EA009125B1 - Применение ингибиторов il-18 для лечения и/или предупреждения заболеваний, характерных для синдрома системной воспалительной реакции - Google Patents

Применение ингибиторов il-18 для лечения и/или предупреждения заболеваний, характерных для синдрома системной воспалительной реакции Download PDF

Info

Publication number
EA009125B1
EA009125B1 EA200301248A EA200301248A EA009125B1 EA 009125 B1 EA009125 B1 EA 009125B1 EA 200301248 A EA200301248 A EA 200301248A EA 200301248 A EA200301248 A EA 200301248A EA 009125 B1 EA009125 B1 EA 009125B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
inhibitor
sepsis
inhibitors
receptor
treatment
Prior art date
Application number
EA200301248A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200301248A1 (ru
Inventor
Чарльз А. Динарелло
Джамила Фантуцци
Соо-Хиун Ким
Леонид Резников
Менахем Рубинштейн
Даниэла Новик
Борис Шварцбурд
Original Assignee
Йеда Рисерч Энд Дивелопмент Ко., Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Йеда Рисерч Энд Дивелопмент Ко., Лтд. filed Critical Йеда Рисерч Энд Дивелопмент Ко., Лтд.
Publication of EA200301248A1 publication Critical patent/EA200301248A1/ru
Publication of EA009125B1 publication Critical patent/EA009125B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/212—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/215—IFN-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Данное изобретение относится к применению ингибитора IL-18 для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения заболеваний, характерных для синдрома системной воспалительной реакции (SIRS), выбранных из сепсиса, тяжелого сепсиса и септического шока. Также изобретение относится к применению экспрессирующего вектора, содержащего кодирующую последовательность ингибитора IL-18, выбранного из ингибиторов каспазы-1 (ICE), антител против IL-18, антител против любой из субъединиц рецептора IL-18, ингибиторов пути передачи сигнала с участием IL-18, антагонистов IL-18, которые конкурируют с IL-18 и блокируют IL-18-рецептор, ингибиторов продуцирования IL-18 и IL-18-связывающих белков, их изоформ, мутеинов, слитых белков или циклических пермутированных производных, имеющих, по существу, ту же активность, что и IL-18-связывающий белок, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения сепсиса. Изобретение относится к применению вектора, индуцирующего и/или усиливающего эндогенную продукцию ингибитора IL-18 в клетке для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения сепсиса, к применению клетки, которая была генетически модифицирована с тем, чтобы продуцировать ингибитор IL-18, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения сепсиса. Наконец, изобретение относится к способу лечения и/или предупреждения заболеваний, характерных для синдрома системной воспалительной реакции (SIRS), выбранных из сепсиса, тяжелого сепсиса и септического шока, предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, с применением ингибитора IL-18.

