CN1173736C - 白细胞介素-18抑制剂抑制肿瘤转移的用途 - Google Patents

白细胞介素-18抑制剂抑制肿瘤转移的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN1173736C
CN1173736C CNB008106894A CN00810689A CN1173736C CN 1173736 C CN1173736 C CN 1173736C CN B008106894 A CNB008106894 A CN B008106894A CN 00810689 A CN00810689 A CN 00810689A CN 1173736 C CN1173736 C CN 1173736C
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
hse
inhibitor
adhesion
tnf
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
CNB008106894A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1364086A (zh
Inventor
C
C·迪纳洛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ares Trading SA
Original Assignee
Ares Trading SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ares Trading SA filed Critical Ares Trading SA
Publication of CN1364086A publication Critical patent/CN1364086A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1173736C publication Critical patent/CN1173736C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

本文公开了IL-18抑制剂在抑制肿瘤转移中的用途。优选IL-18结合蛋白质(IL-18BP)的用途。

Description

白细胞介素-18抑制剂抑制肿瘤转移的用途
发明领域
本发明涉及肿瘤转移和对其抑制的方法。更具体说，本发明涉及通过抑制白细胞介素-18(IL-18)的产生和/或作用来防止肿瘤的转移。
发明背景
循环性癌细胞粘附于毛细血管内皮细胞是发生转移的关键步骤(1，2)。血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)(免疫球蛋白超家族中的一个成员)介导造血细胞和活化白细胞对前炎症细胞因子活化的内皮细胞的粘附(3-5)。然而，动物和人的癌细胞可能篡夺VCAM-1的粘附功能来强化实验性转移的扩散(6)。
例如，已知IL-1β和TNF-α促进了肺组织中表达VLA-4的黑色素瘤细胞的转移，其机制包括上调内皮细胞的VCAM-1表达(7-9)。已证明在正常和脂多糖处理的小鼠中IL-1和TNF-α明显有助于B16M细胞的肝脏定居(7，8，10-20)。另外，甘露糖受体-介导的肝脏窦状隙内皮(HSE)细胞的活化包括自分泌性IL-1-β介导HSE细胞的VCAM-1表达，导致增加B16M细胞粘附和转移(21)。还显示了IL-1-β活化的HSE细胞释放VLA-4-刺激因子，其促进了B16M细胞对HSE细胞的粘附(11)。因此，IL-1β诱导VCAM-1的表达和VLA-4-刺激因子从HSE细胞的释放，这将使它们有能力为某些窦状隙内-捕获表达VLA-4的癌细胞创造了转移前的微环境。
然而封阻IL-1β和TNF-α仅能废除部分转移，这表明还有其它因子(或补偿它们的缺失或通过其它途径起作用)参与。另外，大部分转移性癌细胞和靶组织都不能产生这些前炎症细胞因子。而且，内毒素或甘露糖受体配体的浓度通常不足以增加到引发前炎症细胞因子的释放。所以还未很好地鉴定到癌细胞毛细管内转移时能引起VCAM-1上调和其牵连物的多种介质。
IL-18(IFNγ-诱导因子)是一种新型的细胞因子，具有IL-1蛋白质家族的结构特征和IL-12的功能特性(23)。有报道说在内毒素诱导的肝损伤中，Kupffer细胞产生的IL-18激活TNF-α和FAS配体介导的肝毒性途径(24)。近期已揭示IL-18也具有前炎症特性，它通过直接刺激CD3+/CD4+和自然杀伤细胞TNF-α的基因表达和合成，随后刺激CD14+细胞群产生IL-1β和IL-8，因此表明IL-18在细胞因子等级系统中出人意料的关键地位(25)。然而尚未阐明它在癌转移中的可能作用。
通过在IL-18珠上进行层析、测序、克隆和在COS7细胞中表达，从尿中纯化得到结合白细胞介素-18的蛋白质(IL-18BP)。在体内IL-18BP废除了IL-18对干扰素-γ(IFN-γ)、IL-8的诱导和对NF-κB的活化。在LPS之后将IL-18BP给予小鼠即消除了循环性IFN-γ。因此，IL-18BP可作为早期Th1细胞因子应答抑制剂起作用。IL-18BP在脾中固有地表达，属于免疫球蛋白超家族，且与IL-1II型受体具有有限的同源性。它的基因位于人染色体11q13上，且在8.3kb基因组序列中未发现有编码跨膜区域的外显子。一些痘病毒编码的假定蛋白质与IL-18BP高度同源，提示病毒产物可能减弱IL-18的功能和干扰细胞毒性T-细胞应答反应(28和WO 99/09063)。如WO 99/09063中更详细叙述的那样，IL-18BP和其突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性组分或环状排列衍生物和混合物能结合IL-18和/或能调节IL-18的活性和/或能封阻IL-18的活性。
