SK287522B6

SK287522B6 - Použitie inhibítorov produkcie a/alebo účinku IL-18

Info

Publication number: SK287522B6
Application number: SK88-2002A
Authority: SK
Inventors: Charles Dinarello
Original assignee: Ares Trading S. A.
Priority date: 1999-07-22
Filing date: 2000-07-17
Publication date: 2011-01-04
Also published as: BRPI0012675B1; CA2380216A1; EP1206274A2; BG65800B1; DE1206274T1; KR100682219B1; ATE363288T1; US7741276B2; JP4827352B2; ES2186596T3; CN1364086A; WO2001007480A2; HK1048248A1; UA73745C2; BG106311A; CY1107932T1; HUP0202107A3; WO2001007480A3; NO20020153D0; AR024907A1

Abstract

Použitie inhibítorov produkcie a/alebo účinku IL-18 na výrobu lieku na inhibíciu nádorových metastáz.

Description

Predložený vynález sa týka nádorových metastáz melanómu a prostriedkov na ich inhibíciu. Konkrétnejšie sa vynález týka predchádzania nádorovým metastázam melanómu prostredníctvom inhibície produkcie a/alebo účinku interleukínu-18 (IL-18). Inhibítory IL-18 sú vybrané z protilátok proti IL-18 receptorových podjednotiek, antagonistov IL-18 a IL-18 viažucich proteínov.

Doterajší stav techniky

Adherovanie cirkulujúcich rakovinových buniek na endotelium kapilár je rozhodujúcim krokom v genéze metastáz (1,2). Cievna bunková adhézna molekula-1 (VCAM-1), člen imunoglobulínovej superrodiny, sprostredkúva adherovanie hematopoetických buniek a aktivovaných leukocytov na prozápalové cytokínmi aktivované endoteliálne bunky (3-5). Ale adhezívnu funkciu VCAM-1 si môžu uzurpovať živočíšne a ľudské rakovinové bunky, aby zvýšili potenciál šírenia experimentálnych metastát (6).

Je napríklad známe, že IL-Ιβ a TNF-α posilňujú vytvárame metastáz melanómovými bunkami exprimujúcimi VLA-4 v pľúcnom tkanive mechanizmom zahŕňajúcim nadreguláciu expresie VCAM-1 v endoteliálnych bunkách (7-9). Demonštrovalo sa tiež, že IL-1 a TNF-α sa významne podieľajú na kolonizácii pečene B16M bunkami tak pri normálnych myšiach, ako aj pri myšiach ošetrených lipopoly-sacharidom (7,8,10-20). Okrem toho, aktivácia pečeňových sinusoidálnych endoteliálnych buniek (HSE) sprostredkovaná manózovým receptorom zahŕňa autokrinnú expresiu VCAM-1 HSE bunkami sprostredkovanú IL-Ιβ, ktorá vedie k zvýšeniu adherovania B16M buniek a k zvýšenej tvorbe metastáz (21). Ukázalo sa tiež, že IL-l^-aktivované HSE bunky vylučujú VLA-4-stimulačné faktory, ktoré posilňujú adherovanie B16M buniek na HSE bunky (11). Takže IL-Ιβ indukuje expresiu VCAM-1 a vylučovanie VLA-4-stimulačného faktora z HSE buniek, čo im môže poskytovať schopnosť vytvárať prometastázové mikroprostredie pre určité rakovinové bunky zastavené v intrasinusoide a exprimujúce VLA-4.

Ale blokovanie IL-Ιβ a TNF-α viedlo len k čiastočnému zrušeniu metastáz, z čoho vyplýva, že na tomto procese sa podieľajú aj iné faktory, buď kompenzujúce neprítomnosť IL-Ιβ a TNF-α, alebo účinkujúce prostredníctvom alternatívnych dráh. Navyše, väčšina metastazujúcich rakovinových buniek a cieľových tkanív nie je schopná produkovať tieto prozápalové cytokíny. Okrem toho koncentrácia endotoxínu alebo manózového receptorového ligandu nie je zvyčajne dostatočne zvýšená, aby indukovala vylučovanie pozápalových cytokínov. Teda množstvo mediátorov, ktoré iniciujú nadreguláciu VCAM-1 a jej podieľame sa na tranzite rakovinových buniek kapilárami, nie je dobre charakterizovaných.

Z Cytokine, 9 (110, November 1997, 897, je známe, že metastáze a rast melanómu B16 u myší s nedostatkom IL-Ιβ (ICE) sú redukované po vstreknutí B16 buniek inkubovaných so špecifickými ICE inhibítormi v porovnaní so vstreknutím neošetrených B16 buniek.

IL-18 (IFNy-indukujúci faktor) je nový cytokín, ktorý zdieľa štrukturálne znaky s IL-1 rodinou proteínov (22) a funkčné vlastnosti s IL-12 (23). Bolo zverejnené, že produkcia IL-18 Kupfferovými bunkami aktivuje tak TNF-α, ako aj FAS ligandom sprostredkované hepatotoxické dráhy pri poškodení pečene indukovanej endotoxínom (24). Najnovšie sa odhalilo, že IL-18 má aj prozápalové vlastnosti, prostredníctvom priamej stimulácie génovej expresie a syntézy TNF-α CD3⁺/CD4⁺ bunkami a prirodzenými zabíjačskými bunkami s následnou produkciou IL-Ιβ a IL-18 CD14⁺ populáciou, čím sa odhalila neočakávaná kľúčová pozícia IL-18 v hierarchii cytokínov (25). Ale jeho možná úloha pri rakovinových metastázach ešte nebola objasnená.