Description

Данное изобретение относится к применению ингибиторов ΙΠ-18 для лечения и/или предупреждения сепсиса.
Предпосылки изобретения
В 1989 г. был обнаружен фактор, индуцируемый в сыворотке из мышей, инфицированных МусоЬас1етшт Ьоу18 и стимулированных БР8. Этот фактор был способен индуцировать интерферон-γ (ΙΕΝ-γ) в культурах клеток селезенки нормальных мышей в присутствии интерлейкина-2 (Ш-2) (№1катига е! а1., 1989). Этот фактор действовал не как прямой индуктор ΙΕΝ-γ, а скорее как костимулятор вместе с 1Ь-2, анти-СЭЗ или митогенами. В попытке дополнительной идентификации этой активности из сыворотки мышей после обработки эндотоксином был выявлен, по-видимому, гомогенный белок с М.м. 50-55 кДа, который был связан с вышеупомянутой активностью (№1катига е! а1. 1993). Поскольку другие цитокины могут действовать в качестве костимуляторов в отношении продуцирования ΙΕΝ-γ, неспособность нейтрализующих антител к 1Ь-1, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6 или ΤΝΕ блокировать эту сывороточную активность предполагала, что этот фактор был отличающимся фактором. Те же самые авторы документировали, что эндотоксин-индуцируемый костимулятор продуцирования ΙΕΝ-γ присутствовал в экстрактах печеней из мышей, предварительно подвергнутых воздействию Р. аспек (Окатига е! а1. 1995). В соответствии с этой экспериментальной моделью, популяция печеночных макрофагов (клеток Купфера) увеличивается, и, следовательно, низкая доза бактериального липополисахарида (БР8) становится летальной. Подобная обработка не является летальной для неподготовленных описанным выше способом мышей.
Этот фактор, названный ΙΕΝ-γ-индуцирующим фактором (ΙΟΙΕ) и позднее названный интерлейкином-18 (ΙΠ-18), был очищен до гомогенности из этих обработанных Р. аспек печеней мышей, и была получена частичная аминокислотная последовательность. Для клонирования кДНК мышиного ΙΠ-18 использовали вырожденные олигонуклеотиды, полученные из аминокислотных последовательностей очищенного ΙΠ-18 (Окатига е! а1. 1995). Человеческая кДНК-последовательность для ΙΠ-18 была сообщена в 1996 г. (ИкЫо е! а1. 1996).
Интерлейкин ΙΠ-18 (ТкШкш е! а1. 1996, №1катига е! а1. 1993, Окатига е! а1. 1995, ИкЫо е! а1. 1996) имеет общие структурные признаки с семейством ΙΠ-1 белков (Ва/ап е! а1. 1996), которые все имеют βскладчатую структуру в отличие от большинства других цитокинов, которые проявляют структуру четырехспиральных пучков. Подобно ΙΠ-1β, ΙΠ-18 синтезируется в виде биологически неактивного предшественника (проГк-18) и лишен сигнального пептида (ИкЫо е! а1. 1996). Предшественники ΙΠ-1β и ΙΠ-18 расщепляются каспазой 1 (46-1 β-конвертирующим ферментом, или Ιί,Έ). которая расщепляет эти предшественники после остатка аспарагиновой кислоты в положении Р1. Полученные зрелые цитокины высвобождаются из клетки (Сйауит е! а1. 1997 и Си е! а1. 1997), несмотря на отсутствие сигнального пептида.
Известно, что ГБ-18 действует как костимулятор в отношении продуцирования цитокинов (ΙΕΝ-γ, ГБ-2 и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора) Т-хелперными клетками типа Ι (Тй1) (Койпо е! а1. 1997), а также как костимулятор в отношении ΕΆδ-лиганд-опосредованной цитотоксичности, проявляемой клонами мышиных природных клеток-киллеров (ТкШкш е! а1. 1996).
Интерлейкин-12 (ΙΕ-12) является иммунорегуляторным цитокином, продуцируемым моноцитами/макрофагами и другими антигенпрезентирующими клетками. Он является центральным в «оркестровке» как природных, так и приобретенных клеточно-опосредованных иммунных ответов (ТттсЫеп 1998). Он состоит из гетеродимера, составленного из ковалентно связанных продуктов двух отдельных генов: тяжелой цепи (р40) и легкой цепи (р35). Продуцирование ΙΕ-12 стимулируется в ответ на определенные бактерии, бактериальные продукты, внутриклеточные паразиты и вирусы. ΙΕ-12 были приписаны следующие функции: 1) он является сильнодействующим индуктором ΙΕΝ-γ из Т-клеток и природных клеток-киллеров (ΝΚ-клеток), 2) он является комитогенным для таких клеток, 3) он является решающим для развития Тй1-реакций в большинстве систем (таким образом, приводя вторично к увеличениям продуцирования ΙΕΝ-γ и ΊΝΕ, активации макрофагов и т.д.), 4) он усиливает цитотоксичность цитотоксических Т-лимфоцитов и ΝΚ-клеток, и 5) он является необходимым для гиперчувствительности замедленного типа. Было показано, что продуцирование ΙΕ-12 в выделенных мышиных лейкоцитах селезенки, обработанных штаммом 8!арйу1ососсик аигеик Со\\'ап 1, подавляется ΙΕΝ-α или ΙΕΝ-β (Кагр е! а1. 2000).
Недавно сообщалось, что ΙΕ-12 участвует в патогенезе органоспецифических аутоиммунных воспалительных заболеваний, таких как рассеянный (множественный) склероз (М8) (Кагр е! а1. 2000) и воспалительное заболевание кишечника (ΙΒΌ) (В1итЬетд апб 81тоЬет 2001 и ПоссЫ 1999), и, следовательно, считается потенциальной мишенью лекарственных средств для лечения этих состояний.
ΙΠ-18 и ΙΕ-12 проявляют явный синергизм в индукции ΙΕΝ-γ в Т-клетках (Окатига е! а1. 1998). Исследования механизма этого синергизма обнаружили, что ΙΕ-12 повышающим образом регулирует экспрессию обеих цепей рецептора ΙΠ-18 на продуцирующих ΙΕΝ-γ клетках (К1т е! а1. 2001). Хотя Ш-12 и ΙΠ-18 активируют как природный, так и приобретенный иммунитет, их избыточное продуцирование ак
- 1 009125 тивированными макрофагами может индуцировать нарушения множества органов, в том числе нарушение функции иммунной системы (8ек1 е! а1. 2000).
Цитокинсвязывающие белки (растворимые рецепторы цитокинов) являются обычно внеклеточными лигандсвязывающими доменами их соответствующих рецепторов цитокинов клеточной поверхности. Они продуцируются либо альтернативным сплайсингом, либо протеолитическим расщеплением рецептора клеточной поверхности. Эти растворимые рецепторы были описаны в прошлом: например, растворимые рецепторы для 1Ь-б и ΙΕΝ-γ (Коу1ск е! а1. 1989), ΤΝΕ (Епде1тапп е! а1. 1989 и Епде1тапп е! а1. 1990), Ш-1 и Ш-4 (Майкхе\\'кк| е! а1. 1990) и ΙΕΝ-α/β (ΝονΚΚ е! а1. 1994, ΝονΚΚ е! а1. 1992). Один цитокинсвязывающий белок, названный остеопротегерином (ОРС, известный также как ингибирующий остеокласты фактор - ОС1Е), член ΤΝΕΚ/Еак-семейства, является, по-видимому, первым примером растворимого рецептора, который существует только в виде секретируемого белка (Апбегкоп е! а1. 1997, 81гаопе! е! а1. 1997, Уакиба е! а1. 1998).
Интерлейкин-18-связывающий белок (1Ь-18ВР) был аффинно очищен на 1Ь-18-колонке из мочи (ΝονκΚ е! а1. 1999). 1Ь-18ВР прекращает 1Ь-18-индукцию ΙΕΝ-γ и 1Ь-18-активацию ΝΕ-кВ ш νί!το. Кроме того, 1Ь-18ВР ингибирует индукцию ΙΕΝ-γ в мышах, инъецированных ЬР8. Ген 1Ь-18ВР локализован в хромосоме 11 человека, и в геномной последовательности размером 8,3 т.п.н., содержащей ген 1Ь-18ВР, не был найден экзон, кодирующий трансмембранный домен. До настоящего времени у человека были обнаружены четыре изоформы 1Ь-18ВР, генерируемые альтернативным сплайсингом мРНК. Они были названы 1Ь-18ВР а, Ь, с и б, причем все они имеют один и тот же Ν-конец и отличаются по С-концу (Νο\зск е! а1. 1999). Эти изоформы различаются по их способности связывать Ш-18 (К1т. е! а1. 2000). Известно, что из этих четырех изоформ изоформы а и с 1Ь-18ВР человека (ЫЕ-18ВР) имеют нейтрализующую активность в отношении 1Ь-18. Наиболее представленная изоформа 1Ь-18ВР, изоформа а сплайсингового варианта, проявляет высокую аффинность в отношении 1Ь-18 с быстрой скоростью связывания и медленной скоростью диссоциации и константой диссоциации (Кб), составляющей приблизительно 0,4 нМ (К1т е! а1. 2000). 1Ь-18ВР конститутивно экспрессируется в селезенке и принадлежит к суперсемейству иммуноглобулинов. Остатки, участвующие во взаимодействии ΙΗ-18 с 1Ь-18ВР, были описаны с использованием компьютерного моделирования (К1т е! а1. 2000) и на основе взаимодействия между сходным белком ΙΗ-1β и ΙΕ-1Κ типа Ι (Уфегк е! а1. 1997). Согласно этой модели связывания ΙΗ-18 с Ш18ВР, было сделано предположение, что остаток С1и в положении 42 и остаток Ьук в положении 89 ΙΗ-18 связываются с Ьук-130 и С1и-114 в [Ц-18ВР соответственно (К1т е! а1. 2000).
ГЕ-18ВР конститутивно присутствует во многих клетках (Ригеп е! а1. 1999) и циркулирует в кровотоке здоровых людей (игикЫйага е! а1. 2000), представляя уникальный феномен в биологии цитокинов. Вследствие высокой аффинности ГЕ-18ВР в отношении ΙΒ-18 (Кб = 0,4 нМ), а также высокой концентрации ГЕ-18ВР, обнаруженной в кровотоке (20-кратного молярного избытка относительно ΙΒ-18), было сделано предположение, что большинство молекул, если не все молекулы, ΙΒ-18 в кровотоке являются связанными с ГЕ-18ВР. Таким образом, циркулирующий ГЕ-18ВР, который конкурирует с рецепторами клеточной поверхности за ΙΒ-18, может действовать в качестве природной противовоспалительной и иммуносупрессивной молекулы.
Как упоминалось, ΙΒ-18 индуцирует ΙΕΝ-γ, который, в свою очередь, как сообщалось недавно, индуцирует генерирование мРНК ГЕ-18ВРа ш νίΐτο (МиЫ е! а1. 2000). Таким образом, !К-18ВРа мог бы служить в качестве сигнала «выключения», терминирующего воспалительную реакцию.
ГЕ-18ВР является значимо гомологичным с семейством белков, кодируемым несколькими поксвирусами (ΝονΚΚ е! а1. 1999, Х1апд апб Мокк 1999). Ингибирование ΙΒ-18 этим предположительным вирусным ГЕ-18ВР может аттенуировать воспалительную антивирусную Тй1-реакцию.
Термин синдром системной воспалительной реакции (8ΙΚ.8) описывает обычный клинический синдром сепсиса, независимо от его причины. 8ΙΚ.8 может быть результатом травмы, панкреатита, реакций на лекарственные средства, аутоиммунного заболевания и других нарушений; когда этот синдром возникает в ответ на инфекцию, говорят о присутствии сепсиса (№111епк апб Магкйа11 199б).
Септический шок является распространенной причиной смерти в медицинских и хирургических отделениях интенсивной терапии (Акйх апб Каской 1998). Термины сепсис, тяжелый сепсис и септический шок используются для идентификации развертывания клинической реакции на инфекцию. Пациенты с сепсисом проявляют признаки инфекции и клинических манифестаций воспаления. Пациенты с тяжелым сепсисом развивают гипоперфузию с дисфункцией органов. Септический шок проявляется гипоперфузией и стойкой гипотензией. Смертность находится в диапазоне от 1б% у пациентов с сепсисом до 40-60% у пациентов с септическим шоком. Наиболее обычной причиной септического шока является бактериальная инфекция. Наиболее частыми местами инфекции являются легкие, брюшная полость и мочевые пути. Обычные противовоспалительные терапии, такие как применение кортикостероидов, не смогли показать улучшение в выживании от сепсиса и септического шока. Три моноклональных антитела, специфических в отношении эндотоксина, испытывали в клинических испытаниях, и они не смогли улучшить коэффициенты выживаемости. Терапия с использованием антагонистов к фактору некроза опухоли, интерлейкину 1, брадикинина, ибупрофена; и активирующего тромбоциты фактора не обнаруживала
- 2 009125 улучшения выживания от септического шока (Άδίίζ апй Каской 1998).
Сепсис вызывается ш!ег ака грамположительными бактериями, например, 8!арйу1ососси5 ер1йегШ1Й18. Считается, что липотейхоевые кислоты и пептидогликаны, которые являются основными компонентами клеточной стенки видов 8!арйу1ососси5, являются индукторами высвобождения цитокинов в этом состоянии (Стир!а е1 а1. 1996 и С1еге1апй е1 а1. 1996). Однако другие грамположительные компоненты также рассматриваются в качестве стимуляторов синтеза цитокинов (Непйешоп е1 а1. 1996). Считается, что продуцирование 1Ь-1, ΤΝΕ-α и ΙΕΝ-γ вносит основной вклад в патогенез септического шока (Όίпаге11о 1996 и Окика^а е1 а1. 1988). Кроме того, было показано, что хемокин 1Ь-8 индуцируется нейтрофилами в ответ на 8. ер1ЙепшЙ15 (НасЫсйа е1 а1. 1998). Важными факторами в регуляции индукции 1Ь-1, ΤΝΕ-α и ΙΕΝ-γ 8. ер1ЙепшйЕ являются 1Ь-18, 1Ь-12, ΙΗ-1 β и ΤΝΕ-α. ΙΗ-1 β и ΤΝΕ-α могут рассматриваться как костимулы для продуцирования ΙΕΝ-γ Т-лимфоцитами, подобно 1Ь-18. Эти два цитокина имеют костимуляторную активность на продуцирование ΙΕΝ-γ в контексте ΙΤ-12- или бактериальной стимуляции (8кееп е! а1. 1995 и ТОрр е! а1. 1993).
Недавно №1катига е! а1. (2000) сообщили, что одновременное введение ΙΗ-18 и ГО-12 мышам приводит к высокой токсичности, сходной с токсичностью, обнаруженной в индуцированном эндотоксином септическом шоке.
Было показано, что уровни ГБ-18 повышаются в сыворотках пациентов с сепсисом (Епйо е! а1. 2000), но это увеличение коррелировало с уровнями креатинина, что позволяет предполагать, что повышенные уровни ΙΗ-18 могут быть результатом почечной недостаточности. В другом исследовании (ОгоЬтуег е! а1. 2000) уровни ΙΗ-18 у 9 субъектов с сепсисом во время первых 96 ч после госпитализации были высокими и не коррелировали с уровнями креатинина.
Как видно из вышесказанного, ΙΗ-18 является плейотропным интерлейкином, имеющим как усиливающую, так и ослабляющую воспаление функции. С одной стороны, он усиливает продуцирование провоспалительных цитокинов, подобных ΤΝΕ-α, усиливая таким образом воспаление. С другой стороны, он индуцирует продуцирование оксида азота (ΝΟ), ингибитора каспазы-1, блокируя таким образом созревание ΙΗ-1β и, возможно, ослабляя воспаление. Эта двойственная роль ΙΗ-18 подвергает сомнению эффективность ингибиторов ΙΗ-18 в лечении воспалительных заболеваний. Кроме того, вследствие участия большого разнообразия различных цитокинов и хемокинов в регуляции воспаления, нельзя всегда ожидать получения благоприятного эффекта блокированием только одного из путей в столь сложной сети взаимодействий.
№!еа е! а1. (2000) сообщали, что введение поликлонального антитела против ΙΗ-18 защищало мышей против вредных действий ЬР8, происходящих как из Е. сой, так и из испытанных видов 8. 1ур1нтшгит, подтверждая концепцию, что ΙΗ-18 играет важную патогенную роль в летальном эндотоксикозе. Однако неопределенность в отношении эффективности потенциальной композиции для лечения на основе введения ингибиторов ΙΗ-18 проявляется в том, что мыши с нокаутом ΙΗ-18 не являются менее чувствительными к сепсису по сравнению с животными дикого типа (8акао е! а1. 1999), и в том, что недавние сообщения предполагают, что провоспалительная активность ΙΗ-18 является существенной для защитной системы хозяина против тяжелых инфекций (ЛакатзЫ е! а1. 2001 и Бо55 е! а1. 2001).
Таким образом, существует необходимость в обеспечении средства для лечения и/или предупреждения сепсиса, несмотря на вышеупомянутые соображения, касающиеся применения ингибиторов ΙΕ-18.
Сущность изобретения