发明概述
本发明提供了在制备用于抑制肿瘤转移的药物中针对IL-18产生和/或作用的抑制剂的用途。
IL-18产生的抑制剂是例如天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)-1抑制剂。
对IL-18作用的抑制剂选自：抗IL-18的抗体、抗IL-18受体亚基的抗体、IL-18受体信号途径的抑制剂、能与IL-18竞争和封阻IL-18受体的IL-18拮抗剂、和IL-18BP、其突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性组分或环状排列衍生物(结合IL-18)。
所用的抑制剂优选IL-18BP，或其突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性组分或环状排列衍生物(具有与IL-18BP相同的活性)。
本发明还提供了能抑制IL-18产生和/或活性的药物组合物来抑制肿瘤转移。
为了抑制肿瘤转移另一种抑制IL-18产生和/或作用的方法，是将包含IL-18产生和/或作用抑制剂(如IL-18BP)的编码序列的表达载体引入体内。
附图简述
图1：野生型、IL-1β-/-和ICE-/-小鼠脾内注射B16M细胞后的实验肝脏定居。在注射B16M细胞后取出肝脏，以含有10％甲醛的磷酸盐缓冲盐水固定。IL-1β-/-和ICE-/-小鼠肝中几乎所有实验性转移(黑色素瘤结节)都被根除。
图2：不可逆性ICE抑制剂和抗小鼠IL-18抗体对B16M粘附于HSE细胞和对未处理的和用B16M-CM处理的HSE产生IL-1β和TNF-α的作用。存在B16M-CM时将培养的HSE细胞培养10小时。在一些实验中，在B16M-CM处理前，未处理的和处理的HSE细胞都接收10μM ICEi或10μg/ml抗-小鼠IL-18抗体。按照最初加入的细胞数量的相对值，计算出粘附于HSE底物的B16M细胞的百分比。另外，在粘附前回收培养物上清液，用ELISA测定IL-1β和TNF-α的浓度。4次独立的实验数据都以平均值±SD表示，各一式六份(n＝24)。按Student’s双标记非配对t-检验，相对于未处理的HSE，粘附于B16M-CM处理的HSE的B16M细胞和IL-1β或TNF-α产生的增加具有统计学显著性的(*P＜0.01)。无B16M-CM时，当用ICEi或抗-IL-18抗体处理时，IL-1β或TNF-α的产生和B16M细胞对HSE细胞的粘附没有统计学显著性(没有显示数据)。
图3：体外ICEi对B16M细胞粘附于B16M-CM处理的HSE的影响。用基础培养基或B16M-CM培养HSE细胞8小时。在用B16M-CM之前，一些HSE细胞接收过10μM ICEi培养18小时。另外，将1ng/ml重组鼠类IL-1β和B16M-CM一起加入某些HSE细胞中8小时。在其它实验中，HSE细胞接收1ng/ml鼠类IL-1β或100pg/ml TNF-α6小时，且在用细胞因子处理前1小时加入或不加入10μg/ml兔抗小鼠IL-18多克隆抗体。也将非特异性IgG多克隆抗体加到未处理和细胞因子处理的HSE细胞中。此后，洗涤HSE细胞并加入BCEFCF-AM-标记的B16M细胞，8分钟后再洗涤。按照最初加入的细胞数量的相对值计算出粘附于HSE底物的B16M细胞的百分比。以平均值±SD表示3次独立实验的结果，各一式六份(n＝18)。按Student’s双标记非配对t-检验，未处理的HSE(*)、和IL-1β或TNF-α处理的HSE(**)之间粘附程度的差异具有统计学显著性(p＜0.01)。B16细胞对其它IECi处理的对照HSE(接收或不接收1ng/ml鼠类IL-1β8小时)粘附的变化没有统计学显著性(没有显示数据)。
图4：体外B16M细胞粘附于IL-18-处理的HSE。用1ng/ml重组鼠类IL-18培育HSE细胞6小时。一些实验中，在加入IL-18前10分钟加入10μg/mlTNF-sRp55或100ng/ml 1L-1Ra。其它实验中，在加入B16M细胞前30分钟，在HSE细胞中加入10μg/ml抗-VCAM-1抗体或类似浓度的非特异性抗小鼠IgG。然后，如以下实施例所述测定了B16M细胞的粘附百分比。以平均值±SD表示3次独立实验的结果，各一式六份(n＝18)。按Student双标记非配对t-检验，基础培养基处理的HSE(*)和IL-18处理的HSE(**)之间粘附程度的差异具有统计学显著性(P＜0.01)。
发明详述
一些前炎症细胞因子(包括白细胞介素(IL)-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α))能促进癌细胞粘附于内皮细胞，从而导致肿瘤转移扩散。这些前炎症细胞因子可能通过诱导血管细胞粘附分子-1(VACM-1)来促进粘附和转移。本发明显示用B16黑色素瘤(B16M)细胞培养物的条件培养液(CM)(B16M-CM)处理原代培养的小鼠HSE细胞，促进了体外B16M与HSE细胞的粘附。B16M-CM还能诱导体外HSE细胞产生IL-1β和TNF-α。然而尚未清楚证明肿瘤的转移确实受IL-18和TNF-α的调节。
