ES2186596T3 - Uso de inhibidores de la interleucina-18 para inhibir metastasis tumorales. - Google Patents
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Abstract
Uso de inhibidores de la producción y/o acción de IL-18 en la preparación de medicamentos a fin de inhibir la metástasis de tumores.
Description
Uso de inhibidores de la
interleucina-18 para inhibir metástasis
tumorales.
La presente invención se refiere a metástasis
tumorales de melanomas y a los medios para inhibirla. Más
específicamente, la invención hace referencia a la prevención de
las metástasis tumorales de melanomas inhibiendo la producción y/o
la acción de la interleucina-18
(IL-18). Los inhibidores de la IL-18
se seleccionan entre los anticuerpos contra las subunidades de
IL-18 del receptor de IL-18, los
antagonistas de IL-18 y las proteínas de unión a
IL-18.
La adherencia de las células cancerosas
circulantes al endotelio capilar es una etapa crítica en la génesis
de la metástasis (1,2). La molécula 1 de adherencia celular vascular
(VCAM-1), un miembro de la superfamilia de las
inmunoglobulinas, media la adherencia de las células hematopoyéticas
y los leucocitos activados a las células endoteliales activadas por
las citocinas pro-inflamatorias
(3-5). No obstante, la función adherente de
VCAM-1 puede ser usurpada por células cancerosas
animales y humanas para potenciar la diseminación metastásica
experimental (6).
Por ejemplo, la IL-1\beta y el
TNF-\alpha son conocidos por potenciar la
metástasis de las células de melanoma que expresan
VLA-4 en tejido pulmonar mediante un mecanismo que
implica la regulación al alza de la expresión de
VCAM-1 por las células endoteliales
(7-9). Asimismo se ha demostrado que la
IL-1 y el TNF-\alpha contribuyen
significativamente a la colonización hepática de las células B16M en
ratones tanto normales como tratados con lipopolisacáridos
(7,8,10-20). Además, la activación de las células
del endotelio sinusoidal hepático (HSE) mediada por el receptor de
manosa implica la expresión de las células de HSE mediada por
IL-1\beta de VCAM-1, conduciendo
a un incremento de la adherencia de las células B16M y de la
metástasis (21). Asimismo se mostró que las células de HSE
activadas por IL-1\beta liberan factores
estimuladores de VLA-4, que potencian la adherencia
de las células B16M a las células de HSE (11). De este modo, la
IL-1\beta induce la expresión de
VCAM-1 y la liberación del factor de estimulación de
VLA-4 desde las células de HSE, que pueden
conferirles una capacidad para crear un microentorno prometastásico
para ciertas células cancerosas que expresan VLA-4
detenidas intrasinusoidalmente.
No obstante, el bloqueo de
IL-1\beta y TNF-\alpha conducía
solamente a una anulación de la metástasis parcial, indicando que
también están implicados otros factores que o bien compensan su
ausencia, o bien actúan por medio de rutas alternativas. Además, la
mayoría de las células cancerosas metastásicas y los tejidos diana
son incapaces de producir estas citocinas
pro-inflamatorias. Por otra parte, la concentración
de endotoxina o de ligando del receptor de manosa normalmente no
aumenta suficientemente para inducir la liberación de citocina
pro-inflamatoria. Por tanto, los múltiples
mediadores que evocan la regulación al alza de
VCAM-1 y su implicación durante el tránsito capilar
de las células cancerosas no están bien caracterizados.
Se sabe a partir de Cytokine, 9(11),
Noviembre 1997, 897, que la metástasis y el crecimiento del melanoma
B16 en ratones carentes de enzima conversora de
IL-1\beta (ICE) se reducen después de la inyección
de células B16 incubadas con inhibidores de ICE específicos en
comparación con la inyección de células B16 no tratadas.
La IL-18 (factor inductor de
IFN\gamma) es una citocina novedosa que comparte rasgos con la
familia de proteínas de la IL-1 (22) y propiedades
funcionales con la IL-12 (23). Se ha informado que
la producción de IL-18 a partir de células de
Kupffer activa las rutas hepatotóxicas mediadas por el ligando tanto
de TNF-\alpha como de FAS en la lesión de hígado
inducida por endotoxinas (24). Más recientemente, se ha revelado que
la IL-18 también posee propiedades proinflamatorias
por estimulación directa de la expresión génica y la síntesis de
TNF-\alpha a partir de células CD3^{+}/CD4^{+}
y asesinas naturales con la subsiguiente producción de
IL-1\beta e IL-18 a partir de la
población CD14^{+}, revelando de ese modo una posición fundamental
inesperada de la IL-18 en la jerarquía de las
citocinas (25). No obstante, su posible papel en la metástasis del
cáncer todavía no ha sido elucidado.
