e tratados com lipopolissacarídeo (7,8,10-20). Além disso, a ativação de célula do endotélio sinusoidal hepático (HSE) mediada pelo receptor de manose envolve expressão de célula HSE mediada por IL-Ιβ de VCAM-1, induzindo para metástase e adesão de célula B16M aumentada (21). Foi também mostrado que células HSE ativadas por IL-Ιβ libera fatores de estimulação de VLA-4, que potencializa adesão de células B16M para células HSE (11). Dessa forma, IL- 1β induz expressão VCAM-1 e liberação de fator de estimulação VLA-4 de células HSE, que pode conceder-lhes uma capacidade de crias um micro-ambiente pró-metastático para certas células de câncer de expressão VLA-4 interrompidas intra-sinusoidalmente.

Entretanto, TNF-α e IL-Ιβ de bloqueio conduzem para apenas uma anulação de metástase parcial, indicando que outros fatores ou compensando pela sua ausência, ou atuando por meio de caminhos alternativos são também envolvidos. Além disso, a maioria das células de câncer me-tastasizantes e os tecidos alvo são incapazes de produzir essas citocinas pró-inflamatórias. Entretanto, a concentração de ligante receptor de manose ou endotoxina freqüentemente não aumenta suficientemente para induzir liberação de citocina pró-inflamatória. Então, os múltiplos mediadores que evocam super-regulagem VCAM-1 e seu envolvimento durante a passagem capilar de células de câncer não são bem caracterizados. A IL-18 (fator de indução IFNy) é uma nova citocina que divide características estruturais com a família de IL-1 de proteínas (22) e propriedades funcionais com IL-12 (23). Foi reportado que a produção de IL-18 de células Kupffer ativa ambos caminhos hepatotóxicos mediados por ligantes FAS e TNF-α em danos do fígado induzidos por endotoxina (24). Mais recentemente, foi descrito que IL-18 também possui propriedades pró-inflamatórias por estimulação direta de síntese e expressão de gene de TNF-α de CD3+/CD4+ e células assassinas naturais com produção subse-qüente de IL-Ιβ e IL-18 da população de CD14+, dessa forma demostrando uma posição principal inesperada de IL-18 na hierarquia da citocina (25). Entretanto, sua possível função em metástase de câncer não foi ainda explicada.

Uma proteína de ligação de interleucina-18 (IL-18BP) foi purificada a partir da urina por cromatografia em contas de IL-18, seqüenciadas, clonadas e expressadas em células COS7. IL-18BP aboliu indução de IL-18 de interferon-γ (IFN-γ), IL-18 e ativação de NF-kB in vitro. A administração de IL-18BP em camundongos anulou a circulação de IFN-γ seguindo LPS. Dessa forma, IL-18BP funciona como um inibidor da resposta de citocina Th1 precoce. IL-18BP é constitutivamente expressada no baço, pertencente à superfamília de imunoglobulina e tem homologia limitada ao receptor de IL-1 tipo II. Seu gene foi localizado no cromossomo humano 11q13 e nenhum codificação exon para um domínio de trans-membrana foi constatado ■ · em uma seqüência genômica de 8,3 kb. Vários poxvírus codificam proteínas putativas altamente homólogas para IL-18BP, sugerindo que produtos virais •------------------------------------------- > possam atenuar IL-18 e interfere com a resposta de T-célula citotóxica (28 e WO 99/09063). Como descrito mais particularmente em^WO 99/09063?) IL-18BP e muteínas, proteínas fundidas, derivativos funcionais, frações ativas ou derivativos permutados de forma circular e misturas destes são capazes de aglutinar para lL-18 e/ou capazes de modular a atividade de IL-18 e/ou capazes de bloquear a atividade de IL-18.

Sumário da Invenção A presente invenção é fornecida para o uso de inibidores de produção de IL-18 e/ou ação na preparação de medicamentos para inibir metástase de tumor.

Inibidores de produção de IL-18 são, por exemplo, inibidores de caspase-1.

Os inibidores da ação de IL-18 são selecionados a partir de anticorpos contra IL-18, anticorpos contra quaisquer das subunidades de receptores de IL-18, inibidores do caminho de sinalização do receptor de IL-18, antagonistas de IL-18 que compete com IL-18 e bloqueia o receptor de IL-18, e IL-18BPs, muteínas, proteínas fundidas, derivativos funcionais, frações ativas ou derivativos permutados de forma circular destes que ligam IL-18.