本发明显示B16M-CM诱导HSE细胞产生IL-18而且IL-18是增加B16M细胞与HSE细胞粘附的细胞因子。通过激活HSE细胞中VCAM-1的表达，IL-18促进了粘附，而没有TNF-α或IL1β的参与。用特异性天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂(10μM，18小时)培养HSE细胞完全消除了B16M-CM诱导的粘附，而不减少TNF-α的产生，且加入鼠IL-1β也不逆转这种作用。将抗鼠IL-18抗体加到HSE细胞中能防止B16M-CM诱导的粘附，而不干扰B16M-CM诱导IL-1β和TNF-α。类似地，最近克隆的IL-18结合蛋白质(IL-18BP)也能防止B16M-CM诱导的B16M与HSE细胞的粘附(体外)。TNF-α和IL-1β的抑制剂如p55可溶性TNF-受体或IL-1受体拮抗剂不能逆转IL-18诱导的这种粘附。因此，本发明提供IL-18产生和作用的抑制剂作为工具来抑制肿瘤转移。IL-18产生的抑制剂包括天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1的抑制剂。IL-18作用的抑制剂选自：直接针对IL-18的抗体、直接针对两种已知IL-18受体亚基中的任何一种的抗体、IL-18受体信号途径的抑制剂、能与IL-18竞争并封阻IL-18受体的IL-18拮抗剂，和能结合IL-18并封阻其生物活性的IL-18结合蛋白质。
本发明涉及IL-18在前炎症细胞因子介导的VCAM-1表达的上调中的可能作用，与其它细胞因子可能的相互作用和防止诱导VCAM-1的方法。本发明发现IL-18在引发前炎症中起作用，导致肝脏窦状隙壁VCAM-1的上调，并因此有利于癌细胞的粘附和转移。将用B16M-CM处理的小鼠HSE细胞的原代培养物作为癌细胞依赖性内皮细胞活化模型，来研究B16M细胞诱导的IL-18对B16M细胞粘附于HSE(通过VCAM-1依赖性机制)机理的作用。在特异性IL-1受体阻断(用IL-1Ra)、成熟IL-1β和IL-18分泌的抑制(用不可逆性IL-1转化酶抑制剂(ICEi))、TNF-阻断(用p55TNF-可溶性受体(TNF-sR p55))和IL-18功能的阻断(用抗IL-18抗体和IL-18结合蛋白质)的条件下，检验了IL-18的特异性作用。另外，将B16M细胞脾内注射ICE-/-和IL-1β-/-小鼠。与正常对照相比在缺陷型小鼠中观察到的低转移密度提示IL1β可能还有IL-18参与了炎症的促转移(prometastatic)作用(表1)。
进行的体外实验显示IL-18的产生是(由B16M细胞衍生的上清液)刺激HSE粘附作用的原因。由于VCAM-1的上调刺激了B16M-CM处理的HSE的所有粘附活性，数据表明IL-18介导了细胞因子诱导的HSE表达VCAM-1。另外，抗IL-18抗体减少了B16M-CM抑制的细胞粘附，而对HSE细胞产生TNF-α和IL-1β没有影响。因此，HSE细胞中IL-1β和TNF-α的产生是IL-18非依赖性的，且不会造成粘附。相反，无论是TNF-sR p55或IL-1R都不能抑制IL-18处理的HSE细胞粘附的增加，证实了自分泌性TNF-α或IL-1β都不是造成IL-18诱导的HSE粘附的原因。
用HSE细胞得到的结果与用其它细胞系统得到的结果相反，如非CD14+人血单个核细胞(25)中IL-18通过TNF-α产生诱导了IL-1β。很可能存在着HSE-特异性前炎症细胞因子等级体系，其中TNF-α和IL-1β不受IL-18的控制，但可用IL-18作为VCAM-1上调的下游介质。
与小鼠HSE细胞不同，如RT-PCR核查所示B16M细胞不表达IL-18基因，且用ICEi培养18小时不会消除细胞因子-和B16M-CM对HSE细胞的粘附刺激活性。然而，IL-18的局部产生可能影响B16M细胞在肝脏微脉管系统中的转运或驻留。另一发现是用1ng/ml鼠IL-18培养B16M细胞6小时能2倍增加它们对未处理的HSE的粘附，将抗VCAM-1抗体加入到HSE中减少了80％IL-18介导的粘附，表明有VACM-1/VLA-4相互作用的参与。类似地，接收B16-CM处理的HSE上清液6小时的B16M细胞与HSE的粘附(通过VCAM-1依赖性机制)也明显地增加了2倍，且抗IL-18抗体消除了这种粘附刺激作用。
本发明的这些发现表明IL-18是前炎症细胞因子肝脏释放和转移发展之间的一种新连接。肿瘤活化的HSE细胞产生IL-18确定了两种参与调节黑色素瘤细胞与HSE细胞粘附的互补机制；一种是HSE中的自分泌机制，其控制TNF-α/IL-1β-介导的VCAM-1的上调；和一种B16M细胞的旁泌性机制，其上调黑色素瘤细胞VLA-4，强化它们的VCAM-1依赖性粘附能力。这种同时发生的两种细胞粘附分子的上调使得癌-毛细管内皮细胞相互作用途径具有很高价值。
可用IL-18产生和/或转移的抑制剂来消除B16M细胞的I1-18诱导的粘附。IL-18产生的抑制剂是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1。IL-18作用的抑制剂选自直接针对IL-18的抗体、直接针对两种已知IL-18受体亚基中任何一种的抗体、IL-18受体信号途径的抑制剂、能与IL-18竞争并封阻IL-18受体的IL-18拮抗剂，和能结合IL-18并封阻其生物活性的IL-18结合蛋白质。