Z moču sa purifikoval proteín viažuci interleukín-18 (IL-18BP) chromatografiou na IL-18 gulôčkach, sekvenoval sa, klonoval a exprimoval v COS7 bunkách. IL-18BP ruší IL-18 indukciu interferónu-γ (IFN-γ), IL-8 a aktiváciu NF-κΒ in vitro. Podávanie IL-18BP myšiam ničilo cirkulujúci IFN-γ po LPS. Takže IL-18BP funguje ako inhibítor skorej Thl cytokínovej odpovede. IL-18BP sa konštitutívne exprimuje v slezine, patrí do imunoglobulínovej superrodiny a má obmedzenú homológiu s IL-1 receptorom typu II. Jeho gén bol lokalizovaný na ľudskom chromozóme 1 lql3 a v 8,3kb genómovej sekvencii sa nezistil žiadny exón kódujúci transmembránovú doménu. Niekoľko poxvírusov kóduje pravdepodobné proteíny, ktoré sú vysoko homologické s IL-18BP, čo naznačuje, že vírusové produkty môžu oslabovať IL-18 a interferovať s cytotoxickou T-bunkovou odpoveďou (28 a WO 99/09063). Ako je opísané konkrétnejšie vo WO 99/09063, IL-18BP a jeho muteíny, fuzované proteíny, funkčné deriváty, účinné frakcie a kruhovo permutované deriváty a ich zmesi sú schopné viazať sa na IL-18 a/alebo sú schopné modulovať aktivitu IL-18, a/alebo sú schopné blokovať aktivitu IL-18.

WO 98/41232 odhaľuje farmaceutické prostriedky, ktoré obsahujú IL-18 antagonistu na modulovanie citlivosti na kortikosteroidy.

EP 0 850 952 odhaľuje použitie protilátky na IL-18 receptor na inhibíciu IL-18 aktivity.

V Immunology Letters 68“ 135-139 je analyzovaný vzájomný vzťah medzi intratumorálnou IFN-gamma expresiou a klinickými výsledkami v prípade pacientov postihnutých karcinómom krčka maternice alebo kolorektálnym karcinómom. Je tam opísané, že nedostatok expresie IFN-gamma má súvislosť s existenciou vzdialenej metastázy a zlou prognózou.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je použitie inhibítorov produkcie a/alebo účinku IL-18 na výrobu lieku na inhibíciu nádorových metastáz melanómu.

Inhibítormi produkcie IL-18 sú napríklad inhibítory kaspázy-1.

Inhibítory účinku IL-18 sú vybrané zo skupiny, ktorá obsahuje protilátky proti IL-18, protilátky proti ktorejkoľvek IL-18 receptorovej podjednotke, inhibítory IL-18 receptorovej signalizačnej dráhy, antagonisty IL-18, ktoré konkurujú IL-18 a blokujú IL-18 receptor a IL-18BP proteíny, ich muteíny, fuzované proteíny, funkčné deriváty, účinné frakcie alebo ich kruhovo permutované deriváty, ktoré majú rovnakú aktivitu ako IL-18 viažuci proteín (IL-18BP).

Výhodne používanými inhibítormi sú IL-18BPs alebo ich muteín, fuzovaný proteín, funkčný derivát, aktívna frakcia alebo kruhovo permutovaný derivát, ktoré majú rovnaký účinok ako IL-18BP.

Predložený vynález poskytuje aj farmaceutické prostriedky na inhibíciu produkcie a/alebo účinku IL-18 na inhibíciu nádorových metastáz melanómu.

Iným spôsobom inhibície produkcie a/alebo účinku IL-18 na inhibíciu nádorových metastáz melanómu je zavedenie expresného vektora obsahujúceho kódujúcu sekvenciu inhibítora produkcie a/alebo účinku IL-18, ako napríklad IL-18BP, do tela.

Niekoľko prozápalových cytokínov, vrátane interleukínu (IL)-l β a nádorového nekrotického faktora a (TNF-a), podporuje adherovanie nádorových buniek na endoteliálne bunky, čo vedie k metastatickému šíreniu nádorov. Tieto prozápalové cytokíny podporujú adherovanie a metastázy pravdepodobne prostredníctvom cievnej bunkovej adhéznej molekuly-1 (VCAM-1). Predložený vynález dokazuje, že ošetrenie primáme kultivovaných hlodavčích HSE buniek s kondiciovaným médiom (C) z B16 melanómových (B16M) bunkových kultúr (B16M-CM) tiež indukuje produkciu IL-Ιβ a TNF-α HSE bunkami in vitro. Ale ešte sa zrejmým spôsobom nedokázalo, že nádorové metastázy sú naozaj sprostredkované IL-Ιβ a TNF-a.