Данное изобретение относится к применению ингибитора ΙΗ-18 в приготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения сепсиса и других заболеваний, характерных для синдрома системной воспалительной реакции (8ΙΚ8), выбранных из тяжелого сепсиса и септического шока, а также связанного с сепсисом нарушения функции сердца.
Более конкретно, данное изобретение относится к применению ингибитора ΙΗ-18, выбранного из ингибиторов каспазы-1 (Ιί',Έ). антител против ΙΗ-18, антител против любой из субъединиц рецептора ΙΕ18, ингибиторов пути передачи сигнала с участием ΙΗ-18, антагонистов ΙΗ-18, которые конкурируют с ΙΕ18 и блокируют ЬБ-18-рецептор, ингибиторов продуцирования ЬБ-18 и ЕБ-18-связывающих белков, их изоформ, мутеинов, слитых белков, функциональных производных, активных фракций или производных циркулярной перестановки, имеющих, по меньшей мере, по существу, ту же самую активность, что и ЕБ18-связывающий белок.
ΙΕ-18-связывающий белок, используемый в соответствии с данным изобретением, является его изоформой, мутеином, слитым белком (например, Iд-слитым), функциональным производным (например, ПЭГ-конъюгированным), активной фракцией или производным циркулярной перестановки.
Антитела, используемые в соответствии с данным изобретением, могут быть специфическими антителами против ΙΠ-18, выбранными из химерных, гуманизированных и человеческих антител.
Кроме того, данное изобретение относится к применению ингибитора в приготовлении лекарственного средства, дополнительно содержащего ингибитор ΙΕ-12, предпочтительно нейтрализующее ΙΕ-12 антитело, интерферон, предпочтительно интерферон α или β, ингибитор фактора некроза опухоли, предпочтительно растворимый ΤΝΕΚΙ, или ΤΝΕΚΙΙ, и/или ингибитор ТЪ-1, предпочтительно антагонист ре
- 3 009125 цептора Ш-1, для одновременного, последовательного или раздельного введения.
В одном аспекте данное изобретение обеспечивает применение экспрессирующего вектора, содержащего кодирующую последовательность ингибитора 1Ь-18, выбранного из ингибиторов каспазы-1 (1СЕ), антител против 1Ь-18, антител против любой из субъединиц рецептора 1Ь-18, ингибиторов пути передачи сигнала с участием 1Ь-18, антагонистов 1Ь-18, которые конкурируют с 1Ь-18 и блокируют 1Ь18-рецептор, ингибиторов продуцирования 1Ь-18 и 1Ь-18-связывающих белков, их изоформ, мутеинов, слитых белков или производных циркулярной перестановки, имеющих, по меньшей мере, по существу, ту же самую активность, что и 1Ь-18-связывающий белок, в приготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения сепсиса, например, посредством генотерапии.
В другом аспекте данное изобретение обеспечивает применение вектора для индукции и/или усиления эндогенной продукции ингибитора 1Ь-18 в клетке в приготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения сепсиса.
Кроме того, данное изобретение обеспечивает применение клетки, которая была генетически модифицирована для продуцирования ингибитора 1Ь-18, в приготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения сепсиса.
В другом варианте данное изобретение относится к способу лечения и/или предупреждения сепсиса и других заболеваний, характерных для синдрома системной воспалительной реакции (8ΙΚ8), в том числе связанной с сепсисом дисфункции сердца, предусматривающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически эффективного количества ингибитора 1Ь-18, выбранного из ингибиторов каспазы-1 (1СЕ), антител против 1Ь-18, антител против любой из субъединиц рецептора 1Ь-18, ингибиторов пути передачи сигнала с участием 1Ь-18, антагонистов 1Ь-18, которые конкурируют с 1Ь-18 и блокируют 1Ь-18-рецептор, ингибиторов продуцирования 1Ь-18 и 1Ь-18-связывающих белков, их изоформ, мутеинов, слитых белков, функциональных производных, активных фракций или производных циркулярной перестановки, имеющих, по меньшей мере, по существу, ту же самую активность, что и 1Ь-18-связывающий белок. Этот способ может предусматривать совместное введение терапевтически эффективного количества ингибитора цитокинов, выбранного из ингибитора 1Ь-12, предпочтительно нейтрализующих антител, ингибиторов фактора некроза опухоли, предпочтительно растворимой части ΤΝΕΚΙ или ΤΝΕΚΙΙ, ингибиторов Ш-1, предпочтительно антагонистов рецептора 1Ь-1, и ингибиторов 1Ь-8 и/или интерферона, предпочтительно интерферона-α или -β.
Кроме того, данное изобретение обеспечивает способ лечения и/или предупреждения сепсиса и других заболеваний, характерных для синдрома системной воспалительной реакции (8ΙΚ8), предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически эффективного количества вектора, кодирующего последовательность ингибитора ΙΗ-18, выбранного из ингибиторов каспазы-1 (ЮЕ), антител против ΙΗ-18, антител против любой из субъединиц рецептора ΙΗ-18, ингибиторов пути передачи сигнала с участием ΙΗ-18, антагонистов ΙΗ-18, которые конкурируют с ΙΗ-18 и блокируют ΙΗ-18рецептор, ингибиторов продуцирования ΙΗ-18 и ΙΕ-18-связывающих белков, их изоформ, мутеинов, слитых белков или производных циркулярной перестановки.
В следующем варианте данное изобретение относится к способу лечения и/или предупреждения сепсиса и других заболеваний, характерных для 8ΙΚ8, предусматривающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически эффективного количества вектора для индукции и/или усиления эндогенного продуцирования ингибитора ΙΗ-18 в клетке.
Кроме того, данное изобретение обеспечивает способ лечения и/или предупреждения сепсиса и других заболеваний, характерных для 8ΙΚ8, предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, клетки, которая была генетически модифицирована для продуцирования Ш-18.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 показывает распределение сывороточного Ш-18В Ра у здоровых индивидуумов. Сыворотки здоровых индивидуумов мужского и женского пола в возрасте 20-60 лет, анализированные на присутствие Ш-18ВРа при помощи специфического ЕЫ8А-теста (п=107).
Фиг. 2А показывает средние уровни ΙΗ-18 и Ш-18ВРа у пациентов с сепсисом и здоровых субъектов. [Ш-18 и Ш-18ВРа в сыворотке определяли у здоровых индивидуумов (см. фиг. 1) и в 198 пробах из 42 пациентов с сепсисом сразу же после госпитализации и во время госпитализации.
Фиг. 2В показывает распределение индивидуальных уровней [Ш-18 и Ш-18ВРа у здоровых субъектов и пациентов, описанных в фиг. 2А. Средние уровни в сыворотке Ш-18 и Ш-18ВРа у здоровых субъектов показаны пунктирной вертикальной и горизонтальной линией соответственно.
Фиг. 3 показывает сравнение между общим и свободным Ш-18 у отдельных пациентов с сепсисом после госпитализации. Уровень свободного Ш-18 (черные кружки) в сыворотках рассчитывали на основе концентрации общего Ш-18 (белые кружки) и !Ш-18ВРа, с учетом стехиометрии 1:1 Ш-18 к Ш-18ВР в комплексе и рассчитанной Кй, составляющей 400 пМ. Каждая вертикальная линия связывает общий и свободный Ш-18 в отдельной пробе сыворотки.
Фиг. 4 показывает действие Ш-18ВР на 8. ер1йегт1й18-индуцированное продуцирование ΙΕΝ-γ в цельной крови. Цельная кровь стимулировалась только 8. ер1йепшй15 или 8. ер1йепшй15 и рекомбинант
- 4 009125 ным 1Ь-18ВР в указанных концентрациях. После 48 ч инкубации культуру крови лизировали и измеряли ΙΡΝ-γ. Результаты выражены в процентах индукции ΙΡΝ-γ 8. ерйегтШк. Р<0,01 против одного 8. ер1йегιηίάίδ. Данные представляют среднее±стандартная ошибка среднего (8ЕМ) шести экспериментов. 8ЕМ представляет разброс средней величины пробы. 8ЕМ дает представление о точности средней величины. 8ЕМ=8П/(квадратный корень величины пробы). Эти данные анализировали с использованием спаренного критерия Стьюдента.
Фиг. 5 показывает ингибиторное действие, проявляемое двойной активностью 1Ь-18ВРа и моноклональных антител против 1Ь-12, на продуцирование ΙΡΝ-γ цельной кровью, обработанной 8. ер1ЙепшЙ15. Цельную кровь стимулировали 8. ерйегтШк в присутствии или в отсутствие 1Ь-18ВРа (125 нг/мл), тАЬ к 1Ь-12 (2,5 мкг/мл) и обоих. После 48 ч инкубации культуру крови лизировали и измеряли ΙΡΝ-γ. Результаты выражены в процентах индукции ΙΡΝ-γ 8. ерйегтШк. Р<0,01 против одного 8. ер1ЙепшЙ15. Данные представляют среднее±стандартная ошибка среднего (8ЕМ) шести экспериментов. 8ЕМ представляет разброс средней величины пробы. 8ЕМ дает представление о точности средней величины. 8ЕМ=8П/(квадратный корень величины пробы). Эти данные анализировали с использованием спаренного критерия Стьюдента.
Фиг. 6 показывает количественное определение ГЬ-18ВРа, отраженное в стандартной кривой ЕЫ8А. Рекомбинантный [Ш-18ВРа человека серийно разводили и подвергали ЕЫ8А, как описано в примере 3. Эти результаты показывают среднюю оптическую плотность±8Е (стандартная ошибка) 10 экспериментов.
Фиг. 7 показывает ингибиторное действие ΙΠ-18 на количество !П-18ВРа согласно тесту ЕЫ8А. Показан процент ингибирования сигнала.
Фиг. 8 показывает иммунологическую перекрестную реактивность изоформ ГЬ-18ВР человека. Анализ ЕЫ8А [В.-18ВР выполняли со всеми изоформами (а-ά) Ш-18ВР. Исходные растворы (3,2 мкг/мл) изоформ Ш-18ВР серийно разводили и тестировали в Ш-ШВРа-ЕЬША.
Фиг. 9 показывает содержание ΙΒ-18 в ткани миокарда после введения ЬР8. Мышей инъецировали ЬР8 Е.со11 (0,5 мг/кг, внутрибрюшинно). Сердца гомогенизировали в указанных на х-оси временных точках. ЕЫ8А проводили для определения содержания ΙΒ-18 в миокарде (п=4-5 животных на группу).
Фиг. 10 показывает действие антитела к ΙΒ-18 на индуцированную ЬР8 дисфункцию миокарда. Мышей инъецировали либо носителем (внутривенно инъецируемым физиологическим раствором, п=8), либо ЬР8 Е.сой (0,5 мг/кг, инъецируемых внутрибрюшинно, п=8) и определяли развиваемое давление в левом желудочке (ЬУИР) через 6 ч перфузии выделенного сердца. В отдельных экспериментах мышей предварительно обрабатывали либо сывороткой нормальных кроликов (ΝΚ.8, п=5), либо антителом к Ш18 (антиПЬ-Ш, п=8) за 30 мин перед введением ЬР8.
Подробное описание изобретения
Данное изобретение относится к введению ингибиторов ΙΒ-18 для предупреждения или лечения сепсиса, и оно основано на открытиях, описанных в примерах. В соответствии с данным изобретением было обнаружено, что уровни эффективного (свободного) циркулирующего ΙΒ-18 являются значимо повышенными в сыворотке пациентов с сепсисом по сравнению со здоровыми индивидуумами и что ингибирование ΙΒ-18 вызывает уменьшение индукции ΙΡΝ-γ грамположительной бактерией 81арйу1ососси8 ер1ЙепшЙ15.
Кроме того, превентивное лечение сепсиса может проводиться введением ингибитора ΙΒ-18 в комбинации с ингибиторами других цитокинов, потенциально способными увеличивать его действие.
Сепсис, согласно данному изобретению, включает 8ΙΚ.8, тяжелый сепсис, септический шок, эндотоксиновый бактериально-токсический шок и т. д. и может быть вызван грамположительными или грамотрицательными бактериями.
Термин «ингибитор ΙΌ18» в контексте данного изобретения относится к любой молекуле, модулирующей продуцирование и/или действие ΙΒ-18 таким образом, что продуцирование и/или действие ΙΒ-18 ослабляется, уменьшается или частично, по существу или полностью предотвращается или блокируется.
Ингибитором продуцирования может быть любая молекула, негативно воздействующая на синтез, процессинг или созревание ΙΒ-18, например ингибитор Ι0Έ. Ингибиторами, рассматриваемыми в соответствии с данным изобретением, могут быть, например, супрессоры экспрессии гена интерлейкина Ш18, антисмысловые мРНК, уменьшающие или предотвращающие транскрипцию мРНК ΙΒ-18, или рибозимы, приводящие к деградации мРНК, белки, нарушающие правильную укладку, или частично, или по существу предотвращающие секрецию ΙΒ-18, протеазы, деградирующие ΙΒ-18 и т.п.
Ингибиторами действия ΙΒ-18 могут быть антагонисты ΙΒ-18, например Ш-ШВР. Антагонисты могут либо связываться с самой молекулой ΙΒ-18, либо изолировать молекулу ΙΒ-18 с достаточной аффинностью и специфичностью для частичной или, по существу, полной нейтрализации ΙΒ-18 или активного сайта (сайтов) ΙΒ-18, ответственных за связывание с его лигандами (например, с его рецепторами). Антагонист может также ингибировать путь передачи сигнала с участием ΙΒ-18, который активируется в клетках при связывании ΙΕ-18/рецептор.
Ингибиторами действия ΙΒ-18 могут быть также растворимые рецепторы ΙΒ-18 или молекулы, ими
- 5 009125 тирующие эти рецепторы, или агенты, блокирующие рецепторы 1Ь-18 или молекулы, имитирующие эти рецепторы, или агенты, блокирующие рецепторы 1Ь-18, антитела к 1Ь-18, такие как моноклональные антитела, или любой другой агент или молекула, предотвращающие связывание 1Ь-18 с его мишенями, уменьшая или предотвращая таким образом запуск внутриклеточных или внеклеточных реакций, опосредуемых 1Ь-18.
Термин «1Ь-18-связывающие белки» применяется здесь как синоним «1Ь-18ВР». Он включает в себя 1Ь-18-связывающие белки, определенные в №0 99/09063 или в ΝονίοΚ с! а1., 1999, в том числе сплайсинговые варианты и/или изоформы 1Ь-18-связывающих белков, определенных в К1ш е! а1., 2000. В частности, изоформы а и с 1Ь-18ВР человека применимы в соответствии с данным изобретением. Белки, применимые в соответствии с данном изобретением, могут быть гликозилированными или негликозилированными, они могут происходить из природных источников, таких как моча, или предпочтительно они могут быть получены рекомбинантно. Рекомбинантная экспрессия может проводиться в прокариотических системах экспрессии, подобных Е. сой, или в эукариотических системах экспрессии и предпочтительно в системах экспрессии млекопитающих.
В применении здесь, термин «мутеины» относится к аналогам 1Б-18ВР или аналогам вирусного 1Ь18ВР, в которых один или несколько аминокислотных остатков встречающегося в природе 1Б-18ВР или вирусного 1Б-18ВР заменены отличными аминокислотными остатками или делетированы, или один или несколько аминокислотных остатков добавлены к встречающейся в природе последовательности 1Ь18ВР или вирусного 1Б-18ВР без значительного изменения активности полученных продуктов по сравнению с 1Б-18ВР или вирусным 1Б-18ВР дикого типа. Эти мутеины получают известными способами синтеза и/или способами сайт-направленного мутагенеза или любым другим известным способом, подходящим для этого.
Любой такой мутеин предпочтительно имеет последовательность аминокислот, достаточно аналогичную последовательности 1Б-18ВР или достаточно аналогичную последовательности вирусного 1Ь18ВР, так что он имеет, по существу, одинаковую активность с 1Б-18ВР. Одной из активностей 1Б-18ВР является его способность связывать 1Б-18. Пока этот мутеин имеет существенную связывающую активность относительно 1Б-18, он может быть использован для очистки ГС-18, например, посредством аффинной хроматографии, и, следовательно, может рассматриваться, как имеющий, по существу, одинаковую активность относительно 1Б-18ВР. Таким образом, можно определить, имеет ли любой конкретный мутеин, по существу, ту же самую активность, что и 1Б-18ВР, при помощи рутинного экспериментирования, включающего в качестве объекта такой мутеин, например, методом простого конкурентного сэндвич-анализа для определения, связывается ли он или не связывается с подходящим образом меченым 1Б-18. такого как радиоиммуноанализ или анализ ЕЫ8А.
