ES2334773T3 - Uso de inhibidores de il-18 para el tratamiento o prevencion de la sepsis. - Google Patents
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Abstract
El uso de un inhibidor de IL-18 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de disfunción cardíaca relacionada con sepsis, en donde el inhibidor se selecciona a partir de anticuerpos contra IL-18 y las proteínas de unión a IL-18, IL-18BPa e IL-18BPc.
Description
Uso de inhibidores de IL-18 para
el tratamiento o prevención de la sepsis.
La siguiente solicitud reivindica los beneficios
de la Solicitud Provisional de los EE.UU. Nº 60/291.463 presentada
el 16 de mayo de 2001.
La presente invención se refiere al uso de
inhibidores de IL-18 para el tratamiento y/o la
prevención de la disfunción cardíaca relacionada con sepsis.
En 1989 se detectó un factor inducido en el
suero procedente de ratones infectados con mycobacterium
bovis y expuestos a LPS. Este factor fue capaz de inducir
interferón \gamma (IFN-\gamma) en cultivos de
células de bazo de ratones normales en presencia de
interleuquina-2 (IL-2) (Nakamura y
col., 1989). Este factor no funcionó como un inductor directo de
IFN-\gamma sino más bien como un
co-estimulante junto con IL-2,
anti-CD3 o mitógenos. Un intento por identificar
mejor esta actividad de suero de ratón tratado con
post-endotoxina reveló una proteína de
50-55 kDa aparentemente homogénea, asociada a la
anterior actividad (Nakamura y col., 1993). Puesto que otras
citoquinas pueden actuar como co-estimulantes para
la producción de IFN-\gamma, el fallo de los
anticuerpos neutralizantes de IL-1,
IL-4, IL-5, IL-6 ó
TNF en el bloqueo de la actividad en suero sugería que se trataba
de un factor distinto. Los mismos autores documentaron que el
co-estimulante inducido por endotoxina para la
producción de IFN-\gamma estaba presente en
extractos de hígado de ratones preacondicionados con P.
acnes (Okamura y col., 1995). De acuerdo con este modelo
experimental, la población de macrófagos hepáticos (células
Kupffer) se expande, y por tanto una dosis baja de lipopolisacáridos
bacterianos (LPS) se vuelve letal. Un tratamiento similar no es
letal para ratones no preacondicionados. El factor, denominado
factor inductor de IFN-\gamma (IGIF) y
posteriormente designado como interleuquina-18
(IL-18), fue purificado hasta homogeneidad a partir
de hígados de ratón tratados con P. acnes y se obtuvo una
secuencia parcial de aminoácidos. Se usaron oligonucleótidos
degenerados derivados de secuencias de aminoácidos de
IL-18 purificada para clonar un ADNc de
IL-18
murino (Okamura y col., 1995). La secuencia de ADNc humano para la IL-18 se publicó en 1996 (Ushio y col., 1996).
murino (Okamura y col., 1995). La secuencia de ADNc humano para la IL-18 se publicó en 1996 (Ushio y col., 1996).
La interleuquina IL-18 (Tsutsui
y col., 1996, Nakamura y col., 1993, Okamura y col., 1995, Ushio y
col., 1996), comparte características estructurales con la familia
de proteínas IL-1 (Bazan y col., 1996), que tiene un
estructura de lámina de pliegue \beta diferente a la de la
mayoría de las citoquinas, que exhiben una estructura de haz de
cuatro hélices. De forma similar a la IL-1\beta,
la IL-18 se sintetiza como un precursor
biológicamente inactivo (proIL-18) y carece de
péptido señal (Ushio y col., 1996). Los precursores de
IL-1\beta e IL-18 son atacados
por caspasa 1 (enzima convertidora de IL-1\beta, o
ICE), que ataca a los precursores justo detrás de un residuo de
ácido aspártico en la posición P1. Las citoquinas maduras
resultantes son liberadas de la célula (Ghayur y col., 1997, y Gu y
col., 1997), a pesar de la falta de péptido señal.
Se sabe que la IL-18 actúa como
co-estimulante en la producción de citoquinas
(IFN-\gamma, IL-2 y factor
estimulante de colonia de granulocito-macrófagos)
mediante células T colaboradoras tipo 1 (Th1) (Kohnoet y col.,
1997) y también como co-estimulante para la
citotoxicidad mediada por ligando mediante clones de células
asesinas naturales murinas (Tsutsui y col., 1996).
La interleuquina-12
(IL-12) es una citoquinas inmunorreguladora
producida mediante monocito/macrófagos y otras células
presentadoras de antígenos. Es básica en la orquestación de
inmunorrespuestas mediadas por células tanto innatas como
adquiridas (Trinchieri, 1998). Consiste en un heterodímero compuesto
de los productos ligados covalentemente de dos genes separados: una
cadena pesada (p40) y una cadena ligera (p35). La producción de
IL-12 se estimula en respuesta a determinadas
bacterias, productos bacterianos, parásitos intracelulares y virus.
Las siguientes funciones se han atribuido a IL-12:
1) es un potente inductor de IFN-\gamma a partir
de células T y células asesinas naturales (NK), 2) es
co-mitogénica para dichas células, 3) es crítica
para el desarrollo de respuesta Th1 en la mayoría de los sistemas
(conduciendo de este modo y de forma secundaria a aumentos en la
producción de IFN-\gamma y TNF, a la activación de
macrófagos, etc.), 4) potencia los linfocitos T citotóxicos y la
citotoxicidad de células NK, y 5) es necesaria para respuestas de
hipersensibilidad de tipo retardado. Se demostró que la producción
de IL-12 en leucocitos esplénicos murinos aislados
tratados con la cepa Cowan 1 de Staphylococcus aureus se
veía suprimida por IFN-\alpha ó
IFN-\beta (Karp y col., 2000).
Recientemente se ha publicado que la
IL-12 está implicada en la patogénesis de
enfermedades inflamatorias autoinmunes específicas de órgano tales
como la esclerosis múltiple (MS) (Karp y col., 2000) y la enfermedad
inflamatoria del intestino (IBD) (Blumberg y Strober, 2001, y
Fiocchi, 1999), y por tanto es considerada como una diana potencial
para fármacos en el tratamiento de estas afecciones.
La IL-18 y la
IL-12 exhiben un marcado sinergismo en la inducción
de IFN-\gamma en células T (Okamura y col.,
1998). La investigaciones sobre el mecanismo de este sinergismo han
revelado que la IL-12 regula al alza la expresión
de ambas cadenas del receptor de IL-18 en células
productoras de IFN-\gamma (Kim y col., 2001).
Aunque la IL-12 y la IL-18 activan
la inmunidad tanto innata como inducida, una producción excesiva
mediante macrófagos activados puede inducir múltiples trastornos en
órganos, incluyendo la malfunción del sistema inmune (Seki y col.,
2000).
Las proteínas de unión de citoquina (receptores
de citoquina solubles) normalmente son los dominios de unión de
ligando extracelular de sus respectivos receptores de citoquina de
superficie celular. Se producen mediante división alternativa o
mediante ruptura proteolítica del receptor de superficie celular.
Estos receptores solubles se han descrito en el pasado: por
ejemplo, los receptores solubles para IL-6 e
IFN-\gamma (Novick y col., 1989), TNF (Engelmann
y col., 1989, y Engelmann y col., 1990), IL-1 e
IL-4 (Maliszewski y col., 1990) e
IFN-\alpha/\beta (Novick y col., 1994, Novick y
col., 1992). Una proteína de unión de citoquina, denominada
osteoprotegerina (OPG, también conocida como factor inhibidor de
osteoclasto, OCIF), un miembro de la familia TNFR/Fas, parece ser
el primer ejemplo de un receptor soluble que existe sólo como
proteína secretada (Anderson y col., 1997, Simonet y col., 1997,
Yasuda y col., 1998).
