ES2298106T3 - Proteinas de fusion que comprenden dos moleculas gp130 solubles. - Google Patents
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Abstract
Composición farmacéutica que contiene una molécula de fusión que comprende dos moléculas gp130 solubles.
Description
Proteínas de fusión que comprenden dos moléculas
gp130 solubles.
La presente invención se refiere a una
composición farmacéutica que contiene una molécula de fusión que
comprende dos moléculas gp130 solubles (sgp13C). En particular, se
ha generado una proteína de fusión con Fc de gp130 soluble
(sgp130-Fc) y ha mostrado, en varios modelos de
cultivo celular así como con células de la lámina propia de
pacientes con enfermedad de Crohn, que bloquea específicamente las
respuestas de IL-6 dependientes de
IL-6R soluble, mientras que las respuestas por el
IL-6R unido a la membrana permanecen
inalteradas.
Adicionalmente, sgp130-Fc
también inhibió la proliferación inducida por el factor inhibidor de
leucemia (LIF) y la oncostatina M (OSM).
La citocina pleiotrópica,
interleucina-6 (IL-6), muestra un
amplio espectro de funciones biológicas entre las que la
estimulación de las células B y la inducción de la síntesis de
proteínas de fase aguda en el hígado son las más notables. La
IL-6 ejerce su actividad sobre las células diana
mediante la unión a un receptor de superficie específico de
IL-6 ("IL-6R" o "gp80").
Este complejo de receptor/ligando facilita la homodimerización de
gp130, la segunda subunidad del complejo del receptor de
IL-6.
La dimerización de gp130 da como resultado la
transducción de una señal de IL-6 (Taga et
al., 1997a). Las formas solubles del IL-6R
(sIL-6R) que se generan mediante dos mecanismos de
corte y empalme y eliminación alternativos también pueden
desencadenar la dimerización de gp130 y la señalización cuando forma
el complejo con IL-6 (Taga et al., 1997a así
como Rose-John et al., 1994)
Puesto que la parte citoplasmática del
IL-6R no contribuye a la transducción de señales
(Taga et al., 1989), la señalización mediante un homodímero
de gp130 puede inducirse por un complejo de IL-6 con
IL-6R soluble o unido a la membrana (Taga et
al., 1997b).
Sin embargo, la presencia de
sIL-6R conduce a la sensibilización de las células
que responden a IL-6 hacia el ligando, tal como se
describió anteriormente para las células de hepatoma humano HepG2
(Peters et al., 1996). Además, se ha demostrado que las
células de hibridoma dependientes estrictamente de
IL-6 no proliferan en respuesta a cantidades muy
bajas de IL-6 cuando el sIL-6R
presente en medios de cultivo se elimina continuamente (Galliard
et al., 1997).
La gp130, descrita inicialmente como el
transductor de señales de interleucina-6, es una
cadena transductora compartida por muchas citocinas, tales como
IL-6, IL-11, factor inhibidor de
leucemia (LIF), oncostatina M (OSM) y factor neurotrófico ciliar
(CNTF). Todas estas citocinas actúan mediante un complejo de
receptor bi o tripartito en el que se desencadena la señalización
mediante la homodimerización (para IL-6) o
heterodimerización con la proteína LIF-Rb/gp190
(para IL-11, LIF, OSM, y CNTF) de gp130. Por tanto
estas citocinas median actividades biológicas similares en diversos
tejidos.
Mientras que gp130 puede encontrarse en casi
todos los tipos de células, el IL-6R muestra una
expresión mucho más restringida. La liberación del
sIL-6R por un tipo de célula hace que otras células
que sólo expresan gp13C respondan a IL-6. Esta
situación se denomina transeñalización (Rose-John
et al., (1994). De hecho, se han descrito varias actividades
celulares que requieren el complejo de sIL-6R e
IL-6 y no se han observado con IL-6
sola.
La proteína gp130 soluble se encuentra en altas
concentraciones en el plasma humano (Narazaki et al.,
1993).
Recientemente se ha descrito la citocina de
diseño, hiper-IL-6
(H-IL-6), en la que el extremo
COOH-terminal de los IL-6R está
fusionado de manera covalente al extremo
NH_{3}-terminal de la IL-6 madura
mediante un ligador peptídico flexible. Tal como se observó con el
complejo de IL-6/sIL-6R,
H-IL-6 también actúa sobre las
células que sólo expresan gp130. A diferencia de los componentes
separados IL-6 y sIL-6R, una
concentración de 100 a 1000 veces inferior de esta molécula de
fusión es
\hbox{suficiente para inducir señales biológicas comparables (Fischer et al ., 1997).}
El documento WO 99/02552 describe proteínas
quiméricas construidas a partir de la fusión de la forma que se
produce de manera natural de sIL-6R e
IL-6, que son útiles en el tratamiento de trastornos
relacionados con IL-6.
Una realización del documento WO 95/113C3
describe proteínas heterodiméricas que comprenden el dominio
extracelular de un receptor de citocina, tal como el
sIL-6R o sCNTFR y el dominio extracelular de gp130.
Se ha notificado que tales heterodímeros son antagonistas eficaces
de IL-6 o CNTF, porque actuarían como trampas para
IL-6 o CNTF, haciendo así que la citocina sea
inaccesible para formar un complejo de transducción de señales con
las formas nativas unidas a la membrana de sus receptores. Las
patentes estadounidenses números 5.783.672 y 5.426.048 describen la
generación de proteínas receptoras heterodiméricas que comprenden
OSM-R\beta+gp130 y LIF-R+gp130,
respectivamente.
Las partes extracelulares de muchos receptores
de citocina tales como ambos receptores de TNF (Van Zee et
al., 1992) se han fusionado a la región constante de una cadena
pesada de inmunoglobulina (Fc). De ese modo se generan homodímeros
de receptor unidos con enlaces disulfuro que son similares a los
anticuerpos IgG. Tales proteínas de fusión se denominan proteínas
con Fc o inmunoadhesinas. Muestran una afinidad aumentada por sus
ligandos y una semivida en plasma aumentada en comparación con los
receptores solubles monoméricos (para revisión, Ashkenazi et
al., 1997). Además, se han descrito proteínas de fusión con Fc
biológicamente activas de IL-2,
IL-10, IL-15 e
IL-17. De manera similar a los anticuerpos, las
proteínas de fusión con Fc recombinantes secretadas pueden
purificarse a partir del medio de cultivo mediante una purificación
de una única etapa mediante proteína A o proteína
G-Sepharose.
El objetivo de la presente invención es
proporcionar una composición farmacéutica que contiene una molécula
de fusión que comprende dos moléculas gp130 solubles (sgp130). En
particular, se ha generado una proteína de fusión con Fc de gp130
soluble (sgp130-Fc) y se ha encontrado que se
expresa mucho en las células COS-7. Esta proteína
de fusión ha mostrado en varios modelos de cultivo celular así como
con células de la lámina propia de pacientes con enfermedad de
Crohn que bloquea específicamente las respuestas de
IL-6 dependientes de IL-6R soluble,
mientras que las respuestas mediante el IL-6R unido
a la membrana permanecen no afectadas. Adicionalmente,
sgp130-Fc también inhibió la proliferación inducida
por el factor inhibidor de leucemia (LIF) y la oncostatina M (OSM)
aunque a concentraciones aproximadamente 1000 veces superiores.
Las moléculas de fusión de la composición
farmacéutica de la presente invención pueden modificarse mediante
ingeniería genética usando métodos conocidos. Los dominios
utilizados pueden estar constituidos por el dominio extracelular
completo de gp130 o pueden estar constituidos por mutantes de
fragmentos del mismo que mantienen la capacidad para inhibir la
actividad del complejo agonista de
IL-6/sIL-6R.
La clonación y la expresión de gp130 humana se
han notificado en 1990 junto con su supuesto dominio extracelular
(Hibi et al., 1990).
Una variante de corte y empalme del ADNc que
codifica para una forma soluble de gp130 se ha encontrado expresada
en blastocitos (Sharkey et al., 1995). Tal variante carece de
dominio de señalización extracelular. Las moléculas de fusión según
la invención y que comprenden dos de tales variantes de sgp130 están
comprendidas en el alcance de la presente invención.
Las fusiones pueden ser directas (el extremo
C-terminal de una cadena polipeptídica está unida al
extremo N-terminal de la otra a través de un enlace
covalente sencillo) o pueden emplear un dominio de ligador flexible,
tal como la región bisagra de la IgG humana, o ligadores
polipeptídicos que consisten en aminoácidos pequeños tales como
glicina, serina, treonina o alanina, en diversas longitudes y
combinaciones. Adicionalmente, a las moléculas de fusión de la
invención se les puede añadir cola de
His-His-His-His-His-His
(His6), para permitir una rápida purificación mediante
cromatografía de quelación metálica, y/o con epítopos para los que
los anticuerpos están disponibles, para permitir la detección en
inmunotransferencias de tipo Western, inmunoprecipitación o bloqueo
de la depleción de actividad en ensayos biológicos.