除直接使用IL-18产生和/或作用的抑制剂以外，本发明还考虑将其引入到需要IL-18产生和/或作用抑制效果的细胞中。为了此目的，用于特异性引入的系统(如将编码IL-18BP的DNA引入细胞)是必需的。一些可以如此进行的方法是本领域已知的。例如，可将合适的携带上述DNA的载体引入细胞，该载体能使DNA插入到细胞中从而让该DNA在细胞中表达。其它文献中描述了送递到细胞的方法，如美国专利No.5,910,487、WO 99/29349等。
本发明的用于抑制IL-18产生和/或作用的药物组合物是那些包含活性成分作为抑制剂的组合物，这些活性成分选自天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1抑制剂、抗IL-18抗体、抗IL-18受体任一亚基的抗体、IL-18受体信号途径的抑制剂、能与IL-18竞争并封阻IL-18受体的拮抗剂，和IL-18BP或其具有相同活性的突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性组分或环状重排衍生物。
术语突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性组分和环状重排衍生物与WO 99/09063中所述的含义相同。
IL-18的抗体和IL-18BP是该药物组合物的优选活性组分。
该药物组合物还包括常规的载体、赋形剂和其它本领域已知的其它成分(取决于实际应用的方式，即注射、口服或本领域已知的其它任何方式)。
可由临床医生根据应用方法、患者体重和其它因素确定实际剂量。
通过以上描述，参考以下用于说明的实施例(对本发明无任何限制作用)更易理解本发明。
实施例
试剂
自Serotec Ltd.(Oxford，England)得到大鼠抗小鼠IgG和大鼠抗小鼠VCAM-1单克隆抗体。从R & D System Inc.(Minneapolis，MN)得到重组小鼠IL-1β。重组人IL-1受体拮抗剂(IL-1R是Upjohn Co.，Kalamazoo，MI的赠品)和人p55 TNF可溶性受体(TNFsR p55)是Serono Inc.，Norwell，MA的赠品。从AlexisCo.(San Diego，CA)得到IL-1β转化酶抑制剂(ICEi)。从PeproTech EC Ltd(London，UK)购得重组鼠IL-18和兔抗小鼠IL-18多克隆抗体IgG。如(28)所述制备IL-18结合蛋白质(IL-18BP)。
B16M细胞的培养。如(11)所述培养、维持和传代B16M细胞。如下制备B16M条件培养液(B16M-CM)：将5×105个细胞接种于25cm2T-瓶中，培养24小时。然后在5ml无血清的培养液中培养这些细胞24小时(细胞最终密度为6×104个细胞/cm2)。收集上清液，用新鲜的无血清的培养液作3∶1稀释，并用0.22微米滤器过滤。
细胞因子分析。用基于抗-小鼠IL-1β和TNF-α单克隆抗体的特异性ELISA试剂盒，按说明书(R&D Systems，Minneapolis，MN)测定原代培养的HSE细胞和B16M细胞的细胞因子释放。
实施例1：定量测定B16M细胞对原代HSE培养物的粘附
如(26)所述从同基因小鼠分离HSE、鉴定并培养。如(16)中所述用2’，7’-二-(2-羧乙基)-5，6-羧基荧光素-乙酰氧基甲酯溶液(BCECF-AM，MolecularProbes，Eugene，OR)标记B16M细胞。然后在24-孔板中加入培养的HSE 2×105个细胞/孔，8分钟后用新鲜培养液洗涤诸孔3次。用基于荧光测定系统所述的定量方法测定了粘附细胞的数量(16)。在一些实验中，在加入B16M细胞前几小时用B16M-CM预培育HSE细胞。
实施例2：肝脏转移试验如(27)所述准备了野生型、IL-1β-/-和ICE-/-雄性C57BL/6J小鼠。使用6到8周龄的小鼠(每笼关养5只)。对麻醉的小鼠(Nembutal，50mg/kg腹腔内)脾内注射3×105B16黑色素瘤活细胞(悬浮于0.1ml Hank平衡盐溶液中)产生肝脏转移。注射癌细胞后第10天麻醉下处死这些小鼠。将肝组织进行组织加工。用数字显微镜成像密度分析来辨别正常肝组织中转移的B16M和肝脏转移的密度，采用所述(17)的立体方法计算每100mm3肝中转移的数量(根据每个肝脏15张10×10mm2切片检测到的病灶平均数)。
实施例3：注射到IL-1β和ICE缺陷型小鼠中的B16M细胞生长和转移减 少。将不同2批的相同B16M细胞脾内注射入成年C57B1/6J野生型、ICE-/-和IL-1β-/-小鼠中，进行2次独立的实验(相隔1年)。尸体解剖显示所有试验的小鼠中都有可见的黑色素瘤，用脾重量评估肿瘤大小没有显著性差异(表1)。相反，与野生型小鼠肝相比，IL-1β-/-和(尤其是)ICE-/-小鼠肝中转移的发生明显降低(图1)。对转移病灶的数量和大小进行了定量性组织分析，来确定所研究的小鼠肝中转移的密度(如病灶数/100mm3)和体积(占器官的百分比)参数。与野生型小鼠相比(表1)，IL-1β-/-和ICE-/-小鼠肝的肝脏转移密度明显减少84％-90％，表明大部分注射的B16M细胞不能植入这些小鼠的肝组织中。另外，与野生型小鼠肝脏的数值相比，IL-1β-/-和ICE-/-小鼠肝脏的转移体积也明显减少6到7倍(P＜0.01)，表明成功定居于肝脏的B16M细胞的生长速度也降低了。我们还观察到IL-1β-/-和ICE-/-小鼠肝脏之间这些转移参数的差异，在实施例I中几乎所有ICE-/-小鼠肝脏都根除了转移(图1)。