Se purificó mediante afinidad una proteína de
unión de interleuquina-18 (IL-18BP)
en una columna de IL-18, a partir de orina (Novick
y col., 1999). La IL-18BP elimina la inducción de
IL-18 de IFN-\gamma, y la
activación de IL-18 de NF-kB in
vitro. Además, la IL-18BP inhibe la inducción de
IFN-\gamma en ratones inyectados con LPS. El gen
de IL-18BP se localizó en el cromosoma humano 11, y
no se pudo descubrir ningún exón que codifique para un dominio
transmembrana en la secuencia genómica de 8,3 kb que comprende el
gen de IL-18BP. Hasta la fecha se han descubierto
cuatro isoformas de IL-18BP generada mediante
división alternativa de ARNm en humanos. Se designaron como
IL-18BP a, b, c y d, compartiendo todas ellas el
mismo extremo N y diferenciándose en el extremo C (Novick y col.,
1999). Estas isoformas varían en su capacidad para unirse a
IL-18 (Kim y col., 2000). De las cuatro isoformas
de IL-18BP humanas (hIL-18BP), se
sabe que la a y la c tienen una capacidad de neutralización de
IL-18. La isoforma de IL-18BP más
abundante, la variante de división isoforma a, exhibe una elevada
afinidad por la IL-18 con un rápido inicio y un
lento decaimiento, y una constante de disociación (Kd) de
aproximadamente 0,4 nM (Kim y col., 2000). La
IL-18BP se expresa de forma constitutiva en el bazo,
y pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas. Los residuos
implicados en la interacción de IL-18 con
IL-18BP han sido descritos mediante el uso de
modelización computerizada (Kim y col., 2000) y en base a la
interacción entre la proteína similar IL-1\beta y
la IL-1R de tipo I (Vigers y col., 1997). De acuerdo
con el modelo de la IL-18 que se une a la
IL-18BP, el residuo Glu de la posición 42 y el
residuo Lys de la posición 89 de la IL-18 han sido
propuestos como uniones con el Lys-130 y el
Glu-114 de la IL-18BP,
respectivamente (Kim y col., 2000).
La IL-18BP está presente
constitutivamente en muchas células (Puren y col., 1999) y circula
en humanos saludables (Urushihara y col., 2000), representando un
fenómeno único en la biología de las citoquinas. Debido a la alta
afinidad de la IL-18BP por la IL-18
(Kd = 0,4 nM) así como a la alta concentración de
IL-18BP encontrada en circulación (un exceso molar
de 20 sobre la IL-18), se ha especulado que la
mayoría de las moléculas de IL-18, si no la
totalidad, en circulación se unen a IL-18BP. Por
tanto, la IL-18BP en circulación, que compite con
los receptores de superficie celular por la IL-18,
puede actuar como un antiinflamatorio natural y como una molécula
inmunosupresora.
Como se ha mencionado, la IL-18
induce IFN-\gamma que a su vez, según se ha
publicado recientemente, induce la generación de ARNm de
IL-18BPa in vitro (Muhl y col., 2000). Por lo
tanto, la IL-18BPa podría servir como señal de
"apagado", finalizando la respuesta inflamatoria.
La IL-18BP es significativamente
homóloga a una familia de proteínas codificada por varios virus de
la Viruela (Novick y col., 1999, Xiang y Moss, 1999). La inhibición
de IL-18 por dicha IL-18BP vírica
putativa puede atenuar la respuesta inflamatoria antiviral de
Th1.
El término síndrome de respuesta inflamatoria
sistémica (SIRS) describe el síndrome clínico familiar de la
sepsis, independiente de su causa. El SIRS puede ser el resultado de
un trauma, pancreatitis, reacciones a fármacos, enfermedad
autoinmune, y otros trastornos: cuando surge como respuesta a una
infección, se dice que la sepsis está presente (Nathens y Marshall,
1996).
El choque séptico es la causa más común de
muerte en las unidades de cuidados intensivos médicas y quirúrgicas
(Astiz y Rackow, 1998). Los términos sepsis, sepsis severa y choque
séptico se usan para identificar el continuo de la respuesta
clínica frente a la infección. Los pacientes con sepsis presentan
evidencias de infección y manifestaciones clínicas de inflamación.
Los pacientes con sepsis severa desarrollan hipoperfusión con
disfunción de órganos. El choque séptico se manifiesta mediante
hipoperfusión e hipotensión persistente. La mortalidad oscila entre
el 16% en pacientes con sepsis y el 40-60% en
pacientes con choque séptico. La infección bacteriana es la causa
más común de choque séptico. Las zonas más frecuentes de infección
son los pulmones, el abdomen y el tracto urinario. Las terapias
anti-inflamatorias generales tales como el uso de
corticosteroides no han mostrado mejoría en la supervivencia de
sepsis y choque séptico. Se han evaluado tres anticuerpos
monoclonales específicos de endotoxina en ensayos clínicos y no han
mejorado las tasas de supervivencia. Las terapias con antagonistas
de factor de necrosis tumoral, interleuquina 1, bradiquinina,
ibuprofeno y factor de activación de plaquetas, no mostraron
mejoras en la supervivencia al choque séptico (Astiz y Rackow,
1998).
La sepsis está provocada, entre otras, por
bacterias Gram-positivas, por ejemplo
Staphylococcus epidermis. Se cree que los ácidos
lipoteicoicos y los péptidoglicanos, que son los principales
componentes de la pared celular de la especie
Staphylococcus, son los inductores de la liberación de
citoquinas en esta afección (Grupta y col., 1996, y Cleveland y
col., 1996). Sin embargo, también se consideran otros componentes
Gram-positivos como estimulantes de la síntesis de
citoquinas (Henderson y col., 1996). Se cree que la producción de
IL-1, TNF-\alpha e
IFN-\gamma es el principal contribuyente a la
patogénesis del choque séptico (Dinarello, 1996, y Okusawa y col.,
1988). Además, se demostró que la quemoquina IL-18
es inducida por neutrófilos en respuesta a S. epidermidis
(Hachicha y col., 1998). Los factores importantes en la regulación
de la inducción de IL-1,
TNF-\alpha e IFN-\gamma por
S. epidermidis son la IL-18, la
IL-12, la IL-1\beta y el
TNF-\alpha. La IL-1\beta y el
TNF-\alpha pueden considerarse como coestímulos
para la producción de IFN-\gamma mediante
linfocitos T de un modo similar a la IL-18. Estas
dos citoquinas tienen una actividad coestimulante sobre la
producción de IFN-\gamma en el contexto de la
IL-12 o de estimulación bacteriana (Skeen y col.,
1995, y Tripp y col., 1993).
Recientemente se ha publicado (Nakamura y col,
2000) que la administración concomitante de IL-18 e
IL-12 a ratones da como resultado una elevada
toxicidad similar a la encontrada en el choque séptico inducido por
endotoxinas.
Se ha demostrado que los niveles de
IL-18 son elevados en sueros procedentes de
pacientes con sepsis (Endo y col., 2000), pero este aumento se
correlacionó con los niveles de creatinina lo que sugiere que los
niveles elevados de IL-18 pueden deberse a un fallo
renal. En otro estudio (Grobmyer y col., 2000), los niveles de
IL-18 en 9 sujetos con sepsis durante las primeras
96 horas después del ingreso hospitalario fueron elevados y no se
correlacionaron con los niveles de creatinina.
Como es evidente a partir de lo anterior, la
IL-18 es una interleuquina pleiotrópica que tiene
funciones tanto potenciadores como atenuadoras de la inflamación.
Por un lado potencia la producción de citoquinas proinflamatorias
como el TNF-\alpha, promoviendo de este modo la
inflamación. Por otro lado, induce la producción de óxido nítrico
(NO), un inhibidor de caspasa-1, bloqueando así la
maduración de la IL-1\beta, y posiblemente
atenuando la inflamación. Este doble papel de la
IL-18 cuestiona seriamente la eficacia de los
inhibidores de IL-18 en el tratamiento de
enfermedades inflamatorias. Además, debido a la implicación de una
amplia variedad de diferentes citoquinas y quemoquinas en la
regulación de la inflamación, no siempre se puede esperar obtener un
efecto beneficioso bloqueando sólo uno de los mecanismos en un
entramado de interacciones tan complicado.
Netea y col. (2000) publicaron que la
administración de anticuerpos policlonales
anti-IL-18 protegió a los ratones
contra los efectos nocivos de LPS derivada de las especies de E.
coli o de S. typhimurium probadas, lo que apoya el
concepto de que la IL-18 tiene una función
patogénica importante en la endotoxemia letal. Sin embargo, la
incertidumbre respecto a la eficacia de una formulación potencial
para el tratamiento basado en la administración de inhibidores de
IL-18, se manifiesta en que los ratones afectados
por IL-18 no son menos susceptibles a la sepsis que
los animales no tratados (Sakao y col., 1999), y en que informes
recientes sugieren que la actividad proinflamatoria de la
IL-18 es esencial para albergar defensas contra
infecciones graves (Nakanishi y col., 2001, y Foss y col.,
2001).
Por tanto, existe una necesidad para
proporcionar medios para tratar y/o prevenir la sepsis a pesar de
las consideraciones anteriores en relación al uso de inhibidores de
IL-18.