En otra realización, la proteína de fusión de la
composición farmacéutica de la invención se prepara usando un
método similar, pero usando el dominio Fc de la IgG1 humana (Aruffo
et al., 1991). En este caso las moléculas homodiméricas que
portan el dominio Fc se expresarán como homodímeros unidos con
enlaces disulfuro.
En otra realización de la composición
farmacéutica de la invención, las moléculas de fusión de la
invención se preparan mediante la expresión como moléculas de
fusión utilizando bucles de ligador flexible. Se diseña un
constructo de ADN que codifica para la proteína de fusión de manera
que expresa dos dominios extracelulares o solubles fusionados entre
sí en tándem ("cabeza con cabeza") mediante un bucle flexible.
Este bucle puede ser completamente artificial (por ejemplo,
repeticiones de poliglicina interrumpidas por serina o treonina en
un intervalo determinado) o "sacadas" de proteínas que se
producen de manera natural (por ejemplo la región bisagra de
hIgG).
Además, la presente invención también contempla
el uso de versiones mutadas o modificadas mediante ingeniería
genética de gp130 con propiedades novedosas que permiten unir el
complejo agonista de
IL-6/sIL-6R.
Puede usarse una variedad de medios para generar
e identificar mutaciones de sgp130 que tienen las propiedades
deseadas. Puede usarse la mutagénesis al azar mediante métodos
convencionales del ADN que codifica para sgp130, seguido por el
análisis de la colección de productos para identificar a las
citocinas mutadas que tienen las propiedades novedosas deseadas tal
como se resume a continuación. Se ha usado de manera amplia la
mutagénesis mediante ingeniería genética con el fin de aclarar la
organización estructural de los dominios funcionales de las
proteínas recombinantes. Se han descrito varios enfoques diferentes
en la bibliografía para llevar a cabo la mutagénesis por
sustitución o deleción. La de mayor éxito parece ser la mutagénesis
de barrido con alanina (Cunningham et, (1989a) y mutagénesis
de barrido homóloga (Cunningham et al., 1989b).
Las moléculas de fusión de la composición
farmacéutica de la presente invención pueden preparase mediante la
clonación y la expresión en un sistema procariota o eucariota,
usando los vectores de expresión apropiados. Puede emplearse
cualquier método conocido en la técnica.
Por ejemplo las moléculas de ADN que codifican
para las proteínas de la invención se insertan en vectores de
expresión construidos de manera apropiada mediante técnicas bien
conocidas en la técnica (véase Sambrook et al, 1989). El
ADNc bicatenario se une a vectores de plásmido mediante la adición
de una cola de nucleótidos homopolimérica o mediante la restricción
de la unión implicando el uso de ligadores de ADN sintéticos o
técnicas de unión de extremos romos: se usan ADN ligasas para unir
las moléculas de ADN y se evita el acoplamiento indeseado mediante
el tratamiento con fosfatasa alcalina.
Con el fin de poder expresar la proteína
deseada, un vector de expresión debe comprender también secuencias
de nucleótidos específicas que contienen información reguladora
transcripcional y traduccional unidas al ADN que codifica para la
proteína deseada de tal manera que permita la expresión génica y la
producción de la proteína. En primer lugar, con el fin de
transcribir el gen, debe estar precedido por un promotor que pueda
reconocerse por la ARN polimerasa, al que se une la polimerasa e
inicia así el proceso de transcripción. Existen una variedad de
tales promotores en uso, que funcionan con eficacias diferentes
(promotores fuertes y débiles).
Para huéspedes eucariotas pueden emplearse
diferentes secuencias reguladoras transcripcionales y
traduccionales, dependiendo de la naturaleza del huésped. Pueden
derivarse a partir de fuentes víricas, tales como adenovirus, virus
de papiloma bovino, virus símico o similares, en las que las señales
reguladoras están asociadas con un gen particular, que tiene un
alto nivel de expresión. Son ejemplos el promotor TK del virus del
herpes, el promotor temprano de SV40, el promotor del gen gal4 de
levadura, etc. Las señales reguladoras de la iniciación de la
transcripción pueden seleccionarse para que permitan la represión y
activación, de modo que puede modularse la expresión de los
genes.
La molécula de ADN que comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica para la molécula de fusión de la invención
se inserta en vector(es), que tiene(n) las señales
reguladoras transcripcionales y traduccionales, que puede integrar
las secuencias génicas deseadas en la célula huésped. Las células
que se han transformado de manera estable mediante el ADN
introducido pueden seleccionarse también mediante la introducción de
uno o más marcadores que permiten la selección de las células
huésped que contienen el vector de expresión. El marcador también
puede proporcionar fototrofia a un huésped auxotrópico, resistencia
a biocidas, por ejemplo antibióticos, o metales pesados tales como
cobre, o similares. El gen marcador seleccionable puede o bien
unirse directamente a las secuencias génicas de ADN que van a
expresarse, o bien introducirse en la misma célula mediante
transfección conjunta. También pueden necesitarse elementos
adicionales para la síntesis óptima de las proteínas de la
invención.
Los factores de importancia para seleccionar un
plásmido o vector viral particular incluyen: la facilidad con la
que las células receptoras que contienen el vector pueden
reconocerse y seleccionarse de aquellas células receptoras que no
contienen el vector; el número de copias del vector que se desea en
un huésped particular; y si es deseable poder "lanzar" el
vector entre las células huésped de las diferentes especies.
Una vez que el/los vector(es) o la
secuencia de ADN que contiene el/los constructo(s) se
ha(n) preparado para la expresión del/de los
constructo(s) de ADN puede(n) introducirse en una
célula huésped apropiada mediante cualquiera de una variedad de
medios adecuados: transformación, transfección, conjugación, fusión
de protoplastos, electroporación, precipitación con fosfato de
calcio, microinyección directa, etc.
Las células huésped pueden ser o bien
procariotas o bien eucariotas. Se prefieren los huéspedes
eucariotas, por ejemplo células de mamífero, tales como células de
ser humano, mono, ratón y de ovario de hámster chino (CHO), porque
proporcionan modificaciones postraduccionales a las moléculas de
proteína, incluyendo el plegamiento correcto o glicosilación en
sitios correctos. También las células de levadura pueden llevar a
cabo las modificaciones peptídicas postraduccionales incluyendo la
glicosilación. Existen varias estrategias de ADN recombinante que
utilizan secuencias de promotor fuerte y un elevado número de copias
de plásmidos que pueden utilizarse para la producción de las
proteínas deseadas en levadura. La levadura reconoce las secuencias
líder en productos génicos de mamífero clonados y secreta péptidos
que portan las secuencias líder (es decir, prepéptidos).
Después de la introducción del/de los
vector(es), se hacen crecer las células huésped en un medio
selectivo, que selecciona el crecimiento de las células que
contienen el vector. La expresión de la(s)
secuencia(s) génica(s) clonada(s)
da como resultado la producción de las proteínas deseadas.
da como resultado la producción de las proteínas deseadas.
La purificación de las proteínas recombinantes
se lleva a cabo mediante uno cualquiera de los métodos conocidos
para este fin, es decir, cualquier procedimiento convencional que
implica extracción, precipitación, cromatografía, electroforesis, o
similares. Un procedimiento de purificación adicional que puede
usarse con preferencia para purificar la proteína de la invención
es la cromatografía de afinidad usando anticuerpos monoclonales que
se unen a la proteína diana y se producen e inmovilizan en una
matriz de gel que está contenida en una columna. Se hacen pasar a
través de la columna las preparaciones impuras que contienen la
proteína recombinante. La proteína se unirá a la columna mediante
el anticuerpo específico mientras que las impurezas pasaran a través
de ella. Después del lavado, se eluye la proteína del gel mediante
un cambio en el pH o la fuerza iónica.
Un objeto adicional de la presente invención es
una molécula de ADN que comprende la secuencia de ADN que codifica
para la proteína de fusión anterior, así como las secuencias de
nucleótidos sustancialmente iguales. Las "secuencias de
nucleótidos sustancialmente iguales" incluyen todas las demás
secuencias de ácido nucleico que, en virtud de la degeneración del
código genético, también codifican para la secuencia de aminoácidos
dada.
Para la producción de la composición
farmacéutica de la proteína de fusión de la invención, se obtienen
las secuencias de ADN a partir de clones existentes.