Se purificó una proteína de unión a
interleucina-18 (IL-18BP) de la
orina mediante cromatografía sobre cuentas de
IL-18, se secuenció, se clonó y se expresó en
células COS7.
IL-18BP abolió la inducción por
IL-18 del interferón-\gamma
(IFN-\gamma), IL-8 y la activación
de NF-\kappaB in vitro. La administración
de IL-18BP a ratones anulaba el
IFN-\gamma circulante después de LPS. De este
modo, IL-18BP funciona como inhibidor de la
respuesta temprana de la citocina Th1. La IL-18BP es
expresada constitutivamente en el bazo, pertenece a la superfamilia
de las inmunoglobulinas y tiene una homología limitada con el
receptor de tipo II de IL-1. Su gen fue localizado
en el cromosoma humano IJq13 y no se encontró ningún exón que
codificara un dominio transmembrana en una secuencia genómica de 8,3
kb. Diversos Poxvirus codifican supuestas proteínas altamente
homólogas a IL-18BP, sugiriendo que los productos
virales pueden atenuar la IL-18 e interferir en la
respuesta de las células T citotóxicas (28 y publicación WO
99/09063). Como se describe más concretamente en la publicación WO
99/09063, la IL-18BP y las muteínas, proteínas
fusionadas, derivados funcionales, fracciones activas o derivados
permutados circularmente y mezclas de los mismos son capaces de
unirse a IL-18 y/o capaces de modular la actividad
de IL-18 y/o capaces de bloquear la actividad de
IL-18.
En la publicación WO 98/41232 se describen
composiciones farmacéuticas que contienen un antagonista de
IL-18 para modular la sensibilidad a los
corticosteroides.
En EP 0.850.952 se describe el uso de un
anticuerpo para el receptor de IL-18 para la
inhibición de la actividad de IL-18.
En Immunology Letters 68:
135-139, se analiza la correlación entre la
expresión del IFN-gamma intratumoral y el resultado
clínico en el caso de pacientes afectados por carcinoma cervical o
carcinoma colorrectal. Se describe que la carencia de expresión de
IFN-gamma se corresponde con la existencia de
metástasis distantes y una prognosis escasa.
La presente invención proporciona el uso de
inhibidores de la producción y/o la acción de IL-18
en la preparación de medicamentos para inhibir la metástasis
tumoral de melanoma.
Los inhibidores de la producción de
IL-18 son p. ej., los inhibidores de la
caspasa-1.
Los inhibidores de la acción de
IL-18 se seleccionan entre los anticuerpos contra
IL-18, los anticuerpos contra cualquiera de las
subunidades del receptor de IL-18, los antagonistas
de IL-18 que compiten con IL-18 y
bloquean el receptor de IL-18, y las
IL-18BP, muteínas, proteínas fusionadas, derivados
funcionales, fracciones activas o derivados permutados
circularmente de los mismos que tienen la misma actividad que la
proteína de unión a IL-18
(IL-18BP).
Preferiblemente los inhibidores utilizados son
las IL-18BP, o una muteína, proteína fusionada,
derivado funcional, fracción activa o derivado permutado
circularmente de los mismos que tienen la misma actividad que la
IL-18BP.
También se describen las composiciones
farmacéuticas para la inhibición de la producción y/o la acción de
IL-18 para inhibir la metástasis tumoral del
melanoma.
Otra manera de inhibir la producción y/o la
acción de IL-18, con el fin de inhibir la metástasis
tumoral del melanoma, es la introducción en el organismo de un
vector de expresión que comprende la secuencia codificante para un
inhibidor de la producción y/o la acción de IL-18,
tal como IL-18BP.
Fig. 1. Colonización hepática experimental
después de la inyección intraesplénica de células B16M en ratones
de tipo salvaje, IL-1\beta^{-/-} e ICE^{-/-}.