La invención se refiere al uso de un inhibidor
de IL-18 en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento y/o la prevención de sepsis relacionada con la
disfunción cardíaca, en el que el inhibidor se selecciona a partir
de anticuerpos contra IL-18 y las proteínas de unión
a IL-18, IL-18BPa e
IL-18BPc.
La proteína de unión a IL-18
usada de acuerdo con la invención es una IL-18BPa o
una IL-18BPc, una proteína fusionada (por ejemplo,
fusionada a Ig), un derivado funcional (por ejemplo, conjugada con
PEG), una fracción activa o un derivado de la misma.
Los anticuerpos usados de acuerdo con la
invención pueden ser anticuerpos específicos
anti-IL-18 seleccionados entre
anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos.
Adicionalmente, la invención se refiere al uso
de un inhibidor en la fabricación de un medicamento que comprende
además un inhibidor de factor de necrosis tumoral \alpha,
preferiblemente TNFRI o TNFRII solubles, y/o un inhibidor de
IL-1\beta, preferiblemente antagonista de receptor
de IL-I para administración simultánea, secuencial o
separada.
En un aspecto, la invención proporciona el uso
de un vector de expresión que comprende la secuencia codificadora
de un inhibidor de IL-18 seleccionado entre
anticuerpos contra IL-18 y proteínas de unión de
IL-18, IL-18BPa e
IL-18BPc, en la fabricación de un medicamento para
el tratamiento y/o la prevención de la sepsis relacionada con la
disfunción cardíaca, mediante por ejemplo terapia génica.
En otro aspecto, la invención proporciona el uso
de un vector para inducir y/o potenciar la producción endógena de un
inhibidor de IL-18 seleccionado entre las proteínas
de unión de IL-18, IL-18BPa e
IL-18BPc, en la fabricación de un medicamento para
el tratamiento y/o la prevención de la sepsis relacionada con la
disfunción cardíaca.
Figura 1: muestra la distribución de
IL-18BPa en suero en individuos saludables. Se
evalúan los sueros de individuos masculinos y femeninos saludables,
con edades entre 20 y 60 años, para determinar la presencia de
IL-18BPa mediante un ensayo específico ELISA
(n=107).
Figura 2 A: muestra los niveles medios de
IL-18 e IL-18BPa en pacientes con
sepsis y en sujetos saludables. Se determinó la
IL-18 y la IL-18BPa en suero en
individuos saludables (véase la Figura 1) y en 198 muestras de 42
pacientes con sepsis inmediatamente tras el ingreso hospitalario y
durante la hospitalización.
Figura 2 B: muestra la distribución de los
niveles individuales de IL-18 e
IL-18BPa de los sujetos saludables y de los
pacientes descritos en la Figura 2 A. Los niveles medios en suero de
IL-18 y de IL-18BPa en sujetos
saludables se indican mediante una línea discontinua vertical y
horizontal, respectivamente.
Figura 3: muestra una comparación entre la
IL-18 total y libre en pacientes individuales con
sepsis tras el ingreso hospitalario. El nivel de
IL-18 libre (círculos rellenos) en suero se calculó
en base a la concentración de IL-18 total (círculos
huecos) e IL-18BPa, teniendo en cuenta una
estequiometría de 1:1 entre la IL-18 y la
IL-18BPa en un complejo, y una Kd calculada de 400
pM. Cada línea vertical une IL-18 total y libre en
una muestra de suero individual.
Figura 4: muestra el efecto de
IL-18BP sobre la producción de
IFN-\gamma inducida por S. epidermidis en
sangre entera. La sangre entera se estimuló sólo con S.
epidermidis o con S. epidermidis e
IL-18BP recombinante en las concentraciones
indicadas. Después de 48 horas de incubación, el cultivo de sangre
fue lisado y se midió el IFN-\gamma. Los
resultados se expresan como porcentaje de inducción de
IFN-\gamma por S. epidermidis. P < 0,01
vs. S. epidermidis sólo. Los datos representan la media \pm
error estándar de la media (SEM) de seis experimentos. SEM
representa la amplitud de la media de la muestra. SEM da una idea de
la precisión de la media. SEM = SD/(raíz cuadrada del tamaño de la
muestra). Los datos fueron analizados mediante el ensayo de Student
pareado.
Figura 5: muestra el efecto inhibidor ejercido
por la doble actividad de IL-18BPa y anticuerpos
monoclonales anti-IL-12 sobre la
producción de IFN-\gamma mediante sangre entera
tratada con S. epidermidis. Se estimuló sangre entera con
S. epidermidis en presencia o en ausencia de
IL-18BPa (125 ng/mL), IL-12 Mab (2,5
\mug/mL), y ambos. Después de 48 horas de incubación, el cultivo
sanguíneo se lisó y se midió el IFN-\gamma. Los
datos se expresan como porcentaje de inducción de
IFN-\gamma. P < 0,01 vs. S. epidermidis
sólo. Los datos representan la media \pm error estándar de la
media (SEM) de seis experimentos. SEM representa la amplitud de la
media de la muestra. SEM da una idea de la precisión de la media.
SEM = SD/(raíz cuadrada del tamaño de la muestra). Los datos fueron
analizados mediante el ensayo de Student pareado.
Figura 6: muestra la cuantificación de
IL-18BPa tal como refleja una curva ELISA estándar.
Se diluyó en serie IL-18BPa humana recombinante y se
sometió a ELISA tal como se describe en el ejemplo 3. Los datos
muestran la absorbancia media \pm SE (desviación estándar) de 10
experimentos.
Figura 7: muestra el efecto inhibidor de
IL-18 sobre la cuantificación de
IL-18BPa a través del ensayo ELISA. Se muestra el
porcentaje de inhibición de la señal.
Figura 8: muestra la reactividad cruzada
inmunológica de las isoformas de IL-18BP. El ensayo
ELISA de IL-18BP se llevó a cabo con todas las
isoformas (a-d) de la IL-18BP. Se
diluyeron en serie disoluciones (3,2 \mug/mL) de las isoformas de
IL-18BP y se evaluaron en ELISA de
IL-18BPa.
Figura 9: muestra el contenido de
IL-18 en tejido de miocardio después de la
administración de LPS. Los ratones fueron inyectados con LPS de
E. coli (0,5 mg/Kg, intraperitonealmente). Se homogeneizaron
los corazones a los tiempos indicados en el eje de las x. Se llevó a
cabo ELISA para determinar el contenido miocardial de
IL-18 (n=4-5 por grupo).
Figura 10: muestra el efecto de anticuerpos
anti-IL-18 sobre la disfunción
miocardial inducida por LPS. Los ratones fueron inyectados con
vehículo (disolución salina inyectada intraperitonealmente n=8) o
con LPS de E. coli (0,5 mg/Kg inyectados
intraperitonealmente, n=8) y se determinó la presión desarrollada en
el ventrículo izquierdo (LVDP) a las 6 horas mediante perfusión
cardíaca aislada. En experimentos separados los ratones fueron
pretratados con suero de conejo normal (NRS, n=5) o con anticuerpo
anti-IL-18
(Anti-IL-18, n=8) 30 minutos antes
del LPS.
La presente invención se refiere a la
administración de un inhibidor de IL-18 seleccionado
entre anticuerpos contra IL-18 y las proteínas de
unión de IL-18 IL-18BPa e
IL-18BPc para prevenir o tratar la disfunción
cardíaca relacionada con la sepsis, y que se basa en los
descubrimientos descritos en los ejemplos. Se descubrió de acuerdo
con la presente invención que los niveles de IL-18
efectiva (libre) en circulación son significativamente elevados en
el suero de pacientes con sepsis en comparación con los individuos
saludables, y que la inhibición de IL-18 causa una
disminución en la inducción de IFN-\gamma por la
bacteria Gram-positiva Staphylococcus
epidermidis.
Además, el tratamiento de prevención de la
disfunción cardíaca relacionada con la sepsis puede abordarse
mediante la administración de un inhibidor de IL-18
en combinación de otros inhibidores de citoquina potencialmente
capaces de aumentar su efecto.
La sepsis de acuerdo con la presente invención
comprende SIRS, sepsis severa, choque séptico, choque endotóxico,
etc., y puede estar provocada por bacterias
Gram-positivas o Gram-negativas.
Los inhibidores de la acción de
IL-18 pueden ser antagonistas de
IL-18, por ejemplo IL-18BPa e
IL-18BPc. Los antagonistas pueden ligarse a o
secuestrar la propia molécula de IL-18 con una
afinidad y una especificidad suficientes para neutralizar parcial o
sustancialmente la IL-18 o el(los)
centro(s) activo(s) de la IL-18
responsables de la unión de IL-18 a sus ligandos
(por ejemplo, a sus receptores).
Los inhibidores de la acción de
IL-18 también pueden ser anticuerpos de
IL-18 tales como anticuerpos monoclonales.
La expresión "proteínas de unión de
IL-18" se usa en la presente memoria como
sinónimo de "IL-18BP". Comprende las proteínas
IL-18BPa e IL-18BPc, de unión de
IL-18. En particular, las isoformas humanas a y c de
la IL-18BP son útiles de acuerdo con la presente
invención. Las proteínas útiles de acuerdo con la presente invención
pueden ser glicosiladas o no glicosiladas, pueden derivar de
fuentes naturales, tales como orina, o pueden producirse de forma
preferible de modo recombinante. La expresión recombinante puede
llevarse a cabo en sistemas de expresión procarióticos como E.
coli, o en sistemas de expresión eucarióticos, y preferiblemente
de mamíferos.
La expresión "proteína fusionada" se
refiere a un polipéptido que comprende una IL-18BPa
o una IL-18BPc fusionada con otra proteína que, por
ejemplo, tiene un tiempo de residencia extendido en los fluidos
corporales. Por tanto, una IL-18BP puede estar
fusionada con otra proteína, polipéptido o similar, por ejemplo una
inmunoglobulina o un fragmento de la misma.
"Derivados funcionales" tal como se usa en
la presente memoria cubre derivados de IL-18BPs y
sus proteínas fusionadas, que pueden prepararse a partir de grupos
funcionales que existen como cadenas laterales en los residuos o
los grupos N- o C-terminales, por medios conocidos
en la técnica, y que se incluyen en la invención siempre que sean
farmacéuticamente aceptables, es decir, que no destruyan la
actividad de la proteína que es sustancialmente similar a la
actividad de IL-18BP y no confieran propiedades
tóxicas a las composiciones que las contienen.
Estos derivados pueden, por ejemplo, incluir
cadenas laterales de polietileno glicol (conjugadas a PEG), que
pueden enmascarar los sitios antigénicos y extender la residencia de
una IL-18BP o de una IL-18BP vírica
en los fluidos corporales. Otros derivados incluyen ésteres
alifáticos de los grupos carbonilos, amidas de los grupos
carboxilos por reacción con amoniaco o con aminas primarias o
secundarias, derivados de N-acilo de grupos amino
libres de los residuos de aminoácido formados con restos acilo (por
ejemplo, grupos alcanoilo o aroilo carbocíclico) o derivados de
O-acilo de grupos hidroxilo libres (por ejemplo, el
de los residuos de serilo o treonilo) formados con restos acilo.
Como "fracciones activas" de una
IL-18BP y de proteínas fusionadas, la presente
invención cubre cualquier fragmento o precursor de la cadena de
polipéptido de la molécula de proteína solo o con moléculas
asociadas o residuos ligados, por ejemplo, residuos de azúcares o
de fosfato, o agregados de la molécula de proteína o de los
residuos de azúcares por sí mismos, siempre que dicha fracción tenga
una actividad sustancialmente similar a la
IL-18BP.
Los derivados funcionales de
IL-18BP pueden estar conjugados con polímeros con el
objetivo de mejorar las propiedades de la proteína, tal como la
estabilidad, la vida media, la biodisponibilidad, la tolerancia por
el cuerpo humano, o la inmunogenicidad. Para alcanzar esta meta, la
IL-18BP puede estar ligada, por ejemplo, a
polietilenglicol (PEG). La conjugación a PEG puede llevarse a cabo
empleando métodos conocidos descritos en el documento WO 92/13095,
por ejemplo.
Por lo tanto, en una realización preferida de la
presente invención, la IL-18BP está conjugada con
PEG.
En otra realización preferida de la invención,
el inhibidor de IL-18 es una proteína fusionada que
comprende toda o parte de una proteína de unión de
IL-18, que está fusionada a toda o parte de una
inmunoglobulina. El especialista en la técnica entenderá que la
proteína de fusión resultante retiene la actividad biológica de la
IL-18BP, en particular la capacidad de unirse a
IL-18. La fusión puede ser directa o a través de un
péptido puente corto que puede tener una longitud de 1 a 3 residuos
de aminoácido o más, por ejemplo una longitud de 13 residuos de
aminoácido. Dicho puente puede ser un tripéptido de la secuencia
E-F-M
(Glu-Phe-Met), por ejemplo, o una
secuencia puente de 13 aminoácidos que comprende
Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met
introducida entre la secuencia de IL-18BP y la
secuencia de inmunoglobulina. La proteína de fusión resultante
presenta propiedades mejoradas, tales como un mayor tiempo de
residencia en fluidos corporales (vida media), una actividad
específica incrementada, un nivel de expresión aumentado, o se
facilita la purificación de la proteína de fusión.
La IL-18BP puede estar fusionada
a la región constante de una molécula de Ig. Preferiblemente, está
fusionada a regiones de cadenas pesadas, como los dominios CH2 y
CH3 de la IgG1 humana, por ejemplo. La generación de proteínas de
fusión específicas que comprenden IL-18BP y una
porción de una inmunoglobulina se describen en el Ejemplo 11 del
documento WP99/09063, por ejemplo. Otras isoformas de las moléculas
de Ig también son adecuadas para la generación de proteínas de
fusión de acuerdo con la presente invención, isoformas tales como
IgG_{2} ó IgG_{4}, u otras clases de Ig, como la IgM o la IgA,
por ejemplo. Las proteínas de fusión pueden ser monoméricas o
multiméricas, hetero- u homomultiméricas.
El inhibidor de IL-18 puede ser
un anticuerpo específico anti-IL-18.
Los anticuerpos anti-IL-18 pueden
ser policlonales o monoclonales, quiméricos, humanizados, o incluso
completamente humanos. Los anticuerpos recombinantes y los
fragmentos de los mismos se caracterizan por la elevada afinidad de
unión a IL-18 in vivo y por la baja
toxicidad. Los anticuerpos que pueden usarse en la invención se
caracterizan por su capacidad para tratar pacientes durante un
periodo suficiente para que tengan una buena, si no excelente,
regresión o alivio de la afección patogénica o de cualquier síntoma
o grupo de síntomas relacionados a una afección patogénica, y una
baja toxicidad.
\newpage
Se ha demostrado que la IL-18
aumenta en el curso de una disfunción cardíaca provocada por sepsis.
La co-administración de LPS junto con un inhibidor
de IL-18, tal como un anticuerpo policlonal
anti-IL-18 neutralizante, protege
frente a la disfunción miocardial inducida por LPS.
Los anticuerpos neutralizantes se cultivan
fácilmente en animales tales como conejos, cabras o ratones mediante
inmunización con IL-18. Los ratones inmunizados son
particularmente útiles para proporcionar fuentes de células B para
la fabricación de hibridomas, que a su vez se cultivan para producir
grandes cantidades de anticuerpos monoclonales
anti-IL-18.
Los anticuerpos quiméricos son moléculas de
inmunoglobulina que se caracterizan por dos o más segmentos o
porciones derivadas de diferentes especies animales. Generalmente,
la región variable del anticuerpo quimérico deriva de un anticuerpo
de mamífero no humano, tal como un anticuerpo monoclonal murino, y
la región constante de inmunoglobulina deriva de una molécula de
inmunoglobulina humana. Preferiblemente, ambas regiones y la
combinación tienen una baja inmunogenicidad, según se determina de
forma rutinaria (Elliot y col., 1994). Los anticuerpos humanizados
son moléculas de inmunoglobulina creadas mediante técnicas de
ingeniería genética en las que las regiones constantes murinas se
reemplazan con contrapartidas humanas a la vez que se mantienen las
regiones de unión de antígeno murinas. El anticuerpo quimérico
ratón-humano resultante preferiblemente tiene una
inmunogenicidad reducida y una farmacocinética mejorada en humanos
(Knight y col., 1993).
Por tanto, en una realización preferida
adicional, el anticuerpo de IL-18 es un anticuerpo
de IL-18 humanizado. Los ejemplos preferidos de
anticuerpos anti-IL-18 humanizados
se describen en la Solicitud de Patente Europea EP 0 974 600, por
ejemplo.
En otra realización preferida adicional, el
anticuerpo de IL-18 es completamente humano. La
tecnología para producir anticuerpos humanos se describe en
detalle, por ejemplo, en los documentos WO 00/76310, WO 99/53049,
US 6.162.963 ó AU 5336100. Los anticuerpos completamente humanos son
preferiblemente anticuerpos recombinantes, producidos en animales
transgénicos, por ejemplo, xenoratones, que comprenden todas o parte
de las localizaciones de Ig humana funcionales.
Los inhibidores de polipéptido pueden producirse
en sistemas recombinantes procarióticos o eucarióticos, o pueden
codificarse en vectores diseñados para dianas génicas.
Se pueden usar otros inhibidores de citoquina
junto con los inhibidores de IL-18 en el tratamiento
de la disfunción cardíaca relacionada con la sepsis. Un inhibidor de
IL-18 puede usarse en combinación con un inhibidor
de IL-12.
Adicionalmente, se puede usar un inhibidor de
IL-18 en combinación con inhibidores de otras
citoquinas, de las que se sabe que desempeñan un papel importante
en el choque séptico, por ejemplo la IL-1, el TNF,
la IL-8, etc. (Dinarello, 1996, y Okusawa y col.,
1988). Un ejemplo de inhibidor de IL-1 es el
antagonista de receptor de IL-1, y para el TNF, la
porción soluble de los receptores TNFR1 y TNFR2.
La expresión "inhibición de citoquinas" en
el contexto de esta invención se refiere a cualquier molécula que
modula la producción de la citoquina referida (por ejemplo,
inhibidores de ICE en el caso de IL-1) y/o la
acción de tal modo que su producción y/o acción se atenúa, reduce o
se evita o bloquea de forma parcial, sustancial o total.
Un inhibidor de producción puede ser cualquier
molécula que afecte de forma negativa a la síntesis, el procesado o
la maduración de dicha citoquina. Los inhibidores, considerados de
acuerdo con la invención, pueden ser por ejemplo supresores de
expresión génica de la citoquina, ARNms que reduzcan o prevengan la
trascripción del ARNm de la citoquina, o ribozimas que conduzcan a
la degradación del ARNm, proteínas que afecte a un plegamiento
correcto, o que eviten parcial o sustancialmente la secreción de
dicha citoquina, proteasas que degraden la citoquina y
similares.
Los antagonistas de citoquinas ejercen su
actividad de diferentes modos. Los antagonistas pueden unirse o
secuestrar a la propia molécula de citoquina con una afinidad y una
especificidad suficientes, o neutralizar sustancialmente el epítopo
o epítopos de citoquina responsables de la unión de receptor de
citoquina (denominados a partir de aquí "antagonistas
secuestradores"). Un antagonista secuestrador puede ser, por
ejemplo, un anticuerpo dirigido contra la citoquina, una forma
truncada del receptor de citoquina (por ejemplo, receptor soluble
TNFRI y TNFRII en el caso de TNF), que comprende los dominios
extracelulares del receptor o las porciones funcionales del mismo,
etc. De forma alternativa, los antagonistas de citoquina pueden
inhibir el mecanismo de señalización de citoquina activado por el
receptor de superficie celular después de la unión de citoquina
(denominados a partir de aquí "antagonistas de señalización").
Un antagonista también puede ser una molécula que se una al
receptor pero que no sea capaz de disparar el mecanismo de
señalización activado tras la unión de la citoquina a dicho
receptor (por ejemplo, IL-Ra, Dinarello 1996). Todos
los grupos de antagonistas son útiles, tanto solos como en conjunto,
en combinación con un inhibidor de IL-18 para la
terapia de la sepsis.
El inhibidor de IL-18 puede
usarse simultáneamente, secuencialmente o de forma separada con
respecto a los inhibidores de citoquina descritos anteriormente.
La invención se refiere además al uso de un
vector de expresión que comprende la secuencia de codificación de
un inhibidor de IL-18 seleccionado entre los
anticuerpos contra IL-18 y las proteínas de unión de
IL-18, IL-18BPa e
IL-18BPc, en la preparación de un medicamento para
la prevención y/o el tratamiento de la disfunción cardíaca
relacionada con la sepsis. Por tanto se usa una estrategia de
terapia génica para el tratamiento y/o la prevención de la
enfermedad. Así, de forma ventajosa, la expresión del inhibidor de
IL-18 se producirá in situ, bloqueando de
este modo de forma eficaz la IL-18 directamente en
el(los) tejido(s) o células afectados por la
enfermedad.
\global\parskip0.900000\baselineskip
El uso de un vector para inducir y/o potenciar
la producción endógena de un inhibidor de IL-18
seleccionado entre las proteínas de unión de IL-18,
IL-18BPa e IL-18BPc, en una célula
normalmente silenciosa para la expresión de un inhibidor de
IL-18, o que expresa cantidades del inhibidor que no
son suficientes, también queda contemplado por la invención. El
vector puede comprender secuencias reguladoras funcionales en las
células deseadas para expresar el inhibidor o
IL-18. Dichas secuencias reguladoras pueden ser
promotores o potenciadores, por ejemplo. La secuencia reguladora
puede introducirse a continuación en la localización correcta del
genoma mediante recombinación homóloga, ligando de este modo de
forma operativa la secuencia reguladora con el gen del cual se
requiere que la expresión sea inducida o potenciada. La tecnología
se denomina normalmente "activación génica endógena" (EGA), y
se describe, por ejemplo, en el documento WO 91/09955.
La invención también comprende la administración
de células modificadas genéticamente, capaces de producir un
inhibidor para el tratamiento o la prevención de la disfunción
cardíaca relacionada con la sepsis.
La definición de "farmacéuticamente
aceptable" pretende abarcar cualquier vehículo que no interfiere
con la eficacia de la actividad biológica del ingrediente activo, y
que no es tóxico para el anfitrión al que se administra. Por
ejemplo, para administración parenteral (por ejemplo, intravenosa,
subcutánea, intramuscular), la(s) proteína(s)
activa(s) pueden formularse en una forma de dosis unitaria
para inyección en vehículos tales como disolución salina,
disolución de dextrosa, suero de albúmina y disolución de
Ringer.
Los ingredientes activos de la composición
farmacéutica de acuerdo con la invención pueden administrarse a un
individuo en una serie de formas. Las rutas de administración
incluyen las rutas intradermal, transdermal (por ejemplo, en
formulaciones de liberación lenta), intramuscular, intraperitoneal,
intravenosa, subcutánea, oral, epidural, tópica e intranasal. Se
puede usar cualquier otra ruta de administración que sea
terapéuticamente eficaz, por ejemplo absorción a través de los
tejidos epiteliales o endoteliales o mediante terapia génica en al
que una molécula de ADN que codifica el agente activo es
administrada al paciente (por ejemplo, a través de un vector), que
hace que el agente activo sea expresado y secretado in vivo.
Adicionalmente, la(s) proteína(s) de acuerdo con la
invención pueden administrarse junto a otros componentes de agentes
biológicamente activos tales como tensioactivos, excipientes,
vehículos, diluyentes y portadores farmacéuticamente aceptables.
Para administración parenteral (por ejemplo
intravenosa, subcutánea, intramuscular) la(s)
proteína(s) activa(s) puede(n) formularse como
una disolución, una suspensión, una emulsión o un polvo liofilizado
en asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente
aceptable (por ejemplo, agua, disolución salina, disolución de
dextrosa) y aditivos que mantengan la isotonicidad (por ejemplo,
manitol) o la estabilidad química (por ejemplo, conservantes y
tampones). La formulación se esteriliza mediante técnicas usadas
habitualmente.
La biodisponibilidad de proteína(s)
activa(s) de acuerdo con la invención también puede aliviarse
usando procedimientos de conjugación que aumentan la vida media de
la molécula en el cuerpo humano, por ejemplo ligando la molécula a
polietilenglicol, tal como se describe en la Solicitud de Patente
PCT WO 92/13095.
Las cantidades terapéuticamente efectivas de
la(s) proteína(s) activa(s) dependerán de
muchas variables, que incluyen el tipo de antagonista, la afinidad
del antagonista por IL-18, cualquier actividad
citotóxica residual exhibida por los antagonistas, la ruta de
administración, la condición clínica del paciente (incluyendo la
deseabilidad de mantener un nivel no tóxico de actividad de
IL-18 endógena).
Una "cantidad terapéuticamente efectiva" es
aquella que cuando se administra, el inhibidor de
IL-18 produce la inhibición de la actividad
biológica de IL-18. La dosis administrada, en forma
de dosis sencillas o múltiples, a un individuo variará dependiendo
de una serie de factores, que incluyen las propiedades
farmacocinéticas del inhibidor de IL-18, la ruta de
administración, las condiciones y características del paciente
(sexo, edad, peso corporal, salud, tamaño), la extensión de los
síntomas, tratamientos concurrentes, la frecuencia del tratamiento
y el efecto deseado. El ajuste y la manipulación de los intervalos
de dosis establecidos son competencia y están al alcance de los
especialistas en la técnica, así como los métodos in vitro e
in vivo para determinar la inhibición de
IL-18 en un individuo.
De acuerdo con la invención, el inhibidor de
IL-18 puede administrarse profiláctica o
terapéuticamente a un individuo que lo necesite anteriormente,
simultáneamente o secuencialmente respecto a otros regímenes o
agentes terapéuticos (por ejemplo, regímenes de múltiples fármacos),
en una cantidad terapéuticamente efectiva, en particular con un
inhibidor de IL-12 y/o un inhibidor de
IL-1, interferón y antagonista de TNF. Los agentes
activos que son administrados simultáneamente a otros agentes
terapéuticos pueden administrarse en la misma o en diferentes
composiciones.
Además se describe un método para la preparación
de una composición farmacéutica que comprende mezclar una cantidad
efectiva de un inhibidor de IL-18 y/o de un
inhibidor de IL-12 y/o de un inhibidor de
IL-1, interferón y/o un antagonista de TNF con un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
Habiendo descrito ya la invención, será más
fácil de entender a través de los siguientes ejemplos, que se
proporcionan a modo de ilustración.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La mediad de citoquinas específicas en
circulación y sus inhibidores naturales en pacientes sanos y
enfermos proporciona información acerca de su implicación en la
progresión y la gravedad de una enfermedad. Como se ha mencionado
en la sección de antecedentes, uno de los mediadores clave de la
sepsis es el IFN-\gamma. Puesto que la
IL-18 es un co-inductor de
IFN-\gamma, el nivel de IL-18 y su
inhibidor natural, la variante a de la IL-18BP,
fueron monitorizadas en pacientes con sepsis y comparadas con los
niveles encontrados en sujetos sanos usando ELISAs específicos
(ejemplo 3).
\vskip1.000000\baselineskip
El nivel medio de IL-18 en 107
donantes sanos fue de 64\pm17 pg/mL, determinado mediante ensayo
ECL (Pomerantz y col., 2001). El ensayo ECL se evaluó para
determinar la interferencia de proteínas relacionadas. Se descubrió
que no se veía afectado por la presencia de
IL-1\beta madura o de
pro-IL-1\beta, mientras que la
pro-IL-18 era reactiva. Por lo
tanto, hasta un 20% de la IL-18 madura detectada en
las muestras de suero humano en el presente estudio puede ser
pro-IL-18. El ensayo ECL de
IL-18 no se vio afectado por
IL-18BPa en una concentración \leq 160 ng/mL.
Se evaluaron los niveles de
IL-18BPa en el suero procedente de los 107
individuos sanos mediante ELISA (ejemplo 3). Los niveles de
IL-18BPa oscilaron entre 0,5 ng/mL y 7 ng/mL, con un
promedio de 2,15 \pm 0,15 ng/mL (Figura 1).
Debido a que tanto la IL-18 como
la IL-18BPa están presentes de forma concomitante en
el suero, puede que algo de la IL-18 esté presente
formando un complejo con IL-18BPa. El nivel de
IL-18 libre se calculó en base al nivel medio de
IL-18 total (2,15 ng/mL). La IL-18
libre fue determinada de acuerdo a la ley de acción de masas. El
cálculo se basó en los siguientes parámetros: las concentraciones de
IL-18 total determinadas mediante ensayo ECL; la
concentración de IL-18BPa total determinada mediante
ELISA; una estequiometría de 1:1 en el complejo de
IL-18BPa y de IL-18, y una constante
de disociación (Kd) de 0,4 nM (Novick y col., 1999, y Kim y col.,
2000). En un sistema de equilibrio L + R \leftrightarrow LR, donde
L representa IL-18 y R representa
IL-18BP, se aplican las siguientes ecuaciones:
Kd =
[LR]/[L_{libre}][R_{libre}]
L_{libre} =
L_{total} -
LR
R_{libre} =
R_{total} -
LR
Sustituyendo: L_{total} = 64\pm17 pg/mL
(nivel medio), R_{total} = 2,15\pm0,15 ng/mL (de media) y Kd =
0,4 nM, se obtuvo que en pacientes sanos aproximadamente 51,2 pg/mg
de IL-18 (cerca del 80% del total) está en forma
libre.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluaron los niveles de
IL-18 y de IL-18BPa en 192 muestras
de suero procedentes de 42 pacientes sépticos inmediatamente
después del ingreso y durante la hospitalización. Los niveles de
IL-18 y de IL-18BPa fueron
significativamente más elevados en pacientes con sepsis que en los
sujetos sanos (Figura 2 A), y se observó una amplia distribución de
valores (Figura 2 B). Además, dichos niveles fueron incluso más
altos en estos pacientes el día del ingreso, mostrando un
incremento del 2200 por cien en el nivel de IL-18 en
comparación con los individuos sanos (1,5 \pm 0,4 ng/mL frente a
0,064 \pm 0,17 ng/mL) y un incremento del 1300 por cien en el
nivel de IL-18BPa (28,6 \pm 4,5 frente a 2,15
\pm 0,15 ng/mL, Figura 2 A). No pudo observarse ninguna
correlación estadísticamente significativa entre los niveles de
creatinina y las concentraciones de IL-18 o de
IL-18BPa en estos sueros (determinado mediante
puntuación APACHE II, Knaus y col., 1993), lo que sugiere que los
niveles elevados de IL-18 y de
IL-18BPa en estos pacientes no se debían a un fallo
renal.
Debido a que los niveles en suero de
IL-18 y de IL-18BPa en pacientes con
sepsis variaban considerablemente (Figura 2 B), se calcularon los
niveles de IL-18 libre en suero en las muestras
individuales. Los cálculos se realizaron como se ha descrito
previamente, usando las mismas tres ecuaciones y sustituyendo los
valores de Kd, L_{total}, R_{total} determinados
experimentalmente. Los cálculos muestran que la
IL-18BPa redujo el nivel de IL-18
libre en la mayoría de los pacientes (Figura 3). De forma
destacable, este efecto fue particularmente fuerte cuando la
IL-18 total era elevada. Por ejemplo, en dos
pacientes, la IL-18 en suero alcanzó 0,5 nM (10
ng/mL), un incremento del 15000 por ciento sobre los individuos
sanos. Sin embargo, considerando la unión a la
IL-18BPa en circulación (27 ng/mL y 41,2 ng/mL), el
nivel de IL-18 libre en estos dos pacientes cayó en
un 78% y un 84%, respectivamente (Figura 3). Por lo tanto, la
mayoría de la IL-18 en suero está bloqueada por la
IL-18BPa en circulación. Aún así, de acuerdo con
estos cálculos, la IL-18 que queda libre todavía es
superior a la presente en individuos sanos. Por tanto, es de esperar
que la administración de IL-18BPa exógena a
pacientes sépticos disminuya aún más el nivel de
IL-18 libre en circulación, aliviando los efectos de
la enfermedad.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha mencionado en la sección de
antecedentes, se sabe que la bacteria Gram-positiva
Staphylococcus epidermidis produce sepsis. La inducción de
citoquinas, por ejemplo IL-1,
IFN-\gamma y TNF-\alpha, es una
etapa clave en esta patología. Puesto que la IL-18
es un co-inductor de IFN-\gamma,
se evaluó el efecto de su inhibición sobre la inducción de
IFN-\gamma de Staphylococcus epidermidis.
La IL-18BPa, usada como inhibidor de
IL-18, fue una versión marcada con histidina
recombinantes producida en células CHO.
Se mezclaron 0,5 mL de sangre en tubos de
polipropileno de fondo redondo de 12x75 mm de 5 mL (Falcon, Becton
Dickinson Labware, Franklin Lakes, NL) con 0,5 mL de medio de
crecimiento RPMI (Cellgro Mediatech, Hendon, VA suplementado con
L-glutamina 10 mM, 100 U/mL de penicilina, 100
\mug/mL de estreptomicina y FBS al 10% [Gibco BRL, Grand Island,
NY]) que contenía S. epidermidis (de ATCC) con o sin
IL-18BP. Las muestras fueron incubadas a 37ºC (5%
de CO_{2}) durante 48 horas seguidas de un tratamiento con Triton
X-100 (Bio-Rad Laboratories,
Richmond, CA) a una concentración final del 0,5% para lisar las
células presentes en la muestra de sangre entera. Los tubos que
contenían las muestras fueron invertidos varias veces hasta que la
muestra sanguínea mostró una apariencia clara. La concentración de
IFN-\gamma en las muestras lisadas de sangre, que
representa tanto citoquina intracelular como secretada, se midió
mediante electroluminiscencia (ECL) tal como se describe en
Pomerantz y col. (2001).
Para este estudio se usó sangre entera de
voluntarios sanos no fumadores. La sangre se extrajo mediante
punción de vena y se mantuvo en tubos heparinizados. Se propagó
S. epidermidis en caldo de infusión
cerebro-corazón durante 24 horas, se lavó en
disolución salina libre de pirógeno y se hirvió tal como se describe
en Aiura y col. (1993). La concentración de bacterias muertas por
efecto del calor se ajustó a 10 células bacterianas por célula
sanguínea blanca (WBC).
Los resultados de la Figura 4 muestran que la
IL-18BPa es capaz de inhibir la inducción de S.
epidermidis de
IFN-\gamma.
IFN-\gamma.
Puesto que se sabe que el
IFN-\gamma es co-estimulado por
IL-18 e IL-12, se evaluó el efecto
de la combinación de anticuerpos específicos de
IL-18BPa y de IL-12 (Mab
anti-IL-12 humano 11.5.14,
Prepotech, Rocky Hill, NJ) sobre la inducción de
IFN-\gamma dirigida por S. epidermidis.
Dicha inducción se evaluó en presencia de 125 ng/mL de
IL-18BPa (IL-18BPa marcada con
histidina producida en células COS y purificada en una columna de
talón tal como describe Novick y col., 1999) y 2,4 \mug/mL de
anticuerpo específico anti-IL-12
humano. Los resultados mostrados en la Figura 5 sugieren que los
anticuerpos específicos anti-IL-12
potencian el efecto inhibidor de la IL-18BPa sobre
la inducción de IFN-\gamma por efecto de S.
epidermidis.
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo ELISA comprendió dos anticuerpos
anti-IL-18BPa: Mab murino 582.10, un
subclon del Mab 582 descrito en el Ejemplo 4, como anticuerpo de
captura, y anticuerpo policlonal de ratón para la detección (Ejemplo
4). Se recubrieron placas ELISA de 96 pocillos de microtitulación
(Maxisorb, Nunc A/S, Roskilde, Dinamarca) con Mab
anti-IL-18BPa Nº 582.10 (un subclon
del Mab 582, 4 \mug/mL en PBS) durante una noche a 4ºC. Las placas
fueron lavadas con PBS que contenía un 0,05% de Tween 20
(disolución de lavado) y bloqueadas (2 h, 37ºC) con disolución de
stock de BSA (KPL, Geithersburg, MD) diluida 1:10 en agua. La
disolución de stock de BSA se diluyó 1:15 en agua (diluyente) para
la dilución de todas las muestras evaluadas y del anticuerpo de
detección. Las muestras de suero se diluyeron al menos a 1:5 en el
diluyente y se añadieron alícuotas de 100 \muL a los pocillos. Se
diluyó rIL-18BPa altamente puro (preparado en CHO y
purificado mediante inmunoafinidad usando el Mab N 430
purificado-G específico para IL-18BP
mostrado en la tabla 1, ejemplo 4) mediante 7 diluciones en serie
al 50% (de 4 a 0,062 ng/mL) y se añadió a todas las placas ELISA
para la generación de una curva de calibrado. Las placas fueron
incubadas durante 2 horas a 37ºC y lavadas 3 veces con la disolución
de lavado. Se añadió suero de
anti-IL-18BPa de conejo (1:5000 en
diluyente, 100 \muL/pocillo) y las placas fueron incubadas otras
2 horas a 37ºC. Las placas se lavaron 3 veces, se añadió un
conjugado de peroxidada de rábano
cabra-anti-conejo (HRP, Jackson
ImmunoResearch Labs, 1:10.000 en PBS, 100 pL/pocillo) y las placas
se incubaron durante 1 h a 37ºC. Las placas fueron lavadas 3 veces
y desarrolladas mediante la adición de sustrato de Peroxidasa OPD
(comprimidos de o-fenilendiamina dihidrocloruro,
Sigma) durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se
detuvo mediante HCl 3 N (100 \muL) y se determinó la absorbancia a
492 nm mediante un lector ELISA. Se representó la OD en función de
la concentración de IL-18BPa y se observó linealidad
en un rango entre 0,12 y 2,00 ng/mL de IL-18BPa
(Figura 6).
La curva de calibrado de
IL-18BPa en ausencia de suero o en presencia de
hasta un 20% de suero humano permaneció igual. Puesto que la
IL-18BPa se une a IL-18 con una
afinidad muy alta, fue necesario determinar si el ensayo ELISA
distingue entre la IL-18BPa libre y la ligada. Se
descubrió que la IL-18 interfiere con el método
ELISA de IL-18, sin embargo, la interferencia no es
significativa en muestras de suero. En el 90% de los pacientes de
sepsis los niveles en suero de IL-18 permanecieron
por debajo de 4 ng/mL (ver más adelante). Dichas muestras de suero
tienen una IL-18BPa elevada, lo que requiere una
dilución de 5 a 20 veces antes de medir la IL-18BPa.
En dichas diluciones, la interferencia de IL-18 con
la IL-18BPa en el ELISA es inferior al 10% (Figura
7). Otras citoquinas relacionadas, incluyendo la
proIL-18, usadas con un exceso molar de 10 a 1
respecto a la IL-18BPa, así como con un exceso de
200 a 1 de IL-1\beta madura, no mostraron
interferencia con el ensayo.
La isoforma más abundante de la
IL-18BP humana es la IL-18BPa,
mientras que las isoformas b, c y d son variantes de división
minoritarias (Novick y col., 1999, y Kim y col., 2000). La
IL-18BPa exhibe la mayor afinidad por la
IL-18 (Kim y col., 2000). La afinidad de la
IL-18BPc por IL-18 es 10 veces más
baja, mientras que las isoformas b y d no se unen o neutralizan
IL-18. Por lo tanto, fue importante determinar la
reactividad cruzada de la IL-18BPa en ELISA con las
otras isoformas de IL-18BP. Tal como se muestra en
la Figura 8, la IL-18BPc humana generó una señal 10
veces más baja referido a masa en comparación con la
huIL-18BPa, mientras que las isoformas b y d
generaron una señal insignificante en el ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inyectó un conejo con
rIL-18BPa-His6 para la generación de
anticuerpos policlonales.
Para la producción de anticuerpos monoclonales,
se inyectaron ratones Balb/C 5 veces con 10 \mug de
IL-18BPa recombinante marcada con histidina
(rIL-18BPa-His6). Al ratón que
presentó el mayor título, determinado mediante un radioinmunoensayo
invertido (IRIA, ejemplo 5) o RIA en fase sólida (sRIA, ejemplo 5),
se la aplicó una dosis final intraperitonealmente 4 y 3 días antes
de la fusión. Se prepararon linfocitos a partir de bazo y se llevó
a cabo la fusión con células de mieloma NSO/1. Los hibridomas que
produjeron anticuerpos de IL-18BPa fueron
subclonados mediante dilución limitante. Los clones generados fueron
evaluados mediante IRIA (Ejemplo 5). En la Tabla 1 se muestran
hibridomas representativos.
\vskip1.000000\baselineskip
_{1} Placas recubiertas con anticuerpos
anti-ratón de cabra, y detección de hibridomas con
^{125}I IL-18BPa.
_{2} Placas recubiertas con
IL-18BP urinaria, y detección de hibridomas con
anticuerpos ^{125}I anti-ratón de cabra.
\vskip1.000000\baselineskip
Los hibridomas que secretan anticuerpos
dirigidos contra la etiqueta de histidina fueron descartados. Los
anticuerpos fueron caracterizados con más detalle empleando sRIA
para determinar su capacidad para reconocer la
IL-18BP natural (purificada a partir de orina). En
la Tabla 1 se muestran las características de unión de varios
hibridomas positivos. Los hibridomas nº 148, 430, 460 y 582 fueron
positivos con IL-18BP tanto recombinante como
urinaria. Se obtuvieron los anticuerpos adecuados para el ensayo de
transferencia Western, de inmunoprecipitación, de purificación por
inmunoafinidad y para el desarrollo de un ELISA específico. Los
clones positivos que producen anticuerpos específicos
anti-IL-18BP fueron inyectados en
ratones Balb/C pre-imprimados con pristano para la
producción de ascites. Los isotipos de los anticuerpos fueron
definidos mediante el uso de un ensayo ELISA de IgG
anti-ratón (Amersham-Pharmacia,
Biotech). El Mab 582, que fue altamente reactivo con la
IL-18BP recombinante y nativa (Tabla 1) fue usado
para la preparación del ELISA específico de IL-18BP
(Ejemplo 3).
Se evaluaron anticuerpos mediante sRIA en
presencia de IL-18 (ejemplo 5) para determinar su
capacidad para reconocer un complejo de IL-18BPa
con IL-18. La mayoría de los anticuerpos fueron
incapaces de reconocer IL-18BP cuando forma un
complejo con IL-18. Por lo tanto, dichos anticuerpos
parecen estar dirigidos contra el dominio de unión de ligando de la
IL-18BPa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recubrieron placas de microtitulación de PVC
(Dynatech Laboratories, Alexandria, VA) durante una noche a 4ºC con
anticuerpos F(ab)2 anti-ratón de cabra
purificados por afinidad (10 \mug/mL, 100 \muL/pocillo; Jackson
ImmunoResearch Labs). Las placas fueron lavadas entonces dos veces
con PBS que contenía un 0,05% de Tween 20 (disolución de lavado) y
bloqueadas con BSA (0,5% en disolución de lavado) durante 2 horas a
37ºC. Se añadieron sobrenadantes de cultivo de hibridoma (100
\muL/pocillo) y se incubaron las placas durante 2 horas a
temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas tres veces, se
añadió
^{125}I-rIL-18BPa-His6
(10^{5} cpm en 100 \muL) a cada pocillo y las placas fueron
incubadas durante 5 horas a 22ºC. A continuación las placas fueron
lavadas tres veces y se contabilizaron los pocillos individuales con
un contador gamma. Los hibridomas que generaron sobrenadante, que
exhibieron una radioactividad ligada en niveles 5 veces superiores
al control negativo, fueron considerados positivos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó rIL-18BPa (5 \mug/mL)
como antígeno de captura y se usaron anticuerpos
anti-ratón ^{125}I de cabra (100 \muL, 10^{5}
cpm) para la detección. El bloqueo y los lavados se realizaron como
se ha indicado anteriormente. Los clones positivos fueron escrutados
mediante sRIA para determinar su capacidad para reconocer la
IL-18BP aislada a partir de orina humana concentrada
(Novick y col., 1999). Las placas de microtitulación fueron
recubiertas con IL-18BP purificada mediante afinidad
de ligando (1 \mug/mL), bloqueadas y lavadas como se ha indicado
anteriormente. Se añadieron sobrenadantes de hibridoma (100 \muL)
y se llevó a cabo la detección con anticuerpos
anti-ratón ^{125}I de cabra (10^{5} cpm en 100
\muL).
\vskip1.000000\baselineskip
Las placas de microtitulación se recubrieron con
IL-18BP urinaria (0,5 \mug/mL) o con
rIL-18BPa (5 \mug/mL), se bloquearon y se lavaron
como en el caso de sRIA. Se añadió IL-18 humana
recombinante (50 \muL) hasta una concentración final de 1,5
\mug/mL (15 minutos a temperatura ambiente), seguido de la adición
de sobrenadantes de hibridoma (50 \muL). La detección se realizó
con anticuerpos anti-ratón ^{125}I de cabra
(10^{5} cpm en 100 \muL, 2 h a temperatura ambiente).
\vskip1.000000\baselineskip
El TNF\alpha y la IL-1\beta
han sido implicadas en la disfunción cardíaca durante la sepsis.
Puesto que la IL-18 es una citoquina
pro-inflamatoria que media en la producción de
TNF\alpha y de IL-1\beta, se evaluó el efecto de
la concentración de IL-18 sobre la disfunción
cardíaca inducida por LPS.
Se trataron ratones con vehículo (disolución
salina) o con LPS. Se recolectaron los corazones a 2, 4 y 6 horas
después de la administración de LPS y se homogeneizaron para
determinar el contenido miocardial de IL-18 mediante
ELISA (Kit adquirido a R&D Systems (Minneapolis, MN)). Los
resultados de la Figura 9 muestran un aumento del 100% en el
contenido miocardial de IL-18 4 horas después de la
administración de LPS, lo que indica que la IL-18
está implicada en la disfunción cardíaca durante la sepsis.
\newpage
En el ejemplo previo se ha observado un aumento
del contenido de IL-18 en la disfunción cardíaca
inducida por LPS. Por tanto, se evaluó el efecto de la
neutralización de IL-18 sobre disfunción miocardial
inducida.
Se determinó la función miocardial mediante una
técnica Langerdorff isovolumétrica, sin recirculación, tal como se
ha descrito anteriormente (Meng y col., 1998). Se perfusionaron
corazones aislados con disolución normotérmica
Krebs-Henseleit que contiene 11,0 mmol/L de glucosa,
1,2 mmol/L de CaCl_{2}, 4,7 mmol/L de KCl, 25 mmol/L de
NaHCO_{3}, 119 mmol/L de NaCl, 1,17 mmol/L de MgSO_{4} y 1,18
mmol/L de KH_{2}PO_{4}. Se insertó un globo de látex en el
ventrículo izquierdo a través del atrio izquierdo y se infló con
agua para lograr una presión ventricular y diastólica izquierda
(LVEDP) de 1333 Pa (10 mmHg). Se colocaron cables marcapasos en el
atrio derecho y los corazones se llevaron hasta 300 latidos por
minuto. Se cuantificó el flujo coronario recolectando el efluente
de las arterias pulmonares. La temperatura miocardial se mantuvo a
37ºC. La presión ventricular izquierda desarrollada (LVDP), sus
primeras derivadas (+dP/dt, -dP/dt) y la LVEDP fueron registradas
continuamente mediante un amplificador-digitalizador
de presión computerizado (Maclab 8, AD Instrument, Cupertino, CA).
Después de un periodo de equilibrado de 20 minutos se determinaron
la LVDP y +/-dP/dt a diferentes niveles de LVEDP (1333, 2000 y 2666
Pa, 10, 15 y 20 mmHg, respectivamente).
Después de la administración de LPS, la presión
ventricular izquierda desarrollada (LVDP) se redujo en un 38% en
comparación con los controles de disolución salina (4840 +/- 253 Pa
ó 36,3 +/- 1,9 mmHg frente a 7879 +/- Pa ó 59,1 +/- mmHg,
P<0,001, Figura 10). El pretratamiento de ratones 30 minutos
antes de la administración con LPS con suero de conejo normal (NRS)
tuvo una influencia mínima sobre la disfunción miocardial inducida
por LPS; sin embargo el pretratamiento con anticuerpo neutralizante
de IL-18 eliminó la disfunción (Figura 10). El flujo
coronario no fue diferente entre los grupos (no mostrado).
Los resultados indican que la neutralización de
IL-18 protege frente a la disfunción miocardial
inducida por LPS.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (7)
1. El uso de un inhibidor de
IL-18 en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento y/o la prevención de disfunción cardíaca relacionada con
sepsis, en donde el inhibidor se selecciona a partir de anticuerpos
contra IL-18 y las proteínas de unión a
IL-18, IL-18BPa e
IL-18BPc.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que la proteína de unión a IL-18 está conjugada
con PEG.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que el inhibidor de IL-18 es un anticuerpo
específico anti-IL-18 seleccionado
entre anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos.
4. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento comprende
además un inhibidor de una citoquina, en donde la citoquina se
selecciona entre factor \alpha (TNF-\alpha) e
IL-1\beta, y en donde dicho inhibidor de
TNF-\alpha es la porción soluble de TNFRI o de
TNFRII y el inhibidor de IL-1\beta es el
antagonista de receptor de IL-1.
5. El uso de un vector de expresión que
comprende la secuencia de codificación de un inhibidor de
IL-18 seleccionado entre anticuerpos contra
IL-18, y las proteínas de unión a
IL-18 IL-18BPa e
IL-18BPc, en la fabricación de un medicamento para
el tratamiento y/o la prevención de disfunción cardíaca relacionada
con sepsis.
6. El uso de un vector de expresión, que se
define como en la reivindicación 5, para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la disfunción
cardíaca relacionada con sepsis mediante terapia génica.
7. El uso de una célula que ha sido modificada
genéticamente para producir un inhibidor de IL-18
seleccionado entre anticuerpos contra IL-18 y las
proteínas de unión de IL-18 IL-18BPa
e IL-18BPc en la fabricación de un medicamento para
el tratamiento y/o la prevención de la disfunción cardíaca
relacionada con sepsis.
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