MXPA02000838A - Uso de inhibidores de interleucina-18 para inhibir metastasis tumoral. - Google Patents

Abstract

Se describe el uso de inhibidores de IL-18 para inhibir la metastasis tumoral; se prefiere el uso de la proteina de union a IL-18 (IL-18BP).

Description

USO DE INHIBIDORES DE INTERLEUCINA-18 PARA INHIBIR METÁSTASIS TUMORAL CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a metástasis de tumores y a los medios para inhibirlas. Más específicamente, la invención se refiere a la prevención de metástasis tumoral al inhibir la producción y/o acción de interleucina-18 (IL-18).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La adhesión de células cancerosas en circulación al endotelio capilar es un paso crítico en la génesis de metástasis (1,2). La molécula-1 de adhesión celular vascular (VCAM-1 ), un miembro de la superfamilia de inmunoglobulina, media la adhesión de la células hematopoyéticas y leucocitos activados a las células endoteliales activadas por citocina proinflamatoria (3-5). Sin embargo, la función adhesiva de VCAM-1 puede usurparse por células cancerosas de animal y de humano para potenciar la diseminación metastásica experimental (6). Por ejemplo, se sabe que IL-1 ß y TNF-a potencian la metástasis de células de melanoma que expresan VLA-4 en tejido de pulmón, mediante un mecanismo que implica la sobrerregulación de la expresión de VCAM-1 mediante células endoteliales (7-9). Se ha demostrado que IL-1 y TNF-a contribuyen significativamente a la colonización hepática de células B16M tanto en ratones normales como en ratones tratados con lipopolisacárido (7,8,10-20). Además, la activación de la célula de endotelio sinusoidal hepático (HSE) mediada por el receptor de mañosa implica la expresión de VCAM-1 de la célula del HSE mediada por IL-1 ß llevando a un incremento en la adhesión y metástasis de células (21 ). Se ha mostrado que las células del HSE activadas por IL-1 ß liberan factores estimulantes de VLA-4, los cuales potencian la adhesión celular de B16M a las células del HSE (11 ). Por lo tanto, IL-1 ß induce la expresión de VCAM-1 y la liberación del factor estimulante de VLA-4 a partir de las células del HSE, lo cual puede conferirles una capacidad para crear un microambiente prometastásico para ciertas células cancerosas que expresan VLA-4 arrestadas intrasinusoidalmente. Sin embargo, bloqueando IL-ß y TNF-a se lleva solamente a una anulación parcial de la metástasis, indicando que otros factores ya sea compensadores para su ausencia, o que actúan mediante rutas alternativas también están implicados. Además, la mayoría de las células cancerosas metastásicas y los tejidos blanco son incapaces de producir estas citocinas pro-inflamatorias. Además, la concentración de endotoxina o de ligando del receptor de mañosa usualmente no se incrementa suficientemente para inducir la liberación de citocina pro-inflamatoria. Por lo tanto, no están bien caracterizados los mediadores múltiples que evocan la sobrerregulación de VCAM-1 y su ambiente durante el tránsito capilar de las células cancerosas.