表I
定量性组织分析脾内注射的B16M细胞在IL-1β-/-和ICE-/-小鼠中的实验性肝定居
小鼠组别           转移密度(病灶数/100mm3)     转移体积(％肝体积)
实验I
野生型小鼠         234.16±58.36                66.18％
IL-1β-/-小鼠      25.18±21.02*               10.05％
ICE-/-小鼠         13.56±16.20*               2.1％
实验II
野生型小鼠         198.40±100.54               59.62％
IL-1β-/-小鼠      33.79±19.89*               9.70％
ICE-/-小鼠         27.73±15.68*               8.08％
以平均值±SD显示两次独立实验的数据(每实验组使用7-15只小鼠)。
*采用方差分析(ANOVA)和Scheffe F-检验，表明与野生型小鼠相比差异有统计学显著性(双侧，p＜0.01)。
实施例4：自分泌性IL-18介导了B16M-CM活化的HSE细胞的TNF-α- 和IL-1β诱导的粘附。B16M1-CM明显增加了HSE细胞的TNF-α和IL-1β的产生，和它们对体外其它B16M细胞的粘附(图2)。用10μM ICEi培养HSE18小时，完全消除了B16M-CM诱导的粘附，而不减少HSE的TNF-α产生。外源性加入鼠IL-1β不能补偿ICei对HSE的封阻作用，这与IL-1β-处理的对照HSE中B16M细胞粘附显著增加相反(图3)。当内源产生的TNF-α和外源性加入的IL-1β浓度升高时消除了B16M-CM诱导的粘附增进，这一事实表明这些细胞因子都不直接上调HSE的粘附。重要的是，在用B16M-CM刺激前存在加入到HSE的抗鼠IL-18抗体防止了B16M-CM诱导的粘附，而不影响诱导HSE产生IL-1β和TNF-α(图2)。另外，抗IL-1β抗体也防止了鼠I1-1β和TNF-α对HSE的刺激粘附作用(图3)，表明这些细胞因子对HSE的预粘附作用都是受IL-18介导的。RT-PCR证实HSE细胞表达了IL-18基因(没有显示数据)。相反地，小鼠IL-1β明显增强了(P＜0.01)B16M细胞对HSE的粘附(图4)，且TNF-sR p55或IL-IRa都不能抑制它，证实无论是自分泌性TNF-α或IL-1β都不是造成IL-18诱导HSE粘附的原因。然而，如图4所示，抗-VCAM-1抗体完全抑制了B16M细胞对IL-18处理的HSE的粘附。对照非特异性IgG不影响B16M细胞粘附于IL-18处理的HSE的上调。
实施例5：IL-18BP防止B16-条件培养液诱导的B16黑色素瘤细胞的粘附。如表2所示，将IL-18BP加入B16-CM刺激的HSE将粘附细胞的百分比从35％减少到8.70％(p＜0.01)。这代表100％抑制，因为该粘附水平低于用基础培养液培养的粘附细胞的水平。此结果表明除B16M-CM中存在的以外，HSE产生的内源性IL-18可能是IL-18的一种内源性来源。
表2
IL-1BP对B16条件培养液介导的B16黑色素瘤细胞对肝脏窦状隙内皮细胞粘附的抑制作用
                            ％黑色素瘤细胞粘附
基础培养液                  10.15±1.5
B16-CM                      35.10±4.4
B16-CM/IL-18BP(1ng/ml)      35.10±4.4**
B16-CM/IL-18BP(10ng/ml)     8.70±1.1**
以平均值±SD显示两次独立实验的数据，各一式六份(N＝12)
**采用方差分析(ANOVA)和Scheffe F-检验中，表明与野生型小鼠相互差异有统计学显著性(双侧，p＜0.01)。
参考文献
1.Kohn，E.C.，和Liotta，L.A.(1995)Cancer Res55(9)，1856-62
2.Nicolson，G.L.，和Winkelhake，J.L.(1975)Nature 225，230-232
3.Freedman，A.，Munro，M.，Rich，G.E.，Bevilacqua，M.P.，Morimoto，C.，Mclntyre，B.W.，Rhynhart，K，Pober，J.S.和Nadler，L.M.(1990)Science 249，1030-1033
4.Miyake，M.，Fuchimoto，S.，Iwagaki，H.，Matsubara，N.，Edamatsu，R.，Hiramatsu，M.，和Orita，K.(1991)Res.Comm.Chem.Pathol.Pharmacol.71，293-307
5.Simmons，P.J.，Maskinovsky，B.，Longenecker，B.M.，Berenson，R.，Torok-Storb，B.，和Gallatin，W.M.(1992)Blood80(2)，388-95
6.Rice，G.E.，和Bevilacqua，M.P.(1989)Science246，1303-1306