Мутеины полипептидов 1Б-18ВР или мутеины вирусного 1Б-18ВР, которые могут быть использованы в соответствии с данным изобретением, или кодирующие их нуклеиновые кислоты, включают в себя ограниченный набор, по существу, соответствующих последовательностей в качестве заменяющих пептидов или полинуклеотидов, которые могут быть рутинным образом получены специалистом с квалификацией в данной области без чрезмерного экспериментирования на основании представленных здесь описаний и руководящих указаний.
Предпочтительными заменами для мутеинов в соответствии с данным изобретением являются так называемые «консервативные замены». Консервативные замены аминокислот полипептидов или белков 1Б-18ВР или вирусного 1Б-18ВР могут включать в себя синонимические аминокислоты в группе, которые имеют достаточно сходные физико-химические свойства, так что замена между членами этой группы будет сохранять биологическую функцию данной молекулы (ОгаиШаш, 1974).
Ясно, что вставки и делеции аминокислот также могут быть произведены в описанных выше последовательностях без изменения их функции, в частности, если эти вставки или делеции включают в себя только небольшое число аминокислот, например менее тридцати и предпочтительно менее десяти, и не удаляют или не заменяют аминокислоты, которые являются критическими для функциональной конформации, например остатки цистеина. Белки и мутеины, продуцируемые такими делециями и/или вставками, входят в объем данного изобретения.
Предпочтительными группами синонимических аминокислот являются группы, определенные в табл. I. Более предпочтительно группами синонимических аминокислот являются группы, определенные в табл. II; и наиболее предпочтительно группами синонимических аминокислот являются группы, определенные в табл. III.
- 6 009125
Таблица Ι Предпочтительные группы синонимических аминокислот
Аминокислота Синонимическая группа
Зег Зег, ТЬг. 61у, Азп
Агд Агд. 61п, Ьуз, 61и, Ηι3
Ьеи Не, РЬе. Туг. Ме(, \Ха1, Ьеи
Рго 61у. А1а. ТЬг. Рго
ТЬг Рго, Зег, А1а, 61у. Ηί5. 61п, ТЛг
А1а С1у, ТЬг, Рго, А1а
Уа1 Ме1, Туг, РЬе, Не. Ьеи, Уа1
О1у А!а, ТЬг, Рго. Зег, 61у
Не МеЬ Туг, РЬе. Уа|, Ьеи, Не
РЬе Тгр, Ме(, Туг. Не. Уа), Ьеи. РЬе
Туг Тгр, Ме(, РЬе, Не. \/а1. Ьеи. Туг
Суэ Зег, ТЬг, Суз
ΗΪ3 61и, Ьуз, 61л, ТЬг, Агд, ΗΪ3
61л 61и, Ьуз. Азп, Нгз, ТЬг, Агд, 61п
Азп 61п, Азр, Зег, Азп
Ьуз С/и, 61п, Н1з, Агд, Ьуз
Азр 61и, Азп, Азр
61и Азр, Ьуз, Азл, 61л, Нгз, Агд, 61и
Ме( РЬе, Не, Уа1, Ьеи. Ме1
Тгр Тгр
- 7 009125
Таблица II Более предпочтительные группы синонимических аминокислот
Аминокислота Синонимическая группа
Зег Зег
Агд ΗΪ3, !.уз, Агд
Ьеи 1еи, Не, РНе, Ме!
Рго А!а, Рго
ТНг ТНг
А1а Рго, А1а
Уа1 Уа1. Ме!, Не
61у С!у
Не Не, Ме(. РЬе. Уа1, Ьеи
РНе Ме!, Туг, !1е, Сей, РЬе
Туг РЬе. Туг
Суз Суз, Зег
ΗΪ5 ΗΪ3, С1л. Агд
С1п ΘΙυ, <31η, Ηί$
Азп Азр, Азп
Буз Буз, Агд
Азр Азр, Азп
С1и С1и. С1п
Ме! Ме!, РНе, !1е, Уа!, кеи
Тгр Тгр
- 8 009125
Таблица III
Наиболее предпочтительные группы синонимических аминокислот группа
Аминокислота Синонимическ
Зег Зег
Агд Агд
кеи кеи, Не, Ме!
Рго Рго
ТЬг ТЬг
А1а А1а
Уа1 νβΐ
61у 61у
Не Не. Ме!, кеи
РЬе РЬе
Туг Туг
Суз Суа, Зег
ΗΪ5 ΗΪ5
61л 61л
Аал Аап
1уз куз
Аар Азр
61и 61и
Ме! Ме!. Не, кеи
Тгр Ме!
Примеры получения аминокислотных замен в белках, которые могут быть использованы для получения мутеинов полипептидов или белков 1Ь-18ВР или мутеинов вирусных 1Ь-18ВР для применения в данном изобретении, включают в себя любые известные стадии способа, такие как представленные в патентах США с номерами КЕ 33653, 4959314, 4588585 и 4737462, Магк е! а1.; 5116943, Ко!Й8 е! а1.; 4965195, Ыатеп е! а1.; 4879111, Сйоид е! а1. и 5017691, Ьее е! а1., и белки с заменами аминокислот лизином, представленные в патенте США № 4904584 (8йате е! а1.).
Термин «слитые белки» относится к полипептиду, содержащему 1Ь-18ВР, или вирусный 1Ь-18ВР, или его мутеин, или фрагмент, слитые с другим белком, который, например, имеет продленное время существования в жидкостях тела. Так, 1Ь-18ВР или вирусный 1Ь-18ВР могут быть слиты с другим белком, полипептидом или т. п., например, иммуноглобулином или его фрагментом.
Термин «функциональные производные» в применении здесь охватывает производные 1Ь-18ВР или вирусного 1Ь-18ВР и их мутеины и слитые белки, которые могут быть получены из функциональных групп, встречающихся в виде боковых цепей на остатках, или Ν- или С-концевых групп способами, известными в данной области, и являются включенными в данное изобретение, пока они остаются фармацевтически приемлемыми, т.е. они не нарушают активность данного белка, которая является, по существу, одинаковой с активностью 1Ь-18ВР или вирусных 1Ь-18ВР, и не придают токсических свойств содер жащим их композициям.
Эти производные могут, например, включать в себя боковые цепи полиэтиленгликоля (ПЭГконъюгированные), которые могут маскировать антигенные сайты и продлевать существование 1Ь-18ВР или вирусного 1Ь-18ВР в жидкостях тела. Другие производные включают в себя алифатические сложные эфиры карбоксильных групп, амиды карбокисильных групп, образованные реакцией с аммиаком или с первичным или вторичным аминами, Ν-ацильные производные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованные с ацильными группами (например, алканоильной или карбоциклической ароиль
- 9 009125 ной группами) или О-ацилпроизводные свободных гидроксильных групп (например, серинового или треониного остатков), образованных с ацильными группами.
В качестве «активных фракций» 1Ь-18ВР или вирусного 1Ь-18ВР, мутеинов и слитых белков данное изобретение включает в себя любой фрагмент или предшественники полипептидной цепи только белковой молекулы или вместе с ассоциированными с ней молекулами или связанными с ней остатками, например, сахарными или фосфатными остатками, или агрегаты белковой молекулы или сахарных остатков друг с другом, при условии, что указанная фракция имеет, по существу, одинаковую активность с 1Ь18ВР.
Функциональные производные 1Б-18ВР могут быть конъюгированы с полимерами для улучшения свойств белка, таких как стабильность, полупериод существования в организме, биодоступность, переносимость организмом человека или иммуногенность. Для достижения этой цели 1Б-18ВР может быть связан, например, с полиэтиленгликолем (ПЭГ). Конъюгирование с ПЭГ может проводиться известными способами, например, описанными в \УО 92/13095.
Таким образом, в предпочтительном варианте данного изобретения 1Ь-18ВР является конъюгированным с ПЭГ.
В следующем предпочтительном варианте осуществления данного изобретения ингибитор ΣΠ-18 является слитым белком, содержащим весь 1Ь-18-связывающий белок или часть 1Ь-18-связывающего белка, которые слиты со всем иммуноглобулином или с частью иммуноглобулина. Лицу с квалификацией в данной области будет понятно, что полученный слитый белок сохраняет биологическую активность 1Ь-18ВР, в частности, связывание с 1Ь-18. Это слияние может быть прямым или через короткий линкерный пептид, который может быть таким коротким, как 1-3 аминокислотных остатка в длину, или более длинным, например, имеющим 13 аминокислотных остатков в длину. Указанный линкер может быть, например, трипептидом последовательности Е-Г-М (С1и-Р11с-Мс1). или состоящей из 13 аминокислот линкерной последовательностью, содержащей 61и-Рйе-61у-А1а-61у-Геи-Уа1-Геи-61у-61у-01п-Рйе-Ме!, введенные между последовательностью 1Ь-18ВР и последовательностью иммуноглобулина. Полученный слитый белок имеет улучшенные свойства, например, продленное время существования в жидкостях тела (полупериод существования в организме), увеличенную удельную активность, увеличенный уровень экспрессии, или облегчается очистка этого слитого белка.
1Ь-18ВР может быть слит с константной областью молекулы 1д. Предпочтительно он слит с районами тяжелой цепи, например, с доменами СН2 и СН3 1дС1 человека. Генерирование специфических слитых белков, содержащих 1Ь-18ВР и часть иммуноглобулина, описаны, например, в примере 11 XV О 99/09063. Другие изоформы молекул 1д также пригодны для генерирования слитых белков данного изобретения, например, изоформы 1дС2 или 1дС4, или других классов 1д, например, таких как 1дМ или 1дА. Слитые белки могут быть мономерными или мультимерными, гетеро- или гомомультимерными.
Ингибитор ΣΠ-18 может быть, например, антагонистом молекулы, которая связывает рецептор 1Ь18, но способна запускать путь передачи сигнала, активируемый при связывании этого цитокина с указанным рецептором (например, 1Ь-1-Яа, Итаге11о 1996). Все группы антагонистов являются приемлемыми, либо в отдельности, либо вместе, в комбинации с ингибитором ΣΠ-18 в терапии сепсиса.
Ингибитором ΣΠ-18 может быть специфическое антитело к 1Б-18. Антитела к 1Б-18 могут быть поликлональными или моноклональными, химерными, гуманизированными или даже полностью человеческими. Рекомбинантные антитела и их фрагменты характеризуются высокой аффинностью связывания с ΣΠ-18 ίη νίνο и низкой токсичностью. Антитела, которые могут быть использованы в данном изобретении, отличаются их способностью лечить пациентов в течение периода, достаточного, чтобы иметь регресс хорошей - превосходной степени или ослабление патогенного состояния или любого симптома из группы симптомов, связанных с патогенным состоянием, и низкую токсичность.
Было показано, что 1Б-18 увеличивается в ходе дисфункции сердца, вызываемой сепсисом. Одновременное введение ЬР8 вместе с ингибитором 1Ь-18, таким как нейтрализующее поликлональное антитело к ΣΠ-18, защищает от ЬР8-индуцируемой дисфункции миокарда.
Нейтрализующие антитела легко индуцируются у животных, таких как кролики, козы или мыши, иммунизацией 1Б-18. Иммунизированные мыши особенно применимы для обеспечения источников Вклеток для приготовления гибридом, которые, в свою очередь, культивируют для получения больших количеств моноклональных антител к 1Б-18.
Химерные антитела являются молекулами иммуноглобулина, характеризующимися двумя или несколькими сегментами или частями, происходящими из разных видов животных. Обычно вариабельная область химерного антитела происходит из антитела млекопитающего, не являющегося человеком, например, мышиного моноклонального антитела, а константная область иммуноглобулина происходит из молекулы иммуноглобулина человека.
Предпочтительно, обе эти области и комбинация их имеет низкую иммуногенность, как можно определить рутинными способами (Ε11ΐοΐ е! а1., 1994). Гуманизированные антитела являются молекулами иммуноглобулина, созданными способами генетической инженерии, в которых мышиные константные области заменены копиями иммуноглобулина человека при сохранении мышиных районов связывания антигена. Полученное химерное антитело мышь-человек предпочтительно имеет уменьшенную иммуно
- 10 009125 генность и улучшенную фармакокинетику у человека (КшдЫ с1 а1., 1993).
Таким образом, в следующем предпочтительном варианте антитело против 1Ь-8 является гуманизированным антителом к 1Ь-18. Предпочтительные примеры гуманизированных антител к 1Ь-18 описаны, например, в Европейской заявке на патент ЕР 0974600.
Еще в одном предпочтительном варианте антитело к 1Ь-18 является полностью человеческим. Технология получения антител человека описана подробно, например, в XVО 00/76310, XVО 99/53049, И8 6162963 или Аи 5336100. Полностью человеческие антитела являются предпочтительно рекомбинантными антителами, продуцируемыми в трансгенных животных, например, ксеномышах, содержащими все функциональные локусы 1д человека или части функциональных локусов 1д человека.
Полипептидные ингибиторы могут быть получены в прокариотических или эукариотических рекомбинантных системах или могут кодироваться в векторах, сконструированных для нацеливания генов.
Вместе с ингибиторами 1Ь-18 в лечении сепсиса могут быть использованы ингибиторы других цитокинов. Ингибитор 1Ь-18 может быть использован в комбинации с ингибитором 1Ь-12.
Термин «ингибитор 1Ь-12» в контексте данного изобретения относится к любой молекуле, модулирующей продуцирование и/или действие 1Ь-12 таким образом, что продуцирование и/или действие 1Ь-12 ослабляется, уменьшается или частично, по существу или полностью предотвращается или блокируется.
Ингибитором продуцирования 1Ь-12 может быть любая молекула, негативно воздействующая на его синтез, например, интерферон α/β (Кагр с1 а1. 2000), или молекула, негативно воздействующая на процессинг или созревание 1Ь-12.
Ингибиторами, рассматриваемыми в соответствии с данным изобретением, могут быть, например, супрессоры экспрессии гена интерлейкина 1Ь-12, антисмысловые мРНК, уменьшающие или предотвращающие транскрипцию мРНК 1Ь-12, или рибозимы, приводящие к деградации мРНК 1Ь-12, белки, нарушающие правильную укладку, или частично или по существу предотвращающие секрецию 1Ь-12, протеазы, деградирующие 1Ь-12 и т.п.
Антагонисты 1Ь-12 проявляют свою активность несколькими путями. Антагонисты могут связываться с самой молекулой 1Ь-12 или могут изолировать молекулу 1Ь-12 с достаточной аффинностью и специфичностью для частичной или, по существу, полной нейтрализации эпитопа или эпитопов 1Ь-12, ответственных за связывание рецептора 1Ь-12 (далее называемые изолирующими антагонистами). Изолирующим антагонистом может быть, например, антитело, направленное против 1Ь-12, укороченная форма рецептора 1Ь-12, содержащая внеклеточные домены этого рецептора или его функциональные части и т.д. Антагонисты могут также ингибировать путь передачи сигнала с участием 1Ь-12, который активируется в клетках при связывании 1Ь-12/рецептор (далее называемые антагонистами передачи сигналов). Все группы антагонистов применимы, по отдельности или вместе, в комбинации с ингибитором 1Ь-18, в терапии сепсиса. Антагонисты 1Ь-12 легко идентифицируются и оцениваются рутинным скринингом кандидатов на их действие на активность нативного 1Ь-12 на чувствительных клеточных линиях ίη νίίτο, например, мышиных спленоцитах, в которых форболовый эфир и 1Ь-12 вызывают пролиферацию. Этот анализ содержит композицию 1Ь-12 в варьирующихся разведениях антагонистакандидата, например, от 0,1- до 100-кратных относительно молярного количества 1Ь-12, используемого в этом анализе, и контроли без 1Ь-12, только с антагонистом или форболовым эфиром и 1Ь-2 (Тисс1 с1 а1., 1992).