Predložený vynález ukazuje, že B16M-CM indukuje produkciu IL-18 HSE bunkami, a že IL-18 je cytokín podieľajúci sa na zvyšovaní adherovania B16M buniek na HSE bunky. IL-18 posilňuje adherovanie prostredníctvom aktivácie expresie VCAM-1 v HSE bunkách, bez toho, aby bolo zahrnuté TNF-α alebo IL-Ιβ. Inkubovanie HSE buniek so špecifickým inhibítorom kaspázy-1 (10 μΜ, 18 hodín) úplne ruší B16M-CM-indukovanú adhezívnosť bez toho, aby bola znížená produkcia TNF-α, a účinok sa nezvráti pridaním myšacieho IL-Ιβ. Pridanie protihlodavčej IL-18 protilátky k HSE bunkám zabraňuje B16M-CM-indukovanej adhezívnosti bez toho, aby interferovalo s B16M-CM-indukciou IL-Ιβ a TNF-α. Podobne, v súčasnosti klonovaný proteín viažuci IL-18 (IL-18BP) tiež zabraňuje B16M-CM indukovanému adherovaniu B16M na HSE bunky in vitro. Inhibítory TNF-α a IL-Ιβ, ako napríklad p55 rozpustný TNF-receptor alebo IL-1 receptorový antagonista, neboli schopné zvrátiť toto IL-18-indukované adherovanie. Takže predložený vynález poskytuje inhibítory produkcie a účinku IL-18 ako nástroje na inhibíciu nádorových metastáz melanómu. Inhibítory produkcie IL-18 zahŕňajú inhibítory kaspázy-1. Inhibítory účinku IL-18 sú vybrané zo skupiny, ktorá obsahuje protilátky nasmerované proti IL-18, protilátky nasmerované proti ktorejkoľvek z dvoch známych IL-18 receptorových podjednotiek, inhibítory IL-18 receptorovej signalizačnej dráhy, antagonisty IL-18, ktoré konkurujú IL-18 a blokujú IL-18 receptor a proteíny viažuce IL-18, ktoré sa viažu na IL-18 a blokujú jeho biologický účinok.

Predložený vynález sa týka možnej úlohy IL-18 v nadregulácii expresie VCAM-1 sprostredkovanej prozápalovými cytokínmi, jeho možnej interakcie s inými cytokínmi a prostriedku na zabránenie tejto indukcii VCAM-1. V súlade s predloženým vynálezom sa zistilo, že IL-18 sa zúčastňuje na iniciácii prozápalových dejov vedúcich k nadregulácii VCAM-1 v pečeňovej sinusoidálnej stene, a tým uľahčuje adherovanie nádorových buniek a tvorbu metastáz. Primáme kultivované myšacie HSE bunky ošetrené s B16M-CM boli použité ako model aktivácie endoteliálnych buniek závislej od nádorových buniek, aby sa skúmala úloha IL-18 indukovaného B16M bunkami v mechanizme adherovania B16M buniek na HSE prostredníctvom VCAM-1-závislého mechanizmu. Špecifická úloha IL-18 sa skúmala v podmienkach blokády špecifického IL-1 receptora použitím IL-IRa, inhibovania vylučovania IL-18 a zrelého IL-Ιβ použitím ireverzibilného inhibítora IL-1 konvertujúceho enzýmu (ICEi), blokády TNF použitím p55 TNF-rozpustného receptora (TNF-sR p55) a blokády funkcie IL-18 použitím anti-IL-18 protilátok a proteínu viažuceho IL-18. Okrem toho sa do sleziny ICE'⁷' a IL-Ιβ' myší injektovali B16M bunky. Nízka hustota metastáz pozorovaná v deficientných myšiach v porovnaní s normálnymi kontrolami naznačuje, že na prometastatickej úlohe zápalu sa podieľa IL-1β a možno IL-18 (tabuľka 1).

Uskutočnené in vitro experimenty dokazujú, že produkcia IL-18 spôsobuje stimulujúce účinky HSE adherovania, ktoré sú indukované supematantmi odvodenými od B16M buniek. Keďže nadregulácia VCAM-1 spôsobuje celý adherovanie-stimulujúci účinok B16M-CM-ošetrených HSE, z údajov vyplýva, že IL-18 sprostredkúva expresiu cytokínmi indukovanými HSE. Navyše, protilátky proti IL-18 znižovali B16M-CM inhibované adherovanie buniek bez ovplyvnenia produkcie TNF-α a IL-1 β HSE bunkami. Preto bola produkcia IL-Ιβ a TNF-α HSE bunkami nezávislá od IL-18 a nepodieľala sa na adherovaní. Naopak, ani TNF-sR p55, ani IL-IRa, neboli schopné inhibovať zvýšenie adherovania pri IL-18-ošetrených HSE bunkách, čo potvrdzuje, že ani autokrinné TNF-α, ani IL-Ιβ sa nepodieľajú na HSE adhezívnosti.

Výsledky v HSE bunkách kontrastujú s výsledkami získanými v iných bunkových systémoch, ako napríklad iných ako CD14⁺ ľudských krvných mono-nukleámych bunkách (25), kde IL-18 indukoval IL-Ιβ prostredníctvom produkcie TNF-α. Je pravdepodobné, že existuje HSE-špecifická prozápalová cytokínová hierarchia, v ktorej sú TNF-α a IL-Ιβ nezávislé od IL-18 kontroly, ktorá ale využíva IL-18 ako následný mediátor nadregulácie VCAM-1.

Na rozdiel od hlodavčích HSE buniek, neexprimovali B16M bunky IL-18 gén, čo sa kontrolovalo RT-PCR, a 18-hodinové inkubovanie s ICEi nerušilo cytokíny stimulujúce a adherovanie stimulujúce aktivity B16M-CM vo vzťahu k HSE. Ale lokálna produkcia IL-18 môže ovplyvniť správanie sa B16M buniek v priebehu ich tranzitu alebo zastavenia sa v mikrovaskulatúre pečene. Ďalším zistením bolo, že 6-hodinové inkubovanie B16M buniek s 1 ng/ml hlodavčieho IL-18 dvojnásobne zvyšuje ich adherovanie na neošetrené HSE, a že pridanie anti-VCAM-1 protilátky k HSE znižuje IL-18-sprostredkované adherovanie o 80 %, čo naznačuje, že bola zahrnutá interakcia VCAM-l/VLA-4. Podobne aj B16M bunky, ktoré 6-hodín dostávali supematant z B16M-CM-ošetrených HSE, významne zvýšili (p<0,01), až dvojnásobne, ich adherovanie na HSE mechanizmom závislým od VCAM-1 a anti-IL-18 protilátka zrušila tento adherovanie stimulujúci účinok.