Preferivelmente os inibidores empregados são IL-18BPs, ou uma muteína, proteína fundida, derivativos funcional fração funcional ou derivativos permutado de forma circular destes que têm a mesma atividade quanto a IL-18BP.

As composições farmacêuticas para inibição de produção de IL-18 e/ou ação para inibir metástase de tumor, é a introdução no corpo de um vetor de expressão compreendendo a seqüência de código para uma produção de IL-18 e/ou inibidor de ação, tal como um IL-18BP.

Breve Descrição das Figuras Fig. 1. Colonização hepática experimental após injeção de célula B16M intra-esplênico nos camundongos tipo silvestre, IL-Ιβ7' e ICE7'. Os fígados foram removidos no dia 10 após a injeção de células B16M e fixados em salina tamponada de fosfato com 10% de formaldeído. Quase todas as metástases experimentais (nódulos melanóticos preto) foram extirpadas dos fígados de camundongo ICE'7' e IL-Ιβ'7'.

Fig. 2. Efeito de inibidor ICE irreversível e anticorpo de IL-18 anticamundongo sobre adesão de célula B16M à células HSE, produção de TNF-α e IL-Ιβ a partir de HSE tratada com B16M-CM e não-tratada. As células HSE cultivadas foram incubadas na presença de B16M-CM durante 10 horas. Em algumas experiências, ambas células HSE tratadas e não-tratadas receberam 10 μΜ de ICEi ou 10 μg/ml de anticorpo IL-18 de anticamundongo antes de B16M-CM. O percentual de células B16M aderidas ao substrato HSE foi calculado quanto ao valor relativo com respeito ao número inicial de células adicionadas. Adicionalmente, os sobrenadantes cultivados foram recuperados antes da adesão para determinar a concentração de IL-Ιβ e TNF-α por ELISA. Os dados representam o SD + médio de 4 experiências separadas, cada qual multiplicada por seis (n =24). O aumento de adesão de células B16M para HSE tratada com B16M-CM e de produção de IL-Ιβ ou TNF-α com respeito a HSE não-tratado (* P<0,01) foram estatisticamente significante de acordo com teste t não emparelhados de duas filas de Estudantes. Existem alterações não-estatisticamente significantes na produção de IL-Ιβ ou TNF-α e na adesão de células B16M para células HSE quando essas forem tratadas com anticorpo ICEi ou knti-IL-18) na au-sência de B16M-CM (dados não-mostrados).

Fig. 3. Efeito de ICEi sobre adesão de células B16M para HSE tratado com B16M-CM in vitro. As células HSE foram incubadas com veículo basal ou B16M-CM durante 8 horas. Algumas células HSE receberam 10 μΜ de ICEi durante 18 horas antes de B16M-CM. Além disso, 1 ng/ml de IL-Ιβ de camundongos recombinantes foi também adicionado à algumas células HSE junto com B16M-CM durante 8 horas. Em outras experiências, as células HSE receberam 1 ng/ml de IL-Ιβ de camundongo ou 100 pg/ml de TNF-α durante 6 horas, e 10 μg/ml de anticorpo policlonal de IL-18 de anticamundongo de coelho foi adicionado ou não 1 hora antes do tratamento com citocina. O anticorpo policlonal IgG não específico foi também adicio- nado às células HSE tratadas com citocina e não-tratadas. Em seguida, as células HSE foram lavadas e células B16M rotuladas por BCEFCF-AM foram adicionadas e lavadas novamente 8 minutos mais tarde. O percentual de células B16M aderidas ao substrato HSE foi calculado quanto ao valor relativo com respeito ao número inicial de células adicionadas. Os resultados representam o SD + médio de três experiências separadas, cada qual multiplicada por seis (n=18). As diferenças no grau de adesão com respeito a HSE não-tratado (*) e a HSE tratado com TNF-α ou IL-1 β (**) foram estatisticamente significante (P<0,01), de acordo com o teste t não emparelhado de duas filas de Estudantes. As alterações não estatisticamente significan-tes na adesão de células B16M a outras HSE de controle tratadas com ICEi que adicionalmente recebem ou não 1 ng/ml de IL-Ιβ de camundongo durante 8 horas (dados não-mostrados).