7.Okahara，H.，Yagita，H.，Miyake，K.，和Okumura，K.(1994)Cancer Res 54，3233-3236
8.Garofalo，A.，Chirivi，R.G.S.，Foglieni，C.，Pigot，R.，Mortarini，R.，Martin-Padura，I.，Anichini，A.，Gearing，A.J.，Sanchez-Madrid，F.，Dejana，E.，和Giavazzi，R.，(1995)Cancer Res 55，414-419
9.Martin-Padura，I.，Mortarini，R.，Lauri，D.，Bernasconi，S.，Sanchez-Madrid，F.，Parmiani，G.Mantovani，A.，Anichini，A.，和Dejana，E.(1991)Cancer Res 51，2239-2241
10.Lauri，D.，Bertomeu，M.-C.，和Orr，F.W.(1990)Clin Exp Metastasis 8，27-32
11.Anasagasti，M.J.，Alvarez，A.，Martin，J.J.Mendoza，L.，和Vidal-Vanaclocha，F.(1997)Hepatology 25，840-846
12.Bani，M.R.，Garofalo，A.，Scanziani，E.，和Giavazzi，R.(1991)J.Natl.CancerInst.83，119-123
13.Bertomeu，M.C.，Gallo，S.，Lauri，D.，Hass，T.A.，Orr，F.W.Bastida，E.，和Buchanan，M.R.(1993)Clin Exp Metastasis 11，243-250
14.Burrows F.J.，Haskard，D.O.，Hart，I.R.，Marsall，J.F.，Selkirk，S.，Poole，S.，和Thorpe(1991)Cancer Res 51，4768-4775
15.Chirvi，R.G.S.，Garofalo，A.，Paudura，I.M.，Mantovarni，A.，和Giavazzi，R.(1993)Cancer Res 53，5051-5054
16.Vidal-Vanaclocha，F.，Alvarez，A.，Asumendi，A.，Urcelay，B.，Tonino，P.，和Dinarello，C.A.(1994)Cancer Res 54，2667-2672
17.Vidal-Vanaclocha，F.，Alvarez，A.，Asumendi，A.，Urcelay，B.，Tonino，P.，和Dinarello，C.A.(1996)J Natl Cancer Inst 88，198-205
18.Malik，S.T.，Naylor，M.S.East，N.，Oliff，A.，和Balkwill，F.R.(1990)Eur JCancer 26，1031-1034
19.Orosz，P.，Echtenacher，B.，Falk，W.Rushoff，J.，Weber，D.，和Mannel，D.N.(1993)J Exp Med 177，1391-1398
20.Orosz，P.，Kruger，A.，Hubbe，M.，Ruschoff，J.，Von Hoegen，P.，和Mannel，D.N.(1995)Int.J.Cancer 60，867-871
21.Mendoza，L.，Olaso，E.，Anasagasti，M.J.，Fuentes，A.，和Vidal-Vanaclcha，F.(1998)J Cell Physiol 174，322-330
22.Bazan，J.F.，Timans，J.C.，和Kastelein，R.A.(1996)Nature 379(6556)，591
23.Okamura，H.，Tsutsui，H.，Komatsu，T.，Yutsudo，M.，Hakura，A.，Tanimoto，T.，Torigoe，K.，Okura，T.，Nukada，Y.Hattori，K.，Akita，K.，Namba，M.，Tanaber，F.，Konishi，K.，Fukuda，S.，和Kurimoto，M.(1995)Nature 378，88-91
24.Tsutsui，H.，Matsui，K.，Kawada，N.Hyodo，Y.，Hayashi，N.，Okamura，H.，Higashino，K.，和Nakanishi，K.(1997)J Immunol 159(8)，3961-7
25.Puren，A.J.，Fantuzzi，G.，Gu，Y.，Su，M.S.S.，和Dinarello，C.A.(1998)J ClinInvest 101，711-724
26.Vidal-Vanaclocha，F.，Rocha，M.，Asumendi，A.，和Barbera-Guillem，E.(1993)Hepatology 18，328-339
27.Fantuzzi，G.，Puren，A.J.，Harding，M.W.，Livingston，D.J.，和Dinarello，C.A.(1998)Blood 91，2118-2125
28.Novick，D.Kim，S-H，Fantuzzi，G.，Reznikov，L.L.，Charles A.Dinarello，C.A.，和Rubinstein，M.(1999)Immunity 10，127-136