Zistenia podľa predloženého vynálezu naznačujú, že IL-18 je novým spojivom medzi vylučovaním prozápalových cytokínov pečeňou a vývojom metastáz. Jeho produkovanie nádorom-aktivovanými HSE bunkami determinuje dva komplementárne mechanizmy podieľajúce sa na regulácii adherovania melanómových buniek na HSE bunky: autokrinný mechanizmus v HSE, ktorý riadi TNF-a/IL-^-sprostredkovanú nadreguláciu VCAM-1, a parakrinný mechanizmus v B16M bunkách, ktorý nadreguluje melanómový bunkový VLA-4, čím posilňuje ich adherenčnú schopnosť závislú od VCAM-1. Táto simultánna molekulová nadregulácia oboch bunkových adherenčných partnerov spôsobuje, že interakčná dráha rakovinových a kapilárnych endoteliálnych buniek je veľmi dôležitá.

IL-18 indukované adherovanie B16M buniek sa ruší inhibítormi produkcie a/alebo účinku IL-18. Inhibítory produkcie IL-18 zahŕňajú inhibítory kaspázy-1. Inhibítory účinku IL-18 sú vybrané zo skupiny, ktorá obsahuje protilátky proti IL-18, protilátky proti ktorejkoľvek z dvoch známych IL-18 receptorových podjednotiek, inhibítory IL-18 receptorovej signalizačnej dráhy, antagonisty IL-18, ktoré konkurujú IL-18 a blokujú IL-18 receptor, a IL-18 viažuce proteiny, ktoré sa viažu na IL-18 a blokujú jeho biologický účinok.

Okrem priameho použitia inhibítorov produkcie a/alebo účinku IL-18, predložený vynález zahŕňa aj zavedenie do buniek, v ktorých je želateľný efekt inhibovania produkcie a/alebo účinku IL-18. Na tento účel je nevyhnutný systém na špecifické zavádzanie, napr. DNA kódujúcej IL-18BP, do buniek. V oblasti je známych niekoľko možností, ako to uskutočniť. Napríklad, do buniek sa môže zaviesť vhodný vektor nesúci uvedenú DNA, ktorý je schopný účinne včleniť DNA do buniek takým spôsobom, že v bunkách sa DNA exprimuje. Spôsoby dodávania do buniek sú opísané medzi iným napr. v US patente 5910487, WO 99/29349 a iných.

Farmaceutické prostriedky vhodné na použitie podľa vynálezu na inhibovanie produkcie a/alebo účinku IL-18 sú také prostriedky, ktoré ako účinnú zložku obsahujú inhibítor vybraný zo skupiny, ktorá zahŕňa inhibítor kaspázy-1, protilátku proti IL-18, protilátku proti ktorejkoľvek IL-18 receptorovej podjednotke, inhibítor IL-18 receptorovej signalizačnej dráhy, antagonistu, ktorý konkuruje IL-18 a blokuje IL-18 receptor a IL-18BP alebo jeho muteín, fuzovaný proteín, funkčný derivát, účinnú frakciu alebo kruhovo permutovaný derivát, ktoré majú rovnaký účinok ako IL-18BP.

Výrazy muteín, fuzovaný proteín, funkčný derivát, účinná frakcia a kruhovo permutovaný derivát majú rovnaký význam, aký je uvedený vo WO 99/09063.

Výhodnými účinnými zložkami farmaceutických prostriedkov sú protilátky proti IL-18 a IL-18BPs.

Farmaceutické prostriedky môžu obsahovať aj bežné nosiče, excipienty a iné zložky známe v oblasti v závislosti od ich spôsobu aplikácie, t. j. injekciou, orálne alebo akýmkoľvek iným spôsobom známym v oblasti.

Konkrétna dávka bude závisieť od spôsobu aplikácie, telesnej hmotnosti pacienta a iných faktorov a v každom prípade bude stanovovaná lekárom.

Po opísaní vynálezu ho bude možné jednoduchšie pochopiť prostredníctvom odvolania sa na nasledujúce príklady, ktoré sú poskytnuté ako ilustrácia a nie sú mienené ako obmedzujúce predložený vynález.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1. Experimentálna kolonizácia pečene po vnútroslezinnej injekcii B16M buniek v divom type myší, v IL-Ιβ'⁷' a ICE’⁷' myšiach. Pečene sa odstránili na 10. deň po injekcii B16M buniek a fixovali sa vo fosfátom tlmenom fyziologickom roztoku s 10 % formaldehydom. Z pečení IL-Ιβ'⁷' a ICE'⁷’ myší zmizli takmer všetky experimentálne metastázy (čierne melanotické uzly).