Изолирующие антагонисты являются предпочтительными антагонистами 1Ь-12 для использования в соответствии с данном изобретением. Среди изолирующих антагонистов предпочтительными являются антитела, которые нейтрализуют активность 1Ь-12. В соответствии с данным изобретением предпочтительным является одновременное, последовательное или раздельное применение ингибитора 1Ь-18 с антагонистом 1Ь-12. Антитело к 1Ь-12 является предпочтительным антагонистом 1Ь-12 для применения в комбинации с ингибитором 1Ь-18, так же как производные, фрагменты, районы и биологически активные части этого антитела. Ингибитор 1Ь-18 может быть использован одновременно, последовательно или раздельно с ингибитором 1Ь-12.
Кроме того, ингибитор 1Ь-18 может быть использован в комбинации с ингибиторами других цитокинов, о которых известно, что они играют важную роль в септическом шоке, например, 1Ь-1, ΤΝΕ, 1Ь-8 и т.д., ИшагеНо 1996 и Окнката с1 а1. 1988. Примером ингибитора 1Ь-1 является антагонист рецептора 1Ь1, а примером ингибитора ΤΝΕ является растворимая часть рецепторов ΤΝΕΚ.1 и ΤΝΡΚ.2.
Термин «ингибитор цитокинов» в контексте данного изобретения относится к любой молекуле, модулирующей продуцирование и/или действие указанного цитокина (например, ингибиторам 1СЕ в случае 1Ь-1) таким образом, что его продуцирование и/или действие ослабляется, уменьшается или частично, по существу или полностью предотвращается или блокируется.
Ингибитором продуцирования может быть любая молекула, негативно действующая на синтез, процессинг или созревание указанного цитокина. Ингибиторами, рассматриваемыми в соответствии с данным изобретением, могут быть, например, супрессоры экспрессии гена цитокина, антисмысловые мРНК, уменьшающие или предотвращающие транскрипцию мРНК цитокина, или рибозимы, приводящие к деградации мРНК, белки, нарушающие правильную укладку, или частично или по существу предотвращающие секрецию указанного цитокина, протеазы, деградирующие этот цитокин и т.п.
- 11 009125
Антагонисты цитокинов проявляют свою активность несколькими путями. Антагонисты могут связываться с самой молекулой цитокина или могут изолировать молекулу цитокина с достаточной аффинностью и специфичностью для частичной или, по существу, полной нейтрализации эпитопа или эпитопов цитокина, ответственных за связывание рецептора цитокина (далее называемые изолирующими антагонистами). Изолирующим антагонистом может быть, например, антитело, направленное против цитокина, укороченная форма рецептора цитокина (например, растворимый рецептор ΤΝΕΚΙ и ΤΝΕΚΙΙ в случае ΤΝΕ), содержащая внеклеточные домены рецептора или его функциональные части и т.д. Альтернативно, антагонисты цитокинов могут ингибировать путь передачи сигнала с участием цитокина, который активируется рецептором клеточной поверхности после связывания цитокина (далее называемые антагонистами передачи сигналов). Антагонист может быть также молекулой, которая связывает рецептор, но не способна запускать путь передачи сигнала, активируемый после связывания этого цитокина с указанным рецептором (например, 1Ь-1-Яа, Эшагс11о 1996). Все группы антагонистов применимы, по отдельности или вместе, в комбинации с ингибитором ΙΗ-18, в терапии сепсиса.
Ингибитор ΙΗ-18 может быть использован одновременно, последовательно или раздельно с описанными выше ингибиторами цитокинов.
Данное изобретение относится также к применению экспрессирующего вектора, содержащего кодирующую последовательность ингибитора ΙΗ-18, в приготовлении лекарственного средства для предупреждения и/или лечения сепсиса. Таким образом, генотерапевтический подход используется для лечения и/или предупреждения этого заболевания. Выгодным образом, экспрессия ингибитора ГБ-18 будет происходить затем ίη 8Йи, эффективно блокируя ББ-18 непосредственно в ткани (тканях) или клетках, пораженных этим заболеванием.
Применение вектора для индукции и/или усиления эндогенного продуцирования ингибитора ББ-18 в клетке, в норме, молчащей в отношении экспрессии ингибитора ΙΗ-18 или экспрессирующей количества этого ингибитора, которые являются недостаточными, также рассматривается в соответствии с данным изобретением. Этот вектор может содержать регуляторные последовательности, функциональные в клетках, в которых желательно экспрессировать этот ингибитор или ΙΕ-18. Такими регуляторными последовательностями могут быть, например, промоторы или энхансеры. Затем эта регуляторная последовательность может быть введена в правильный локус генома гомологичной рекомбинацией для связывания таким образом этой регуляторной последовательности с геном, экспрессия которого должна быть индуцирована или усилена. Этот способ обычно называют «активацией эндогенного гена» (ЕСА), и он описан, например, в \УО 91/09955.
Данное изобретение включает в себя также введение генетически модифицированных клеток, способных продуцировать ингибитор ΙΗ-18, для лечения или предупреждения сепсиса.
Специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, что возможно также выключение экспрессии ЕБ-18 с использованием того же самого способа, т.е. введением элемента отрицательной регуляции, например, элемента, индуцирующего молчание гена, в локус гена ΙΗ-18, что приводит к понижению регуляции или прекращению экспрессии ЕБ-18. Лицу с квалификацией в данной области будет понятно, что такое понижение регуляции или индуцирование молчания экспрессии гена оказывает такое же действие, что и применение ингибитора ΙΗ-18 для предупреждения и/или лечения заболевания.
Выражение «фармацевтически приемлемый» означает любой носитель, который не влияет на эффективность биологической активности активного ингредиента и который не является токсичным для хозяина, в который его вводят. Например, для парентерального (например, внутривенного, подкожного, внутримышечного) введения активный белок (активные белки) могут быть приготовлены в унифицированной дозированной форме для инъекции в таких носителях, как физиологический раствор, раствор декстрозы, раствор сывороточного альбумина и раствор Рингера.
Активные ингредиенты фармацевтической композиции данного изобретения могут вводиться индивидууму различными способами. Способы введения включают интрадермальный, трансдермальный (например, в случае композиций медленного высвобождения), внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, пероральный, эпидуральный, локальный и интраназальный способы. Может быть использован любой другой терапевтически эффективный способ введения, например, абсорбция через эпителиальные или эндотелиальные ткани или с использованием гемотерапии, в которой пациенту вводят молекулу ДНК, кодирующую активный агент (например, посредством вектора), что вызывает экспрессию и секрецию этого активного агента ίη νινο. Кроме того, белок (белки) данного изобретения могут вводиться вместе с другими компонентами биологически активных агентов, такими как фармацевтически приемлемые поверхностно-активные вещества, эксципиенты, носители, разбавители и наполнитель.
Для парентерального (например, внутривенного, подкожного, внутримышечного) введения активный белок (активные белки) могут быть приготовлены в виде раствора, суспензии, эмульсии или лиофилизированного порошка вместе с фармацевтически приемлемым парентеральным наполнителем (например, водой, физиологическим раствором, раствором декстрозы) и добавками, которые поддерживают изотоничность (например, маннит) или химическую стабильность (например, консерванты или буферы). Готовую форму стерилизуют обычно используемыми для этого способами.
- 12 009125
Биодоступность активного белка (активных белков) данного изобретения может быть также улучшена с использованием процедур конъюгации, которые увеличивают полупериод существования молекулы в теле человека, например, связыванием этой молекулы с полиэтиленгликолем, как описано в патентной заявке РСТ \УО 92/13095.
Терапевтически эффективные количества активного белка (активных белков) будут зависеть от многих переменных, в том числе от типа антагониста, аффинности антагониста в отношении ΙΗ-18, любой остаточной цитотоксической активности, проявляемой этими антагонистами, способа введения, клинического состояния пациента (в том числе от желательности поддержания нетоксичного уровня активности эндогенного ΙΕ-18).
«Терапевтически эффективным количеством» является такое количество, при введении которого ингибитор ΙΗ-18 приводит к ингибированию биологической активности ΙΕ-18. Доза, вводимая в виде единственной дозы или множественных доз индивидууму, будет варьироваться в зависимости от множества факторов, в том числе от фармакокинетических свойств ингибитора ΙΗ-18, способа введения, состояния и характеристик (пола, возраста, веса тела, здоровья, роста) пациента, степени симптомов, сопутствующих лечебных мероприятий, частоты введения и желаемого эффекта. Коррекция и манипулирование в отношении установленных диапазонов доз находятся вполне в компетенции специалистов с квалификацией в данной области, как и способы определения ш νί!ΐΌ и ΐπ у1уо ингибирования ΙΗ-18 у индивидуума.
Согласно данному изобретению ингибитор ΙΗ-18 может вводиться профилактически или терапевтически индивидууму, нуждающемуся в этом, перед применением других программ лечения или агентов, одновременно или последовательно с другими программами лечения или агентами (например, схемами лечения множественными лекарственными средствами) в терапевтически эффективном количестве, в частности, с ингибитором ΙΕ-12 и/или ингибитором ΙΕ-1, антагонистом интерферона и ТЧР. Активные агенты, которые вводят одновременно с другими терапевтическими агентами, могут вводиться в тех же самых или в других композициях.
Далее, данное изобретение относится к способу приготовления фармацевтической композиции смешиванием эффективного количества ингибитора ΙΗ-18, и/или ингибитора ΙΕ-12, и/или ингибитора ΙΕ-1, антагониста интерферона и/или ТЧР с фармацевтически приемлемым носителем.
После описания данного изобретения оно будет более понятным при ссылке на следующие примеры, которые приведены в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения данного изобретения.
Примеры
Пример 1.
Уровни 6Ь-18ВРа и ΙΗ-18 сыворотки здоровых индивидуумов и пациентов с сепсисом
Измерение специфических циркулирующих в кровотоке цитокинов и их природных ингибиторов у здоровых и больных индивидуумов обеспечивает информацию об их участии в прогрессировании и степени тяжести заболевания. Как упоминалось в разделе предпосылок изобретения, одним из ключевых медиаторов сепсиса является ΙΕΝ-γ. Поскольку ΙΗ-18 является коиндуктором ΙΕΝ-γ, проводили мониторинг уровня ΙΗ-18 и его природного ингибитора, сплайсингового варианта ГО-^ВРа, у пациентов с сепсисом и сравнивали с уровнями, обнаруживаемыми в здоровых субъектах, с использованием специфических анализов ЕЫЗЛ (пример 3).
Уровни ΙΗ-18 и ГО-18ВРа у здоровых субъектов
Средний уровень ΙΗ-18 у 107 здоровых доноров был 64±17 пг/мл, как измерено с использованием ЕСЬ-анализа (электрохемилюминесцентного анализа) (Ротегап!/ е! а1. 2001). ЕСЬ-анализ испытывали на интерференцию (помехи), вызываемые родственными белками. Было обнаружено, что на него не влияло присутствие зрелого ΙΗ-1β или проЧЬ-Ш тогда как про-[Ь-18 был перекрестнореактивным. Таким образом, 20% детектируемого зрелого ΙΗ-18 в пробах сыворотки человека в данном исследовании могут быть про-!Ь-18. ГО-18ВРа при концентрации < 160 нг/мл не влиял на ЕСЬ-анализ ΙΕ-18.
Уровни 6Ь-18ВРа определяли в сыворотке из 107 здоровых индивидуумов с использованием ЕЫ8Л (пример 3). Уровни 6Ь-18ВРа были в диапазоне от 0,5 нг/мл до такой высокой величины, как 7 нг/мл, при средней величине, составляющей 2,15±0,15 нг/мл (фиг. 1).
Поскольку как ΙΗ-18, так и ΙΌ- 18ВРа совместно присутствуют в сыворотке, некоторая часть ΙΗ-18 может присутствовать в комплексе с 6Ь-18ВРа. Уровень свободного ΙΗ-18 рассчитывали на основе среднего уровня общего ΙΗ-18 (2,15 нг/мл). Свободный ΙΗ-18 определяли в соответствии с законом действия масс. Расчет основывался на следующих параметрах: концентрации общего ΙΗ-18, определенные при помощи ЕСЬ-анализа; концентрация общего ГО-^ВРа, определенная при помощи ЕЫ8Л; стехиометрия 1:1 в комплексе ГО-18ВРа и ΙΌ-18 и константа диссоциации (Кб), составляющая 0,4 нМ (Ыоуюк е! а1. 1999 и К1т е! а1. 2000). В равновесной системе Ь + К θ ЬК, где Ь представляет ГО-18, а К представляет ГО18ВР, применимы следующие уравнения:
К6=[ЬК]/[Ьсвоб][Ксвоб]
Ьсвоб_Ьо6щ-Ьк
- 13 009125
Кс ВОБ Кобщ-ЕК
Посредством подставления: Ьобщ=64±17 пг/мл (средний уровень), К,бщ=2,15±0,15 нг/мл (среднее) и Кб=0,4 нМ, было найдено, что у здоровых субъектов приблизительно 51,2 пг/мл ГЬ-18 (около 80% от общего количества) находится в его свободной форме.
Уровни ΙΒ-18 и Ш-18ВРа у пациентов с сепсисом
Уровни ΙΒ-18 и Ш-18ВРа определяли в 192 пробах сывороток из 42 пациентов с сепсисом сразу же после госпитализации и во время госпитализации. Уровни как ГЬ-18, так и Ш-18ВРа были значимо более повышенными у пациентов с сепсисом по сравнению со здоровыми субъектами (фиг. 2А), и наблюдался широкий разброс величин (фиг. 2В). Кроме того, эти уровни были даже более высокими у этих пациентов в день госпитализации, показывая 22-кратное увеличение в уровне ΙΒ-18 по сравнению со здоровыми индивидуумами (1,5-0,4 нг/мл против 0,064-0,17 нг/мл) и 13-кратное увеличение в уровне Ш-НВРа (28,64,5 против 2,15-0,15 нг/мл, фиг. 2А). Не смогли наблюдать статистически значимой корреляции между уровнями креатинина и концентрациями либо ΙΒ-18, либо Ш-ВВРа в этих сыворотках (оцениваемой при помощи оценки АРАСНЕ ΙΙ Кпаик е! а1. (1993), что предполагает, что повышенные уровни ΙΒ-18 и ΙΕ18ВРа у этих пациентов не были обусловлены почечной недостаточностью.
Поскольку уровни ΙΒ-18 и Ш-ВВРа в сыворотке пациентов с сепсисом значительно варьировали (фиг. 2В), рассчитывали уровни свободного ΙΒ-18 в сыворотке в индивидуальных пробах. Эти расчеты производили, как описано ранее, с использованием тех же самых трех уравнений и подставлением в них величин Кб, Ьобщ, К.. · полученных экспериментально. Эти расчеты показывают, что В-ВВРа уменьшал уровень свободного ΙΒ-18 у большинства пациентов (фиг. 3). Примечательно, что этот эффект был особенно сильным, когда общий ΙΒ-18 был очень высоким. Например, у двух пациентов сывороточный ΙΕ18 достигал величины 0,5 нМ (10 нг/мл), 150-кратного увеличения по сравнению со здоровыми индивидуумами. Однако с учетом связывания с циркулирующим В-ВВРа (27 нг/мл и 41,2 нг/мл) уровень свободного ΙΒ-18 у этих двух пациентов падал на 78 и 84% соответственно (фиг. 3). Таким образом, большая часть сывороточного ΙΒ-18 блокируется циркулирующим в кровотоке В-В В Ра. И все-таки, согласно этим расчетам, оставшийся свободный ΙΒ-18 является все еще более высоким, чем ΙΒ-18, обнаруживаемый у здоровых индивидуумов. Таким образом, ожидается, что введение экзогенного ^-^ВРа пациентам с сепсисом дополнительно понижает уровень свободного циркулирующего в кровотоке ΙΒ-18, вызывая ослабление исхода заболевания.