IL-18 (factor de inductor IFN?) es una citosina novedosa que comparte características estructurales con la familia de proteínas IL-1 (22) y propiedades funcionales con IL-12 (23). Se ha reportado que IL-18 funciona a partir de las células de Kupffer activando tanto TNF-a y FAS como las rutas hepatotóxicas mediadas por el ligando (24) en el daño hepático inducido por endotoxina. Más recientemente, se ha revelado que también posee propiedades proinflamatorias al dirigir la estimulación de la expresión del gen y síntesis de TNF-a a partir de células CD3+/CD4+ y asesinas naturales con producción subsecuente de L-1 ß e IL-8 a partir de la población CD14+, por lo tanto revelando una posición pivotal inesperada de IL-18 en la jerarquía de citocinas (25). Sin embargo, su papel principal en la metástasis cancerosa no se ha elucidado aún. Una proteína de unión a interlucina-18 (IL-18BP) se purificó a partir de la orina mediante cromatografía sobre una matriz revestida con IL-18, se secuenció, clonó y expresó en células COS7. La IL-18BP anuló la inducción de IL-18 de interferón-? (IFN-?), IL-8 y la activación de NF-kB in vitro. La administración de IL-18BP a los ratones anuló la circulación de IFN-? después de LPS. Por lo tanto, la IL-18BP funciona como un inhibidor de la respuesta temprana de citocina Th1. La IL-18BP se expresa constitutivamente en el hígado, pertenece a la superfamilia de inmunoglobulina y tiene homología limitada al receptor de IL-1 tipo II. Su gen se localizó en el cromosoma humano 11 q13 y no se encontró ningún exón que codifica para un dominio transmembranal en una secuencia genómica de 8.3 kb. Varios virus que causan erupciones que codifican proteínas putativas altamente homologas a IL-18BP, sugieren que los productos virales pueden atenuar IL-18 e interferir con las respuestas citotóxica de la célula T (28 y WO99/09063). Como se describió más particularmente en WO 99/09063, las IL-18BP, muteínas, los derivados funcionales de proteínas de fusión, fracciones activas o derivados circularmente permutados y mezclas de los mismos son capaces de unir a IL-18 y/o son capaces de modular la actividad de IL-18 y/o son capaces de bloquear la actividad de IL-18.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se provee para el uso de inhibidores de producción y/o acción de IL-18 en la preparación de medicamentos para inhibir la metástasis tumoral. Los inhibidores de la producción de IL-18 son por ejemplo inhibidores de la caspasa-1. Los inhibidores de la acción de IL-18 se seleccionan a partir de anticuerpos en contra de IL-18, anticuerpos en contra de IL-18, anticuerpos en contra de cualquiera de las unidades de receptor IL-18, inhibidores de la ruta de señalización del receptor IL-18, antagonistas de IL-18 los cuales compiten con IL-18 y bloquean el receptor IL-18BP, y IL-18BP, muteínas, proteínas de fusión, derivados funcionales, fracciones activas o derivados circularmente permutados de los mismos los cuales se unen a IL-18.