Los hígados se separaron el día 10 después de la inyección de
células B16M y se fijaron en solución salina tamponada con fosfato
con 10% de formaldehído. Casi todas las metástasis experimentales
(nódulos melanóticos negros) eran erradicadas de los hígados de los
ratones IL-1\beta^{-/-} e ICE^{-/-}.
Fig. 2. Efecto del inhibidor de ICE irreversible
y del anticuerpo anti-IL-18 de ratón
sobre la adherencia de las células B16M a las células de HSE, y la
producción de IL-1\beta y
TNF-\alpha de HSE no tratado y tratado con
B16M-CM. Las células de HSE cultivadas se incubaron
en presencia de B16M-CM durante 10 horas. En
algunos experimentos, las células de HSE tanto no tratadas como
tratadas recibían ICEi 10 \muM o 10 \mug/ml de anticuerpo
anti-IL-18 de ratón antes de
B16M-CM. El porcentaje de células B16M adheridas al
sustrato de HSE se calculó como el valor relativo con respecto al
número inicial de células añadidas. Además, los sobrenadantes de
cultivo se recuperaron antes de la adherencia para determinar la
concentración de IL-1\beta y
TNF-\alpha mediante ELISA. Los datos representan
la media\pmDT de 4 experimentos por separado, cada uno por
sextuplicado (n=24). El aumento de la adherencia de las células
B16M a HSE tratado con B16M-CM y de la producción de
IL-1\beta o TNF-\alpha con
respecto al HSE no tratado (*p<0,01) fue estadísticamente
significativo según el ensayo de la t de Student, de dos colas, no
emparejado. No hubo cambios estadísticamente significativos en la
producción de IL-1\beta o
TNF-\alpha ni en la adherencia de las células B16M
a las células de HSE cuando estas eran tratadas con ICEi o
anticuerpo anti-IL-18 en ausencia de
B16M-CM (datos no mostrados).
Fig. 3. Efecto de ICEi sobre la adherencia de
las células B16M a HSE tratado con B16M-CM in
vitro. Las células de HSE se incubaron con medio basal o
B16M-CM durante 8 horas. Algunas células de HSE
recibieron ICEi 10 \muM durante 18 horas antes de
B16M-CM. Además, también se añadió 1 ng/ml de
IL-1\beta murina recombinante a algunas células
de HSE junto con B16M-CM durante 8 horas. En otros
experimentos, las células de HSE recibieron 1 ng/ml de
IL-1\beta o 100 pg/ml de
TNF-\alpha de ratón durante 6 horas, y se
añadieron 10 \mug/ml de anticuerpo policlonal
anti-IL-18 de ratón de conejo o no
antes del tratamiento con citocina. También se añadió anticuerpo
policlonal IgG no específico a las células de HSE no tratadas y
tratadas con citocina. Después, las células de HSE se lavaron y se
añadieron células B16M marcadas con BCEFCF-AM y se
lavaron de nuevo 8 minutos más tarde. El porcentaje de células B16M
adheridas al sustrato de HSE se calculó como el valor relativo con
respecto al número inicial de células añadidas. Los resultados
representan la media\pmDT de tres experimentos separados, cada
uno por sextuplicado (n=18). La diferencias en el grado de
adherencia con respecto al HSE no tratado (*) y al HSE tratado con
IL-1\beta y TNF-\alpha (**) eran
estadísticamente significativas (p<0,01), según el ensayo de la
t de Student de dos colas, no emparejado. Sin cambios
estadísticamente significativos en la adherencia de las células
B16M a otro HSE de control tratado con ICEi que recibían
adicionalmente o no 1 ng/ml de IL-1\beta murina
durante 8 horas (datos no mostrados).
Fig. 4. Adherencia de células B16M in
vitro a HSE tratado con IL-18. Las células de
HSE se incubaron con 1 ng/ml de IL-18 murina
recombinante durante 6 horas. En algunos experimentos, se añadieron
10 \mug/ml de TNF-sRp55 o 100 ng/ml de
IL-1Ra 10 minutos antes de la IL-18.
En otros experimentos, se añadieron 10 \mug/ml de anticuerpo
anti-VCAM-1 o una concentración
similar de IgG anti-ratón no específica a las
células de HSE 30 minutos antes de las células B16M. Después, se
determinó el porcentaje de adherencia de las células B16M como se
describe más abajo en los ejemplos. Los resultados representan la
media \pm DT de tres experimentos separados, cada uno por
sextuplicado (n=18). Las diferencias en el grado de adherencia con
respecto al HSE tratado con medio basal (*) y al HSE tratado con
IL-18 (**) eran estadísticamente significativas
(p<0,01), según el ensayo de la t de Student de dos colas, no
emparejado.