Пример 2.
Действие Ш-НВРа на 8. ер1бегт1б1к-индуцированное продуцирование ΙΕΝ-γ в клетках, присутствующих в пробах цельной крови из здоровых субъектов
Как упоминалось в разделе предпосылок изобретения, известно, что грамположительная бактерия 81ар11у1ососсик ер1бегт1б1к вызывает сепсис. Происходит индукция цитокинов, например, ΙΕ-1, ΙΕΝ-γ и ΤΝΕ-α, которые являются ключевыми медиаторами для этой патологии. Поскольку ΙΒ-18 является коиндуктором ΙΕΝ-γ, испытывали действие его ингибирования на индукцию ΙΕΝ-γ 8!арйу1ососсик ер1бегт1б1к. ΙΕ-ВВРа, используемый в качестве ингибитора ΙΒ-18, был рекомбинантным меченым гистидином вариантом, продуцируемым в клетках СНО.
0,5 мл крови смешивали в круглодонных полипропиленовых пробирках 12x75 мм на 5 мл ^акоп, Вес!оп Рккшкоп ЬаЬтеате, Вгапккп Ьакек, ΝΣ) с 0,5 мл среды для выращивания ΡΕΜΙ (Се11дго Меб1а!есД Непбоп, УА, дополненной 10 мМ Ь-глутамином, 100 Е/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 10% ФТС [С1Ьсо ВКЬ, Сгапб Ыапб, ΝΥ]), содержащей 8. ер1бегт1б1к (из АТСС) с к^ВР или без ΙΕ18ВР. Пробы инкубировали при 37°С (5% СО2) в течение 48 ч с последующей обработкой Тритоном Х100 (В1о-Каб ЕаЬота!от1ек, Ккйтопб, СА) при конечной концентрации 5% для лизиса клеток, присутствующих в пробе цельной крови. Пробирки, содержащие эти пробы, перевертывали несколько раз, пока проба крови не приобретала прозрачный вид. Концентрацию ΙΕΝ-γ в этих лизированных пробах крови, которая представляла как внутриклеточный, так и секретированный цитокин, измеряли электрохемилюминесценцией (ЕСЬ), как описано РотегаШ/ е! а1. (2001).
Для этого исследования использовали цельную кровь здоровых некурящих добровольцев. Кровь брали венопункцией и хранили в гепаринизированных пробирках. 8. ер1бегт1б1к размножали в инфузионном бульоне для головного мозга-сердца в течение 24 ч, промывали в апирогенном солевом растворе и кипятили, как описано Ашта е! а1. (1993). Концентрацию убитых нагреванием бактерий доводили до 10 бактериальных клеток на один лейкоцит (^ВС).
Результаты, приведенные на фиг. 4, показывают, что ^-^ВРа способен ингибировать индукцию ΙΕΝ-γ 8. ер1бегт1б1к.
Поскольку известно, что ΙΕΝ-γ костимулируется ΙΒ-18 и ΙΕ-12, исследовали действие комбинации Ш-ВВРа и специфических антител против ΙΕ-12 (тАЬ против ΙΕ-12 человека 11.5.14. Ргерго!есД Коску Н111, ΝΥ) на индукцию ΙΕΝ-γ, вызываемую 8. ер1бегт1б1к. Эту индукцию тестировали в присутствии 125 нг/мл В-ВВРа (меченого гистидином ^-^ВРа, продуцируемого в клетках СО8 и очищенного на !а1опколонке, как описано ΝονχΚ е! а1. 1999) и 2,5 мкг/мл антитела, специфического в отношении ΙΕ-12 человека. Результаты, показанные на фиг. 5, предполагают, что специфические антитела против ΙΕ-12 стиму
- 14 009125 лируют ингибиторное действие 1Ь-18ВРа на индукцию ΙΕΝ-γ 8. ер1бегт1б18.
Пример 3.
Разработка 1Ь-18ВР-специфического теста ЕЫ8Л
ЕБ18А содержал два антитела против 1Ь-18ВРа: мышиное моноклональное антитело тАЬ 582.10, субклон тАЬ 582, описанный в примере 4, в качестве захватывающего антитела и кроличье поликлональное антитело для детектирования (пример 4). Микротитрационные 96-луночные планшеты ЕБ18А (МахкоГЬ; Νιιπο А/8, Коккббе, Иеишагк) покрывали анти-1Ь-18ВРа тАЬ № 582.10 (субклоном тАЬ 582, 4 мкг/мл в ФСБ) в течение ночи при 4°С. Эти планшеты промывали ФСБ, содержащим 0,05% Твин 20 (промывочным раствором), и блокировали (2 ч, 37°С) исходным раствором БСА (КРЬ, СеййегкЬигд, ΜΌ), разведенным 1:10 в воде. Исходный раствор БСА разводили 1:15 в воде (разбавитель) для разведения всех испытываемых проб и детектирующего антитела. Пробы сыворотки разводили по меньшей мере 1:5 в этом разбавителе, и аликвоты по 100 мкл добавляли в лунки. Высокоочищенный г1Ь-18ВРа (полученный в клетках СНО и очищенный иммуноаффинно с использованием белок С-очищенного моноклонального антитела тАЬ № 430, специфического в отношении 1Б-18ВР, показанного в табл. 1 примера 4) разводили посредством 7 серийных 2-кратных разведений (4-0,062 нг/мл) и добавляли в каждый планшет ЕЫ8А для получения стандартной кривой. Эти планшеты инкубировали в течение 2 ч при 37°С и промывали 3 раза промывочным раствором. Добавляли кроличью анти-1Ь-18ВРа-сыворотку (1:5000 в разбавителе, 100 мкл на лунку) и планшеты дополнительно инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Планшеты промывали 3 раза, добавляли конъюгат козьи анти-кроличьи антитела-пероксидаза хрена (НКР, 1аск§ои 1ттипоИе5еагс11 ЬаЬк, 1:10000 в ФСБ, 100 пл на лунку), и планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Эти планшеты промывали 3 раза и проявляли добавлением субстрата для пероксидазы ОРИ (офенилендиаминдигидрохлоридные таблетки, 81дта) и выдерживали в течение 30 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали 3 н. НС1 (100 мкл), и оптическую плотность при 492 нм определяли ЕЫ8А-ридером. ОИ представляли в виде графика как функцию концентрации 1Ь-18Вра, и наблюдали линейный характер кривой в диапазоне 0,12-2,00 нг/мл 1Ь-18ВРа (фиг. 6).
Стандартная кривая 1Ь-18ВРа в отсутствие сыворотки или в присутствии до 20% сыворотки человека оставалась одной и той же. Поскольку 1Ь-18ВРа связывает 1Б-18 с очень высокой аффинностью, было необходимо определить, различает ли анализ ЕЫ8А между свободным и связанным 1Ь-18ВРа. Было обнаружено, что ΙΠ-18 мешает ЕЫ8А ГБ-18, однако это вмешательство в анализ является незначимым в пробах сыворотки. У 90% пациентов с сепсисом уровни ΙΠ-18 в сыворотке были ниже 4 нг/мл (см. ниже). Такие пробы сыворотки имели повышенный 1Ь-18ВРа, так что требовалось разведение их в 5-20 раз перед измерением 1Ь-18ВРа. При таких разведениях помехи 1Б-18 были менее 10% (фиг. 7). Другие родственные цитокины, в том числе про-ГБ-18, используемый при 10-кратном молярном избытке относительно 1Ь-18ВРа, а также 200-кратный избыток зрелого ΙΠ-1 β, не мешали в этом анализе.
Наиболее представленной изоформой 1Б-18ВР человека является 1Ь-18ВРа, тогда как изоформы Ь, с и б являются минорными сплайсинговыми вариантами (№\зск е! а1. 1999 и К1т е! а1. 2000). 1Ь-18ВРа проявляет наивысшую аффинность в отношении ΙΠ-18 (К1т е! а1. 2000). Аффинность 1Ь-18ВРс в отношении ΙΠ-18 является в 10 раз более низкой, тогда как изоформы Ь и б не связывают или не нейтрализуют ΙΕ-18. Таким образом, было важным определить перекрестную реактивность ГБ-18ВРа в ЕЫ8А с другими изоформами ГО-18ВР. Как показано на фиг. 8, [И-18ВРС человека генерировал в 10 раз более низкий сигнал в расчете на вес по сравнению с ГБ-18ВРа человека, тогда как изоформы ГБ-18ВР человека Ь и б давали незначимый сигнал в этом анализе ЕЫ8А.
Пример 4.
Получение специфических анти-ГБ-^ВР -антител
Кролика инъецировали НБ-^ВРа-Нкб для генерирования поликлональных антител.
Для получения моноклональных антител самок мышей Ва1Ь/С инъецировали 5 раз 10 мкг рекомбинантного меченого гистидином ГБ-18ВРа (НБ-^ВРа-Нкб). Мыши, проявляющей наивысший титр, определяемый обращенным радиоиммуноанализом (ΣΚΙΆ, пример 5) или твердофазным ША (5К[А. пример 5), вводили конечную бустер-инъекцию внутрибрюшинно за 4 или за 3 дня перед слиянием. Лимфоциты получали из селезенки, и выполняли слияние с миеломными клетками Ν8Ο/1. Гибридомы, которые, как было обнаружено, продуцируют антитела к ГБ-18ВРа, субклонировали способом лимитирующего разведения. Полученные клоны анализировали при помощи ГКЕА (пример 5). Репрезентативные гибридомы показаны в табл. 1.
- 15 009125
Таблица 1
Репрезентативные гибридомы, продуцирующие анти-Ш-18Вра
№ тАЬ ΙΚΙΑι (имп/мин) зК1А2 (имп/мин)
148 23912 7941
297 1652 6483
369 316 12762
430 6887 3254
433 1009 15300
460 3199 4326
485 400 13010
582 15000 17897
601 1046 1928
1 Планшеты, покрытые козьими антимышиными антителами, и гибридомы, детектируемые 1251-Ш18ВРа.
2 Планшеты, покрытые Ш-18ВР мочи, и гибридомы, детектируемые козьими антимышиными 1251- антителами.
Гибридомы, секретирующие антитела, направленные против гистидиновой метки, выбрасывали. Антитела дополнительно характеризовали при помощи δΒΙΑ по их способности узнавать природно встречающийся Ш-18ВР (очищенный из мочи).
Характеристики связывания нескольких положительных гибридом показаны в табл. 1. Гибридомы № 148, 430, 460 и 582 были положительными с обоими Ш-18ВР, рекомбинантым и выделенным из мочи Ш-18ВР. Получали антитела, пригодные для Вестерн-блоттинга, иммунопреципитации, иммуноаффинной очистки и для разработки специфических ЕЬ18Л. Положительные клоны, продуцирующие специфические антитела против Ш-18ВР, инъецировали в мышей Ва1Ъ/С, предварительно праймированных пристаном (2,6,10,14-тетраметилпентадеканом), для получения асцитов. Изотипы этих антител определяли с использованием ЕЫ8Л с антителом против мышиного ΙΑ'ι (Лшег8Йаш-Рйагшас1а Вю1есй). Для сборки Ш-18ВР-специфического ЕЫ8Л (пример 3) использовали шЛЪ 582, которое было высокореактивным с рекомбинантным и природным Ш-18ВР (табл. 1).
Антитела испытывали при помощи δΒΙΑ в присутствии Ш-18 (пример 5) на их способность узнавать комплекс Ш-18ВРа с Ш-18. Большинство антител не были способны узнавать Ш-18ВР, когда он был в комплексе с Ш-18. Таким образом, эти антитела, по-видимому, направлены против лигандсвязывающего домена Ш-18ВРа.
Пример 5.
Радиоиммуноанализы для детектирования продуцирующих антитело против Ш-18ВР клеточных клонов Обращенный радиоиммуноанализ (ΙΒΙΆ)
Микротитрационные планшеты из РУС (Оупа1есК БаЪогаЮпез, Л1ехапбпа, УЛ) покрывали в течение ночи при 4°С аффинно очищенными козьими антимышиными Р(аЪ')2-антителами (10 мкг/мл, 100 мкл на лунку; Даскзоп 1шшипоВе8еагсй БаШ). Затем планшеты промывали дважды ФСБ, содержащим 0,05% Твин 20 (промывочным раствором), и блокировали БСА (0,5% в промывочном растворе) в течение 2 ч при 37°С. Добавляли культуральные супернатанты гибридом (100 мкл на лунку), и планшеты инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали три раза, в каждую лунку добавляли 1251-гШ-18ВРа-Н18б (105 имп/мин в 100 мкл), и планшеты инкубировали в течение 5 ч при 22°С.
Затем планшеты промывали три раза, и отдельные лунки считали в гамма-счетчике. Гибридомы, генерирующие супернатанты, которые проявляли связанную радиоактивность при уровнях, в 5 раз более высоких, чем отрицательный контроль, рассматривались как положительные.
Твердофазный ΒΙΑ (δΒΙΆ) гШ-18ВРа (5 мкг/мл) использовали в качестве захватываемого антигена и козьи антимышиные 125Ιантитела (100 мкл, 105 имп/мин) использовали для детектирования.
Блокирование и промывки выполняли, как описано выше. Положительные клоны дополнительно подвергали скринингу при помощи δΒΙΑ на их способность узнавать Ш-18ВР, выделенный из концентрированной мочи человека (Иоу1ск е! а1. 1999). Микротитрационные планшеты покрывали Ш-18ВР мочи (1 мкг/мл), аффинно очищенным при помощи лиганда, блокировали и промывали, как описано выше. Супернатанты гибридом (100 мкл) добавляли, и детектирование выполняли с использованием козьих антимышиных ^Э-антител (105 имп/мин в 100 мкл).
δΒΙΑ для антител, специфических в отношении лигандсвязывающего сайта Ш-18ВР
Микротитрационные планшеты покрывали либо выделенным из мочи Ш-18ВР (0,5 мкг/мл), либо гШ-18ВРа (5 мкг/мл), блокировали и промывали, как в δΒΙΑ. Добавляли рекомбинантный Ш-18 человека (50 мкл) до конечной концентрации 1,5 мкг/мл (15 мин при комнатной температуре) с последующим добавлением супернатантов гибридом (50 мкл). Детектирование выполняли с использованием козьих анти
- 16 009125 мышиных 'Э-антител (105 имп/мин в 100 мкл, 2 ч при комнатной температуре).
Пример 6.
Содержание миокардиального ΙΠ-18 после БР8
Предполагалось, что ΤΝΕα и ΙΠ-1β участвуют в дисфункции сердца во время сепсиса. Поскольку ΙΠ-18 является провоспалительным цитокином, который, как известно, опосредует продуцирование ΤΝΕα и ΙΠ-1 β, исследовали концентрацию ΙΠ-18 при ЬР8-индуцированной дисфункции сердца.
Мышей обрабатывали либо носителем (физиологическим раствором), либо ЬР8. Сердца собирали через 2, 4 и 6 ч после введения ЬР8 и гомогенизировали для определения содержания миокардиального ΙΠ-18 при помощи ЕЫ8Л (с набором, купленным в К&Б 8ук!етк (М1ипеароЕк ΜΝ)). Результаты на фиг. 9 показывают двухкратное увеличение содержания ΙΠ-18 в миокарде через 4 ч после введения ЬР8, что указывает на то, что ΙΠ-18 участвует в дисфункции сердца во время сепсиса.
Пример 7.
Эффект нейтрализации ΙΠ-18 на ЬР8-индуцированную дисфункцию миокарда
В предыдущем примере было обнаружено увеличение содержания ΙΠ-18 при дисфункции сердца, индуцированной ЬР8. Таким образом, оценивали эффект нейтрализации ΙΠ-18 на ЬР8-индуцированную дисфункцию миокарда.
Функцию миокарда определяли изоволюметрическим, нерециркулирующим способом Лангендорфа, описанным ранее (Мепд е! а1. 1998). Выделенные сердца перфузировали нормотермическим раствором Кребса-Хензелайта, содержащим 11,0 ммоль/л глюкозы, 1,2 ммоль/л СаС12, 4,7 ммоль/л КС1, 25 ммоль/л NаНСΟ3, 119 ммоль/л №С1, 1,17 ммоль/л Мд8О4 и 1,18 ммоль/л КН2РО4. Баллонный катетер из латекса вставляли в левый желудочек через левое предсердие и наполняли водой для получения конечного диастолического давления левого желудочка (БУЕБР) 10 мм рт.ст. Задающие ритм проволоки подсоединяли к правому предсердию, и сердца электростимулировали при 300 сокращениях в минуту. Коронарный кровоток определяли количественно сбором эффлюента из легочных артерий. Температуру миокарда поддерживали при 37°С. Развившееся давление в левом желудочке (БУБР), его первые производные (+йР/й!, -йР/й!) и конечное диастолическое давление в левом желудочке (БУЕБР) непрерывно регистрировали компьютеризованным чувствительным к давлению усилителем-дигитайзером (Мас1аЬ 8, АБ Iηкΐ^итеη!, Сиретйпо, СА). После 20-минутного периода уравновешивания определяли БУБР и +/йР/й! при варьирующихся уровнях БУЕБР левого желудочка (10, 15 и 20 мм рт.ст.)
После введения БР8 развившееся давление левого желудочка (БУБР) уменьшалось на 38% по сравнению с контролями (физиологическим раствором) (36,3 +/- 1,9 мм рт.ст. против 59,1 +/- мм рт.ст., Р<0,001, фиг. 10). Предобработка мышей за 30 мин до введения БР8 нормальной сывороткой кроликов (ΝΚ8) имела минимальное влияние на БР8-индуцированную дисфункцию сердца; однако, предобработка нейтрализующим ΙΠ-18 антителом прекращала дисфункцию (фиг. 10). Коронарный кровоток не различался между этими группами (не показано).
Эти результаты показывают, что нейтрализация ΙΠ-18 защищает против БР8-индуцированной дисфункции миокарда.