Preferiblemente los inhibidores utilizados son IL-18BP, o una muteína, proteína de fusión, derivado funcional, fracción activa o permutada circularmente derivada de la misma la cual tiene la misma actividad que IL- 18BP. 5 Las composiciones farmacéuticas para la inhibición de la producción y/o acción de IL-18 para inhibir la metástasis tumoral también se proveen mediante la presente invención. Otra manera de inhibir la producción y/o acción de IL-18, con el objeto de inhibir la metástasis tumoral, es la introducción dentro del cuerpo de 10 un vector de expresión que comprende la secuencia codificante para un inhibidor de la producción y/o acción de IL-18, tal como una IL-18BP.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS 15 Figura 1. Colonización hepática experimental después de la inyección intraesplénica de células B16M en los ratones de tipo silvestre, IL-1 ß"A y ICE"'". Los hígados se removieron al día 10 después de la inyección de célula B16M y se fijaron en amortiguador salino de fosfato con formaldehído al 10%. Casi todas las metástasis experimentales (nodulos 20 melanóticos negros) se erradicaron a partir de los hígados de los ratones IL- I ß^ e lCE^'. Figura 2. Efecto del inhibidor irreversible ICE y del anticuerpo IL- 18 anti-ratón sobre la adhesión celular de B16M a las células HSE y, producción de IL-1 ß y TNF-a a partir de HSE no tratadas y tratadas con B16M-CM. Las células HSE cultivas se incubaron en la presencia de B16M-CM por 10 horas. En algunos experimentos, tanto las células HSE no tratadas como tratadas recibieron ICEi 10 µm o 10 µg/ml de anticuerpo anti IL-18 de ratón antes de B16M-CM. El porcentaje de células B16M adheridas al substrato HSE se calculó como un valor relativo con respecto al número inicial de células añadidas. Además, los sobrenadantes de cultivo se recuperaron antes de la adhesión para determinar la concentración de IL-18 y TNF-a mediante ELISA. Los datos representan la media ±DE de 4 experimentos separados, cada uno por sextuplicado (n=24). El aumento de la adhesión de células B16M a HSE tratadas con B16M-CM y de la producción de IL-1 ß o TNF-a con respecto a HSE (*P<0.01 ) no tratadas fue estadísticamente significativa de conformidad con la prueba t de Student de dos colas, no apareada. No hubieron cambios estadísticos significativos en la producción de IL-1 ß o TNF-a y en la adhesión de células B16M a células del HSE cuando éstas se trataron con ICEi o con anticuerpo anti-IL-18 en la ausencia de B16M-CM (datos no mostrados). Figura 3. Efecto de ICEi sobre la adhesión de la célula B16M a HSE in vitro tratado con B16M-CM. Las células del HSE se incubaron con medio basal o B16M-CM por 8 horas. Algunas células del HSE recibieron ICEi 10 µm por 18 horas antes de B16M-CM. Además, también se añadió 1 ng/ml de IL-1 ß recombinante de murino a algunas células del HSE junto con B16M-CM por 8 horas. En otros experimentos, las células del HSE recibieron 1 ng/ml de IL-1 ß de murino o 100 pg/ml de TNF-a por 6 horas, y 10 µg/ml de anticuerpo policlonal de conejo IL-18 anti-ratón que se añadió o no 1 hora antes del tratamiento con citocina. El anticuerpo policlonal IgG no específico también se añadió a las células del HSE no tratadas y tratadas con citoc a. Luego, las células del HSE se lavaron y las células B16M se marcaron con BCEFCF-AM y se añadieron y lavaron de nuevo 8 minutos después. El porcentaje de células B16M adheridas al substrato HSE se calculó como valor relativo con respecto al número inicial de células añadidas. Los resultados representan la media ±DE de tres experimentos separados, cada uno por sextuplicado (n=18). Las diferencias en el grado de adhesión con respecto al HSE (*) no tratado y a HSE (**) tratado con IL-1 ß o TNF-a fueron estadísticamente significativas (P<0.01 ), de conformidad con la prueba t de Student de dos colas, no apareada. Los cambios no fueron estadísticamente significativos en la adhesión de las células B16M a otras células del HSE control tratadas con ICEi que adicionalmente recibieron o no 1 ng/ml de IL-1 ß de murino por 8 horas (datos no mostrados). Figura 4. La adhesión de las células B16M in vitro a HSE tratado con IL-18. Las células del HSE se incubaron con 1 ng/ml de IL-18 recombinante murino por 6 horas. En algunos experimentos, 10 µg/ml de TNF-sRp55 o 100 ng/ml de IL-1 Ra se añadieron 10 minutos antes de la IL-18. En otros experimentos, 10 µg/ml de anticuerpo anti-VCAM-1 o una concentración similar de anti-lgG de ratón no específica se añadió a las células del HSE 30 minutos antes de las células B16M. Entonces, el porcentaje de adhesión de la a. * - - ? s? célula B16M se determinó como se describe aquí a continuación en los ejemplos. Los resultados representan la media ±DE de tres experimentos separados, cada uno por sextuplicado (n=18). Las diferencias en el grado de adhesión con respecto al HSE tratado con medio basal (*) y al HSE (**) tratado con IL-18 fueron estadísticamente significativas (P<0.01 ), de conformidad con la prueba t de Student de dos colas, no apareada.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 10 Varias citocinas pro-inflamatorias, incluyendo interleucina (IL)-1ß y fajctor de necrosis tumoral-alfa (TNF-a), promueven la adhesión de las células cancerosas a las células endoteliales, por lo tanto llevando a la diseminación metastásica de los tumores. Estas citocinas pro-inflamatorias pronueven la adhesión y la metástasis al inducir probablemente a la 15 mol cula-1 de adhesión celular vascular (VCAM-1 ). La presente invención muestra que el tratamiento de las células del HSE de murino de cultivo prirrario con medio acondicionado (CM) de cultivos de célula de melanoma B16 (B16M) (B16M-CM) promueve la adhesión entre células B16M y HSE in vitrc. B16M-CM también induce la producción de IL-1 ß y TNF-a mediante 20 células del HSE in vitro. Sin embargo, no se ha demostrado claramente que la metástasis tumoral se media de hecho por IL-1 ß y TNF-a. La presente invención muestra que B16M-CM induce la producción de IL-18 mediante células del HSE y que IL-18 es la citocina que ?tt?Haáet- ?? contribuye a la adhesión incrementada de las células B16M a células del HSE. IL-18 mejora la adhesión al activar la expresión de VCAM-1 en las células del HSE sin implicar TNF-a o IL-1 ß. La incubación de las células del HSE con un inhibidor específico a caspasa-1 (10 µM, 18h) anula completamente la adhesividad inducida por B 16M-CM sin diminuir la producción de TNF-a, y el efecto no se revierte mediante la adición de IL-1 ß de ratón. La adición del anticuerpo anti-IL-18 de murino a las células del HSE previene la adhesividad inducida por B16M-CM, sin interferir con la inducción de IL-1 ß y TNF-a por B16M-CM. Similarmente, la proteína de unión a IL-18 recientemente clonada (IL-18BP) también previene la adhesividad inducida por B16M-CM de B16M a las células del HSE in vitro. Los inhibidores de TNF-a e IL-1 ß tales como el receptor -TNF soluble P55 o el antagonista del receptor IL-1 fueron incapaces de revertir está adhesión inducida por IL-18. Por lo tanto, la presente invención provee inhibidores de producción y acción de IL-18 como herramienta para inhibir la metástasis tumoral. Los inhibidores de la producción de IL-18 incluyen inhibidores de caspasa-1. Los inhibidores de la acción de IL-18 se seleccionan a partir de un grupo que consiste de anticuerpos dirigidos en contra de IL-18, anticuerpos dirigidos en contra de cualesquiera de las dos subunidades conocidas del receptor IL-18, inhibidores de la ruta de señalización del receptor de IL-18, antagonistas de IL-18, los cuales compiten con IL-18 y bloquean el receptor IL-18 y proteínas de unión a IL-18, las cuales se unen a IL-18 y bloquean su actividad biológica. La presente invención se refiere al posible papel de IL-18 en la t.t,. t y. tt ?.jkxtiX. * i » ...?yy .. .. ** *- +,„«. *. . . X . .? . Z . * . y - . á --. . ?y* i I ... sobrerregulación mediada por citocina proinflamatoria de la expresión de VCAM-1 , su posible interacción con otras citocinas y medios para prevenir esta inducción de VCAM-1. Se encontró de conformidad con la presente invención que IL-18 opera en el inicio de los eventos proinflamatorios que llevan a la sobrerregulación de VCAM-1 en la pared sinusoidal hepática y por lo tanto, facilita la adhesión y metástasis de células cancerosas. Las células del HSE de ratón de cultivo primario tratadas con B16M-CM se utilizaron como modelo de activación de célula endotelial dependiente de célula cancerosa con el objeto de explotar el papel de IL-18 inducida por la célula B16M sobre el mecanismo de la adhesión de la célula de B16M al HSE mediante un mecanismo dependiente de VCAM-1. El papel específico de IL-18 se examinó bajo condiciones de bloqueo específico del receptor de I L-1 con el uso de inhibición de la secreción de IL-1 Ra, IL-1 ß maduro e IL-18 utilizando un inhibidor irreversible de la enzima que convierte IL-1 (ICEi), bloqueo de TNF-utilizando el receptor -TNF soluble p55 (TNF-sR p55) y bloqueo de la función IL-18 utilizando anticuerpos anti-IL-18 y proteínas de unión a IL-18. Además las células, B16M se inyectaron intraesplénicamente en ratones ICE"? e IL-1 ß"? . La baja densidad de metástasis observada en los ratones deficientes en comparación con los controles normales sugiere la participación de IL1 ß y posiblemente IL-18 en el papel prometastásico de la inflamación (cuadro 1 ). Los experimentos in vitro llevados a cabo mostraron que la producción de IL-18 cuenta para los efectos estimulantes de la adhesión al HSE inducidos por los sobrenadantes derivados a partir de las células. Puesto que la sobrerregulación de B16M cuenta para toda la actividad estimulante de adhesión del HSE tratado con B16M-CM, los datos indican que IL-18 media la expresión de VCAM-1 a partir del HSE inducido por citocina. Además, los anticuerpos a IL-18 disminuyeron la adhesión de la célula inhibida por B16M- 5 CM sin afectar la producción de TNF-a e IL-1 ß a partir de las células del HSE. Por lo tanto, la producción de IL-1 ß e TNF-a en las células del HSE fue independiente de IL-18 y no contribuyó a la adhesión. Contrariamente, ni TNF- sR p55 ni IL-1 Ra fueron capaces de inhibir el incremento en la adhesión en las células del HSE tratadas con IL-18, confirmando que ni TNF-a ni IL-1 ß 10 autócrinos contaron para la adhesividad del HSE inducida por IL-18. Los resultados en las células del HSE están en contraste con aquellos obtenidos en otros sistemas celulares, como por ejemplo en las células mononucleares sanguíneas de humano no CD14+ (25), en donde IL-18 induce la producción de TNF-a mediante IL-1 ß. Es probable que exista una 15 jerarquía de citocina proinflamatoria específica para el HSE en la cual TNF-a e IL-1 ß son independientes del control IL-18, pero utilizan IL-18 como un mediador hacía el extremo 3' de la sobrerregulación VCAM-1. A diferencia de las células HSE de murino, las células B16M no expresan el gen IL-18 como se monitorea mediante RT-PCR, y la incubación 20 con ICEi por 18 horas no anula las actividades de citocina y estimulante de la adhesión de B16M-CM en células del HSE. Sin embargo, la producción local de IL-18 puede influir la conducta de la célula B16M durante su tránsito o arresto en la microvasculatura hepática. Un hallazgo adicional fue que la ¡ ^^ ^ xa?^ incubación de la célula B16M con 1 ng/ml de IL-18 de murino por 6 horas incrementó dos veces su adhesión al HSE no tratado, y la adición del anticuerpo Anti-VCAM-1 al HSE disminuyó la adhesión mediada por IL-18 en un 80%, sugiriendo que estaba implicada la interacción VCAM-1?/LA-4. Similarmente, las células B16M que reciben el sobrenadante a partir del HSE tratado con B16M-CM por 6 horas también incrementaron significativamente (PO.001 ) 2 veces su adhesión al HSE mediante mecanismos dependientes de VCAM-1 y el anticuerpo anti-IL-18 anuló este efecto estimulante de la adhesión. Los hallazgos de conformidad con la presente invención sugieren que IL-18 es un vínculo novedoso entre la liberación hepática de citocinas proinflamatorias y el desarrollo metastásico. Su producción a partir de células del HSE activadas por tumor determina dos mecanismos complementarios implicados en la regulación de la adhesión de la célula de melanoma a las células del HSE: un mecanismo autócrino en el HSE, el cual controla la sobrerregulación de VCAM-1 mediada por TNF-a/IL-1 ß, y un mecanismo parácrino en las células B16M, el cual sobrerregula las células de melanoma VLA-4, potenciando su capacidad de adhesión dependiente de VCAM-1. Está sobrerregulación molecular simultanea en ambas contrapartes de adhesión celular hace altamente valiosa la ruta de interacción cáncer-célula endotelial capilar. La adhesión inducida por IL-18 de las células B16M se anula mediante inhibidores de la producción y/o acción de IL-18. Los inhibidores de la producción IL-18 incluyen inhibidores de caspasa-1. Los inhibidores de la acción de IL-18 se selecciona a partir de un grupo que consiste en antibióticos dirigidos en contra de IL-18, anticuerpos dirigidos en contra de cualesquiera de las dos subunidades conocidas para el receptor IL-18, inhibidores de la ruta de señalización del receptor IL-18, antagonistas de IL-18, los cuales compiten con IL-18 y bloquean el receptor IL-18, y proteínas de unión a IL-18, las cuales se unen a IL-18 y bloquean su actividad biológica. Además del uso directo de los inhibidores de la producción y/o acción de IL-18, la presente invención también contempla la introducción dentro de las células en donde se desea la producción de IL-18 y/o acción del efecto inhibidor. Para este propósito es necesario un sistema para introducción específica de, por ejemplo ADN que codifica una IL-18BP dentro de la célula. Se conocen varias posibilidades para realizar esto en la técnica. Por ejemplo, un vector adecuado que porta el ADN anteriormente mencionado puede introducirse dentro de las células, el vector siendo capaz de efectuar la inserción de ADN dentro de las células de manera que ADN se expresa en las células. Los métodos de administración dentro de la células se describen entre otros, por ejemplo en la patente de E.U.A. 5,910,487 WO99/29349, y otros. Las composiciones farmacéuticas de conformidad con la invención para la inhibición de la producción y/o acción de IL-18 son aquellas que comprenden, como ingrediente activo un inhibidor seleccionado a partir de un inhibidor de caspasa-1 , un anticuerpo contra IL-18, un anticuerpo contra cualesquiera de las unidades del receptor IL-18, un inhibidor de la ruta de señalización del receptor IL-18, un antagonista el cual compite con IL-18 y bloquea el receptor IL-18 y IL-18BP o una muteína, proteína de fusión, derivado funcional, fracción activa o permutada circularmente derivada de los mismos la cual tiene la misma actividad. Los términos muteína, proteína de fusión, derivado funcional, fracción activa y derivado permutado circularmente tiene los mismos significados que en el documento WO99/09063. Los anticuerpos a IL-18 y IL-18BP son los ingredientes activos preferidos de las compuestos farmacéuticos. Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender vehículos convencionales, excipientes y otros ingredientes conocidos en la técnica, dependiendo de su modo de aplicación, es decir inyección, oral o cualquier otra ruta conocida en la técnica. La dosis particular dependerá de la manera de aplicación, el peso corporal del paciente y otros factores y en cada caso será determinado por el médico. Habiendo actualmente descrito la invención, la misma se entenderá más fácilmente a través de la referencia a los siguientes ejemplos que se proveen a manera de ilustración y que no se pretende que limiten la presente invención.