Obrázok 2. Účinok ireverzibilného ICE inhibítora a protimyšacej IL-18 protilátky na adherovanie B16M buniek na HSE bunky a na produkciu IL-1 β a TNF-α neošetrenými a B16M-CM-ošetrenými HSE. Kultivované HSE bunky sa inkubovali v prítomnosti B16M-CM 10 hodín. V určitých experimentoch dostali tak neošetrené, ako aj ošetrené HSE bunky 10 μΜ ICEi alebo 10 pg/ml protimyčacej IL-18 protilátky, pred podaním B16M-CM. Percento B16M buniek adherovaných na HSE substráte sa vypočítalo ako relatívna hodnota vo vzťahu k počiatočnému počtu pridaných buniek. Okrem toho sa pred adherovaním izolovali kultivačné supematanty, aby sa stanovila, pomocou ELISA, koncentrácia IL-1 β a TNF-α. Údaje predstavujú priemer ± SD 4 oddelených experimentov, z ktorých každý sa opakoval šesťkrát (n=24). Zvýšenie adherovania B16M buniek na B16M-CM-ošetrené HSE a zvýšenie produkcie IL-1 β alebo TNF-α v porovnaní s neošetrenými HSE (*p<0,01) bolo štatisticky významné podľa Študentovho dvojitého, nepárového t-testu. Nezistili sa žiadne štatisticky významné zmeny v produkcii IL-1 β alebo TNF-α, ani v adherovaní B16M buniek na HSE bunky, keď sa tieto ošetrili s ICEi alebo anti-IL-18 protilátkou, v prípade, že chýbal B16M-CM (údaje nie sú uvedené).

Obrázok 3. Účinok ICEi na adherovanie B16M buniek na B16M-CM-ošetrené HSE in vitro. HSE bunky sa inkubovali so základným médiom alebo s B16M-CM 8 hodín. K niektorým HSE bunkám sa 18 hodín pred B16M-CM pridalo 10 μΜ ICEi. Okrem toho sa k niektorým HSE bunkám na 8 hodín spolu s B16M-CM pridal aj 1 ng/ml rekombinantného hlodavčieho IL-1 β. V iných experimentoch HSE bunky dostali 1 ng/ml hlodavčieho IL-Ιβ alebo 100 pg/ml TNF-α na 6 hodín a hodinu pred ošetrením sa pridalo alebo nepridalo 10 pg/ml králičej protimyšacej IL-18 poly-klonálnej protilátky. K neošetreným a ku cytokínom ošetreným HSE bunkám sa pridala aj nešpecifická IgG polyklonálna protilátka. Potom sa HSE bunky premyli a pridali sa B16M bunky značené s BCEFCF-AM a o 8 minút sa znova premyli. Percento B16M buniek adherovaných na HSE substrát sa vypočítalo ako relatívna hodnota vo vzťahu k počiatočnému počtu pridaných buniek. Výsledky predstavujú priemer ± SD troch oddelených experimentov, z ktorých každý sa opakoval šesťkrát (n=18). Rozdiely v stupni adherovania, čo sa týka neošetrených HSE (*) a IL-Ιβ- alebo TNF-a-ošetrených HSE (**), boli štatisticky významné (p<0,01) podľa Študentovho dvojitého, nepárového t-testu. Nezistili sa žiadne štatisticky významné zmeny v adherovaní B16M buniek na iné ICEi-ošetrené kontrolné HSE, ku ktorým sa dodatočne na 8 hodín pridal alebo nepridal 1 ng/ml hlodavčieho IL-Ιβ (údaje nie sú uvedené).

Obrázok 4. In vitro adherovanie B16M buniek na IL-18-ošetrené HSE. HSE bunky sa inkubovali s 1 ng/ml rekombinantného hlodavčieho IL-18 6 hodín. V niektorých experimentoch sa 10 minút pred IL-18 pridalo 10 pg/ml TNF-sRp55 alebo 100 ng/ml IL-IRa. V iných experimentoch sa 30 minút pred B16M bunkami k HSE bunkám pridalo 10 pg/ml anti-VCAM-1 protilátky alebo podobná koncentrácia nešpecifickej protimyšacej IgG. Potom sa stanovilo percento adherovania B16M buniek, ako bude opísané v príkladoch. Výsledky predstavujú priemer ±SD troch oddelených experimentov, z ktorých každý sa opakoval šesťkrát (n=18). Rozdiely v stupni adherovania medzi HSE ošetrenými základným médiom (*) a IL-18 ošetrenými HSE (**) boli štatisticky významné (p<0,01) podľa Študentovho dvojitého, nepárového t-testu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Reakčné činidlá

Potkanie anti-myšacie IgG a potkanie anti-myšacie VCAM-1 monoklonálne protilátky sa získali od Serotec Ltd. (Oxford, Anglicko). Rekombinantné hlodavčie IL-Ιβ sa získalo od R&D Systém Inc. (Minneapolis, MN). Rekombinantný antagonista IL-1 receptora (IL-IRa) bol láskavým darom od The Upjohn Co. (Kalamazoo, MI) a ľudský p55 TNF rozpustný receptor (TNFsR p55) bol láskavým darom od Serono Inc., Norwell, MA. Inhibítor enzýmu konvertujúceho IL-Ιβ (ICEi) sa získal od Alexis Co. (San Diego, CA). Rekombinantný hlodavčí IL-18 a králičia anti-myšacia IL-18 polyklonálna protilátka IgG sa kúpili od PeproTech EC Ltd. (Londýn, UK). IL-18 viažuci proteín (IL-18BP) sa produkoval, ako je opísané v (28).

Kultivácia B16M buniek

B16M bunky sa kultivovali, udržiavali a pasážovali, ako už bolo opísané v (11). B16M kondiciované médium (B16M-CM) sa pripravilo nasledovne: 5xl0⁵ buniek sa vysialo na 25 cm² T-fľaše a kultivovalo sa 24 hodín. Potom sa bunky kultivovali ďalších 24 hodín v 5 ml média bez séra (konečná hustota buniek 6x10⁴ buniek/cm²). Supematanty sa spojili, nariedili sa čerstvým médiom bez séra v pomere 3:1a prefiltrovali sa cez 0,22 pm filter.