Claims (5)

1.IL-18产生和/或作用的抑制剂的用途，其特征在于，该IL-18产生的抑制剂选自天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1的抑制剂，该IL-18作用的抑制剂选自抗IL-18抗体和IL-18结合蛋白，该抑制剂用于制备抑制黑色素瘤的肿瘤转移的药物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述黑色素瘤是肝脏黑色素瘤。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的IL-18作用的抑制剂是IL-18的抗体。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，  所述的IL-18作用的抑制剂是IL-18BP。
5.编码IL-18产生和/或作用抑制剂的表达载体的用途，其特征在于，该表达载体编码选自天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1的抑制剂，抗IL-18抗体和IL-18结合蛋白的抑制剂，该表达载体用于制备抑制黑色素瘤肿瘤转移的药物。
CNB008106894A 1999-07-22 2000-07-17 白细胞介素-18抑制剂抑制肿瘤转移的用途 Expired - Lifetime CN1173736C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IL13104799A IL131047A0 (en) 1999-07-22 1999-07-22 Use of il-18 inhibitors
IL131047 1999-07-22

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1364086A CN1364086A (zh) 2002-08-14
CN1173736C true CN1173736C (zh) 2004-11-03

Family

ID=11073044

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB008106894A Expired - Lifetime CN1173736C (zh) 1999-07-22 2000-07-17 白细胞介素-18抑制剂抑制肿瘤转移的用途

Country Status (31)

Country Link
US (1) US7741276B2 (zh)
EP (1) EP1206274B1 (zh)
JP (1) JP4827352B2 (zh)
KR (1) KR100682219B1 (zh)
CN (1) CN1173736C (zh)
AR (1) AR024907A1 (zh)
AT (1) ATE363288T1 (zh)
AU (1) AU782478B2 (zh)
BG (1) BG65800B1 (zh)
BR (1) BR0012675A (zh)
CA (1) CA2380216C (zh)
CY (1) CY1107932T1 (zh)
CZ (1) CZ302114B6 (zh)
DE (2) DE60035049T2 (zh)
DK (1) DK1206274T3 (zh)
EA (1) EA005419B1 (zh)
EE (1) EE04838B1 (zh)
ES (1) ES2186596T3 (zh)
HK (1) HK1048248B (zh)
HU (1) HU228780B1 (zh)
IL (2) IL131047A0 (zh)
MX (1) MXPA02000838A (zh)
NO (1) NO329827B1 (zh)
NZ (1) NZ516535A (zh)
PL (1) PL202477B1 (zh)
PT (1) PT1206274E (zh)
SK (1) SK287522B6 (zh)
TR (1) TR200200169T2 (zh)
UA (1) UA73745C2 (zh)
WO (1) WO2001007480A2 (zh)
ZA (1) ZA200200390B (zh)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101111103B1 (ko) 2000-02-10 2012-02-13 아보트 러보러터리즈 사람 인터류킨-18에 결합하는 항체 및 이를 제조하고 사용하는 방법
EP1331943A4 (en) 2000-10-11 2005-01-26 Viron Therapeutics Inc NUCLEIC ACID MOLECULES AND POLYPEPTIDES FOR IMMUNOMODULATION
US7718368B2 (en) 2000-12-04 2010-05-18 Viron Therapeutics Inc. Immunomodulatory protein and useful embodiments thereof
ES2416510T3 (es) * 2002-10-08 2013-08-01 Ares Trading S.A. Uso de una citocina capaz de unirse a IL 18BP y de inhibir la actividad de una segunda citocina
US7968684B2 (en) 2003-11-12 2011-06-28 Abbott Laboratories IL-18 binding proteins
US7691611B2 (en) 2005-06-03 2010-04-06 Ares Trading S.A. Production of recombinant IL-18 binding protein
JP5091127B2 (ja) 2005-06-10 2012-12-05 アレス トレーディング ソシエテ アノニム Ｉｌ−１８結合タンパク質の精製のための方法
CL2008002153A1 (es) 2007-07-24 2009-06-05 Amgen Inc Anticuerpo aislado o fragmanto de unión de antigeno del mismo que se une al receptor de il-18 (il-18r); molecula de ácido nucleico codificante; celula huesped que la comprende; composición farmaceutica; uso médico para tratar o prevenir una condición asociada con il-18r; método in vitro para inhibir la unión de il-18 al il-18r.
US9812033B2 (en) * 2013-03-06 2017-11-07 Venkatesh R. Chari Tactile graphic display
AU2023236289A1 (en) 2022-03-15 2024-08-15 Compugen Ltd. Il-18bp antagonist antibodies and their use in monotherapy and combination therapy in the treatment of cancer

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994005333A1 (en) * 1992-09-02 1994-03-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulation of cell adhesion
US7141393B2 (en) * 1996-12-26 2006-11-28 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Interleukin-18-receptor proteins
SK122199A3 (en) * 1997-03-18 2000-12-11 Basf Ag Methods and compositions for modulating responsiveness to corticosteroids
IL121860A0 (en) * 1997-08-14 1998-02-22 Yeda Res & Dev Interleukin-18 binding proteins their preparation and use