EJEMPLOS Reactivos: IgG de rata anti-ratón y anticuerpo monoclonal VCAM-1 de rata anti-ratón se obtuvieron a partir de Serotec Ltd. (Oxford, Inglaterra). IL-ß recombinante de murino se obtuvo a partir de R&D System Inc. (Minneapolis, MN). El antagonista al receptor IL-1 recombinante humano (IL-1 Ra fue un amable regalo de The Upjohn Co., Kalamazoo, Ml) y el receptor soluble p55 TNF de humano (TNFsR p55) fue un amable regalo de Serono Inc., Norwell, MA. El inhibidor IL-ß para enzima de conversión (ICEi) se obtuvo a partir de Alexis Co. (San Diego, CA). La IL-18 recombinante de murino e IgG anticuerpo monoclonal IL-18 de conejo anti-ratón se compró a partir de PeproTech EC Ltd. (Londres, UK). La proteína de unión a IL-18 (IL-18BP) se produjo como se describió (28).

Cultivo de células B16M Las células B16M se cultivaron, mantuvieron y se realizaron pasajes como previamente se describió (11 ). El medio acondicionado con B16M (B16M-CM) se preparó como sigue: 5 x 105 células se sembraron en una botella T de 25 cm2 y se cultivaron por 24 horas. Después de lo cual, las células se cultivaron por un período adicional de 24 horas en 5 ml de medio libre de suero (densidad celular final de 6 x 104 célula/cm2). Los sobrenadantes se colectaron, diluyeron 3:1 en medio fresco libre de suero y se pasaron a través de un filtro de 0.22 µm.