Fig. 4. Adesão de células B16M in vitro a HSE tratadas com IL- 18. As células foram incubadas com 1 ng/ml de IL-18 de camundongos recombinantes durante 6 horas. Em algumas experiências, 10 gg/ml de TNF-sRp55 ou 100 ng/ml de IL-1 Ra foi adicionado 10 minutos antes de IL-18. Em outras experiências, 10 gg/ml de anticorpo anti-VCAM-1 ou uma concentração similar de IgG anticamundongo não-específico foi adicionado à células HSE 30 minutos antes das células B16M. Em seguida, o percentual de adesão de células B16M foi determinado como descrito à seguir nos exemplos. Os resultados representam o SD + médio de três experiências separadas, cada qual multiplicada por seis (n=18). As diferenças no grau de adesão com respeito ao HSE tratado com veículo basal (*) e ao HSE tratado com IL-18 (**) foram estatisticamente significantes (P<0,01), de acordo com o teste t não emparelhado de duas filas de Estudantes.

Descrição Detalhada da Invenção Várias citocinas pró-inflamatórias, incluindo interleucina (IL)-1 β e fator de necrose de tumor-α (TNF-α), promovem a adesão de células do câncer para células endoteliais, desse modo induzindo à dilatação metastá-tica de tumores. Essas citocinas pró-inflamatórias promovem adesão e metástase provavelmente induzindo-se à molécula-1 de adesão de célula vas- cular (VCAM-1). A presente invenção mostra que o tratamento de células HSE de camundongos cultivados primeiro com veículo condicionado (CM) de cultura de células B16 melanoma (B16M) (B16M-CM) promove a adesão entre células HSE e B16M in vitro. B16M-CM também induz a produção de IL-Ιβ e TNF-α por células HSE in vitro. Entretanto, não foi claramente demonstrado que a metástase de tumor seja realmente mediada por IL-Ιβ e TNF-a. A presente invenção mostra que B16M-CM induz a produção de IL-18 por células HSE e que IL-18 é a citocina contribuinte para adesão aumentada de células B16M para células HSE. IL-18 realça a adesão ativando-se expressão VCAM-1 em células HSE sem o envolvimento de TNF-α ou IL-Ιβ. A incubação de células HSE com um inibidor de caspase-1 específico (10 μΜ, 18 horas) anula completamente a adesão induzida por B16M-CM sem diminuir a produção de TNF-α, e o efeito não é revertido pela adição de IL-Ιβ de camundongo. A adição de anticorpo IL-18 anticamundongo à células HSE previne a adesão induzida por B16M-CM, sem interferir na indução B16M-CM de IL-Ιβ e TNF-α. Similarmente, o recentemente clonado IL-18 de ligação de proteína (IL-18BP) também previne a adesão induzida por B16M-CM de B16M a células HSE in vitro. Os inibidores de TNF-α e IL-Ιβ tal como o receptor TNF solúvel p55 ou o antagonista receptor de IL-1 foram incapazes de reverter esta adesão induzida por IL-18. Dessa forma, a presente invenção fornece inibidores de produção e ação de IL-18 como recurso para inibir metástase de tumor. Os inibidores de produção de IL-18 incluem inibidores de caspase-1. Os inibidores de ação de IL-18 são selecionados a partir de um grupo consistindo em anticorpos direcionados contra IL-18, anticorpos direcionados contra quaisquer uma das duas subunidades receptoras de IL-18 conhecidas, inibidores do caminho de sinalização de receptor IL-18, antagonistas de IL-18, que competem com lL-18 e bloqueiam o receptor de IL-18 e proteínas de ligação de IL-18, que ligam IL-18 e bloqueiam sua atividade biológica. A presente invenção refere-se ao possível papel da IL-18 na super-regulagem mediada pela citocina pró-inflamatória de expressão VCAM-1, sua possível interação com outras citocinas e significa prevenir esta indução de VCAM-1. Foi constatado de acordo com a presente invenção que IL-18 está operando na iniciação de eventos pró-inflamatórios induzindo a super-regulagem VCAM-1 na parede sinusoidal hepática e então, facilitando a adesão de célula do câncer e metástase. As células HSE de camundongo cultivada primeiro tratadas com B16M-CM foram empregadas com um modelo de ativação de célula endotelial dependente de célula de câncer a fim de explorar a papel de IL-18 induzida por célula B16M no mecanismo de adesão de célula B16M para HSE por um mecanismo dependente de VCAM-1. O papel específico de IL-18 foi examinado sob condições de bloqueio de receptor de IL-1 com o uso de IL-1Ra, inibição de secreção de IL-18 e IL-Ιβ maduro empregando um inibidor de enzima de conversão de IL-1 irreversível (ICEi), bloqueio de TNF empregando o receptor solúvel TNF p55 (TNF-sR p55) e bloqueio de função de IL-18 empregando anticorpos anti-IL-18 e proteína de ligação de IL-18. Além disso, as células B16M foram intra-esplenicamente injetadas em camundongos ICE'7' e IL-Ιβ'7 '. A densidade inferior de metástase observada no camundongo deficiente quando comparada com controles normais sugere o envolvimento de IL-Ιβ e possivelmente IL-18 no papel pró-metastático da inflamação (Tabela 1).