Cytokínová analýza

Vylučovanie cytokínov z primárnych kultivovaných HSE buniek a B16M buniek sa meralo použitím špecifických ELISA kitov na základe anti-myšacej IL-Ιβ monoklonálnej protilátky a anti-myšacej TNF-α monoklonálnej protilátky v súlade s odporúčaniami výrobcu (R&D Systems, Minneapolis, MN).

Príklad 1

Kvantitatívne adherovanie B16M buniek na primáme HSE kultúry

HSE sa separovali zo syngénnych myší, identifikovali sa a kultivovali, sa ako už bolo predtým opísané v (26). B16M bunky sa označili s 2’,7’-bis-(2-karboxyetyl)-5,6-karboxyfluórsceín-acetoxymetylesterovým roztokom (MCECF-AM, Molecular Probes, Eugene, OR), ako bolo uvedené v (16). Potom sa do 24-jamkovej platne pridali kultivované HSE v množstve 2xl0⁵ buniek/jamku a o osem minút neskôr sa jamky trikrát premyli s čerstvým médiom. Počet naadherovaných buniek sa stanovoval použitím kvantitatívnej metódy založenej na predtým opísanom fluorescenčnom meracom systéme (16). V niektorých experimentoch sa HSE bunky niekoľko hodín pred pridaním B16M buniek predinkubovali s B16M-CM.

Príklad 2

Test pečeňových metastáz

Divý typ, IL-Ιβ·⁷' a ICE'⁷' samčeky C57BL/6J myší sa generovali, ako bolo predtým opísané v (27). Používali sa myši staré šesť až osem týždňov, ktoré sa chovali v klietkach po päť. Pečeňové metastázy sa produkovali prostredníctvom injekcie 3xl0⁵ životaschopných B16 melanómových buniek suspendovaných v 0,1 ml Hanksovho vyváženého slaného roztoku do sleziny anestetizovaných myší (Nembutal, 50 mg/kg, intraperitoneálne). Myši sa usmrtili v anestéze na 10. deň po injekcii rakovinových buniek. Pečeňové tkanivo sa spracovalo na histológiu. Na rozlíšenie metastatických B16M od normálneho pečeňového tkaniva bola použitá denzitometrická analýza digitalizovaných mikroskopických obrázkov a hustota pečeňových metastáz, čo je počet metastáz na 100 mm³ pečene (vztiahnuté na priemerný počet miest detegovaných v pätnástich 10 x x 10mm² rezoch na pečeň), sa vypočítala použitím predtým opísaných stereologických postupov (17).

Príklad 3

Redukovanie metastáz a rastu BI6M buniek injektovaných do IL-Ιβ a ICE deficientných myší

Dva nezávislé experimenty s ročným odstupom sa uskutočnili použitím dvoch rozličných vzoriek rovnakých B16M buniek, ktoré sa injektovali do pečene dospelých myší C57B1/6J divého typu, ICE'⁷' a IL-Ιβ'⁷'. Nekrospické vyšetrenie demonštrovalo viditeľné melanotické nádory v pečeni všetkých testovaných myší bez významných rozdielov vo veľkosti, čo sa hodnotilo prostredníctvom hmotnosti sleziny (tabuľka 1). Na rozdiel od toho, nastalo značné zníženie metastáz v IL-Ιβ'⁷' a najmä ICE’⁷' myšacích pečeniach v porovnaní s pečeňami myší divého typu (obrázok 1). Uskutočňovali sa kvantitatívne histologické analýzy počtu a veľkosti metastatických lokusov, aby sa stanovila hustota metastáz (ako počet lokusov na 100 mm³) a objemové parametre (zaberanie orgánu v percentách) v študovaných myšacích pečeniach. V porovnaní s divým typom myší (tabuľka 1) sa hustota pečeňových metastáz významne (p<0,01) znížila v pečeniach IL-Ιβ'⁷' myší a ICE'⁷' myší o 84 % až 90 %, z čoho vyplýva, že väčšina injektovaných BI6M buniek nebola schopná implantovať sa do pečeňového tkaniva z týchto myší. Okrem toho sa významne (p<0,01) znížil aj objem metastáz v pečeniach IL-Ιβ'⁷' myší a ICE'⁷' myší, 6- až 7-krát v porovnaní s hodnotami v pečeniach divých typov myší, z čoho vyplýva, že B16M bunky, ktorým sa podarilo kolonizovať pečeň, mali aj zníženú rýchlosť rastu. Pozorovali sme tiež rozdiely v týchto metastatických parametroch medzi pečeňami IL-Ιβ'⁷' myší a ICE'⁷' myší, ktoré viedli k vymiznutiu metastáz takmer vo všetkých pečeniach ICE'⁷' myší z pokusu I (obrázok 1).

Tabuľka 1

Kvantitatívna histologická analýza experimentálnej kolonizácie pečene B16M bunkami, ktoré sa injektovali do slezín, v IL-Ιβ'⁷' a ICE'⁷' myšiach

Skupina myší	Hustota metastáz (ako počet lokusov/ lOOmm³)	Objem metastáz (ako % objemu pečene)
Pokus I
Divý typ myší	234,16 ±58,36	66,18%
IL-Ιβ’⁷' myši	25,18 + 21,02*	10,05 %
ICE'⁷' myši	13,56 ± 16,20*	2,1 %
Pokus II
Divý typ myší	198,40 ± 100,54	59,62 %

Skupina myší	Hustota metastáz (ako počet lokusov/lOOmm³)	Objem metastáz (ako % objemu pečene)
IL-Ιβ'⁷' myši	33,79 ± 19,89*	9,70 %
ICE'⁷' myši	27,73 ± 15,68*	8,08 %

Údaje predstavujú priemerné hodnoty ± SD z dvoch nezávislých pokusov (používalo sa 7 až 15 myší na pokusnú skupinu).

* Označené sú rozdiely, ktoré boli štatisticky významné (dvojstranné, p<0,01) vo vzťahu k divému typu myší využitím analýzy odchýlky (ANOVA) a Scheffeho F-testu.

Príklad 4

Autokrinné IL-18 sprostredkúva TNF-α a IL-Ιβ-indukovanú adhezívnosť B16M-CM-aktivovaných HSE

B16M-CM významne (p<0,01) znižovalo produkciu TNF-α a IL-Ιβ HSE bunkami a ich adhezívnosť na iné B16M bunky in vitro (obrázok 2). Inkubovanie HSE s 10 μΜ ICEi v priebehu 18 hodín úplne zrušilo B16M-CM-indukovanú adhezívnosť bez toho, aby znižovalo produkciu TNF-α HSE bunkami. Exogénne pridanie hlodavčieho IL-Ιβ nekompenzovalo blokovací účinok ICEi na HSE, čo je v rozpore s významným zvýšením adherovania B16M buniek na IL-Ιβ-ošetrené kontrolné HSE (obrázok 3). Zo skutočnosti, že B16M-CM-indukované posilnenie adherovania bolo zrušené v prítomnosti zvýšených koncentrácií endogénne produkovaného TNF-α a exogénne pridávaného IL-Ιβ vyplýva, že žiadny z týchto cytokínov priamo nespôsobuje nadreguláciu HSE adhezívnosti. Dôležité je, že prítomnosť anti-hlodavčej IL-18 protilátky pridanej k HSE pred ich stimulovaním s B16M-CM, zabránilo B16M-CM-indukovanej adhezívnosti bez toho, aby ovplyvnilo indukovanú produkciu IL-Ιβ a TNF-α HSE bunkami (obrázok 2). Okrem toho, anti-IL-18 protilátka zabraňovala aj adherenciu stimulujúcim účinkom hlodavčieho IL-Ιβ a TNF-α na HSE (obrázok 3), z čoho vyplýva, že proadhezívne účinky oboch týchto cytokínov na HSE boli sprostredkované IL-18. RT-PCR potvrdila, že HSE bunky exprimujú IL-18 gén (údaje nie sú uvedené). Naopak, hlodavčí IL-18 významne (p<0,01) zvyšoval adherovanie B16M buniek na HSE (obrázok 4), a ani TNF-sR p55, ani IL-IRa to neboli schopné inhibovať, čo potvrdzuje, že ani autokrinné TNF-α, ani IL-Ιβ sa nepodieľajú na IL-18-indukovanej adhezívnosti HSE. Ale, ako je znázornené na obrázku 4, anti-VCAM-1 protilátka úplne inhibovala adherovanie B16M buniek na IL-18-ošetrené HSE. Kontrolné, nešpecifické IgG neovplyvňovalo nadregulovanie adherovania B16M buniek na IL-18-ošetrené HSE.

Príklad 5

IL-18BP zabraňuje adherovaniu B16 melanómových buniek indukovaných BI6-kondiciovaným médiom

Ako je uvedené v tabuľke 2, pridanie IL-18BP k HSE stimulovaným s B16-CM znižovalo percento adherujúcich buniek z 35 % na 8,70 % (p<0,01). To predstavuje 100 % inhibíciu, keďže úroveň adherovania bola nižšia ako adherovanie buniek použitím základného média. Tieto výsledky naznačujú, že endogénne IL-18 z HSE môže byť endogénnym zdrojom IL-18 okrem IL-18 nachádzajúceho sa v B16M-CM.

Tabuľka 2

Inhibičný účinok IL-18BP na adherovanie B16 melanómových buniek indukovaných BI6-kondiciovaným médiom na pečeňové sinusoidálne endoteliálne bunky

	% Adherovaných melanómových buniek
Základné médium	10,15 ± 1,5
B16-CM	35,10 ±4,4
B16-CM/IL-18BP (1 ng/ml)	15,00 ±2,5**
B16-CM/IL-18BP (10 ng/ml)	8,70 ± 1,1**

Údaje predstavujú priemerné hodnoty ±SD z dvoch nezávislých pokusov uskutočnených šesťkrát (n=12) ** Označené sú rozdiely, ktoré boli štatisticky významné (dvojstranné, p<0,01) vo vzťahu k B16-CM využitím analýzy odchýlky (ANOVA) a Scheffeho F-testu.

Použitá literatúra

1. Kohn, E.C. a Liotta, L.A. (1995) Cancer Res 55(9), 1856-62

2. Nicolson, G.L. a Winkelhake, J.L. (1975) Náture 255, 230-232

3. Freedman, A., Munro, M., Rice, G.E., Bevilacqua, M.P., Morimoto, C., Mclntyre, B.W., Rhynhart, K., Pober, J.S. a Ňadier, L.M. (1990) Science 249, 1030-1033

4. Miyake, M., Fuchimoto, S., Iwagaki, H., Matsubara, N., Edamatsu, R., Hiramatsu, M. a Orita, K. (1991) Res. Comm. Chem. Pathol. Pharmacol. 71, 293-307

5. Simmons, P.J., Masinovsky, B., Longenecker, B.M., Berenson, R., Torok-Storb, B. a Gallatin, W.M. (1992) Blood 80(2),388-95

6. Rice, G.E. a Bevilacqua, M.P. (1989) Science 246, 1303-1306

7. Okahara, H., Yagita, H., Miyake, K. a Okumura, K. (1994) Cancer Res 54, 3233-3236

8. Garofalo, A., Chirivi, R.G.S., Foglieni, C., Pigot, R., Mortarini, R., Martin-Padura, I., Anichini, A., Gearing, A.J., Sanchez-Madrid, F., Dejana, E. a Giavazzi, R. (1995) Cancer Res 55,414-419

9. Martin-Padura, I., Mortarini, R., Lauri, D., Bemasconi, S., Sanchez-Madrid, F., Parmiani, G., Mantovani,

A., Anichini, A. a Dejana, E. (1991) Cancer Res 51, 1139-2241

10. Lauri, D., Bertomeu, M.C. a Orr, F.W. (1990) Clin Exp Metastasis 8, 27-32

11. Anasagasti, M.J., Alvarez, A., Martin, J.J., Mendoza, L. a Vidal-Vanaclocha, F. (1997) Hepatology 25, 840-846

12. Bani, M.R., Garofalo, A., Scanziani, E. a Giavazzi, R. (1991) J. Natl. Cancer Inst. 83, 119-123

13. Bertomeu, M.C., Galie, S., Lauri, D., Haas, T.A., Orr, F.W., Baslida, E. a Buchanan, M.R. (1993) Clin Exp Metastasis 11, 243-250

14. Burrows, F.J., Haskard, D.O., Hart, I.R., Marshall, J.F., Selkirk, S., Poole, S. a Thrope, P.E. (1991) Cancer Res 51,4768-4775

15. Chirivi, R.G.S., Garofalo, A., Padura, I.M., Mantovani, A. a Giavazzi, R. (1993) Cancer Res 53, 50515054

16. Vidal-Vanaclocha, R., Amézaga, C., Asumendi, A., Kaplánski, G. a Dinarello, C.A. (1994) Cancer Res 54, 2667-2672

17. Vidal-Vanaclocha, F., Alvarez, A., Asumendi, A., Urcelay, B., Tonino, P. a Dinarello, C.A. (1996) J Natl Cancer Inst 88, 198-205

18. Malik, S.T., Naylor, M.S., East, N., Oliff, A. a Balkwill, F.R. (1990) Eur J Cancer 26, 1031-1034

19. Orosz, P., Echtenacher, B., Falk, W., Ruschoff, J., Weber, D. a Mannel, D.N. (1993) J Exp Med 177, 1391-1398

20. Orosz, P., Kruger, A., Hubbe, M., Ruschoff, J., Von Hoegen, P. a Männel, D.N. (1995) Int. J. Cancer 60, 867-871

21. Mendoza, L., Olaso, E., Anasagasti, M.J., Fuentes, A. a Vidal-Vanaclocha, F. (1998) J Celí Physiol 174, 322-330

22. Bazan, J.F., Timans, J.C. a Kastelein, R.A. (1996) Náture 379 (6566), 591

23. Okamura, H., Tsutsui, H., Komatsu, T., Yutsudo, M., Hakura, A., Tanimoto, T., Torigoe, K., Okura, T., Nukada, Y., Hattori, K., Akita, K., Namba, M., Tanabe, F., Konishi, K., Fukuda, S. a Kurimoto, M. (1995) Náture 378, 88-91

24. Tsutsui, H., Matsui, K., Kawada, N., Hyodo, Y., Hayashi, N., Okamura, H., Higashino. K. a Nakanishi, K. (1997) J Immunol 159(8), 3961-7

25. Puren, A.J., Fantuzzi, G., Gu, Y., Su, M.S.S. a Dinarello, C.A. (1998) J Clin Invest 101, 711-724

26. Vidal-Vanaclocha, F., Rocha, M., Asumendi, A. a Barbera-Guillem, E. (1993) Hepatology 18, 328-339

27. Fantuzzi, G., Puren, A.J., Harding, M.W., Livingston, D.J. a Dinarello, C.A. (1998) Blood 91, 2118-2125

28. Novick, D., Kim, S.H., Fantuzzi, G. Rezníkov, L.L., Charles A. Dinarello, C.A. a Rubinstein, M. (1999) Immunity 10, 127-136

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Použitie inhibítorov produkcie a/alebo účinku IL-18 na výrobu lieku na inhibíciu nádorových metastáz melanómu, kde inhibítor účinku IL-18 je vybraný z protilátok proti IL-18, protilátok proti ktorejkoľvek z IL-18 receptorových podjednotiek, antagonistov IL-18, ktoré konkurujú IL-18 a blokujú IL-18 receptor, a IL-18 viažucich proteínov, ich muteínov, fuzovaných proteínov, funkčných derivátov, účinných frakcií alebo kruhovo permutovaného derivátu, ktoré majú rovnaký účinok ako IL-18 viažuci proteín - IL-18BP.

2. Použitie podľa nároku 1, kde melanómomje pečeňový melanóm.

3 Použitie podľa nároku 1, kde inhibitorom produkcie IL-18 je inhibítor kaspázy-1, ktorý sa viaže konkrétne a ireverzibilné na IL-18.

4. Použitie podľa nároku 1, kde inhibitorom IL-18 je protilátka proti IL-18.

5. Použitie podľa nároku 1, kde inhibitorom účinku IL-18 je IL-18BP alebo jeho muteín, derivát alebo fragment, ktoré majú rovnaký účinok ako IL-18BP.

6. Použitie expresného vektora kódujúceho inhibítor produkcie a/alebo účinku IL-18, podľa nároku 1, na výrobu lieku na inhibíciu nádorových metastáz melanómu.