Análisis de citocina La liberación de citocina a partir de las células del HSE de cultivo primario y células B16M se midió utilizando equipos específicos para ELISA basándose en los anticuerpos monoclonales IL-ß y TFN-a anti-ratón, como se sugiere por el fabricante (R&D Systems, Minneapolis, MN).

EJEMPL0 1 Adhesión cuantitativa de célula B16M a los cultivos primarios del HSE El HSE se separó a partir de ratones singenéicos, se identificó y cultivó como previamente se describió (26). Las células B16M se marcaron con solución de 2',7'-bis-(2-carboxietil)-5,6-carboxifluorescein- acetoximetiléster (BCECF-AM, Molecular Probes, Eugene, OR) como se reportó (16). Luego, 2 x 105 células/pozo se añadieron al HSE cultivado en una caja de 24 pozos y 8 minutos después, los pozos se lavaron tres veces con medio fresco. El número de células adheridas se determinó usando un método cuantitativo basándose en el sistema de medición de fluorescencia descrito previamente (16). En algunos experimentos, las células del HSE se pre-incubaron con B16M-CM por varias horas antes de la adición de células B16M.

EJEMPLO 2 Ensayo de metástasis hepática Los ratones C57BL/6J de tipo silvestre IL-ß-/- y ICE-/- se generaron como previamente se describió (27). Se utilizaron ratones de seis a ocho semanas de edad, alojados cinco por caja. Las metástasis hepáticas se produjeron mediante la inyección intraesplénica en de ratones anestesiados (Nembutal, 50 mg/kg intraperitoneal) de 3 x 105 células de melanoma B16 viables en 0.1 ml de solución salina balanceada de Hanks. Los ratones se sacrificaron bajo anestesia al décimo día después de la inyección de células cancerosas. Los tejidos hepáticos se procesaron para histología. Los análisis densitométricos de las imágenes microscópicas digitalizadas se utilizaron para discriminar la metástasis de B16M a partir del tejido hepático normal y se calculó la densidad de metástasis del hígado, el cual es el número de metástasis por 100 mm3 de hígado (basándose en el número medio de foci detectados en quince secciones de 10 x 10 mm2 por hígado), utilizando procedimientos estereológicos previamente descritos (17).