También pueden determinarse análogos o variantes
según la presente invención según el siguiente procedimiento. Se
conoce en la técnica anterior el ADN de las secuencias nativas y se
encuentra en la bibliografía. También se consideran dentro del
alcance de la presente invención los polipéptidos codificados por
cualquier ácido nucleico, tal como ADN o ARN que hibrida al
complemento del ADN o ARN nativo en condiciones sumamente
restrictivas o restrictivas de manera moderada, siempre que ese
polipéptido mantenga la actividad biológica de la secuencia
nativa.
nativa.
Las condiciones restrictivas son una función de
la temperatura usada en el experimento de hibridación, la molaridad
de los cationes monovalentes y el porcentaje de formamida en la
disolución de hibridación. Para determinar el grado de restricción
implicado con cualquier conjunto de condiciones dado, se usa en
primer lugar la ecuación de Meinkoth et al. (1984) para
determinar la estabilidad de híbridos con un 100% de identidad
expresada como la temperatura de fusión Tf del híbrido
ADN-ADN: Tf = 81,5ºC + 16,6 (LogM) + 0,41 (%GC) -
0,61 (%form) - 500/L, en la que M es la molaridad de los cationes
monovalentes, %GC es el porcentaje de los nucleótidos G y C en el
ADN, %form es el porcentaje de formamida en la disolución de
hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. Por
cada 1ºC que se reduce la Tf de la calculada para un híbrido con un
100% de identidad, la cantidad de apareamiento erróneo permitida se
aumenta en aproximadamente el 1%. Por tanto, si la Tf utilizada
para cualquier experimento de hibridación dado a las concentraciones
de formamida y sal especificadas es 10ºC inferior a la Tf calculada
para un híbrido al 100% según la ecuación de Meinkoth, la
hibridación se producirá incluso si hay hasta aproximadamente un 10%
de apareamiento erróneo.
Tal como se usa en el presente documento, las
condiciones sumamente restrictivas son aquéllas que toleran una
divergencia de secuencias de hasta aproximadamente el 15%, mientras
que las condiciones restrictivas de manera moderada son aquéllas
que toleran una divergencia de secuencias de hasta aproximadamente
el 20%. Sin limitación, los ejemplos de condiciones sumamente
restrictivas (12-15ºC inferior a la Tf calculada del
híbrido) y de manera moderada (15-20ºC inferior a
la Tf calculada del híbrido) usan una disolución de lavado de 2 X
SSC (citrato salino convencional) y SDS al 0,5% a la temperatura
apropiada inferior a la Tf calculada del híbrido. La última
restricción de la condición se debe principalmente a las condiciones
de lavado, particularmente si las condiciones de hibridación
utilizadas son aquéllas que permiten formar híbridos menos estables
junto con híbridos estables. Las condiciones de lavado en
condiciones restrictivas superiores eliminan entonces los híbridos
menos estables. Una condición común de hibridación que puede usarse
con las condiciones de lavado de sumamente restrictivas a
restrictivas de manera moderada descritas anteriormente es la
hibridación en una disolución de 6 X SSC (o 6 X SSPE), 5 X reactivo
de Denhardt, SDS al 0,5%, ADN de esperma de salmón fragmentado,
desnaturalizado 100 \mug/ml a una temperatura de aproximadamente
20º a 25ºC inferior a la Tf. Si se usan sondas mixtas, es
preferible usar cloruro de tetrametilamonio (TMAC) en vez de SSC
(Ausubel, 1987-1998).
Otro objeto de la presente invención son
composiciones farmacéuticas que contienen formas tratadas con PEG u
otras modificadas químicamente de las proteínas híbridas.
Las moléculas de fusión de la composición
farmacéutica de la presente invención son útiles en el tratamiento
y/o la prevención de todas las patologías, en las que debe inhibirse
la actividad del complejo agonista de
IL-6/sIL-6R. Por ejemplo los usos
terapéuticos de las moléculas de fusión incluirían lo siguiente:
- a)
- La IL-6 parece estar directamente implicada en el mieloma múltiple actuando o bien de un modo autocrino o bien paracrino para estimular la formación de tumor (van Oers et al., 1993). Además, los niveles de IL-6 elevados crean efectos secundarios indeseables tales como reabsorción ósea, hipercalcemia y caquexia. En estos casos se sabe que sIL-6R sensibiliza a las células diana para IL-6. Por tanto, las moléculas de fusión de la invención tal como se describen en el presente documento serían beneficiosas tanto para los efectos secundarios como para inhibir el crecimiento tumoral.
- b)
- En enfermedades autoinmunitarias: la importancia patogénica de IL-6 en trastornos autoinmunitarios se ha revisado por muchos autores en la bibliografía (véase Yoshizaki et al., 1992), así la interferencia con la transducción de señales de IL-6 puede ser útil para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias (Nishimoto et al., 1999). Ejemplos de tales patologías son lupus eritematoso sistémico, tiroiditis de Hashimoto, esclerodermia, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, epitelitis autoinmunitaria, diabetes mellitus, síndrome de Sjögren, polimiositis, glomerulonefritis y otras enfermedades inflamatorias, tales como soriasis y enfermedad de Chron.
- c)
- En la osteoporosis, que puede agravarse disminuyendo los niveles de estrógeno en mujeres postmenopáusicas o a través de la ovariectomía, la IL-6 parece ser un mediador crítico de la osteoclastogénesis, conduciendo a la reabsorción ósea (Jilka et al., 1992). De manera importante, la IL-6 sólo parece desempeñar un papel importante en el estado con estrógeno reducido, y aparentemente está implicada de manera mínima en el mantenimiento óseo normal. Compatible con esto, la evidencia experimental indica que los anticuerpos de bloqueo de función frente a IL-6 pueden reducir el número de osteoclastos [Jilka et al., 1992)]. Aunque también se usa la terapia de sustitución de estrógenos, parece que hay efectos secundarios que pueden incluir un riesgo aumentado de cáncer de mama y endometrio. Por tanto, las moléculas de fusión de la invención tal como se describen en el presente documento serían más eficaces para reducir la osteoclastogénesis hasta niveles normales.
- d)
- La IL-6 puede ser un mediador del factor de necrosis tumoral (TNP) que conduce a caquexia asociada con SIDA y cáncer (Strassmann et al., 1992), quizás mediante la reducción de la actividad lipoproteína lipasa en el tejido adiposo (Greenberg, et al., 1992). En consecuencia, las moléculas de fusión de la invención descritas en el presente documento serían útiles para aliviar o reducir la caquexia en tales pacientes.
- e)
- Infecciones bacterianas y víricas: la presencia del virus del herpes 8 humano (HHV8) se ha demostrado en más del 90% de las lesiones de sarcoma de Kaposi (SK). Además, el virus se ha identificado en linfoma de derrame primario (PEL) y en pacientes con enfermedad de Castleman multicéntrica (ECM). De manera intrigante, se demostró que las células dendríticas de la médula ósea de pacientes con mieloma múltiple (MM) estaban infectadas por HHV8. Desde entonces, la asociación de HHV8 con MM ha sido un tema de intenso debate, que se ha reavivado recientemente. El genoma de HHV8 codifica para varias proteínas con homologías significativas con las proteínas antiapoptóticas humanas, quimiocinas y citocinas incluyendo una forma vírica de interleucina-6 (vIL-6) con un 25% de homología con la IL-6 humana (Moore et al., 1996).
La vIL-6 ha demostrado tener
actividades biológicas que recuerdan a la IL-6
humana, es decir, la estimulación de la proliferación de células de
hibridoma murino y de mieloma humano. Más recientemente se demostró
en ratones, a los que se les inyectaron células NIH3T3
transfectadas con vIL-6, que vIL-6
inducía angiogénesis y hematopoyesis. Se concluyó que a través de
estas funciones vIL-6 desempeñaba un importante
papel en la patogénesis de trastornos asociados con HHV8. Se ha
tratado de manera polémica la contribución del IL-6R
a la señalización de vIL-6. Molden et al.,
usando sobrenadantes no purificados de células COS-7
transfectadas con vIL-6, han demostrado que la
actividad STAT se inducía en las células que expresaban gp130 pero
no IL-6R (Molden et al., 1997). Por el
contrario, Burger et al. encontraron que la actividad de
vIL-6 se reducía por un antagonista del receptor de
IL-6, argumentando una participación de
IL-6R en la señalización de vIL-6
(Burger et al., 1998). En el presente documento se muestra
que vIL-6 recombinante purificada interacciona
físicamente con gp130 pero no con IL-6R, y que
IL-6R era prescindible para la actividad biológica
de vIL-6. La actividad de vIL-6 se
inhibe por la proteína de fusión sgp130-Fc.