As experiências in vitro realizadas mostram que a produção de IL-18 conta para os efeitos de estimulação de adesão de HSE induzida por sobrenadantes derivativos de células B16M. Desde que a super-regulagem de VCAM-1 conte para todas as atividades de estimulação de adesão de HSE tratado com B16M-CM, os dados indicam que IL-18 media a expressão de VCAM-1 de HSE induzido por citocina. Além disso, anticorpos para IL-18 diminuíram a adesão de células inibidas por B16M-CM sem afetar a produção de TNF-α e IL-Ιβ de células HSE. Dessa forma, a produção de IL-Ιβ e TNF-α em células HSE foi independente de IL-18 e não contribuiu com adesão. Reciprocamente, nem TNF-sR p55 nem IL-1 Ra foram capazes de inibir o aumento de adesão em células HSE tratadas com IL-18, confirmando que nem TNF-α autócrino nem IL-Ιβ contaram para adesão de HSE induzida por IL-18.

Os resultados em células HSE estão em contraste com aqueles obtidos em outros sistemas celulares, como por exemplo células mononu-cleares sangüíneas humanas não CD14+ (25), onde IL-Ιβ induzida por IL-18 por meio da produção de TNF-α. É provável que uma hierarquia de citocina pró-inflamatória específica de HSE exista na qual TNF-α e IL-Ιβ sejam independentes de controle de IL-18, porém estejam empregando IL-18 como um mediador a jusante de super-regulagem de VCAM-1.

As células HSE de camundongos diferentes, células B16M não expressaram o gene IL-18 como controlado por RT-PCR, uma incubação com ICEi durante 18 horas não anulou as atividades de estimulação de adesão e citocina de B16M-CM sobre células HSE. Entretanto, a produção local de IL-18 pode influenciar o comportamento da célula B16M durante sua passagem ou interrupção na microvasculatura hepática. Uma descoberta adicional foi que a incubação de células B16M com 1 ng/ml de IL-18 de camundongo durante 6 horas aumentada em 2 dobras sua adesão para HSE não-tratado, e adição de anticorpo anti-VCAM-1 para HSE diminuiu adesão mediada por IL-18 em 80%, sugerindo que a interação VCAM-1/VLA-4 foi envolvida. Similarmente, as células B16M recebendo o sobrenadante de HSE tratado por B16M-CM durante 6 horas também significantemente diminuiu (P<0,01) em 2 dobras sua adesão para HSE pelo mecanismo dependente de VCAM-1 e anticorpo anti-IL-18 aboliu este efeito de estimulação de adesão. A descoberta de acordo com a presente invenção sugere que IL-18 seja um novo elo entre a liberação hepática de citocinas pró-inflamatórias e desenvolvimento de metástase. Sua produção a partir de células HSE de ativada por tumor determina dois mecanismos complementares envolvidos na regulação de adesão de célula melanoma para células HSE: um mecanismo autócrino em HSE, que controla a super-regulagem de VCAM-1 mediado por TNF-a/IL-Ιβ, e um mecanismo pacrácrino em células B16M, que super-regula VLA-4 de célula melanoma, potencializando sua capacidade de adesão dependente de VCAM-1. Esta super-regulagem molecular simultânea de ambas contra partes de adesão de células produz al- tamente valiosos o caminho de interação de célula endotelial capilar de câncer. A adesão induzida por IL-18 de células B16M é anulada por inibidores de produção e/ou ação de IL-18. Os inibidores de produção de IL-18 incluem inibidores de caspase-1. Os inibidores de ação IL-18 são selecionados a partir de um grupo consistindo em anticorpos direcionados contra IL-18, anticorpos direcionados contra quaisquer uma das duas subunidades receptoras de IL-18 conhecidas, inibidores do caminho de sinalização de receptor de IL-18, antagonista de IL-18, que compete com IL-18 e bloqueia o receptor IL-18, e proteínas de ligação de IL-18, que ligam IL-18 e bloqueia sua atividade biológica.