EJEMPLO 3 Metástasis reducida v crecimiento de células B16M inyectadas dentro de ratones deficientes en IL-13 e ICE Dos experimentos independientes, un año aparte, se llevaron a cabo utilizando dos lotes diferentes de las mismas células B16M inyectadas intraesplénicamente en ratones adultos C57BL/6J de tipo silvestre, ICE_/" y IL-1 ß ". La inspección necrópsica demostró tumores melanóticos visibles en el bazo a partir de todos los ratones ensayados, sin diferencias significativas en el tamaño como se evaluó mediante peso esplénico (cuadro 1 ). En contraste, ocurrió una disminución marcada en la metástasis en los hígados de ratones IL-1 ß"/_ y, especialmente, ICE" " en comparación con los hígados de ratones de tipo silvestre (figura 1 ). Un análisis histológico cuantitativo del número y tamaño de foci metastásicos se llevó a cabo para determinar la densidad de metástasis (como número de foci/100 mm3) y parámetros de volumen (ocupación porcentual del órgano) en los hígados de ratón estudiados. En comparación con los ratones de tipo silvestre (cuadro 1 ), la densidad de metástasis hepática disminuyó significativamente (P<0.01 ) en los hígados de ratones IL-1 ß"? y ICE"? por 84%-a-90%, indicando que la mayoría de las células B16M inyectadas no fueron capaces de implantarse en tejidos hepáticos en estos ratones. Además, el volumen metastásico también disminuyó significativamente (P<0.01 ) en los hígados de ratones IL-1 ß"y" e ¡CE" '" de 6 a 7 veces, en comparación con los valores en los hígados de ratones ÍiMá ?J^^MÜt Í UmtÍiiM MÍaÍm m t -JpT 'pí 1 Y tilín i 1 n V - tnr tt? de tipo silvestre, indicando que las células B16M tuvieron éxito para colonizar el hígado y también tuvieron una velocidad de crecimiento reducida. Los inventores también observaron una diferencia en estos parámetros de metástasis entre los hígados de ratones IL-1 ß' e ICE"?, llevando a la erradicación de las metástasis en casi todos los hígados de ratones ICE"'" a partir del experimento I (figura 1 ).

CUADRO 1 Análisis histológico cuantitativo de la colonización hepática experimental de células B16M inyectadas intraesplénicamente en ratones IL-1 X -/- e ICE :- - Grupo del ratón Densidad de Volumen de metástasis (como no. metástasis (como % de foci/100 mm3) de volumen hepático) Experimento I Ratones de tipo silvestre 234.16±58.36 66.18% Ratones IL-1"A 25.18121.02* 10.05% Ratones ICE"? 13.56+16.20* 2.1 % Experimento II Ratones de tipo silvestre 198.40±100.54 59.62% Ratones I L-1 ß"/_ 33.79±19.89* g.70% Ratones ICE" 27.73±15.68* 8.08% i ..,. - i ?t. x imítí ^á Los datos representan valores promedio ± DE a partir de dos experimentos independientes (se utilizaron 7 a 15 ratones por grupo experimental). *Diferencias que fueron estadísticamente significativas (p<0.01 , de dos lados) con respecto a los ratones de tipo silvestre empleando el análisis de varianza (ANOVA) y la prueba Scheffe F, como se indica.

EJEMPLO 4 IL-18 autócrino media la adhesividad inducida por TNF-a e IL-16 a partir del HSE activado con B16M-CM B16M-CM incrementó significativamente (P<0.01 ) la producción de TNF-a y IL-1 ß por células del HSE y su adhesividad por otras células B16M in vitro (figura 2). La incubación del HSE con ICEi 10 µM por 18 horas anuló completamente la adhesividad inducida por B16M-CM sin disminuir la producción de TNF-a a partir del HSE. La IL-1 ß de murino exógenamente añadida no compensó el efecto bloqueador de ICEi sobre el HSE, esto está en contraste con el incremento significativo en la adhesión de la célula B16M en el HSE control tratado con IL-1 ß (figura 3). El hecho de que la mejoría en la adhesión inducida por B16M-CM se anuló en la presencia de concentraciones elevadas de TNF-a endógenamente producida e IL-1 ß endógenamente añadida indica que ninguna de estas citocinas sobrerregula directamente la adhesividad del HSE. De manera importante, la presencia del anticuerpo a IL- 18 anti-murino añadido al HSE antes de la estimulación con B16M-CM previno la adhesividad inducida por B16M-CM sin afectar la producción inducida de IL-1 ß y TNF-a a partir del HSE (figura 2). Además, el anticuerpo anti-IL-18 también previno los efectos estimulantes de la adhesión de IL-1ß y TNF-a de murino sobre el HSE (figura 3), indicando que las acciones proadhesivas de estas citocinas sobre el HSE fueron mediadas ambas por IL-18. El RT-PCR confirmó que las células del HSE expresan el gen IL-18 (datos no mostrados). Contrariamente, la IL-18 de murino significativamente (P<0.01 ) incrementó la adhesión de la célula B16M al HSE (figura 4), y ni TNF-sR p55 ni IL-1 Ra fueron capaces de inhibirla, confirmando que ni TNF-a autócrino ni IL-1 ß cuentan para la adhesividad del HSE inducida por IL-18. Sin embargo, como se muestra en la figura 4, el anticuerpo anti-VCAM-1 inhibió completamente la adhesión de las células B16M al HSE tratadas con IL-18. La IgG control no específica no afectó la sobrerregulación de la adhesión de la célula B16M al HSE tratado con IL-18.

EJEMPLO S IL-18BP previene la adhesión de las células de melanoma B16 inducida por el medio acondicionado con B16 Como se muestra en el cuadro 2, la adición de IL-18BP al HSE estimulado con B16-CM redujo el porcentaje de células adheridas de 35% a 8.70% (p<0.01 ). Esto represente una inhibición del 100% puesto que el nivel ÜÍMl lüMiÜÉÜII UMÉtiÉifeaÜ^li^k. de adhesión estuvo por debajo del nivel de células adheridas utilizando medio basal. Este resultado sugiere que la IL-18 endógena a partir del HSE puede ser una fuente endógena de IL-18 además de que está presente en B16-CM.

CUADRO 2 Efecto inhibidor de IL-1BP sobre la adhesión en medio condicionado con B16 de células de melanoma B16 a las células hepáticas sinusoidales endoteliales % de adhesión celular del melanoma Medio basal 10.15±1.5 B16-CM 35.10±4.4 B16-CM/IL-18BP (1 ng/ml) 15.00±2.5 ;*** B16-CM/IL-18BP (10 ng/ml) 8.7±1.1' Los datos representan valores promedio ±DE a partir de dos experimentos independientes hechos por sextuplicado (N=12) ** Se indican las diferencias que fueron estadísticamente significativas (p<0.01 , de dos lados) con respecto a B16-CM empleando el análisis de varianza (ANOVA) y la prueba Scheffe F.

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Claims (1)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de inhibidores de la producción y/o acción de IL-18 en la preparación de medicamentos para inhibir las metástasis tumoral. 2 - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el inhibidor de la producción de IL-18 es un inhibidor de caspasa-1. 3.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el inhibidor de la acción de IL-18 se selecciona a partir de anticuerpos IL-18, anticuerpos en contra de cualesquiera de las unidades de receptor de I L-18, inhibidores de la ruta de señalización del receptor de IL-18, antagonistas de IL-18 que compiten con IL-18 y bloquean el receptor de IL-18, y proteínas de unión a IL-18, una muteína, proteína de fusión, derivado funcional, fracción activa o permutada circularmente derivada a partir de los mismos la cual tiene la misma actividad. A.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 3, en donde el inhibidor de la acción de IL-18 es el anticuerpo a IL-18. 5.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 3, en donde el inhibidor de la acción de IL-18 es una IL-18BP o una muteína, derivada o fragmento de la misma la cual tiene la misma actividad de IL-18BP. 6.- Una composición farmacéutica para inhibición de la producción y/o acción de IL-18 para inhibir la metástasis tumoral que comprende anticuerpos contra IL-18, anticuerpos en contra de cualesquiera de las unidades del receptor de IL-18, inhibidores de la ruta de señalización del receptor de IL-18, antagonistas de IL-18 los cuales compiten con IL-18 y bloquean al receptor de IL-18, y proteínas de unión a IL-18, una muteína, derivada o fragmento de la misma la cual tiene la misma actividad, la cual se une a IL-18 y bloquea su actividad biológica. 7.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque comprende un anticuerpo a IL-18. 8.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque comprende una proteína de unión a IL18, una muteína, derivado o fragmento de la misma la cual tiene la misma actividad. 9.- El uso de un vector de expresión que codifica para un inhibidor de la producción y/o acción de IL-18 en la preparación de medicamentos para inhibir la metástasis tumoral. ??