Las composiciones farmacéuticas según la
invención incluyen las moléculas de fusión descritas anteriormente
en un vehículo farmacológicamente aceptable, unidas a un vehículo
y/o incorporadas en liposomas, microcápsulas y preparación de
liberación controlada. Por ejemplo, la composición farmacéutica
puede comprender una o más de las moléculas de fusión en una
disolución acuosa, tal como agua estéril, solución salina, tampón
fosfato o disolución de dextrosa. Alternativamente, los agentes
activos pueden estar comprendidos en una formulación sólida (por
ejemplo cera) o semisólida (por ejemplo gelatinosa) que pueden
implantarse en un paciente que necesite tal tratamiento.
La vía de administración puede ser cualquier
modo de administración conocido en la técnica, incluyendo, pero sin
limitarse a, por vía intravenosa, por vía intratecal, por vía
subcutánea, mediante inyección en el tejido implicado, por vía
intraarterial, por vía intranasal, por vía oral, o mediante un
dispositivo implantado. La administración puede dar como resultado
la distribución del agente activo de la invención por todo el
organismo o en una zona localizada. Por ejemplo, en algunos
estados, que implican regiones distantes del sistema nervioso,
puede ser deseable la administración intravenosa o intratecal del
agente. En algunas situaciones, puede colocarse un implante que
contiene el agente activo en o cerca de la zona lesionada.
Por tanto, otro objeto de la presente invención
es el método para tratar y/o prevenir una de las enfermedades
mencionadas anteriormente mediante una cantidad eficaz de la
molécula de fusión de la invención, junto con un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
Una "cantidad eficaz" se refiere a una
cantidad de los principios activos que es suficiente para afectar el
transcurso y la gravedad de la enfermedad, conduciendo a la
reducción o remisión de tal patología. La cantidad eficaz dependerá
de la vía de administración y el estado del paciente.
Las dosis eficaces útiles para tratar y/o
prevenir estos u otros trastornos o enfermedades relacionados pueden
determinarse usando métodos conocidos por el experto en la técnica
(véase por ejemplo, Fingl, et al., The Pharmacological Basis
of Therapeutics, Goodman y Gilman, ed. Macmillan Publishing Co.,
Nueva York, pág 1-46 ((1975)).
Un objeto adicional de la presente invención son
las composiciones farmacéuticas que contienen la molécula de fusión
de la invención, en presencia de uno o más excipientes
farmacéuticamente aceptables.
"Farmacéuticamente aceptable" pretende
englobar cualquier vehículo que no interfiere con la eficacia de la
actividad biológica del principio activo y que no es tóxico para el
huésped al que se administra.
La invención se describirá ahora por medio de
los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitativos
de la presenta invención de ninguna manera. Estos ejemplos se
referirán a las figuras especificadas a continuación en el presente
documento.
Figura
1
Dibujos esquemáticos de los constructos de
sgp130-Fc y sgp130his.
Figura
2
Interacción de las proteínas gp130 con el
complejo de IL-6/sIL-6R. (A) La
H-IL-6 marcada metabólicamente se
inmunoprecipitó a partir de 200 \mul de medio de cultivo de
células COS-7 transfectadas usando 0,5 g de
sgp130-Fc (carril 2) o una proteína de fusión con Fc
irrelevante (R27080Fc) como control negativo (carril 1). (B) La
sgp130his marcada metabólicamente se inmunoprecipitó a partir de 200
\mu de medio de cultivo de células COS-7
transfectadas usando 0,5 \mug de
H-IL-6-Fc (carril 2)
o la proteína R27080Fc no relacionada como control negativo (carril
1). Los inmunocomplejos se analizaron mediante
SDS-PAGE y fluorografía.
Figura
3
Unión de gp130 humana y murina a los componentes
del complejo de IL-6/IL-6R: El
sIL-6R murino (carril 1-7) o
sIL-6R humano (carril 8-14) marcados
metabólicamente se inmunoprecipitaron a partir de 250 \mul de
medios de cultivo de células COS-7 transfectadas
usando o bien 1 \mug de sgp130-Fc humana (h),
gp130Fc murina (m) o bien IL-6Fc humana (h), tal
como se indica en el panel. La precipitación tuvo lugar en presencia
o ausencia de 350 ng de IL-6 humana (h) o
IL-6 murina (m), tal como se indica. Los
inmunocomplejos se analizaron mediante SDS-PAGE y
fluorografía.
Figura
4
Cinéticas de la unión de
H-IL-6 a sgp130-Fc
inmovilizada. (A) la asociación de
H-IL-6 a sgp130-Fc
inmovilizada condujo al aumento del ángulo alfa de resonancia como
una función del tiempo. La fase de asociación se registró para
diferentes concentraciones de H-IL-6
nanomolares tal como se indica. (B) El cálculo de los datos
obtenidos a partir de las curvas permitió la determinación de la
constante de velocidad de disociación kd a partir de la ordenada en
el origen y la constante de velocidad de asociación ka a partir de
la pendiente de la gráfica. Todos los experimentos cinéticos se
realizaron a temperatura controlada (25ºC).
Figura
5
(A) Proliferación de las células BAF/gp130 en
respuesta a H-IL-6 5 ng/ml y
cantidades crecientes de sgp130-Fc o sgp130his. (B)
Proliferación de las células BAF/gp130/IL-6R en
respuesta a IL-6 1 ng/ml y cantidades crecientes de
sgp130-Fc o sgp130his. Los datos representan las
medias +/- DE de dos experimentos paralelos. (C) Proliferación de
las células BAF/gp130 en respuesta a IL-6 100 ng/ml
junto con sIL-6R 50 ng/ml y cantidades crecientes de
sgp130-Fc o H-IL-6
10 ng/ml y cantidades crecientes de sgp130-Fc. Los
datos representan las medias +/- DE de tres experimentos
paralelos.
Figura
6
Proliferación de las células
BAF/gp130/LIFR/CNTFR en respuesta a
H-IL-6 10 ng/ml, LIF 1 ng/ml, OSM 10
ng/ml o CNTF 0,5 ng/ml en presencia de cantidades crecientes de
sgp130-Fc. Los datos representan las medias +/- DE
de dos experimentos paralelos.
Figura
7
Inhibición de la fase aguda en células de
hepatoma: (A) las células HepG2 se estimularon con 100 ng/ml de
IL-6 o H-IL-6
durante 18 h en presencia o ausencia de sgp130-Fc 1
\mug/ml, (B) las células HepG2/IL-6 se
estimularon con 100 ng/ml de
IL-6R-Fc o
H-IL-6 con o sin
sgp130-Fc 1 \mug/ml durante 18 h. Las células no
estimuladas tratadas con o sin sgp130-Fc se usaron
como control (co). La expresión de
\alpha1-antiquimotripsina de las células se
analizó mediante 4 h de marcaje por pulsos e inmunoprecipitación
posterior con un anticuerpo específico. Los inmunocomplejos se
analizaron mediante SDS-PAGE y fluorografía.
Figura
8
Análisis de apoptosis en células mononucleares
de la lámina propia (LPMC) de pacientes de Crohn. Las LPMC se
aislaron tal como se describió y se cultivaron tal como se describió
durante 48 h en presencia o ausencia de 10 \mug/ml de un
anticuerpo específico para IL-6R neutralizante o
sgp130-Fc. Posteriormente las células se tiñeron
con anexina V y yoduro de propidio y se analizaron mediante FACS. Se
muestra el porcentaje de células apoptóticas (positivo para anexina
V y negativo para yoduro de propidio).
\newpage
Ejemplo
1
Se adquirieron DMEM, penicilina y estreptomicina
de Gibco (Eggenstein, Alemania). Se obtuvo FCS de Seromeal (Berlín,
Alemania). Se adquirió DEAE-dextrano de Sigma
(Taufkirchen, Alemania). Las enzimas de restricción procedían de
New England Biolabs (Schwalbach, Alemania) o AGS (Heidelberg,
Alemania). La ADN ligasa de T4 y la polinucleótido cinasa procedían
de Boehringer Mannheim (Mannheim, Alemania). Se obtuvo la proteína
A-Sepharose de Pharmacia (Fribrugo, Alemania).
Tran-35S-Label (44 TBq/mmoles)
procedían de ICN (Meckenheim, Alemania), se obtuvo
[6-3H]timidina (74 GBq/mmoles) de Amersham
International (Aylesbury, RU). Las películas de rayos X
(X-OMAT-AR) procedían de Eastman
Kodak (Rochester, NJ). Se generó
H-IL-6 tal como se describió; se
produjeron H-IL-6,
sIL-6R,
H-IL-6-Fc e
IL-6-Fc tal como se describió
(Fischer et al., 1997); Özbek et al., 1998; Jostock
et al., 1999.