Varias citocinas proinflamatorias, incluyendo la
interleucina (IL)-1\beta y el factor de necrosis
tumoral alfa (TNF-\alpha), promueven la
adherencia de células cancerosas a las células endoteliales,
conduciendo de ese modo a la diseminación metastásica de los
tumores. Estas citocinas proinflamatorias promueven la adherencia y
la metástasis probablemente induciendo la molécula de adherencia
celular vascular 1 (VCAM-1). La presente invención
demuestra que el tratamiento de las células de HSE murinas
cultivadas primarias con medio acondicionado (CM) de cultivos de
células de melanoma B16 (B16M) (B16M-CM) promueve
la adherencia entre las células B16M y HSE in vitro.
B16M-CM también induce la producción de
IL-1\beta y TNF-\alpha por las
células de HSE in vitro. No obstante, no se ha demostrado
claramente que la metástasis tumoral está en efecto mediada por
IL-1\beta y TNF-\alpha.
La presente invención muestra que
B16M-CM induce la producción de
IL-18 por las células de HSE y que la
IL-18 es la citocina que contribuye a un aumento de
la adherencia de las células B16M a las células de HSE.
IL-18 potencia la adherencia activando la expresión
de VCAM-1 en células de HSE sin la implicación del
TNF-\alpha o la IL-1\beta. La
incubación de las células de HSE con un inhibidor de
caspasa-1 específico (10 \muM, 18 h) anula
completamente la adherencia inducida por B16M-CM sin
disminuir la producción de TNF-\alpha, y el
efecto no es revertido por la adición de IL-1\beta
de ratón. La adición de anticuerpo
anti-IL-18 murino a las células de
HSE evita la adherencia inducida por B16M-CM, sin
interferir en la inducción por B16M-CM de
IL-1\beta y TNF-\alpha. De un
modo similar, la proteína de unión a IL-18
recientemente clonada (IL-18BP) también evita la
adherencia inducida por B16M-CM de B16M a las
células de HSE in vitro. Los inhibidores de
TNF-\alpha e IL-1\beta tales
como el receptor de TNF soluble p55 o el antagonista del receptor de
IL-1 eran incapaces de invertir esta adherencia
inducida por IL-18. De este modo, la presente
invención proporciona inhibidores de la producción y la acción de
IL-18 como herramientas para inhibir la metástasis
tumoral del melanoma. Los inhibidores de la producción de
IL-18 incluyen los inhibidores de la
caspasa-1. Los inhibidores de la acción de
IL-18 se seleccionan del grupo que consiste en
anticuerpos dirigidos contra IL-18, anticuerpos
dirigidos contra una cualquiera de las dos subunidades del receptor
de IL-18 conocidas, antagonistas de
IL-18, que compiten con IL-18 y
bloquean el receptor de IL-18 y proteínas de unión a
IL-18, que se unen a IL-18 y
bloquean su actividad biológica.
La presente invención hace referencia al posible
papel de IL-18 en la regulación al alza mediada por
citocinas proinflamatorias de la expresión de
VCAM-1, a su posible interacción con otras citocinas
y a los medios para evitar esta inducción de
VCAM-1. Se encontró según la presente invención que
la IL-18 funciona en el inicio de los eventos
proinflamatorios conduciendo a la regulación al alza de
VCAM-1 en la pared sinusoidal hepática y por tanto,
facilitando la adherencia y la metástasis de las células cancerosas.
Las células de HSE tratadas con B16M-CM se
utilizaron como modelo de activación de células endoteliales
dependiente de células cancerosas con el fin de explorar el papel
de la IL-18 inducida por células B16M en el
mecanismo de la adherencia de las células B16M a HSE mediante un
mecanismo dependiente de VCAM-1. Se examinó el papel
específico de IL-18 en condiciones de bloqueo del
receptor de IL-1 específico con el uso de
IL-1Ra, IL-1\beta madura e
inhibición de la secreción de IL-18 utilizando un
inhibidor irreversible de la enzima conversora de
IL-1 (ICEi), bloqueo de TNF utilizando el receptor
soluble de TNF (TNF-sR p55) y bloqueo de la función
de IL-18 utilizando anticuerpos
anti-IL18 y proteína de unión a
IL-18. Además, se inyectaron intraesplénicamente
células B16M en ratones ICE^{-/-} e
IL-1\beta^{-/-}. La baja densidad de metástasis
observada en los ratones deficientes en comparación con los
controles normales sugiere la implicación de IL1\beta y
posiblemente IL-18 en el papel prometastásico de la
inflamación (Tabla 1).
Los experimentos in vitro llevados a cabo
muestran que la producción de IL-18 es responsable
de los efectos estimuladores de la adherencia de HSE inducidos por
los sobrenadantes derivados de células B16M. Puesto que la
regulación al alza de VCAM-1 es responsable de toda
la actividad estimuladora de la adherencia de HSE tratado con
B16M-CM, los datos indican que IL-18
media la expresión de VCAM-1 del HSE inducido por
citocinas. Además, los anticuerpos contra IL-18
disminuían la adherencia de las células inhibida por
B16M-CM sin afectar a la producción de
TNF-\alpha e IL-1\beta de las
células de HSE. Por lo tanto, la producción de
IL-1\beta y TNF-\alpha en
células de HSE era independiente de IL-18 y no
contribuía a la adherencia. Por el contrario, ni
TNF-sR p55 ni IL-1Ra eran capaces de
inhibir el aumento de adherencia en células de HSE tratadas con
IL-18, confirmando que ni el
TNF-\alpha ni la IL-1\beta
autocrinos eran responsables de la adherencia de HSE inducida por
IL-18.
Los resultados en las células de HSE contrastan
con los obtenidos en otros sistemas celulares, como por ejemplo
células mononucleares de sangre humana no CD14^{+} (25), donde
IL-18 inducía IL-1\beta vía
producción de TNF-\alpha. Es probable que exista
una jerarquía de citocinas proinflamatorias específicas de HSE en
la que TNF-\alpha e IL-1\beta
son independientes del control por IL-18, pero están
utilizando IL-18 como mediador aguas abajo de la
regulación al alza de VCAM-1.
A diferencia de las células de HSE murinas, las
células B16M no expresaban el gen IL-18 como se
verificó mediante RT-PCR, y la incubación con ICEi
durante 18 horas no anulaba las actividades de las citocinas y
estimuladoras de la adherencia de B16M-CM sobre las
células de HSE. No obstante, la producción local de
IL-18 puede influir en el comportamiento de las
células B16M durante su tránsito o detención en la microvasculatura
hepática. Un descubrimiento adicional fue que la incubación de las
células B16M con 1 ng/ml de IL-18 murina durante 6
horas aumentaba al doble su adherencia a HSE no tratado, y la
adición de anticuerpo anti-VCAM-1 a
HSE disminuía la adherencia mediada por IL-18 en un
80%, sugiriendo que estaba implicada la interacción
VCAM-1/VLA-4. De un modo similar,
las células B16M que recibían el sobrenadante de HSE tratado con
B16M-CM durante 6 horas también aumentaban
significativamente al doble (p<0,01) su adherencia a HSE por el
mecanismo dependiente de VCAM-1 y el anticuerpo
anti-IL-18 abolía este efecto
estimulador de la adherencia.
Los descubrimientos según la presente invención
sugieren que la IL-18 es un nuevo enlace entre la
liberación hepática de citocinas proinflamatorias y el desarrollo
de metástasis. Su producción a partir de células de HSE activadas
por tumores determina dos mecanismos complementarios implicados en
la regulación de la adherencia de las células de melanoma a las
células de HSE: un mecanismo autocrino en HSE, que controla la
regulación al alza de VCAM-1 mediada por
TNF-\alpha/IL-1\beta, y un
mecanismo paracrino en las células B16M, que regula al alza la
VLA-4 de las células de melanoma, potenciando su
capacidad de adherencia dependiente de VCAM-1. Esta
regulación al alza molecular simultánea de ambas contrapartes de la
adherencia celular hace muy valiosa la ruta de interacción de las
células cancerosas-endoteliales capilares.
La adherencia inducida por IL-18
de las células B16M es anulada por los inhibidores de la producción
y/o acción de IL-18. Los inhibidores de la
producción de IL-18 incluyen inhibidores de la
caspasa-1. Los inhibidores de la acción de
IL-18 se seleccionan del grupo que consiste en
anticuerpos dirigidos contra IL-18, anticuerpos
dirigidos contra una cualquiera de las dos subunidades del receptor
de IL-18 conocidas, antagonistas de
IL-18, que compiten con IL-18 y
bloquean el receptor de IL-18, y proteínas de unión
a IL-18, que se unen a IL-18 y
bloquean su actividad biológica.
Además del uso directo de los inhibidores de la
producción y/o la acción de IL-18, la presente
invención también contempla la introducción en las células en las
que se desea un efecto inhibidor de la producción y/o la acción de
IL-18. Para este fin es necesario un sistema de
introducción específico, p. ej., del ADN que codifica una
IL-18BP en las células. Se conocen en la técnica
diversas posibilidades de realizar esto. Por ejemplo, se puede
introducir en las células un vector adecuado que porta el ADN
anterior, siendo el vector capaz de efectuar la inserción del ADN
en las células de un modo tal que el ADN es expresado en las
células. Los métodos de distribución a las células se describen
entre otros, p. ej., en la patente de los Estados Unidos 5.910.487,
la publicación WO99/29349, y otros.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para
el uso según la invención para la inhibición de la producción y/o
la acción de IL-18 son aquellas que comprenden, como
ingrediente activo un inhibidor seleccionado entre el inhibidor de
caspasa-1, un anticuerpo contra
IL-18, un anticuerpo contra cualquiera de las
subunidades del receptor de IL-18, un inhibidor de
la ruta de señalización del receptor de IL-18, un
antagonista que compite con IL-18 y bloquea el
receptor de IL-18 e IL-18BP o una
muteína, una proteína fusionada, un derivado funcional, una
fracción activa o un derivado permutado circularmente de la misma
que tenga la misma actividad que IL-18BP.
Los términos muteína, proteína fusionada,
derivado funcional, fracción activa y derivado permutado
circularmente tienen el mismo significado que en la publicación WO
99/09063.
Los anticuerpos contra IL-18 y
las IL-18BP son los ingredientes preferidos de las
composiciones farmacéuticas.
Las composiciones farmacéuticas también pueden
comprender portadores, excipientes y otros ingredientes
convencionales conocidos en la técnica, dependiendo de su modo de
aplicación, esto es, inyección, oral o cualquier otra ruta conocida
en la técnica.
La dosificación concreta dependerá del modo de
aplicación, el peso corporal del paciente y otros factores y será
determinada en cualquier caso por el médico.
Habiendo descrito ahora la invención, la misma
se comprenderá más fácilmente por medio de la referencia a los
siguientes ejemplos que se proporcionan a modo de ilustración y no
se pretende que sean limitantes de la presente invención.
Se obtuvieron IgG anti-ratón de
rata y anticuerpo monoclonal
anti-VCAM-1
anti-ratón de rata de Serotec Ltd. (Oxford,
Inglaterra). Se obtuvo IL-1\beta murina
recombinante a partir de R&D System Inc. (Minneapolis, MN). El
antagonista del receptor de IL-1 humana recombinante
(IL-1Ra fue una amable donación de The Upjohn Co.,
Kalamazoo, MI) y el receptor soluble de TNF p55 humano (TNFsR p55)
fue una amable donación de Serono Inc., Norwell, MA. El inhibidor
de la enzima conversora de IL-1\beta (ICEi) se
obtuvo de Alexis Co. (San Diego, CA). La IL-18
murina recombinante y el anticuerpo policlonal IgG
anti-IL-18 de ratón de conejo fueron
adquiridos de PreProTech EC Ltd. (Londres, UK). La proteína de
unión a IL-18 (IL-18BP) fue
producida como se ha descrito (28).
Cultivo de células B16M. Se cultivaron
células B16M, se mantuvieron y se hicieron pasar como se ha descrito
previamente (11). Se preparó medio acondicionado con B16M
(B16M-CM) como sigue: se cultivaron en placa 5 x
10^{5} células en un matraz en T de 25 cm^{2} y se cultivaron
durante 24 horas. Después de lo cual, las células fueron cultivadas
durante un período adicional de 24 horas en 5 ml de medio sin suero
(densidad celular final de 6 x 10^{4} células/cm^{2}). Los
sobrenadantes se recogieron, se diluyeron 3:1 en medio sin suero y
se hicieron pasar a través de un filtro de 0,22 \mum.
Análisis de citocinas. Se midió la
liberación de citocinas a partir de las células de HSE y las células
B16M cultivadas primarias utilizando kits de ELISA específicos
basados en anticuerpos monoclonales
anti-IL-1\beta y
TNF-\alpha de ratón, como sugería el fabricante
(R&D Systems, Minneapolis, MN).
Se separó HSE de ratones singeneicos, se
identificaron y se cultivaron como se ha descrito antes (26). Las
células B16M se marcaron con solución de éster acetoximetílico de
2',7'-bis(2-carboxietil)-5,6-carboxifluoresceína
(BCECF-AM, Molecular Probes, Eugene, OR) como se ha
informado (16). Después, se añadieron 2x10^{5} células/pocillo a
HSE cultivado en placas de 24 pocillos y 8 minutos más tarde, los
pocillos se lavaron tres veces con medio de nueva aportación. El
número de células adherentes se determinó utilizando un método
cuantitativo basado en el sistema de medición de la fluorescencia
descrito previamente (16). En algunos experimentos, las células de
HSE se pre-incubaron con B16M-CM
durante varias horas antes de la adición de las células B16M.
Se generaron ratones C57BL/6J macho de tipo
salvaje, IL-1\beta^{-/-} e ICE^{-/-} como se
ha descrito previamente (27). Se utilizaron ratones de seis a ocho
semanas de edad, alojados 5 por jaula. Se produjeron metástasis
hepáticas por medio de inyección intraesplénica en los ratones
anestesiados (Nembutal, 50 mg/kg intraperitoneal) de 3 x 10^{5}
células de melanoma B16 viables suspendidas en 0,1 ml de solución
salina equilibrada de Hank. Los ratones fueron sacrificados bajo
anestesia el 10º día después de la inyección de las células
cancerosas. Los tejidos hepáticos se trataron para la histología. El
análisis densitométrico de las imágenes microscópicas digitalizadas
se utilizó para discriminar las B16M metastásicas del tejido
hepático normal y se calculó la densidad de metástasis hepáticas,
que es el número de metástasis por 100 mm^{3} de hígado
(basándose en el número medio de focos detectados en quince
secciones de 10x10 mm^{2} por hígado), utilizando los
procedimientos estereológicos descritos previamente (17).
Se realizaron dos experimentos independientes,
con un año de diferencia, utilizando dos lotes diferentes de las
mismas células B16M inyectadas intraesplénicamente en ratones
C57B1/6J adultos de tipo salvaje, ICE^{-/-} e
IL-1\beta^{-/-}. La inspección necrópsica
demostró tumores melanóticos visibles en el bazo de todos los
ratones analizados, sin diferencias significativas en el tamaño
evaluado por el peso esplénico (Tabla 1). En cambio, se producía un
descenso marcado en las metástasis en los hígados de ratones
IL-1\beta^{-/-} y, especialmente ICE^{-/-} en
comparación con los hígados de ratón de tipo salvaje (Fig. 1).
También se llevó a cabo un análisis histológico cuantitativo del
número y el tamaño de los focos metastásicos para determinar los
parámetros de densidad (como núm. de focos/100 mm^{3}) y volumen
(porcentaje de ocupación del órgano) en los hígados de los ratones
estudiados. En comparación con los ratones de tipo salvaje (Tabla
1), la densidad de las metástasis hepáticas disminuyó
significativamente (p<0,01) en los hígados de ratones
IL-1\beta^{-/-} e ICE^{-/-} en un 84%-90%,
indicando que la mayor parte de las células B16M inyectadas eran
incapaces de implantarse en el tejido hepático de estos ratones.
Además, el volumen de las metástasis también disminuyó
significativamente (p<0,01) en hígados de ratones
IL-1\beta^{-/-} e ICE^{-/-} 6 a 7 veces, en
comparación con los valores de los hígados de ratones de tipo
salvaje, indicando que las células B16M que tenían éxito al
colonizar el hígado también presentaban una reducción de la
velocidad de crecimiento. Los autores de la presente invención
también observaron una diferencia en estos parámetros de metástasis
entre los hígados de los ratones
IL-1\beta^{-/-} e ICE^{-/-}, conduciendo a la
erradicación de la metástasis en casi todos los hígados de los
ratones ICE^{-/-} del experimento 1 (Fig. 1).
B16M-CM aumentó
significativamente (p<0,01) la producción en células de HSE de
TNF-\alpha e IL-1\beta, y su
adherencia a otras células B16M in vitro (Fig. 2). La
incubación de HSE con ICEi 10 \muM durante 18 horas anuló
completamente la adherencia inducida por B16M-CM sin
disminuir la producción de TNF-\alpha a partir de
HSE. La IL-1\beta murina añadida exógenamente no
compensó el efecto de bloqueo de ICEi sobre HSE, que contrasta con
el incremento significativo de la adherencia a las células B16M en
el HSE de control tratado con IL-1\beta (Fig. 3).
El hecho de que la potenciación de la adherencia inducida por
B16M-CM fuera abolida en presencia de
concentraciones elevadas de TNF-\alpha producido
endógenamente e IL-1B añadida exógenamente indica
que ninguna de estas citocinas regula al alza directamente la
adherencia al HSE. Importantemente, la presencia de anticuerpo
anti-IL-18 murino añadido a HSE
antes de la estimulación con B16M-CM evitaba la
adherencia inducida por B16M-CM sin afectar a la
producción de IL-1\beta y
TNF-\alpha inducida a partir de HSE (Fig. 2). Por
otra parte, el anticuerpo anti-IL18 también evitaba
los efectos de estimulación de la adherencia de
IL-1\beta y TNF-\alpha murinos
sobre el HSE (Fig. 3), indicando que las acciones
pro-adherencia de estas citocinas sobre HSE estaban
mediadas ambas por IL-18. La RT-PCR
confirmó que las células de HSE expresaban el gen de
IL-18 (datos no mostrados). Por el contrario, la
IL-18 murina aumentó significativamente (p<0,01)
la adherencia de las células B16M a HSE (Fig. 4), y ni
TNF-sR p55 ni IL-1Ra fueron capaces
de inhibirla, confirmando que ni el TNF-\alpha ni
la IL-1\beta autocrinos eran responsables de la
adherencia a HSE inducida por IL-18. No obstante,
como se muestra en la Fig. 4, el anticuerpo
anti-VCAM-1 inhibió completamente
la adherencia de las células B16M a HSE tratado con
IL-18. La IgG no específica de control no afectó a
la regulación al alza de la adherencia de las células B16M a HSE
tratado con IL-18.
Como se muestra en la Tabla 2, la adición de
IL-18BP a HSE estimulado con B16-CM
reducía el porcentaje de células adherentes del 35% al 8,70%
(p<0,01). Esto representa una inhibición del 100% ya que el nivel
de adherencia estaba por debajo del nivel de células adherentes
utilizando el medio basal. Este resultado sugiere que la
IL-18 endógena de HSE puede ser una fuente endógena
de IL-18 además de la que está presente en
B16M-CM.
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Claims (6)
1. El uso de inhibidores de la producción y/o
acción de IL-18 para la preparación de medicamentos
para inhibir la metástasis tumoral de melanomas, donde el inhibidor
de IL-18 se selecciona entre los anticuerpos contra
IL-18, los anticuerpos contra cualquiera de las
subunidades del receptor de IL-18, los antagonistas
de IL-18 que compiten con IL-18 y
bloquean el receptor de IL-18, y las proteínas de
unión a IL-18, muteínas, proteínas fusionadas,
derivados funcionales, fracciones activas o derivados permutados
circularmente de los mismos que tienen la misma actividad que la
proteína de unión a IL-18
(IL-18BP).
2. El uso según la reivindicación 1, donde el
melanoma es melanoma hepático.
3. El uso según la reivindicación 1, donde el
inhibidor de la producción de IL-18 es un inhibidor
de caspasa-1 que se une específicamente e
irreversiblemente a IL-18.
4. El uso según la reivindicación 1, donde el
inhibidor de IL-18 es un anticuerpo contra
IL-18.
5. El uso según la reivindicación 1, donde el
inhibidor de la acción de IL-18 es una
IL-18BP, o una muteína, derivado o fragmento de la
misma que tiene la misma actividad que IL-18BP.
6. El uso de un vector de expresión que codifica
un inhibidor de la producción y/o la acción de IL-18
como se define en la reivindicación 1 para la preparación de
medicamentos para inhibir la metástasis tumoral de melanomas.
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