Claims (32)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Применение ингибитора К-18 для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения заболеваний, характерных для синдрома системной воспалительной реакции (8ГК8), выбранных из сепсиса, тяжелого сепсиса и септического шока.
  2. 2. Применение по п.1, согласно которому лекарственное средство предназначено для лечения и/или предупреждения связанной с сепсисом дисфункции сердца.
  3. 3. Применение по любому из пп.1 и 2, согласно которому ингибитор ГБ-18 выбиран из ингибиторов каспазы-1 (1СЕ), антител против ГБ-18, антител против любой из субъединиц рецептора ГБ-18, ингибиторов пути передачи сигнала с участием ГБ-18, антагонистов ГБ-18, которые конкурируют с ГБ-18 и блокируют ГБ-18-рецептор, ингибиторов продукции ГБ-18 и ГБ-18-связывающих белков, их изоформ, мутеинов, слитых белков, функциональных производных, активных фракций или циклических пермутированных производных, имеющих, по существу, ту же активность, что и ГБ-18-связывающий белок.
  4. 4. Применение по п.3, согласно которому ингибитор ГБ-18 является ГБ-18-связывающим белком или его изоформой, мутеином, слитым белком, функциональным производным, активной фракцией или циклическим пермутированным производным.
  5. 5. Применение по п.4, согласно которому ГБ-18-связывающий белок является ПЭГконъюгированным.
  6. 6. Применение по любому из пп.3-5, согласно которому слитый белок содержит Гд.
  7. 7. Применение по п.3, согласно которому ингибитор ГБ-18 является специфическим антителом против ГБ-18, выбранным из химерного, гуманизированного или человеческого антител.
  8. 8. Применение по любому из предыдущих пунктов, согласно которому лекарственное средство дополнительно содержит ингибитор ГБ-12 для одновременного, последовательного или отдельного введения.
  9. 9. Применение по п.8, согласно которому ингибитор ГБ-12 является нейтрализующим антителом.
  10. 10. Применение по любому из пп.1-9, согласно которому лекарственное средство дополнительно содержит интерферон для одновременного, последовательного или отдельного введения.
  11. 11. Применение по п.10, согласно которому интерферон является интерфероном-β.
  12. 12. Применение по п.10, согласно которому интерферон является интерфероном-α.
  13. 13. Применение по любому из предыдущих пунктов, где лекарственное средство дополнительно содержит ингибитор цитокина, выбранного из фактора некроза опухоли (ΤΝΡ), ГБ-1 и ГБ-8, для одновременного, последовательного или отдельного введения.
  14. 14. Применение по п.13, согласно которому ингибитор ΤΝΡ является растворимой частью ΤΝΡΚΓ или БИРКИ.
  15. 15. Применение по п.13, согласно которому ингибитор ГБ-1 является антагонистом рецептора ГБ-1.
  16. 16. Применение экспрессирующего вектора, содержащего кодирующую последовательность ингибитора ГБ-18, выбранного из ингибиторов каспазы-1 (ГСЕ), антител против ГБ-18, антител против любой из субъединиц рецептора ГБ-18, ингибиторов пути передачи сигнала с участием ГБ-18, антагонистов ГБ18, которые конкурируют с ГБ-18 и блокируют ГБ-18-рецептор, ингибиторов продуцирования ГБ-18 и ГБ18-связывающих белков, их изоформ, мутеинов, слитых белков или циклических пермутированных производных, имеющих, по существу, ту же активность, что и ГБ-18-связывающий белок, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения сепсиса.
  17. 17. Применение по п.16 для генотерапии сепсиса.
  18. 18. Применение вектора, индуцирующего и/или усиливающего эндогенную продукцию ингибитора ГБ-18 в клетке для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения сепсиса.
  19. 19. Применение клетки, которая была генетически модифицирована с тем, чтобы продуцировать ингибитор ГБ-18, для приготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения сепсиса.
  20. 20. Способ лечения и/или предупреждения заболеваний, характерных для синдрома системной воспалительной реакции (8ГК8), выбранных из сепсиса, тяжелого сепсиса и септического шока, предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически эффективного количества ингибитора ГБ-18.
  21. 21. Способ по п.20, согласно которому ингибитор ГБ-18 выбран из ингибиторов каспазы-1 (ГСЕ), антител против ГБ-18, антител против любой из субъединиц рецептора ГБ-18, ингибиторов пути передачи сигнала с участием ГБ-18, антагонистов ГБ-18, которые конкурируют с ГБ-18 и блокируют ГБ-18рецептор, ингибиторов продукции ГБ-18 и ГБ-18-связывающих белков, их изоформ, мутеинов, слитых белков, функциональных производных, активных фракций или циклических пермутированных производных, имеющих, по существу, ту же самую активность, что и ГБ-18-связывающий белок.
  22. 22. Способ по п.21, дополнительно предусматривающий введение субъекту терапевтически эффективного количества ингибитора ГБ-12.
  23. 23. Способ по любому из пп.21 и 22, дополнительно предусматривающий введение субъекту ингибитора цитокина, выбранного из группы, состоящей из ингибитора фактора некроза опухоли (ΤΝΡ), ин
    - 20 009125 гибитора Ш-1 и ингибитора 1Ь-8.
  24. 24. Способ по п.23, согласно которому ингибитор ΤΝΕ является растворимой частью ΤΝΕΚΙ или ΤΝΕΚΙΙ.
  25. 25. Способ по п.23, согласно которому ингибитор Ш-1 является антагонистом рецептора 1Ь-1.
  26. 26. Способ по любому из пп.20-25, дополнительно предусматривающий введение субъекту интерферона.
  27. 27. Способ по п.26, согласно которому интерферон является интерфероном-α.
  28. 28. Способ по п.26, согласно которому интерферон является интерфероном-β.
  29. 29. Способ лечения и/или предупреждения, характерных для синдрома системной воспалительной реакции (8ΙΚ8), выбранных из сепсиса, тяжелого сепсиса и септического шока, предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически эффективного количества экспрессирующего вектора, содержащего кодирующую последовательность ингибитора Ш-18, выбранного из группы, состоящей из ингибиторов каспазы-1 (1СЕ), антител против Ш-18, антител против любой из субъединиц рецептора Ш-18, ингибиторов пути передачи сигнала с участием Ш-18, антагонистов Ш-18, которые конкурируют с Ш-18 и блокируют 1Ь-18-рецептор, ингибиторов продуцирования Ш-18 и Ш-18-связывающих белков, их изоформ, мутеинов, слитых белков или циклических пермутированных производных, и фармацевтически приемлемого носителя.
  30. 30. Способ лечения и/или предупреждения заболеваний, характерных для синдрома системной воспалительной реакции (8ΙΚ8), выбранных из сепсиса, тяжелого сепсиса и септического шока, предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически эффективного количества вектора, индуцирующего и/или усиливающего эндогенную продукцию ингибитора Ш-18 в клетке, и фармацевтически приемлемого носителя.
  31. 31. Способ лечения и/или предупреждения заболеваний, характерных для синдрома системной воспалительной реакции (8ΙΚ8), выбранных из сепсиса, тяжелого сепсиса и септического шока, предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, клетки, которая была генетически модифицирована для продуцирования ингибитора Ш-18, и фармацевтически приемлемого носителя.
  32. 32. Способ по любому из пп.20-31 для лечения и/или предупреждения связанной с сепсисом дисфункции сердца.
EA200301248A 2001-05-16 2002-05-16 Применение ингибиторов il-18 для лечения и/или предупреждения заболеваний, характерных для синдрома системной воспалительной реакции EA009125B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US29146301P 2001-05-16 2001-05-16
PCT/US2002/015556 WO2002092008A2 (en) 2001-05-16 2002-05-16 Use of il-18 inhibitors for the treatement or prevention of sepsis