Além do seu uso direto de inibidores de ação e/ou produção de IL-18, a presente invenção também contempla introdução em células onde a ação e/ou produção de IL-18 inibindo o efeito é desejado. Para este propósito um sistema para introdução específica de, por exemplo, o DNA codificando uma IL-18BP nas células é necessário. Várias possibilidades para fazer isto são conhecidas na técnica. Por exemplo, um vetor adequado portando o DNA acima pode ser introduzido nas células, o vetor sendo capaz de afetar a inserção do DNA nas células de um modo tal que o DNA seja expressado nas células. Os métodos de liberação em células são descritos entre outros, por exemplo, na Patente U.S. n° 5.910.487, WO 99/29349, e outros.

As composições farmacêuticas de acordo com a invenção para a inibição de ação e/ou produção de IL-18 são aquelas que compreendem, um ingrediente ativo, um inibidor selecionado a partir de um inibidor de cas-pase-1, um anticorpo contra IL-18, um anticorpo contra quaisquer das subunidades receptoras de IL-18, um inibidor do caminho de sinalização de receptor IL-18, um antagonista que compete com IL-18 e bloqueia o receptor de IL-18 e IL-18BP ou uma muteína, proteína fundida, derivativos funcional, fração ativa ou derivativos permutado de forma circular destes que têm a mesma atividade.

Os termos muteína, proteína fundida, derivativo funcional, fração ativa e derivativo permutado de forma circular têm o mesmo significado como em WO 99/09063.

Os anticorpos para IL-18 e IL-18BPs são os ingredientes ativos preferidos das composições farmacêuticas.

As composições farmacêuticas podem também compreender portadores convencionais, excipientes e outros ingredientes conhecidos na técnica, dependendo do seu modo de aplicação, isto é injeção, oral ou qualquer outro modo conhecido na técnica. A dosagem particular dependerá da maneira de aplicação, o peso do corpo do paciente e outros fatores e em qualquer caso será determinado pelo médico.

Tendo agora descrito a invenção, a mesma será mais facilmente entendida por meio de referencias aos seguintes exemplos que são fornecidos pelo modo de ilustração e não são entendidos ser limitantes da presente invenção.

Exemplos Reaqentes Anticorpo monoclonal VCAM-1 anticamundongo de rato e IgG anticamundongo de rato foram obtidos de Serotec Ltd. (Oxford, England). IL-1β de camundongos recombinantes foi obtida a partir de R&D System Inc. (Minneapolis, MN). O antagonista receptor de IL-1 humano recombinate (IL-1Ra foi um dado por The Upjohn Co., Kalamazoo, Ml), e receptor solúvel TNF p55 humano (TNFsR p55) foi um tipo dado por Serono Inc., Norwell, MA. O inibidor de enzima de conversão de IL-Ιβ (ICEi) foi obtido por Alexis Co. (San Diego, CA). IgG de anticorpo policlonal de IL-18 anticamundongo de coelho e IL-8 de camundongo recombinante foi comprado por Pepro Tech EC Ltd. (London, UK). A proteína de ligação de IL-18 (IL-18BP) foi produzida como descrita (28).

Cultura de células B16M, As células B16M foram cultivadas, mantidas e passadas como previamente descrito (11). O veículo condicionado B16M (B16M-CM) foi preparado como segue: 5 x 105 de células foram chapeadas em um frasco T de 25 cm2 e cultivadas durante 24 horas. Após a qual, as células foram cul- tivadas durante um período adicional de 24 horas em 5 ml de veículo livre de soro (densidade celular final de 6 x 104 de células/cm2). Os sobrenadantes foram coletados, diluídos 3:1 em veículo sem soro fresco e passado por meio de um filtro de 0,22 ím.

Análise de citocina A liberação de citocinas de células HSE cultivadas primeiro e células B16M foi avaliada empregando Kits ELISA específicos com base em IL- 1β anticamundongos e anticorpos monoclonais TNF-α, como sugerido pelo fabricante (R&D Systems, Minneapolis, MN). $ Exemplo 1: Adesão de CélulasuB16M)Quantitativa para Culturas de? HSE) Primárias. HSE foi separado de camundongos singenéicos, identificados e cultivados como previamente descrito (26). As células B16M foram rotuladas com solução de 2',7'-bis-(2-carboxietil)-5,6-carboxifluorescein-acetoximetiléster (BCECF-AM, Molecular Probes, Eugene, OR) como reportado (16). Em seguida, 2 x 105 de células/cavidade foram adicionadas à HSE cultivada em prato de cavidade 24 e 8 minutos mais tarde, as cavidades foram lavadas três vezes com veículo fresco. O número de células aderentes foi determinado empregando-se um método quantitativo com base em um sistema de avaliação de fluorescência previamente descrito (16). Em algumas experiências, as células HSE foram pré-incubadas com B16M-ÇIVP durante várias horas antes da adição de células B16M.

Exemplo 2: Ensaio de Metástase hepática.

Camundongos C57BL/6J machos IL-Ιβ'7' e ICE'7' tipo silvestre foram gerados como previamente descrito (27). Camundongos com seis a oito semanas de vida, resididos cinco por jaula, foram empregados. As metástase hepáticas foram produzidas pela injeção intra-esplênica em camundongos anestesiados (Nembutal, 50 mg/Kg intraperitoneal) de 3 x 105 de células de melanoma B16 viáveis suspensas em 0,1 ml de solução de sal equilibrada de Hank. Os camundongos foram mortos sob anestesia no décimo dia após a injeção de células de câncer. Os tecidos do fígado foram processados para histologia. A análise densitométricas de imagens micros- cópicas digitalizadas foi empregada para descriminar B16M metastático de tecido hepático normal e a densidade de metástase do fígado, que o número de metástase por 100 mm3 de fígado (com base no número médio de foco detectado em quinze seções de 10 x 10 mm2 por fígado), foi calculado empregando procedimentos estereológicos previamente descritos (17).

Exemplo 3: Metástase Reduzida e Desenvolvimento de Células B16M Injetadas em Camundongos Deficientes ICE e IL-1 β.

Duas experiências independentes, um ano aparte, foram realizadas empregando duas diferentes bateladas das mesmas células B16M injetadas intra-esplenicamente em camundongos IL-1 β'7" e ICE'7' tipo silvestre C57B1/6J adultos. A inspeção necrópsica demonstrou tumores melanóti-cos visíveis no baço de todos os camundongos ensaiados, sem diferença significante no tamanho como avaliado pelo peso do baço (Tabela 1). Ao contrário, uma diminuição notada em metástase ocorreu em fígados de camundongos IL-Ιβ'7' e especialmente ICE'7’ comparado com fígados de camundongos tipo silvestres (Fig. 1). Uma análise histológica quantitativa em número e tamanho de foco metastático foi realizada para determinar a parâmetros de volume (percentual de ocupação de órgão) e densidade de metástase (quanto ao n° de foco/100 mm3) em fígados de camundongos estudados. Comparado com o camundongo tipo silvestre (Tabela 1), a densidade da metástase hepática significantemente diminuiu (P<0,01) em fígados de camundongos ICE'7' e IL-Ιβ'7' de 84% para 90%, indicando que a maioria das células B16M injetadas foram incapazes de implantar-se no tecido hepático desses camundongos. Além disso, o volume de metástase também diminuiu significantemente (P < 0,01) em fígados de camundongos ICE'7' e IL-Ιβ'7' de 6 a 7 dobras, quando comparados com os valores em fígados de camundongos tipo silvestre, indicando que células B16M sucedendo para colonizar fígado tem também uma taxa de desenvolvimento reduzida. Nós também observamos uma diferença nesses parâmetros de metástase entre fígados de camundongos IL-Ιβ'7' e ICE'7', induzindo à erradicação da metástase em quase todos fígados de camundongos ICE"7' da experiência I (Fig. 1).

Tabela 1 Análise histológica quantitativa sobre a colonização hepática experimental de células B16M injetadas intran-esplenicamente em camundongos ll_-l% e ICE°/o Grupo de Camundongo Densidade de Metástase Volume de Metástase (quanto ao n° de (quanto ao percentual _________________________foco/1 OOmm3)__________de volume de fígado) Experiência I

Camundongos tipo silvestre 234,16 ± 58,36 66,18% Camundongos IL-I% 25,18 ±21,02* 10,05% Camundongos ICE% 13,56 ±16,20* 2,1% Experiência II

Camundongos tipo silvestre 198,40 ± 100,54 59,62% Camundongos IL-I β% 33,79 ± 19,89* 9,70% Camundongos ICE% 27,73 ± 15,68* 8,08%_________________________________________________________ Os dados representam valores médios + SD de duas experiências independentes (7 a 15 camundongos por grupos de experiência foram empregados). *Diferenças que foram estatisticamente significante ( dois lados, p<0,01) com respeito a camundongos tipo silvestre empregando a análise de variação (ANOVA) e o teste Scheffe F, são indicados.

Exemplo 4: IL-18 Autócrino media Adesão Induzida por TNF-a- e IL-Ιβ- de HSE ativado por B16M-CM. ÇB16M-CM significantemente (p< 0,01) aumento a produção de célula HSE de TNF-oc e IL-Ιβ, e sua adesão para outras células B16M in vitro (fig. 2). A incubação de HSE com 10 μΜ ICEi durante 18 horas anulou completamente adesão induzida por B16M-CM sem diminuir a produção de TNF-α de HSE. Ratos IL-Ιβ exoginamente adicionados não compensam para o efeito de bloqueio de ICEi sobre HSE, que está em contraste com o aumento de adesão de célula B16M significante em HSE de controle tratado por IL-Ιβ- (figura 3). O fato de que o realce de adesão é induzido por B16M-CM foi abolido na presença de concentrações elevadas de TNF-oc endoge-namente produzido, e IL-Ιβ exogenamente adicionado indica que nenhuma dessas citocinas diretamente desregulou a adesão de HSE. Com a importância, a presença de anticorpolL-18 de anti-rato adicionado ao HSE antes da estimulação com B16M-CM prevenindo a adesão induzida de B16M-CM sem afetar a produção de TNF-α e IL-Ιβ de HSE (fig. 2). Além disso, anticorpo anti-IL-18 também preveniu os efeitos da adesão por estimulação de rato IL-Ιβ e TNF-α sobre HSE (fig. 3), indicando que a ação de pró-adesão destas citocinas em HSE foram ambos mediados -18-IL. RT-PCR confirmado que células HSE expressam gene IL-18 (dados não conhecidos). Contrariamente, IL-18 de rato significantemente aumentou (p < 0,01) a adesão de célula B16M em HSE (fig.4), e nem TNF-sR p55 nem IL-1Ra foram capazes de inibi-lo, confirmando que nem o TNF-α autócrino nem IL-Ιβ contaram para adesão de HSE induzida por IL-18. Entretanto, como mostra na Figura 4, anticorpo anti-VCAM-1 inibiu completamente a adesão de células B16M para HSE tratado com IL-18. Ig-G não específico de controle não afetou a super-regulagem de adesão de célula B16M para HSE tratado por IL-18. Exemplo 5:ClL-18BP/previne a adesão de células de melanona B16 induzidas pelo veículo condicionado por B16.

Como mostrado na Tabela 2, a adição de IL-18BP com HSE estimulada com B16-CM reduziu o percentual de células aderentes de 35% para 8,70% (p< 0,01). Isto representa uma inibição de 100% desde que o nível de adesão seja abaixo do nível de células aderentes empregando veículo basal. Este resultado sugere que IL-18 endógeno a partir do HSE pode ser uma fonte de endógenos de IL-18 além daquela presente no B16M-CM.

Tabela 2 Efeito inibidor deJL-1BP\sobre adesão de veículo condicionado B-16 de células de melanoma B16 para Células Endotelial Sinusoidal Hepática.

Percentual de Adesão de Célula de Melanoma Veículo Basal 10,15 ±1,5 B16-CM 35,10 ±4,4 B16-CM/IL-18BP (1 ng/ml) 15,00 ± 2,5** B16-CM/IL-18BP (10 ng/ml)____________________8,70 ±1,1**____________ Os dados representam valores SD + médios de duas experiências independentes feitas multiplicadas por seis (N=12) **Diferenças que foram estatisticamente significante (dois lados, p < 0,01) com respeito a B16-CM empregando a análise de variação (ANO-VA) e o teste Scheffe F, são indicados.

Referências 1. Kohn, E. C., e Liotta, L.A.(1995) Câncer Res 55(9), 1856-62. 2. Nicolson, G. L., e Winkelhake, J. L. (1975) Nature 255, 230-232. 3. Freedmar, A., Munro, M., Rice, G. E., Bevilacqua, Μ. P., Morimoto, C., Mclntyre, B. W., Rhynhart, K., Pober, J. S., e Nadler, L. M. (1990) Science 249, 1030-1033. 4. Miyake, M., Fuchimoto, S., Iwagaki, H., Matsubara, N., Edamatsu, R., Hi-ramatsu, M., e Orita, K. (1991) Res. Comm. Chem. Pathol. Pharmacol. 71, 293-307. 5. Simmons, P. J., Masinovsky, B., Longenecker, Β. M., Berenson, R., Torok-Storb, B., e Gallatin, W. M. (1992) Blood 80 (2), 388-95. 6. Rice, G. E., e Bevilacqua, Μ. P. (1989) Science 246, 1303-1306. 7. Okahara, H., Yagita, H., Miyake, K., e Okumura, K. (1994) Câncer Res 54, 3233-3236. 8. Garofalo, A., Chirivi, R. G. S., Foglieni, C., Pigot, R., Mortarini, R., Martin-Padura, I., Anichini, A., Gearing, A. J., Sanchez-Madrid, F., Dejana, E., e Giavazzi, R. (1995) Câncer Res 55, 414- 419. 9. Martin-Padura, I., Mortarini, R., Lauri, D., Bernasconi, S., Sanchez-madrid, F., Parmiani, G., Mantovani, A., Anichini, A., e Dejana, E. (1991) Câncer Res 51,2239-2241. 10. Lauri, D., Bertomeu, M.-C., e Orr, F. W. (1990) Clin Exp Metastasis 8, 27-32. 11. Anasagasti, M. J., Alvarez, A, Martin, J. J., Mendoza, L., e Vidal-Vanaclocha, F. (1997) Hepatology 25, 840-846. 12. Bani, M. R., Garofalo, A., Scanziani, E., e Giavazzi, R.(1991) J. Natl. Câncer Inst. 83, 119-123. 13. Bertomeu, M. C., Gallo, S., Lauri, D., Haas, T. A., Orr, F. W., Bastida, E., e Buchanan, M. R. (1993) Clin Exp Metastasis 11,243-250. 14. Burrows, F. J., Haskard, D. O., Hart, I. R., Marshall, J. F., Selkirk, S., Po-ole, S., e Thorpe, P. E. (1991) Câncer Res 51,4768-4775. 15. Chirivi, R. G. S., Garofalo, A., Padura, I. M., Mantovani, A., e Giavazzi, R. (1993) Câncer Res 53, 5051-5054. 16. Vidal-Vanaclocha, F., Amézaga, C., Asumendi, A., Kaplanski, G., e Dinarello, C. A.(1994) Câncer Res 54, 2667-2672. 17. Vidal-Vanaclocha, F., Alvarez, A., Asumendi, A., Urcelay, B., Tonino, P., e Dinarello, C. A.(1996) J Natl Câncer Inst 88, 198-205. 18. Malik, S. T., Naylor, M. S., East, N„ Oliff, A., e Balkwill, F. R. (1990) Eur J Câncer 26, 1031-1034. 19. Orosz, P., Echtenacher, B., Falk, W., Ruschoff, J., Weber, D., e Mannel, D. N. (1993) JExp Med 177, 1391-1398 20. Orsoz, P., Krüger, A., Hubbe, M., Rüschoff, J., Von, Hoegen, P., e Mannel, D. N. (1995). Int. J. Câncer 60, 867-871. 21. Mendoza, L., Olaso, E., Anasagasti, M. J., Fuentes, A., e Vidal-Vanaclocha, F. (1998) J Cell Physiol 174, 322-330 22. bazan, J. F., Timans, J. C., e Kastelein, R. A., (1996) Nature 379, (6566), 591. 23. Okamura, H., Tsutsui, H., Komatsu, T., Yutsudo, M., Hakura, A., Tani-moto, T., Torigoe, K., Okura, T., Nukada, Y., Hattori, K., Akita, K., Namba, M., Tanabe, F., Konishi, K., Fukuda, S., e Kurimoto, M. (1995) Nature 378, 88-91. 24. Tsutsui, H., Matsui, K., Kawada, N., Hyodo, Y., Hayashi. N., Okamura, H., Higashino, K., e Nakanishi, K. (1997) J Immunol 159 (8), 3961-7. 25. Puren, A., J., Fantuzzi, G., Gu. Y., Su, M. S.-S., e Dinarello, C. A.(1998) J Clin Invest 101,711-724. 26. Vidal-vanaclocha, F., Rocha, M., Asumendi, A., e Barbera-Guillem, E. (1993) Hepatology 18, 328-339. 27. Fantuzzi, G., Puren, A.J., Harding, M. W., Livingston, D. J., e Dinarello, C. A.(1998) Blood 91,2118-2125. 28. Novick, D., Kim, S-H., Fantuzzi, G., Reznikov, L.L., Charles A. Dinarello, C. A., e Rubinstein, M. (1999) Immunity 10, 127-136. REIVINDICAÇÕES f ‘

Claims (3)

1. Uso de anticorpos contra 1L-18 e IL-18BP, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de medicamentos para inibir metástase tumo-ral de melanoma.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o melanoma é um melanoma hepático.

3. Uso de um vetor de expressão codificando para anticorpos contra IL-18 e IL-18BP como definidos na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de medicamentos para inibir metástase tumo-ral do melanoma.