Se construyó
IL-6R-Fc humana mediante la fusión
de ADNc que codifica para la parte extracelular de la
IL-6R humana a un ADNc que codifica para la parte
Fc humana de IgG1 usando los sitios de restricción SspI y EcoRV,
respectivamente. Se generaron los ADNc de sIL-6R
humano y sIL-6R murino tal como se describió
anteriormente (Mackiewicz et al., 1992; Mackiewicz et
al., 1995). Se usó el vector pCDM8 (Invitrogen, Leek, NL) para
la expresión de proteínas sIL-6R en células de
mamífero. H-IL-6 en el vector de
expresión pCDM8
Se fusionó la secuencia de ADNc que codifica
para el dominio extracelular de gp130 a un fragmento Bgl2/NotI que
codifica para la región constante de una cadena pesada de IgG1
humana [Fanslow et al., 1992). Se ligó un fragmento
XhoI/EcoRI del ADNc de gp130 con la parte Fc mediante un adaptador
de oligonucleótido sintético. Para obtener una versión con cola de
con poli-His de gp130 soluble, se sustituyó la parte
Fc en el constructo sgp130-Fc por un adaptador de
oligonucleótido sintético que codifica para 6 residuos de histidina
seguido por un codón de terminación de la traducción. Para la
expresión de proteínas, se usó el plásmido de expresión en
mamíferos pDC409 (Giri et al., 1994).
Se hicieron crecer células HepG2,
COS-7, BAF/gp130 y BAF/gp130/IL-6R
en DMEM a 37ºC, 5% de CO_{2} en una atmósfera saturada de agua.
Se complementaron los medios de cultivo celular con FCS al 10%,
estreptomicina 100 mg/l y penicilina 60 mg/l. Se cultivaron
BAF/gp130/IL-6R en presencia de IL-6
10 ng/ml, BAF/gp130 en presencia de
H-IL-6 10 ng/ml,
BAF/gp130/LIFR/CNTFR en presencia de CNTF 10 ng/ml. Se transfectaron
las células COS-7 usando el método de
DEAE-dextrano (McMahan et al., 1991). Para la
producción de proteínas recombinantes, se cultivaron las células en
medios que contenían FCS al 0,5%, se recogieron los sobrenadantes en
el día 5 tras la transfección.
Se purificó sgp130-Fc tal como
se describió para IL-6Fc anteriormente. Se purificó
sgp130his a partir de 900 ml de medio de cultivo en una columna t
mi NJ/quelato (Pharmacia) mediante elución con imidazol 100 mM
usando un sistema de FPLC (Aekta Explorer, Pharmacia). Se
combinaron las fracciones que contenían proteína identificadas
mediante SDS-PAGE y tinción con plata posterior y se
dializaron frente a PBS. Se determinaron las concentraciones de
proteínas purificadas usando un microensayo de proteínas por BCA
(Pierce, Rockford, IL) siguiendo las instrucciones del fabricante o
se estimaron a partir de SDS-PAGE con tinción de
plata.
Se marcaron metabólicamente las células 48 h
tras la transfección con
[^{35}S]metionina/[^{35}S]cisteína 50 mCi/ml en
medio libre de metionina/cisteína durante 8 horas. Se
inmunoprecipitaron las proteínas secretadas usando 1 \mug/ml de
anticuerpos o proteínas con Fc apropiados, se precipitaron los
inmunocomplejos a partir de los medios de cultivo usando Proteína
A-Sepharose, se analizaron mediante
SDS-PAGE (Laemmli, 1970) y se visualizaron mediante
fluorografía usando la disolución intensificadora fluorográfica
"Amplify" (Amersham).
Se inmovilizó de manera covalente
sgp130-Fc en una matriz de carboximetildextrano
(Fisons, Loughborough, RU) siguiendo las recomendaciones del
fabricante (Krebs et al. 1998). Se realizaron los
experimentos de unión a temperatura controlada (25ºC) con
diferentes concentraciones de H-IL-6
usando el biosensor óptico IASYS^{TM} (Fisons). Se analizaron los
cromatogramas de afinidad de asociación y disociación mediante
regresión no lineal con el software FASTfit (Fisons), que utiliza
el algoritmo de Marquard-Levenburg para el ajuste de
datos iterativo.
Se lavaron exhaustivamente células BAF/gp130,
BAF/gp130/IL-6R y BAF/gp130/LIFR/CNTFR (Kallen et
al., 1999) con PBS con el fin de eliminar los factores de
crecimiento y se resuspendieron en medio libre de citocinas. Se
cultivaron 5 x 10^{3} células/pocillo de un placa de 96 pocillos
en un volumen final de 100 ml con citocinas y cantidades crecientes
de proteínas gp130 tal como se indicó en las figuras durante 68
horas y se posteriormente se marcaron por pulsos con
[^{3}H]timidina 0,25 mCi durante 4 horas. Se recogieron las
células sobre filtros de vidrio y se determinó la
[^{3}H]timidina incorporada mediante recuento por
centelleo.
Se hicieron crecer células HepG2 y células HepG2
transfectadas de manera estable con ADNc de IL-6
humana (células HepG2/IL-6) (Mackiewicz et
al., 1992) hasta casi confluencia y se estimularon durante 18 h
con IL-6, H-IL-6 o
sIL-6R-Fc 100 ng/ml en presencia o
ausencia de sgp130-Fc 1 \mug/ml tal como se indica
en las figuras. Posteriormente se marcaron por pulsos las células
durante 4 h con [^{35}S]-cisteína/metionina (10
\muCi/ml). Se trataron los sobrenadantes de las células con
Pansorbin durante 1 h antes de que se inmunoprecitara la
\alpha1-antiquimotripsina marcada radiactivamente
con un anticuerpo específico (Gibco, Eggenstein, Alemania) y se
detectó mediante SDS-PAGE y fluorografía.
Se cultivaron células mononucleares de la lámina
propia (LPMC) en medios completos que consistían en
RPMI-1640 con L-glutamina 3 mM,
tampón HEPES 10 mM, gentamicina 10 \mug/ml (Whittecker,
Walkersville, MD), penicilina y estreptomicina cada una 100 U/ml
(Whittacker), 2ME 0,05 mM (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) y suero
bovino fetal inactivado por calor al 10%. Se estimularon las
células con proteína C reactiva (10 ug/ml Sigma Chem), PMA 50 ng/ml
y fitohemaglutinina 10 ug/ml (PHA, Sigma) en presencia o ausencia de
sgp130-Fc o un anticuerpo específico para
IL-6R neutralizante, tanto a 1 como 10 \mug/ml tal
como se indica en la figura. Tras 48 h, se tiñeron las células con
anexina V y yoduro de propidio usando el kit I de detección de
apoptosis con anexina V-FITC (Pharmingen) y se
analizaron mediante FACS.
Se generaron dos formas solubles de gp130. Se
fusionó el ADNc que codifica para la parte extracelular de gp130
humana o murina a la región constante de una cadena pesada de IgG1
humana (sgp130-Fc). Este tipo de proteínas de
fusión generalmente se denominan generalmente proteínas con Fc o
inmunoadhesinas (Ashkenazi et al., 1997; Jostok et
al., 1999). Se muestra en la figura 1 una representación
esquemática de sgp130-Fc. Se añadió en el segundo
constructo una cola de secuencia de
"hexa-histidina" al extremo
COOH-terminal de la parte extracelular de gp130
humana (sgp130his) (figura 1). Se expresaron de manera transitoria
sgp130-Fc y sgp130his en células
COS-7 y se purificaron a partir de los medios de
cultivo mediante cromatografía de afinidad en proteína
A-Sepharose o agarosa-quelato de Ni,
respectivamente. Se analizaron las proteínas gp130 purificadas
mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y
tinción con plata.
Se ha demostrado anteriormente la formación de
un complejo ternario compuesto por IL-6, las formas
solubles de IL-6R y gp130. Para analizar la unión
de sgp130-Fc y sgp130his a
IL-6/sIL-6R se usó la proteína de
fusión "hiper-IL-6"
(H-IL-6) en la que el extremo
COOH-terminal del dominio de unión a ligandos de la
IL-6R está fusionado al extremo
NH2-terminal de IL-6 mediante un
ligador peptídico flexible (Fischer et al., 1997). Tal como
se muestra en la figura 2, se inmunoprecipitaron
H-IL-6 y sgp130his radiomarcadas,
con sgp130-Fc y
H-IL-6Fc, respectivamente. La
IL-6 humana se une al sIL-6R humano
y con menor afinidad al sIL-6R murino, mientras que
la IL-6 murina sólo se une al receptor murino. Por
tanto, era de interés investigar si se aplican otras restricciones
de especie a la formación del complejo ternario de
IL-6, sIL-6R y sgp130 (figura 3). Se
inmunoprecipitó sIL-6R humano o murino radiomarcado
con sgp130-Fc humana o murina en ausencia o
presencia de IL-6 humana o murina.
sIL-6R no se precipitó conjuntamente con
sgp130-Fc en ausencia de IL-6.
sIL-6R murino formó un complejo ternario con todas
las combinaciones de IL-6 y
sgp130-Fc. Tal como se esperaba, el
sIL-6R murino sólo pudo precipitarse conjuntamente
con sgp130-Fc humana o murina en presencia de
IL-6 humana. De manera interesante, el
sIL-6R murino no se precipitó con
IL-6Fc, una proteína de fusión de
IL-6 humana e IgG1 humana, lo que indica una muy
baja afinidad de IL-6 humana por
sIL-6R murino en ausencia de gp130. Los resultados
muestran claramente que sIL-6R humano puede
interaccionar con sgp130 murina y viceversa. Se midió la cinética
de unión de H-IL-6 a
sgp130-Fc mediante resonancia de plasmón (figura
4A). Se inmovilizó sgp130-Fc en una cubeta
IASYS^{TM} (véase "Materiales y Métodos") y se analizó la
interacción a tiempo real de H-IL-6
y sgp130-Fc. En la figura 4 se muestran curvas de
asociación registradas para 7 concentraciones de
H-IL-6. Se utilizaron los datos
obtenidos para calcular una tasa de asociación, kass = 4,08 x 106
+/- 2,55 x 105 M-1 s-1, y una tasa
de disociación, kdiss = 1,71 x 10-2 +/- 0,0012
s-l, entre HIL-6 y
sgp130-Fc. A partir de estos valores puede
derivarse una afinidad de Kd = 4,20 nM (figura 4B).
Habiéndose mostrado que sgp130 interacciona
específicamente con el complejo de
IL-6/sIL-6R era de interés conocer
si las proteínas sgp130 interfieren con la actividad biológica de
IL-6 y sIL-6R. Se hizo uso de las
células pre-B dependientes de IL-3,
BAF/3, que no expresan gp130 y por tanto no responden a
IL-6 ni a
IL-6/sIL-6R. Sin embargo, las
células BAF/3 transfectadas de manera estable con ADNc de gp130
humana (BAF/gp130) o ADNc de gp130 y sIL-6R humanos
(BAF/gp130/IL-6R), en ausencia de
IL-3 crecen en respuesta a
IL-6/sIL-6R o IL-6,
respectivamente 0. Se bloqueó la proliferación de células BAF/gp130
estimuladas por H-IL-6 mediante
sgp130-Fc y sgp130his de manera dependiente de la
dosis (figura 5A). sgp130-Fc volvió a ser
aproximadamente 10 veces más activa que sgp130his, cuando se usaron
de ambas proteínas en igual concentración molar. Ninguna de las
proteínas gp130 tuvo una influencia sobre la proliferación de
células BAF/gp130/IL-6R inducidas por
IL-6 (figura 5B). Estos resultados muestran
claramente que sgp130 neutraliza específicamente la actividad de
sIL-6R complejado con IL-6 y deja
de interferir con respuestas desencadenadas por
IL-6R unido a la membrana. Además, se comparó el
efecto de sgp130-Fc sobre la proliferación de las
células BAF inducida por H-IL-6 e
IL-6 más sIL-6R y se obtuvieron
resultados similares. Una concentración de 20 ng de
sgp130-Fc/ml condujo a una inhibición del 50% de la
proliferación inducida por 10 H-IL-6
y 10 IL-6 más 50 sIL-6R,
respectivamente (figura 5C).
Además de ser la subunidad de transducción de
señales del complejo de IL-6R, gp130 también
participa en la señalización en respuesta a, por ejemplo, el factor
inhibidor de leucemia (LIF), oncostatina M (OSM) y factor
neurotrófico ciliar (CNTF). LIF y OSM actúan mediante un receptor de
superficie compuesto por gp130 y LIFR. El complejo de CNTFR también
contiene gp130 y LIFR y, de manera similar al complejo de
IL-6R, una proteína de unión a ligandos adicional
(CNTFR). Para investigar el efecto de sgp130-Fc
sobre las respuestas frente a estas citocinas de tipo
IL-6, se usaron células BAF/3 que expresan gp130,
LIFR y CNTFR (BAF/gp130/LIFR/CNTFR). Mientras que
sgp130-Fc no tuvieron efecto sobre la proliferación
inducida por CNTF de estas células, se inhibió la proliferación
estimulada por LIF y OSM a altas concentraciones de
sgp130-Fc (figura 6). sgp130-Fc no
influyó en la repuesta de células BAF/gp130/LIFR/CNTFR frente a
IL-3. Es de importancia que el efecto inhibidor de
sgp130-Fc sobre la proliferación inducida por LIF y
OSM es muy débil en comparación con su efecto sobre la respuestas
estimulada por
H-IL-6.
H-IL-6.
Las células de hepatoma humano HepG2 sintetizan
las denominadas proteínas de fase aguda tales como haptoglobina y
cd-antiquimotripsina en respuesta a
IL-6 (Gauldie et al., 1987) o
IL-6/sIL-6R (Mackiewicz et
al., 1992). Se marcaron metabólicamente células HepG2 tratadas
con IL-6 o HqL-6 en ausencia o
presencia de sgp130-Fc durante 4 horas, y
posteriormente se analizó la cantidad de
\alpha1-antiquimotripsina secretada en los medios
de cultivo (figura 7A). sgp130-Fc no tuvo efecto
sobre la síntesis de la proteína inducida por IL-6,
mientras que se inhibió fuertemente la síntesis de
\alpha1-antiquimotripsina inducida por
H-IL-6. Estos resultados destacan
el hallazgo de que sgp130-Fc inhibe específicamente
las respuestas dependientes de sIL-6R y no
interfiere con la IL-6R expresada en la
superficie
celular.
celular.
Se obtuvieron resultados similares con células
HepG2-IL-6. Estas células tras la
transfección estable de un ADNc de IL-6 humana
perdieron la expresión en superficie de IL-6R.
Aunque estas células secretan altas cantidades de
IL-6 en su medio de cultivo, dejaron de responder
completamente frente a IL-6. Sin embargo, las
células HepG2-IL-6 pudieron
estimularse por el complejo de
IL-6/sIL-6R [33]. De acuerdo con los
resultados obtenidos con las células HepG2, se inhibió fuertemente
por sgp130-Fc la síntesis de
\alpha1-antiquimotripsina inducida por
sIL-6R y H-IL-6 en
las células HepG2-IL-6.
La enfermedad de Crohn (MCD) es una enfermedad
inflamatoria crónica del tracto gastrointestinal. Se ha sugerido
que una activación del sistema inmunitario de la mucosa en respuesta
a antígenos bacterianos con producción consecutiva de citocinas
patológicas desempeña un papel patogénico clave. Un anticuerpo
neutralizante dirigido frente a IL-6R pudo suprimir
la resistencia de las células mononucleares de la lámina propia
(LPMC) de pacientes con MCD frente a la apoptosis. Se quiso
analizar si un efecto antiapoptótico de IL-6 en este
sistema se transduce mediante IL-6R expresado en la
superficie, o si la resistencia de las células inmunológicamente
competentes frente a la apoptosis depende de la presencia de
sIL-6R. Se cultivaron LPMC en presencia de
anticuerpo anti-IL-6R neutralizante
o sgp130-Fc en las condiciones descritas en
"Materiales y Métodos". Se determinaron/detectaron las células
apoptóticas como células positivas para anexina V, negativas para
yoduro de propidio mediante análisis por FACS. Las muestras sin
tratar contenían aproximadamente un 60% de células apoptóticas. El
tratamiento con el anticuerpo neutralizante frente a
IL-6R o sgp130-Fc dio como resultado
un aumento de las células apoptóticas en un 15% y un 13%,
respectivamente. La eficacia de sgp130-Fc indica un
importante papel de sIL-6R para la resistencia de
LPMC frente a la apoptosis. No es probable que IL-6R
expresado en la membrana contribuya al efecto antiapoptótico,
puesto que el tratamiento con anticuerpo y sgp130-Fc
conduce a un aumento similar del número de células apoptóticas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El anticuerpo neutralizante frente a gp130 GPX7
fue cedido amablemente por el Dr. Yasukawa (Tosoh, Tokyo, Japón).
Se han descrito anteriormente las células BAF/3 transfectadas de
manera estable con los ADNc de gp130 e IL-6R
humanos (Fischer et al., 1997). A role for the
immunogloblulin-like domain of the human
IL-6 receptor: intracellular protein transport and
shedding. Eur J Biochem 263: 438). Se ha descrito la preparación y
caracterización de la línea celular
HepG2-IL-6 (Mackiewicz et
al., 1992).
Se amplificó ADN de vIL-6
mediante PCR y se insertó en el plásmido de expresión en mamíferos
pDC409 (Jostock et al., 1999) como un ADN en 3' que codifica
para una proteína con cola de hexahistidina usando los sitios de
restricción Sal I y Not I. Se transfectaron células
COS-7 usando DEAE-dextrano, se
recogieron los sobrenadantes tras 5 días y se purificaron en
agarosa-Ni-NTA según las
instrucciones del fabricante (Quiagen, Hilden, Alemania). Se
equilibro el material de la columna con tampón fosfato 50 mM pH
7,5/NaCl 500 mM/imidazol 20 mM, tras cargar el sobrenadante del
cultivo se lavó la columna con tampón de equilibración y se eluyó
con tampón fosfato 50 mM pH 7,5/NaCl 500 mM/imidazol 100 mM. Se
combinaron las proteínas eluidas y se dializaron frente a PBS a
4ºC.
Se transfectaron células COS-7
con el plásmido de expresión de vIL-6. 48 h tras la
transfección se marcaron metabólicamente las células durante 8 h
con [^{35}S]-cisteína/metionina 50 \muCi/ml en
medio libre de cisteína/metionina (Gibco, Eggenstein, Alemania). Se
incubaron los sobrenadantes durante 2 h a 4ºC con un antisuero de
conejo producido frente a una proteína vIL-6
expresada por bacterias. Alternativamente, se incubaron los
sobrenadantes con 2 pg/ml de IL-6-Fc
humana (Jostock et al., 1999), sgp130-Fc
humana o una IL6R-Fc humana. Se construyó la
IL-6R-Fc humana fusionando el ADNc
que codifica para la parte extracelular de IL-6R
humano a un ADNc que codifica para la parte Fc humana de IgG1
(Jostock et al., 1999), usando los sitios de restricción
SspI y EcoRV, respectivamente. Se fusionó la parte extracelular de
gp130 a la parte Fc de una IgG1 humana (Jostock et al.,
1999), como un fragmento XhoI-EcoRI. Se expresaron
de manera transitoria todas las proteínas con Fc en células
COS-7 y se purificaron en proteína
A-Sepharose (Jostock et al., 1999). Se
precipitaron los inmunocomplejos con proteína
A-Sepharose, se separaron mediante
SDS-PAGE y se visualizaron mediante
fluorografía.
Se midió la proliferación de células BAF/3
transfectadas en placas de microtitulación de 96 pocillos. Se
expusieron las células a citocinas durante 68 h y posteriormente se
marcaron por pulsos con [^{3}H]-timidina durante
4 h. Se midieron las tasas de proliferación recogiendo las células
sobre filtros de vidrio y determinando la radiactividad incorporada
mediante recuento por centelleo. Se realizó para cada citocina el
ensayo de proliferación al menos tres veces por triplicado.
Se hicieron crecer células
HepG2-IL-6 hasta confluencia. 4 h
antes de la estimulación con citocinas, se privaron las células de
suero. Tras 15 min. de estimulación, se lavaron las células en PBS y
se lisaron en tampón de Laemmli. Se separaron las proteínas
mediante electroforesis en SDS-PAGE al 10% y se
analizaron mediante inmunotransferencia de tipo Western usando el
Acm phospho-STAT3 (Y705) Biolabs, Frankfurt,
Alemania).
Se obtuvieron células de músculo liso (SMC) de
trozos de aortas humanas obtenidas durante la cirugía de aneurismas
(5 donantes machos, edad media de 72 años) por cortesía del Dr. W.
Schmiedt (Departamento de Cirugía Torácica y Cardíaca, Universidad
de Mairtz, Alemania). Se prepararon fragmentos de los medios
aislados (Ross, 1971) y se dejaron crecer las células de músculo
liso hacia fuera de los fragmentos de los medios que se mantenían
en medio que contenía factor \beta de crecimiento de fibroblastos
básico recombinante humano 1 ng/ml, factor de crecimiento
epidérmico recombinante humano 5 ng/ml, gentamicina 25 mg/l y
anfotericina B 1,25 mg/l a 37ºC en 5% de CO_{2} en una atmósfera
humidificada. Se evaluó la pureza de las SMC mediante tinción con un
Acm frente a \alpha-actina (clon 1A4, Sigma,
Deisenhofen, Alemania). Se cambió el medio cada tres días. 24 h
antes de los experimentos, se hicieron crecer SMC en DMEM sin ningún
aditivo. Se sometió a ensayo la viabilidad de las células usando la
exclusión con azul trípano.
Se aisló ARN celular total de cultivos de SMC
confluentes y se llevó a cabo la transcripción inversa de 1 pg de
ARN total seguido por PCR que se realizó tal como sigue:
desnaturalización inicial durante 5 min. a 95ºC, luego
desnaturalización durante 40 s a 95ºC, hibridación durante 1 min. a
62ºC y extensión durante 3 min. a 72ºC. Los cebadores de PCR para
MCP-1, IL-6, gp130 y GAPDH fueron
tal como se describieron (Klouche et al., 1999). Los
cebadores de PCR para el LIF-R se han descrito en la
bibliografía (Shimon et al., 1997). Se corrieron los
productos de PCR en geles de agarosa al 1% en 1 x TBE y se tiñeron
con bromuro de etidio. Para los análisis inmunocitoquímicos, se
fijaron las células con formaldehído al 18,5%/glutaraldehído al
12,5% durante 2 h a temperatura ambiente y se incubaron con Acm
específico frente a gp130 marcada con PE (clon AM64, IgG1;
Pharmingen, San Diego, EE.UU.) durante la noche a 4ºC seguido por
montaje y fotografía.
Para expresar vIL-6 en células
de mamífero, se clonó el ADNc en un vector de expresión (Fischer
et al., 1997) que añadió una cola de hexahistidina al
extremo COOH-terminal de la proteína. Se purificó la
proteína hasta casi homogeneidad mediante cromatografía de afinidad
con Ni. Con el análisis de SDS-PAGE de la proteína
purificada es visible una doble banda de 24-26 kDa
que lo más probable es que refleje formas de vIL-6
glicosiladas de manera diferente.
La proteína vIL-6 marcada con
^{35}S metabólicamente pudo precipitarse a partir del sobrenadante
de células transfectadas con un antisuero de conejo producido
frente a una proteína vIL-6 expresada por bacterias.
Para someter a prueba la interacción física con subunidades del
receptor del sistema del receptor de IL-6, se incubó
la proteína ^{35}S-vIL-6 con
proteínas de fusión con Fc que contenían IL-6, la
parte extracelular del IL-6R y la parte
extracelular de gp130. Se precipitaron los complejos de proteína con
proteína A-Sepharose. Ni
IL-6-Fc ni
IL-6R-Fc interaccionaron con
vIL-6. Por el contrario, sgp130-Fc
precipitó conjuntamente la proteína vIL-6 lo que
indica la unión de vIL-6 a la parte extracelular de
gp130. La especificidad de la interacción de las proteínas con Fc
con sus ligandos relacionados se demuestra tal como sigue. Se
precipita IL-6 marcada con S metabólicamente humana
con IL-6R-Fc, como una banda ancha
que refleja diferentes estados de glicosilación de
IL-6 humana expresada de manera recombinante (Schiel
et al., 1990). No se precipitó IL-6 con
IL-6-Fc ni con
sgp130-Fc. Por el contrario, una proteína de fusión
de sIL-6R e IL-6
(hiper-IL-6), que se ha demostrado
que estimula directamente gp130 (Fischer et al., 1997), se
precipita con sgp130-Fc pero no con
IL-6-Fc ni con
IL-6R-Fc. A continuación se
cuestionó si vIL-6 se unía a gp130 en el mismo sitio
que el complejo de IL-6/sIL-6R. Se
realizó la precipitación de vIL-6 marcada
metabólicamente con sgp130-Fc en presencia o
ausencia de IL-6 e
hiper-IL-6 humana. La unión de
vIL-6 a sgp130-Fc no se vio afectada
por un exceso de IL-6 humana. Sin embargo, la
precipitación de vIL-6 por
sgp130-Fc, se bloqueó completamente en presencia de
hiper-IL-6. Este experimento
demostró claramente que vIL-6 e
hiper-IL-6 competían por el mismo
sitio de unión en gp130 humana. Habiéndose mostrado una interacción
directa de vIL-6 con gp130, a continuación se
cuestionó si se necesitaba IL-6R para la actividad
biológica de vIL-6. Se hizo uso de las células
pre-B dependientes de IL-3, BAF/3,
que no expresan gp130 y por tanto no responden a
IL-6 ni a
IL-6/sIL-6R. Sin embargo, las
células BAF/3 transfectadas de manera estable con ADNc de gp130
humana o ADNc de gp130 e IL-6R humanos, en ausencia
de IL-3, crecen en respuesta a
IL-6/sIL-6R o IL-6,
respectivamente (Vollmer et al., 1999). Las células BAF/3
transfectadas con ADNc de gp130 (células BAF-130)
crecen en respuesta a cantidades crecientes de
hiper-IL-6. Cuando se estimularon
las mimas células con IL-6, no se observó
crecimiento de las células. Sin embargo, las células estimuladas
con vIL-6 mostraron proliferación dependiente de la
dosis. De acuerdo con la eficacia de unión a gp130 inferior,
vIL-6 demostró tener una actividad biológica
específica 20-50 veces inferior a la de
hiper-IL-6. En las células BAF/3
transfectadas con los ADNc de gp130 e IL-6R (células
BAF-130/IL-6R) se observó
proliferación en respuesta a IL-6,
hiper-IL-6 y vIL-6.
La actividad biológica específica de IL-6 era 100
veces superior a la de vIL-6. Las células
BAF-130/IL-6R son más sensibles a
IL-6 que a
hiper-IL-6 puesto que expresan más
IL-6R que gp130 (Vollmer et al., 1999). A
continuación se examinó si sgp130-Fc inhibía la
actividad biológica de vIL-6. Se encontró que la
adición de sgp130-Fc a células
BAF-130 estimuladas con
hiper-IL-6 o vIL-6
conducía a una inhibición dependiente de la dosis de la
proliferación de inducida por citocinas. Por el contrario, en las
células BAF-130/IL-6R estimuladas
con IL-6 humana, sgp130-Fc no
inhibió la proliferación inducida por IL-6. La
ausencia de inhibición de IL-6 humana puede indicar
que no hay acceso libre de la proteína de fusión
sgp130-Fc al complejo de
IL-6/IL-6R asociado a la membrana.
Por tanto, la proteína de fusión sgp130-Fc inhibe
específicamente vIL-6 pero no IL-6
humana actuando a través del IL-6R unido a la
membrana. La estimulación por citocinas de gp130 conduce a la
dimerización de gp130, posterior fosforilación de gp130, activación
de JAK cinasas y fosforilación de tirosinas de STAT3. STAT3
fosforilada dimeriza y se transloca hacia el núcleo en el que se une
a secuencias de ADN específicas y actúa como un factor de
transcripción (Taga et al., 1997). Por tanto, se cuestionó
si la estimulación celular por vIL-6 también estaba
mediada por la activación de gp130. La adición de un Acm
neutralizante dirigido frente a gp130 bloqueó completamente la
proliferación de células BAF-130 inducida por
hiper-IL-6 y por
vIL-6. El mismo Acm neutralizante frente a gp130 no
influyó en la proliferación de células BAF/3 no transfectadas
inducida por IL-3. Estos resultados indican que
tanto hiper-IL-6 como
vIL-6 actuaron a través de la activación de gp130.
Para demostrar que la estimulación de células con
vIL-6 conducía a la fosforilación y activación
intracelular de STAT3, se emplearon células
HepG2-IL-6. Las células HepG2, con
la transfección estable de un ADNc de IL-6 humana
perdían la expresión en superficie de IL-6R y por
tanto dejaron de responder completamente a IL-6.
Sin embargo, las células HepG2-IL-6
pudieron estimularse mediante el complejo de
IL-6/sIL-6R (Mackiewicz et
al., 1992). No pudo detectarse la fosforilación de STAT3, en
células HepG2-IL-6 no estimuladas y
estimuladas con IL-6. Por el contrario, la
incubación de células en presencia de
hiper-IL-6 o vIL-6
dio como resultado la fosforilación de STAT3. Esta fosforilación de
STAT3 pudo bloquearse completamente por un Acm neutralizante
dirigido frente a gp130. Estos experimentos demuestran que la
activación por vIL-6 no estaba mediada por la
IL-6R unida a la célula. Además, los resultados
sugieren que vIL-6 y
hiper-IL-6 usan el mismo mecanismo
de activación celular a través de gp130. El sarcoma de Kaposi se
caracteriza por la formación de nuevos vasos y la proliferación de
células fusiformes, "células KS", que están asociadas con
células endoteliales, fibroblastos y células inflamatorias. De
manera histórica, se consideró que las células fusiformes en
proliferación se derivaban de células endoteliales, pero más
recientemente, tanto los tipos de células mesenquimatosas, células
endoteliales como del músculo liso, se han propuesto como posibles
precursores. La tinción inmunohistoquímica y el análisis de
transferencia de tipo Northern revelaron una expresión conjunta de
antígenos específicos para las células endoteliales y del músculo
liso (Kaaya et al., 1995). En estudios anteriores, se
observó que las células de músculo liso sólo pudieron estimularse
con IL-6 en presencia de sIL-6R
(Klouche et al., 1999). Por tanto, se estudió la estimulación
de células del músculo liso primarias humanas por
vIL-6. En las células del músculo liso humanas, la
expresión de ARNm de IL-6, de la quimiocina
atrayente de monocitos MCP-1 y de gp130 está
regulada por incremento de un modo dependiente del tiempo con la
estimulación por vIL-6. Tanto la inducción de
MCP-1 así como las quimiocinas codificadas por virus
pueden estar implicadas en la atracción y presencia características
de células inflamatorias en KS. Además de gp130, la subunidad del
receptor LIF-R la comparten las citocinas de la
familia de IL-6 tales como LIF, CNTF, OSM y
CT-1 (Taga et al., 1997). Por tanto, se
cuestionó si la expresión de ARNm de LIF-R también
estaba modulada por vIL-6 e
hiper-IL-6. El tratamiento de las
células de músculo liso con
hiper-IL-6 y vIL-6
condujo a una regulación por incremento del ARNm de
LIF-R tal como se mide mediante la aparición de una
banda de ADN de 359 pb con la RT-PCR, lo que indica
que la estimulación de células de músculo liso por
vIL-6 dio como resultado un aumento de la expresión
del correceptor para los miembros de la familia de
IL-6 LIF, CNTF, OSM y CT-1. Además,
se encontró que la expresión en la superficie celular de gp130
aumenta enormemente tras el tratamiento de las células con la
proliferación inducida por vIL-6 y
vIL-6 de las células. Notablemente, la expresión de
gp130 precedió a la de IL-6, lo que indica la
inducción de un bucle de estimulación autocrina por
vIL-6. El tratamiento con IL-6
humana en ausencia de sIL-6R no tuvo efectos sobre
la expresión de MCP-1, IL-6 y gp130
y sobre la proliferación (Klouche et al., 1999). Se concluye
a partir de estos datos que vIL-6, como el complejo
de IL-6/sIL-6R, induce un estado
proinflamatorio en las células de músculo liso humanas.
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Claims (9)
1. Composición farmacéutica que contiene una
molécula de fusión que comprende dos moléculas gp130 solubles.
2. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que dos moléculas gp130 solubles están
fusionadas entre sí en tándem mediante un bucle flexible.
3. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1 ó 2, en la que al menos una de las dos moléculas
gp130 solubles es el dominio extracelular completo de gp130.
4. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1 ó 3, en la que las dos moléculas gp130 solubles
están unidas entre sí a través de un enlace covalente sencillo.
5. Composición farmacéutica según una cualquiera
de las reivindicaciones 2 a 4, en la que las dos moléculas gp130
solubles están unidas entre sí a través de un ligador peptídico
flexible.
6. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que las dos moléculas gp130 solubles están
fusionadas al dominio Fc de las proteínas IgG, de modo que se
expresa como homodímero unido con enlaces disulfuro.
7. Composición farmacéutica que contiene una
molécula de ADN que codifica para una molécula según la
reivindicación 1.
8. Composición farmacéutica que contiene un
vector de expresión que contiene una molécula de ADN según la
reivindicación 1.
9. Uso de un compuesto según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8, para la preparación de un medicamento
para el tratamiento y/o la prevención de mieloma múltiple,
enfermedades autoinmunitarias, osteoporosis, caquexia o infecciones
bacterianas y víricas.
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