Also Published As

Publication number Publication date
TR200200169T2 (tr) 2002-06-21
DE60035049T2 (de) 2007-09-27
IL131047A0 (en) 2001-01-28
IL147675A (en) 2009-05-04
US7741276B2 (en) 2010-06-22
KR20020027493A (ko) 2002-04-13
MXPA02000838A (es) 2002-07-30
WO2001007480A3 (en) 2001-05-10
DE60035049D1 (de) 2007-07-12
CY1107932T1 (el) 2013-09-04
JP4827352B2 (ja) 2011-11-30
EA005419B1 (ru) 2005-02-24
UA73745C2 (en) 2005-09-15
PL202477B1 (pl) 2009-06-30
CA2380216A1 (en) 2001-02-01
BRPI0012675B8 (zh) 2021-05-25
EP1206274A2 (en) 2002-05-22
HU228780B1 (en) 2013-05-28
PL353732A1 (en) 2003-12-01
HUP0202107A3 (en) 2005-01-28
WO2001007480A2 (en) 2001-02-01
JP2003505472A (ja) 2003-02-12
EA200200189A1 (ru) 2002-12-26
BRPI0012675B1 (pt) 2001-02-01
NO329827B1 (no) 2011-01-03
CA2380216C (en) 2012-01-31
BG65800B1 (bg) 2009-12-31
BG106311A (en) 2002-08-30
ZA200200390B (en) 2003-04-30
DE1206274T1 (de) 2002-11-14
NZ516535A (en) 2004-04-30
AU782478B2 (en) 2005-08-04
AR024907A1 (es) 2002-10-30
NO20020153L (no) 2002-03-11
BR0012675A (pt) 2002-04-09
KR100682219B1 (ko) 2007-02-12
CZ2002195A3 (cs) 2002-06-12
AU5843200A (en) 2001-02-13
ES2186596T3 (es) 2007-11-16
EP1206274B1 (en) 2007-05-30
CN1364086A (zh) 2002-08-14
SK882002A3 (en) 2002-07-02
EE04838B1 (et) 2007-06-15
ATE363288T1 (de) 2007-06-15
HUP0202107A2 (en) 2002-10-28
NO20020153D0 (no) 2002-01-11
PT1206274E (pt) 2007-07-06
HK1048248B (zh) 2005-04-22
DK1206274T3 (da) 2007-08-13
SK287522B6 (sk) 2011-01-04
EE200200032A (et) 2003-02-17
CZ302114B6 (cs) 2010-10-20
ES2186596T1 (es) 2003-05-16
US20080003216A1 (en) 2008-01-03
HK1048248A1 (en) 2003-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Villinger et al. Comparative sequence analysis of cytokine genes from human and nonhuman primates.
CN1902229B (zh) Il-18结合蛋白
CN1214043C (zh) 抗γ－干扰素的人化抗体
US7741276B2 (en) Use of interleukin-18 inhibitors to inhibit tumor metastasis
CN1921886A (zh) 调节细胞因子活性的方法；相关药剂
CN1295482A (zh) 炎性介质拮抗剂
CN1361700A (zh) 用表皮生长因子拮抗物治疗顽固性的人肿瘤
JP4727995B2 (ja) 哺乳類のサイトカイン；関連試薬の使用
CN1130405A (zh) 具有引起细胞程序性死亡的特征的单克隆抗体
US20230340052A1 (en) Method of reducing bispecific t cell engager or chimeric antigen receptor t cell mediated cytokine release syndrome using interleukins-4, -10, or a fusion protein thereof
Guis et al. Cutaneous pseudolymphoma associated with a TNF-alpha inhibitor treatment: etanercept
CN100359004C (zh) 转基因表达细胞趋化因子的自然杀伤细胞
CA2306790A1 (en) Application of tnf antagonists as medicaments for treating septic diseases
Oliveira et al. Participation of lnterleukin-5 and lnterleukin-8 in the Eosinophil Migration Induced by a Large Volume of Saline
CN1162922A (zh) 以il-6拮抗剂作为有效成分治疗慢性类风湿性关节炎
Wheeler et al. Up-regulation of IL-18BP, but not IL-18 mRNA in rat liver by LPS
CN101074266A (zh) 转导肽－人源粒细胞集落刺激因子融合蛋白及其药物组合物
JP2004315381A (ja) ナチュラルキラーＴ細胞のインターロイキン１８による刺激を利用した免疫疾患治療薬剤および治療キット、並びにＩｇＥ産生の制御方法
WO2020045399A1 (ja) がんの治療のための医薬組成物
CN1754574A (zh) 使用免疫细胞治疗血液缺损症和骨髓抑制
Wiltrout et al. The Use of Cytokine Knockout Mice in Cancer Research
SERODY et al. KENNETH R. COOKE
CN1178554A (zh) 化学修饰的干扰素
Zahava Vadasz et al. the new era of Biological treatments

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: ALEIX TRADE CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO., LTD.

Effective date: 20030213

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20030213

Address after: Swiss Marx

Applicant after: Ares Trading S. A.

Address before: Voight, Israel

Applicant before: Yeda Res & Dev

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1048248

Country of ref document: HK

CX01 Expiry of patent term
CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20041103