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200301248A1 EA200301248A1 (ru) 2005-06-30
EA009125B1 true EA009125B1 (ru) 2007-10-26

Family

ID=23120395

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200301248A EA009125B1 (ru) 2001-05-16 2002-05-16 Применение ингибиторов il-18 для лечения и/или предупреждения заболеваний, характерных для синдрома системной воспалительной реакции

Country Status (20)

Country Link
US (1) US20030008822A1 (ru)
EP (1) EP1425028B1 (ru)
JP (1) JP4502580B2 (ru)
KR (1) KR100877033B1 (ru)
CN (1) CN100556450C (ru)
AT (1) ATE451930T1 (ru)
BR (1) BR0210904A (ru)
CA (1) CA2446942C (ru)
CY (1) CY1109713T1 (ru)
DE (1) DE60234778D1 (ru)
DK (1) DK1425028T3 (ru)
EA (1) EA009125B1 (ru)
ES (1) ES2334773T3 (ru)
HK (1) HK1066723A1 (ru)
IL (2) IL158866A0 (ru)
MX (1) MXPA03010575A (ru)
PT (1) PT1425028E (ru)
SI (1) SI1425028T1 (ru)
UA (1) UA85531C2 (ru)
WO (1) WO2002092008A2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012027723A1 (en) 2010-08-27 2012-03-01 Stem Centrx, Inc Notum protein modulators and methods of use

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002031115A2 (en) 2000-10-11 2002-04-18 Viron Therapeutics, Inc. Nucleic acid molecules and polypeptides for immune modulation
US7718368B2 (en) 2000-12-04 2010-05-18 Viron Therapeutics Inc. Immunomodulatory protein and useful embodiments thereof
CA2524403C (en) 2003-05-13 2013-07-09 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Active variants of the il-18 binding protein and medical uses thereof
EP1628530B8 (en) 2003-05-15 2012-08-01 Genentech, Inc. Methods and compositions for the prevention and treatment of sepsis
US7482376B2 (en) * 2003-07-03 2009-01-27 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Conjugated complement cascade inhibitors
US7968684B2 (en) 2003-11-12 2011-06-28 Abbott Laboratories IL-18 binding proteins
CA2566877A1 (en) * 2004-05-17 2005-11-24 Keio University Medicinal composition and therapeutic method
FI116804B (fi) * 2004-05-18 2006-02-28 Ekspansio Engineering Ltd Oy Materiaalikappaleiden eri suuntiin osoittavien pintojen optinen tarkastus
CA2609060C (en) 2005-06-03 2014-07-15 Urs Weber Production of recombinant il-18 binding protein
PT1891088E (pt) 2005-06-10 2011-12-19 Ares Trading Sa Processo para a purificação da proteína de ligação il-18
CA2681828A1 (en) * 2007-03-28 2008-10-09 Universidad De Barcelona Cd6 products for the treatment of sepsis
CL2008002153A1 (es) 2007-07-24 2009-06-05 Amgen Inc Anticuerpo aislado o fragmanto de unión de antigeno del mismo que se une al receptor de il-18 (il-18r); molecula de ácido nucleico codificante; celula huesped que la comprende; composición farmaceutica; uso médico para tratar o prevenir una condición asociada con il-18r; método in vitro para inhibir la unión de il-18 al il-18r.
KR101451357B1 (ko) * 2011-02-18 2014-10-15 주식회사 스템디알 Ｓｉｒｔ１ 발현 유도 물질을 포함하는 패혈증 또는 패혈증 쇼크의 예방 또는 치료용 조성물
CN115927242A (zh) 2012-05-11 2023-04-07 珍白斯凯尔有限公司 具有抗炎活性的肽及其在制备抗炎组合物中的应用
JP6267190B2 (ja) 2012-05-11 2018-01-24 ジェムバックス アンド カエル カンパニー，リミティド 悪液質の予防用または治療用組成物
KR101799904B1 (ko) 2012-07-11 2017-11-22 주식회사 젬백스앤카엘 세포 투과성 펩티드, 그를 포함한 컨쥬게이트 및 그를 포함한 조성물
US9907838B2 (en) 2013-04-19 2018-03-06 Gemvax & Kael Co., Ltd. Composition and methods for treating ischemic damage
RU2677277C2 (ru) 2013-06-07 2019-01-16 Джемвакс Энд Каэл Ко., Лтд. Биологические маркеры, которые могут быть использованы в иммунотерапии рака
EP3011967B1 (en) 2013-06-21 2020-06-17 Gemvax & Kael Co., Ltd. Hormone secretion regulator, composition containing same, and method for controlling hormone secretion using same
SG11201601717VA (en) * 2013-09-05 2016-04-28 Ab2 Bio Sa Il-18 binding protein (il-18bp) in inflammatory diseases
CN105899224B (zh) 2013-10-23 2019-12-13 珍白斯凯尔有限公司 用于治疗和预防良性前列腺增生的组合物
KR102359396B1 (ko) 2013-11-22 2022-02-08 주식회사 젬백스앤카엘 혈관 신생 억제 활성을 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물
WO2015093854A1 (ko) 2013-12-17 2015-06-25 주식회사 카엘젬백스 전립선 암 치료용 조성물
GB201400997D0 (en) * 2014-01-21 2014-03-05 Vib Vzw Targeting of interleukin-1 and -18 in treatment of septic shock
WO2015156649A1 (ko) 2014-04-11 2015-10-15 주식회사 젬백스앤카엘 섬유증 억제 활성을 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물
WO2015167067A1 (ko) 2014-04-30 2015-11-05 주식회사 카엘젬백스 장기, 조직 또는 세포 이식용 조성물, 키트 및 이식 방법
KR102413243B1 (ko) 2014-12-23 2022-06-27 주식회사 젬백스앤카엘 안질환 치료 펩티드 및 이를 포함하는 안질환 치료용 조성물
KR102636129B1 (ko) 2015-02-27 2024-02-14 주식회사 젬백스앤카엘 청력 손상 방어용 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물
WO2016139297A1 (en) 2015-03-05 2016-09-09 Ab2 Bio Sa Il-18 binding protein (il-18bp) and antibodies in inflammatory diseases
ES2886946T3 (es) 2015-07-02 2021-12-21 Gemvax & Kael Co Ltd Péptido con efecto antiviral y composición que lo contiene
CN109328068A (zh) 2016-04-07 2019-02-12 珍白斯凯尔有限公司 具有增加端粒酶活性和延长端粒的效果的肽以及包含该肽的组合物
JP2019535834A (ja) 2016-11-18 2019-12-12 ユニベルシタ デ バルセロナ 感染症及び関連炎症プロセスの処置のためのｃｄ６及びイミペネムの併用療法
CN107715105B (zh) * 2017-10-26 2020-11-24 重庆医科大学 Il-34在制备治疗或预防脓毒症药物中的应用
CN109954131B (zh) * 2017-12-14 2023-05-02 深圳市中科艾深医药有限公司 一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体拮抗剂作为脓毒血症治疗药物的应用
CN111012899A (zh) * 2020-01-08 2020-04-17 重庆医科大学 Il-38的新用途
WO2024148232A2 (en) 2023-01-06 2024-07-11 Alector Llc Anti-il18 binding protein antibodies and methods of use thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6054487A (en) * 1997-03-18 2000-04-25 Basf Aktiengesellschaft Methods and compositions for modulating responsiveness to corticosteroids
US6083981A (en) * 1996-10-11 2000-07-04 Warner-Lambert Company Sulfonamide substituted aspartic acid interleukin-1β converting enzyme inhibitors

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
WO1991008231A1 (en) * 1989-11-29 1991-06-13 Brigham And Women's Hospital [Ala IL-8]77 AS A LEUKOCYTE ADHESION INHIBITOR
US5536637A (en) * 1993-04-07 1996-07-16 Genetics Institute, Inc. Method of screening for cDNA encoding novel secreted mammalian proteins in yeast
PL336464A1 (en) * 1997-03-18 2000-06-19 Basf Ag Method of and compositions for modulating reactivity in respect to corticosteroids i
IL121860A0 (en) * 1997-08-14 1998-02-22 Yeda Res & Dev Interleukin-18 binding proteins their preparation and use
CA2276216A1 (en) * 1998-06-24 1999-12-24 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo An artificial peptide capable of neutralizing the biological activity of interleukin-18
KR101111103B1 (ko) * 2000-02-10 2012-02-13 아보트 러보러터리즈 사람 인터류킨-18에 결합하는 항체 및 이를 제조하고 사용하는 방법
KR20070057282A (ko) * 2000-02-21 2007-06-04 어플라이드 리서치 시스템스 에이알에스 홀딩 엔.브이. Ｉｌ-18 저해물질의 용도
AU2002224417A1 (en) * 2000-10-18 2002-04-29 Immunex Corporation Methods for treating il-18 mediated disorders

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6083981A (en) * 1996-10-11 2000-07-04 Warner-Lambert Company Sulfonamide substituted aspartic acid interleukin-1β converting enzyme inhibitors
US6054487A (en) * 1997-03-18 2000-04-25 Basf Aktiengesellschaft Methods and compositions for modulating responsiveness to corticosteroids

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012027723A1 (en) 2010-08-27 2012-03-01 Stem Centrx, Inc Notum protein modulators and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
IL158866A (en) 2011-01-31
WO2002092008A3 (en) 2004-04-08
KR100877033B1 (ko) 2009-01-07
PT1425028E (pt) 2010-01-06
KR20040045400A (ko) 2004-06-01
WO2002092008A2 (en) 2002-11-21
JP4502580B2 (ja) 2010-07-14
EP1425028A4 (en) 2006-03-01
UA85531C2 (ru) 2009-02-10
BR0210904A (pt) 2005-08-16
CY1109713T1 (el) 2014-08-13
CN100556450C (zh) 2009-11-04
HK1066723A1 (en) 2005-04-01
ATE451930T1 (de) 2010-01-15
EA200301248A1 (ru) 2005-06-30
IL158866A0 (en) 2004-05-12
JP2004531546A (ja) 2004-10-14
CN1529611A (zh) 2004-09-15
DE60234778D1 (de) 2010-01-28
DK1425028T3 (da) 2010-03-01
EP1425028B1 (en) 2009-12-16
SI1425028T1 (sl) 2010-02-26
CA2446942A1 (en) 2002-11-21
EP1425028A2 (en) 2004-06-09
MXPA03010575A (es) 2005-03-07
US20030008822A1 (en) 2003-01-09
ES2334773T3 (es) 2010-03-16
CA2446942C (en) 2010-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA009125B1 (ru) Применение ингибиторов il-18 для лечения и/или предупреждения заболеваний, характерных для синдрома системной воспалительной реакции
JP4523151B2 (ja) ケモカインペプチド類、その変異体、誘導体および類似体ならびに炎症応答を阻害または増大する方法へのそれらの使用
US8282925B2 (en) Method for treating rheumatoid arthritis using anti-S100A9 antibody
KR20110074898A (ko) 염증을 치료하는 방법
JP2005506947A (ja) 炎症反応を阻害又は増強するための組成物及び方法
US7704944B2 (en) Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use for the treatment of sepsis
US7696154B2 (en) Methods for treating interleukin-18 mediated disorders with interleukin-18 binding proteins
SK15562002A3 (sk) Použitie IL-18 inhibítora, použitie expresného vektora obsahujúceho sekvenciu kódujúcu IL-18 inhibítor, použitie vektora na indukciu a/alebo zosilnenie endogénnej produkcie IL-18 inhibítora v bunke a použitie bunky s produkciou IL-18 inhibítora
KR100584704B1 (ko) 면역 질환을 치료하기 위한 치료제로서의 가용성 림포톡신-베타 수용체, 항림포톡신 수용체 항체 및 항림포톡신 리간드 항체
US7304040B2 (en) Suppression of post-transplant arteriosclerosis
BG66483B1 (bg) Използване на инхибитори на интерлевкин -18 за лечение и/или профилактика на сърдечни заболявания
BG107685A (bg) Хемокинови мутанти за лечение на мултиплена склероза
JPH11501283A (ja) Ｉ型インターフェロンに対する中和活性を有する、インターフェロンレセプターに対するモノクローナル抗体を含んでなる医薬組成物
US7510715B2 (en) Protozoan derived compositions and methods of use thereof
AU2002309887B2 (en) Use of IL-18 inhibitors for the treatment or prevention of sepsis
US6306824B1 (en) Uses of lipopolysaccharide binding protein
AU2002309887A1 (en) Use of IL-18 inhibitors for the treatment or prevention of sepsis

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY