PT1206274E - Utilização de inibidores de interleucina-18 para inibir a metástase de tumores. - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"UTILIZAÇÃO DE INIBIDORES DE INTERLEUCINA-18 PARA INIBIR A METÁSTASE DE TUMORES" Área da invenção A presente invenção relaciona-se com metástase de tumores de melanoma e meios para a inibir. Mais especificamente, a invenção relaciona-se com a prevenção de metástase de tumores de melanoma através da inibição da produção e/ou acção de interleucina-18 (IL-18). Os inibidores de IL-18 são seleccionados de anticorpos contra o receptor de IL-18, subunidades antagonistas de IL-18 e proteínas de ligação à IL-18.

Antecedentes da invenção A adesão de células cancerosas circulantes ao endotélio capilar é um passo crítico na génese de metástases (1,2). A molécula de adesão celular vascular-1 (VCAM-1), um membro da superfamília de imunoglobulinas, medeia a adesão de células hematopoiéticas e leucócitos activados às células endoteliais pró-inflamatórias activadas por citocinas (3-5). No entanto, a função adesiva da VCAM-1 pode ser usurpada por células cancerosas animais e humanas para potenciar a disseminação metastática experimental (6).

Por exemplo, sabe-se que a IL-Ιβ e o TNF-α potenciam a metástase de células de melanoma que expressam VLA-4 no tecido do pulmão por um mecanismo que envolve a regulação positiva da expressão da VCAM-1 pelas células endoteliais (7-9). Foi também demonstrado que a IL-1 e o TNF-a contribuem significativamente para a colonização hepática de células B16M em ratinhos normais e tratados com 2 lipopolissacáridos (7,8,10-20). Além disso, a activação de células do endotélio sinusoidal hepático mediada pelo receptor da manose (HSE) envolve a expressão da VCAM-1 por células HSE mediada pela IL- 1β autócrina, levando a uma maior adesão das células B16M e à metástase (21). Foi também demonstrado que as células HSE activadas pela IL-Ιβ libertam factores de estimulação VLA-4, os quais potenciam a adesão de células B16M às células HSE (11). Deste modo, a IL-Ιβ induz a expressão de VCAM-1 e a libertação o factor de estimulação VLA-4 de células HSE, os quais lhe podem conferir a capacidade de criar um microambiente pró-metastático para determinadas células cancerosas que expressam VLA-4 presas intrassinusoidalmente.

No entanto, o bloqueio da IL- 1β e do TNF-α conduziu apenas a uma anulação parcial da metástase, indicando que também estão envolvidos outros factores que compensam a sua ausência ou actuam por percursos alternativos. Além disso, a maior parte das células cancerosas em metástase e os tecidos alvo são incapazes de produzir estas citocinas pró-inflamatórias. Além do mais, duma maneira geral, a concentração de endotoxina ou do ligando do receptor de manose não aumenta de modo suficiente para induzir a libertação de citocinas pró-inflamatórias. Por esse motivo, os vários mediadores que evocam a regulação positiva da VCAM-1 e o seu envolvimento durante a transição capilar de células cancerosas não estão bem caracterizados.

Sabe-se de Cytokine, 9 (11), Novembro de 1997, 897, que a metástase e crescimento de melanoma B16 em ratinhos deficientes na enzima de conversão da IL-Ιβ (ICE) é diminuída após injecção de células B16 incubadas com 3 inibidores específicos da ICE por comparação com células B16 não tratadas. A IL-18 (factor de indução de IFNy) é uma nova citocina que partilha particularidades estruturais com a família IL-1 de proteínas (22) e propriedades funcionais com a IL-12 (23) . Foi descrito que a produção de IL-18 a partir de células de Kupffer activa os percursos hepatotóxicos mediados por ligandos de TNF-α e FAS em lesões hepáticas induzidas por endotoxinas (24). Mais recentemente foi revelado que a IL-18 também possui propriedades pró-inflamatórias por estimulação directa da expressão de genes e síntese de TNF-α a partir de células CD3+/CD4+ e células assassinas naturais com produção subsequente de IL-Ιβ e IL-8 a partir da população CD14+, revelando desse modo uma posição essencial inesperada da IL-18 na hierarquia das citocinas (25). No entanto ainda não foi elucidado o seu possível papel na metástase do cancro.

Uma proteína de ligação de interleucina-18 (IL-18BP) foi purificada a partir de urina por cromatografia em leitos de IL-18, sequenciada, clonada e expressada em células C0S7. A IL-18BP anulou a indução do interferão-γ (IFN-γ) pela IL-18, da IL-8 e a activação de NF-κΒ in vitro. A administração de IL-18BP em ratinhos anulou o IFN-γ circulante após LPS. Assim, a IL-18BP actua como um inibidor da resposta inicial da citocina Thl. A IL-18BP é expressada constitutivamente no baço, pertence à superfamília de imunoglobulinas e tem homologia limitada ao receptor de IL-1 de tipo II. 0 seu gene foi localizado no cromossoma humano llql3 e não foi encontrado nenhum exão a codificar um domínio transmembranar na sequência genómica 4 de 8,3 kb. Várias poxvírus codificam proteínas putativas extremamente homólogas à IL-18BP, sugerindo que os produtos virais podem atenuar a IL-18 e interferir com a resposta citotóxica de células T (28 e wo 99/09063). Como descrito mais particularmente na WO 99/09063, a IL-18BP e proteínas mutantes, proteínas fundidas, derivados funcionais, fracções activas ou derivados permutados circularmente e suas misturas são capazes de se ligar à IL-18 e/ou capazes de modular a actividade da IL-18 e/ou capazes de bloquear a actividade da IL-18. A WO 98/41232 descreve composições farmacêuticas que contêm um antagonista de IL-18 para modular a resposta aos corticosteróides. A EP 0 850 952 descreve a utilização de um anticorpo para o receptor de IL-18 para inibir a actividade da IL-18.

No Immunology Letters 68: 135-139 é analisada a correlação entre a expressão intratumoral de IFN-gama e o resultado clínico no caso de doentes afectados por carcinoma cervical ou carcinoma colorrectal. É descrito que a ausência de expressão de IFN-gama está correlacionada com a existência de metástases distante e um mau prognóstico.

Sumário da invenção A presente invenção proporciona a utilização de inibidores da produção e/ou acção da IL-18 na preparação de medicamentos para inibir a metástase de tumores de melanoma. Os inibidores da produção de IL-18 são, por exemplo, os inibidores da caspase-1. 5

Os inibidores da acção da IL-18 são seleccionados de anticorpos contra a IL-18, anticorpos contra qualquer uma das subunidades do receptor de IL-18, antagonistas de IL-18 que competem com a IL-18 e bloqueiam o receptor da IL-18, e IL-18BPs, proteinas mutantes, proteínas fundidas, derivados funcionais, fracções activas ou derivados permutados circularmente daqueles possuindo a mesma actividade que a proteína de ligação à IL-18 (IL-18BP).

Preferencialmente os inibidores utilizados são IL-18BPS ou uma proteína mutante, proteína fundida, derivado funcional, fracção activa ou derivado permutado circularmente daquele o qual tem a mesma actividade que a IL-18BP.

Também são descritas composições farmacêuticas para inibição da produção e/ou acção da IL-18 para inibir a metástase de tumores de melanoma.

Outra via para inibir a produção e/ou acção de IL-18, para inibir a metástase de tumores de melanoma, é a introdução no organismo de um vector de expressão compreendendo a sequência de codificação para um inibidor da produção e/ou acção da IL-18, tal como IL-18BP.

Descrição abreviada das figuras

Figura 1. Colonização hepática experimental após injecção intraesplénica de células B16M nos ratinhos IL-Ιβ"7" e ICE_/" de tipo selvagem. Retirou-se os fígados no dia 10 após injecção de células B16M e fixou-se em soro fisiológico tamponado com fosfato com 10% de formaldeído. Praticamente todas as metástases experimentais (nódulos melânicos pretos) foram erradicadas dos fígados de ratinho IL-Ιβ-7- e ICE~/_. 6

Figura 2. Efeito do inibidor irreversível da ICE e do anticorpo anti-IL-18 de ratinho na adesão de células B16M a células HSE e na produção de IL-Ιβ e TNF-α a partir de HSE não tratadas e tratadas com B16M-CM. Incubou-se células HSE cultivadas na presença de B16M-CM durante 10 h. Nalgumas experiências, as células HSE não tratadas e tratadas receberam ambas 10 μΜ ICEI ou 10 μρ/ιτιΐ de anticorpo anti-IL-18 de ratinho antes do B16M-CM. A percentagem de células B16M aderentes ao substrato HSE foi calculada como um valor relativo relativamente ao número inicial de células adicionadas. Além disso, recuperou-se os sobrenadantes das culturas antes da adesão para determinar a concentração de IL-Ιβ e TNF-α por ELISA. Os dados representam a média ± DP de 4 experiências separadas, cada uma em sextuplicado (n=24) . O aumento da adesão das células B16M às HSE tratadas com B16MCM e da produção de IL-Ιβ ou TNF-a relativamente às HSE não tratadas (*P<0,01) foram estatisticamente significativas de acordo com o teste t de Student não emparelhado, bilateral. Não houveram alterações estatisticamente significativas na produção de IL-Ιβ ou TNF-α e na adesão de células B16M às células HSE quando estas foram tratadas com ICEi ou anticorpo anti-IL-18 na ausência de B16M-CM (dados não mostrados).

Figura 3. Efeito de ICEi na adesão de células B16M à HSE tratadas com B16M-CM in vitro. Incubou-se células HSE com meio basal ou B16M-CM durante 8 h. Algumas células de HSE receberam 10 μΜ de ICEi durante 18 h antes do B16M-CM. Além disso, adicionou-se também 1 ng/ml de IL-Ιβ murídea recombinante a algumas células HSE conjuntamente com B16M-CM durante 8 h. Noutras experiências, as células HSE 7 receberam 1 ng/ml de IL-Ιβ murídea ou 100 pg/ml de TNF-a durante 6 h e adicionou-se ou não 10 μg/ml de anticorpo policlonal de coelho anti-lL-18 de ratinho 1 h antes do tratamento com citocina. Adicionou-se também igG de anticorpo policlonal não especifica a células HSE não tratadas e tratadas com citocina HSE. Em seguida, lavou-se as células HSE e adicionou-se células B16M marcadas com BCEFCF-AM e lavou-se novamente 8 min mais tarde. Calculou-se a percentagem de células B16M aderentes ao substrato de HSE como um valor relativo em relação ao número inicial de células adicionadas. Os dados representam a média + DP de 3 experiências separadas, cada uma em sextuplicado (n=18). As diferenças no grau de adesão em relação às HSE não tratadas (*) e às HSE tratadas com IL-Ιβ ou TNF-a (**) foram estatisticamente diferentes (P<0,01), de acordo com o teste t de Student não emparelhado, bilateral. Alterações estatisticamente não significativas na adesão de células B16M a outras HSE de controlo tratadas com ICEi que receberam adicionalmente ou não 1 ng/ml de IL-Ιβ murídea durante 8 h (dados não apresentados).

Figura 4. Adesão de células B16M in vitro a HSE tratadas com IL-18. Incubou-se as células HSE com 1 ng/ml de IL-18 murídea recombinante durante 6 horas. Nalgumas experiências, adicionou-se 10 μρ/ιηΐ de TNF-sRp55 ou 100 ng/ml de iL-lRa 10 min antes da IL-18. Noutras experiências, adicionou-se 10 μρ/ιηΐ de anticorpo anti-VCAM-1 ou uma concentração semelhante de IgG anti-ratinho não específica às células HSE 30 min antes das células B16M. Determinou-se então a percentagem de adesão das células B16M como se descreve a seguir nos exemplos. Os dados representam a média ± DP de 3 experiências separadas, cada 8 uma em sextuplicado (n=18). As diferenças no grau de adesão em relação às HSE tratadas com meio basal (*) e às HSE tratadas com IL-18 (**) foram estatisticamente significativos (P<0,01), de acordo com o teste t de Student não emparelhado, bilateral.

Descrição pormenorizada da invenção Várias citocinas pró-inflamatórias, incluindo interleucina (IL)—1β e o factor de necrose tumoral-alfa (TNF-a), promovem a adesão de células cancerosas às células endoteliais, conduzindo desse modo à disseminação metastática de tumores. Estas citocinas pró-inflamatórias promovem a adesão e metástase provavelmente pela indução da molécula de adesão celular vascular-1 (VCAM-1). A presente invenção mostra que o tratamento de células HSE murídeas de cultura primária com meio condicionado (CM) de culturas de células de melanoma B16 (B16M) (B16M-CM) promove a adesão entre as células B16M e HSE in vitro. O B16M-CM também induz a produção de IL-Ιβ e TNF-α pelas células HSE in vitro. No entanto não foi claramente demonstrado que a metástase de tumores é de facto mediada pelos IL-Ιβ e TNF-a. A presente invenção mostra que o B16M-CM induz a produção de IL-18 pelas células HSE e que a IL-18 é a citocina que contribui para aumentar a adesão de células B16M às células HSE. A IL-18 intensifica a adesão pela activação da expressão da VCAM-1 em células HSE sem o envolvimento de TNF-α ou Ιίΐβ. A incubação de células HSE com um inibidor específico da caspase-1 (10 μΜ, 18 h) anula completamente a aderência induzida pelo B16M-CM sem diminuir a produção de TNF-α, e o efeito não é revertido pela adição de IL-Ιβ de 9 ratinho. A adição de anticorpo anti-IL-18 murídea a células HSE previne a aderência induzida pelo B16M-CM, sem interferir com a indução pelo B16M-CM dos IL-Ιβ e TNF-α. De modo semelhante, a proteína de ligação à IL-18 (IL-18BP) recentemente clonada também previne a aderência induzida pelo B16M-CM de células B16M a HSE in vitro. Os inibidores de TNF-α e IL-Ιβ tal como o receptor solúvel de TNF p55 ou o antagonista do receptor de IL-1 foram incapazes de reverter esta adesão induzida pela IL-18. Assim, a presente invenção proporciona inibidores da produção e acção de IL-18 como ferramentas para inibir a metástase de tumores de melanoma. Os inibidores da produção de IL-18 incluem inibidores da caspase-1. Os inibidores da acção da IL-18 são seleccionados de um grupo consistindo de anticorpos dirigidos contra a IL-18, anticorpos dirigidos contra qualquer uma das duas subunidades conhecidas do receptor de IL-18, antagonistas de IL-18, que competem com a IL-18 e bloqueiam o receptor da IL-18 e proteínas de ligação da IL-18, as quais ligam a IL-18 e bloqueiam a sua actividade biológica. A presente invenção relaciona-se com a possível função da IL-18 na regulação positiva da expressão da VCAM-1 mediada pelas citocinas pró-inflamatórias, com a sua possível interacção com outras citocinas e com meios para prevenir esta indução da VCAM-1. Determinou-se, de acordo com a presente invenção, que a IL-18 actua no arranque de eventos pró-inflamatórios que conduzem à regulação positiva da VCAM-1 na parede sinusoidal hepática, facilitando, por esse motivo, a adesão e a metástase de células cancerosas. Utilizou-se células HSE de ratinho de culturas primárias tratadas com B16M-CM como um modelo de activação de células endoteliais dependente de células cancerosas para explorar 10 a função da IL-18 induzida por células B16M no mecanismo de adesão de células B16M às HSE por um mecanismo dependente da VCAM-1. Examinou-se a função especifica da IL-18 em condições de bloqueio específico do receptor da il-1 com a utilização de iL-lRa, IL-Ιβ madura e inibição da secreção de IL-18 utilizando um inibidor irreversível da enzima de conversão da IL-1 (iCEi), bloqueio do TNF utilizando o receptor solúvel de TNF p55 (TNF-sR p55) e bloqueio do funcionamento da IL-18 utilizando anticorpos anti-IL-18 e proteína de ligação à IL-18. Além disso, injectou-se por via intraesplénica células B16M em ratinhos lCE~/_ e IL- ΐβ-' . A baixa densidade de metástases observadas nos ratinhos deficientes relativamente aos controlos normais suger o envolvimento de IL 1β e possivelmente da IL-18 no papel pró-metastático da inflamação (Quadro 1).

As experiências in vitro realizadas mostram que a produção de IL-18 contribui para os efeitos estimuladores de adesão às HSE induzidos pelos sobrenadantes provenientes de células B16M. Uma vez que a regulação positiva da VCAM-1 contribui para toda a actividade estimuladora da adesão de HSE tratadas com B16M-CM, os dados indicam que a IL-18 medeia a expressão de VCAM-1 a partir de HSE induzida por citocina. Além disso, os anticorpos para a IL-18 diminuíram a adesão de células inibida pelo B16M-CM sem afectar a produção de TNF-α e IL-Ιβ a partir das células HSE. Por conseguinte, a produção de IL-Ιβ e TNF-α em células HSE foi independente da IL-18 e não contribuiu para a adesão. Contrariamente, nem o TNF-sR p55 nem o iL-lRa foram capazes de inibir o aumento de adesão em células HSE tratadas com IL-18, o que confirma que nem o TNF-a autócrino nem a IL-Ιβ contribuíram para a aderência de HSE induzida pela IL-18. 11

Os resultados obtidos em células HSE contrastam com os obtidos noutros sistemas celulares, como por exemplo células mononucleares de sangue humano não CD14+ (25), onde a IL-18 induzia a IL-Ιβ via produção de TNF-α. É provável que exista uma hierarquia de citocinas pró-inflamatórias especificas para a HSE na qual os TNF-α e IL-Ιβ são independentes do controlo de IL-18, mas utilizam a IL-18 como um mediador a jusante da regulação positiva da VCAM-1.

Ao contrário das células HSE murideas, as células B16M não expressam o gene da IL-18 como se verificou por RT-PCR, e a incubação com ICEi durante 18 h não anulou as actividades estimuladoras de citocina e adesão de B16M-CM sobre as células HSE. No entanto, a produção local de IL-18 pode influenciar o comportamento das células B16M durante a sua circulação ou paragem na microvasculatura hepática. Uma observação adicional foi que a incubação de células B16M com 1 ng/ml de IL-18 muridea durante 6 h aumentou em 2 vezes a sua adesão às HSE não tratadas, e a adição de anticorpos anti-VCAM-1 às HSE diminuiu a adesão mediada pela IL-18 em 80%, sugerindo que estava envolvida a interacção VCAM-l/VLA-4. De modo semelhante, as células B16M que receberam o sobrenadante de HSE tratadas com B16M-CM durante 6 h também aumentou significativamente (P<0,01) em 2 vezes a sua adesão às HSE por um mecanismo dependente da VCAM-1 e o anticorpo anti-lL-18 anulou este efeito estimulador da adesão.

As observações de acordo com a presente invenção sugerem que a IL-18 é uma nova ligação entre a libertação hepática de citocinas pró-inflamatórias e o desenvolvimento de metástases. A sua produção a partir de células HSE activadas por tumores determina dois mecanismos 12 complementares envolvidos na regulação da adesão de células de melanoma às células HSE: um mecanismo autócrino nas HSE, o qual controla a regulação positiva da VCAM-1 mediada por TNF-a/lL-Ιβ e um mecanismo parácrino em células B16M, o qual regula positivamente a VLA-4 nas células de melanoma, potenciando a sua capacidade de adesão dependente de VCAM-1. Esta regulação positiva molecular simultânea de ambas as partes opostas da adesão celular torna o percurso de interacção entre células cancerosas e células capilares endoteliais extremamente útil. A adesão de células B16M induzida pela IL-18 é anulada por inibidores da produção e/ou acção de IL-18. Os inibidores da produção de IL-18 incluem inibidores da caspase-1. Os inibidores da acção da IL-18 são seleccionados de um grupo consistindo de anticorpos dirigidos contra a IL-18, anticorpos dirigidos contra qualquer uma das duas subunidades conhecidas do receptor de IL-18, antagonistas de IL-18, que competem com a IL-18 e bloqueiam o receptor da IL-18, e proteínas de ligação à IL-18, que se ligam à IL-18 e bloqueiam a sua actividade biológica.

Além da utilização directa de inibidores da produção e/ou acção de IL-18, a presente invenção também abrange a introdução nas células onde é desejado um efeito inibidor da produção e/ou acção da IL-18. Para este efeito é necessário um sistema para introdução especifica, por exemplo, do ADN que codifica uma IL-18BP nas células. Na técnica são conhecidas várias possibilidades para efectuar isto. Por exemplo pode introduzir-se um vector adequado portador do ADN anterior nas células, sendo o vector capaz de levar a cabo a inserção do ADN nas células de modo a que o ADN seja expressado nas células. Os métodos de introdução 13 nas células são descritos entre outras, por exemplo, na patente US 5 910 487, W099/29349 e outras.

As composições farmacêuticas adequadas para serem utilizadas de acordo com a invenção para a inibição da produção e/ou acção de IL-18 são aquelas que compreendem, como substância activa um inibidor seleccionado de um inibidor da caspase-1, um anticorpo contra a IL-18, um anticorpo contra qualquer uma das subunidades do receptor de IL-18, um inibidor do percurso de sinalização do receptor da IL-18, um antagonista que compita com a IL-18 e bloqueie o receptor da IL-18 e IL-18BP ou uma proteína mutante, proteina fundida, derivado funcional, fracção activa ou derivado permutado circularmente daqueles que tenha a mesma actividade que a IL-18BP.

Os termos proteína mutante, proteína fundida, derivado funcional, fracção activa e derivado permutado circularmente têm o mesmo significado que na WO 99/09063.

Os anticorpos para a IL-18 e IL-18BPs são as substâncias activas preferidas das composições farmacêuticas.

As composições farmacêuticas também podem compreender veículos, excipientes e outros ingredientes convencionais conhecidos na técnica, dependendo do seu modo de aplicação, i.e. injecção, oral ou qualquer outra via conhecida na técnica. A dosagem particular dependerá do modo de aplicação, do peso corporal do doente e de outros factores e será em quaisquer dos casos determinada pelo médico. 14

Tendo-se descrito agora a invenção, a mesma será mais facilmente compreendida por referência aos exemplos seguintes que são proporcionados a titulo de ilustração e não se destinam a limitar a presente invenção.

Exemplos:

Reagentes: A IgG de ratazana anti-ratinho e o anticorpo monoclonal de ratazana anti-VCAM-1 de ratinho foram obtidos de Serotec Ltd. (Oxford, Inglaterra). A IL-Ιβ muridea recombinante foi obtida de R&D System Inc. (Minneapolis, MN). 0 antagonista do receptor da IL-1 humana recombinante (IL-lRa foi uma oferta gentil da The Upjohn Co., Kalamazoo, MI) e o receptor solúvel de TNF p55 humano (TNFsR p55) foi uma oferta gentil de Serono Inc., Norwell, MA. 0 inibidor da enzima de conversão da IL-Ιβ (ICEi) foi obtido de Alexis Co. (San Diego, CA) . A IL-18 muridea recombinante e a IgG de anticorpo policlonal de coelho anti-iL-18 de ratinho foram adquiridas de PeproTech EC Ltd. (London. UK) . A proteína de ligação à IL-18 (IL-18BP) foi produzida como descrito (28).

Cultura de células B16M. Células B16M foram cultivadas, conservadas e transferidas como anteriormente descrito (11). O meio condicionado de B16M (B 16M-CM) foi preparado como se segue: aplicou-se 5xl05 células num balão em T de 25 cm2 e cultivou-se durante 24h. Após o que se cultivou as células durante um período adicional de 24 h em 5 ml de meio livre de soro (densidade celular final de 6xl04 células/cm2) . Recolheu-se os sobrenadantes, diluiu-se a 3:1 15 em meio livre de soro fresco e passou-se através de um filtro de 0,22 μπι.

Análise de Citocina. Mediu-se a libertação de citocinas a partir de células HSE e células B16M de culturas primárias utilizando estojos ELISA específicos baseados em anticorpos anti-IL-Ιβ de ratinho e anticorpos monoclonais contra o TNF-α, como sugerido pelo fabricante (R&D Systems,

Minneapolis, MN).

Exemplo 1: Adesão Quantitativa de Células B16M a Culturas Primárias de HSE.

Separou-se HSE de ratinhos singenésicos, identificou-se e cultivou-se como anteriormente descrito (26). Marcou-se células B16M com solução de éster metílico de 2',7'-bis-(2-carboxietil)-5,6-carboxifluorescein-acetoxilo (BCECF-AM,

Molecular Probes, Eugene, OR) como descrito (16) . Adicionou-se então 2xl05 células/poço a placas de 24 poços de cultura HSE e 8 min. depois lavou-se os poços três vezes com meio fresco. Determinou-se o número de células aderentes utilizando um método quantitativo com base num sistema de medição de fluorescência anteriormente descrito (16). Nalgumas experiências, as células HSE foram pré-incubadas com B16M-CM durante várias horas antes da adição das células B16M.

Exemplo 2: Ensaio de Metástase Hepática. Gerou-se ratinhos C57BL/6J Ιύ-1β_/“ e ICE~/_ machos de tipo selvagem como anteriormente descrito (27). Utilizou-se ratinhos com seis a oito semanas de idade, alojados em grupos de cinco por gaiola. Produziu-se metástases hepáticas por injecção intraesplénica em ratinhos anestesiados (Nembutal, 50 mg/kg 16 intraperitoneal) de 3xl05 células viáveis de melanoma B16 suspendidas em 0,1 ml de solução equilibrada de sal de Hanks. Matou-se os ratinhos sob anestesia no 10° dia após a injecção de células cancerosas. Processou-se os tecidos hepáticos para histologia. Utilizou-se a análise densitométrica de imagens de microscópio digitalizadas para discriminar B16M metastática de tecido hepático normal e calculou-se a densidade de metástases no fígado, a qual é o número de metástases por 100 mm3 de fígado (com base no número médio de focos detectados em quinze secções de 10x10 mm2 por fígado) utilizando procedimentos estereológicos anteriormente descritos (17) .

Exemplo 3: Metàstase Reduzida e Crescimento de Células B16M Injectadas em Ratinhos Deficientes de IL-Ιβ e ICE.

Realizou-se duas experiências independentes, separadas de um ano, utilizando dois lotes diferentes das mesmas células B16M injectadas intraesplenicamente em ratinhos C57B1/6J lCE_/“ e lL-β-7- adultos de tipo selvagem. A inspecção necrópsica demonstrou tumores melânicos visíveis no baço de todos os ratinhos testados, sem diferenças significativas no tamanho como avaliado por pesagem esplénica (Quadro 1). Em contraste ocorreu uma diminuição acentuada na metàstase nos fígados de ratinhos Ιύ-1β·/_ e, especialmente, ICE_/“ em relação aos fígados de ratinhos de tipo selvagem (Figura 1) . Realizou-se uma análise histológica quantitativa no número e tamanho de focos metastáticos para determinar os parâmetros de densidade (como número de focos/100 mm3) e volume (percentagem de ocupação do órgão) das metástases nos fígados dos ratinhos estudados. Comparativamente aos ratinhos selvagens (Quadro 1), a densidade de metástases hepáticas diminuiu significativamente (P<0,01) nos fígados 17 dos ratinhos IL-Ιβ-7- e ICE_/~ em 84% até 90%, indicando que a maioria das células B16M injectadas foram incapazes de se implantar no tecido hepático destes ratinhos. Além disso, os volumes das metástases também diminuíram significativamente (P<0,01) nos figados de ratinhos IL-Ιβ”7” e ICE_/“ em 6 até 7 vezes, em relação aos valores nos figados de ratinhos de tipo selvagem, indicando que as células B16M que tiveram sucesso a colonizar o figado tiveram também uma velocidade de crescimento reduzida. Nós também observamos uma diferença neste parâmetros de metástase entre os figados dos ratinhos IL-Ιβ”7” e ICE_/”, que conduziram a uma erradicação das metástases em quase todos os figados de ratinhos ICE_/” da experiência I (Figura D ·

Quadro 1

Análise histológica quantitativa na colonização hepática experimental de células B16M injectadas intraesplenicamente em ratinhos IL-Ιβ / e ice 1

Densidade de metástases Volume de metástases (como n° de focos/100 (como % do volume do Grupo do Ratinho mm3) figado) Experiência I Ratinho de tipo selvagem 66,18% 234,16158,36 Ratinho IL-Ιβ'7' 10,05% 25,18121,02* Ratinho ICE'7' 13,56116,20* 2,1% Experiência 2 Ratinho de tipo selvagem 59,62% 198,401100,54 Ratinho IL-Ιβ'7' 9,70% 33,79119,89* Ratinho ICE'7' 8, 08% 27,73115,68*

Os dados representam os valores médios±DP de duas experiências independentes (utilizou-se 7 a 15 ratinhos por grupo experimental). 18 *São indicadas as diferenças que foram estatisticamente significativas (bilateral, p<0,01) em relação aos ratinhos de tipo selvagem utilizando a análise de variância (ANOVA) e o teste F de Scheffe.

Exemplo 4: A IL-18 Autócrina Medeia A Aderência de HSE Activada com B16M-CM Induzida pelo TNF-g e IL-Ιβ. A B16M-CM aumenta significativamente (P<0,01) a produção de TNF-α e IL-Ιβ nas células HSE e a sua aderência para outras células B16M in vitro (Figura 2). A incubação de HSE com ICEi 10 μΜ durante 18 h anulou completamente a aderência induzida por B16M-CM sem diminuir a produção de TNF-α a partir de HSE. A adição exógena de IL-Ιβ muridea não compensou o efeito bloqueador da ICEi na HSE, o que está em contraste com o aumento significativo da adesão das células B16M no controlo de HSE tratado com IL-Ιβ (Figura 3) . O facto do aumento da adesão induzida pela B16M-CM ter sido anulado na presença de concentrações elevadas de TNF-α produzido endogenamente e IL-Ιβ adicionada exogenamente indica que nenhuma destas citocinas regula de modo directo positivamente a aderência de HSE. De modo significativo, a presença de anticorpo anti-IL-18 muridea adicionado à HSE antes do estimulo com B16M-CM impediu a aderência induzida pela B16M-CM sem afectar a produção induzida de IL-Ιβ e TNF-α a partir de HSE (Figura 2) . Além disso, o anticorpo anti-IL-18 também preveniu os efeitos estimuladores da adesão dos IL-Ιβ e TNF-α murídeos na HSE (Figura 3), indicando que as acções pró-adesivas destas citocinas na HSE foram ambas mediadas pela IL-18. A RT-PCR confirmou que as células HSE expressavam o gene da IL-18 (dados não mostrados). Inversamente, a IL-18 muridea aumentou 19 significativamente (P<0,01) a adesão de células B16M à HSE (Figura 4), e nem o TNF-sR p55 nem o IL-lRa foram capazes de a inibir, confirmando que nem o TNF-α autócrino nem a IL-Ιβ contribuíram para a aderência de HSE induzida pela IL-18. No entanto, como se mostra na Figura 4, o anticorpo anti-VCAM-1 inibiu completamente a adesão de células B16M à HSE tratada com IL-18. A IgG não específica de controlo não afectou a regulação positiva da adesão de células B16M às HSE tratadas com IL-18.

Exemplo 5: A IL-18BP impede a adesão de células de melanoma BI6 induzida pelo meio condicionado com B16. Como se mostra no Quadro 2, a adição de IL-18BP à HSE estimulada com B16-CM reduziu a percentagem de células aderentes de 35% para 8,70% (p<0,01). isto representa uma inibição de 100% uma vez que o nível de adesão estava abaixo do nível de células aderentes utilizando meio basal. Este resultado sugere que a IL-18 endógena da HSE pode ser uma fonte endógena de IL-18 para além da presente no B16M-CM. QUADRO 2

Efeito Inibidor de IL-1BP na adesão induzida pelo meio condicionado com B16 de células de melanoma B16 às Células

Endoteliais Sinusoidais Hepáticas % de Adesão de Células de Melanoma

Meio basal

B16-CM 10,15±1,5 35,10+4,4 B16-CM/IL-18BP (1 ng/ml) B16-CM/IL-18BP (10 ng/ml) 15,00±2,5** 8,70±1,1**

Os dados representam os valores médios ± DP de 2 experiências independentes feitas em sextuplicado (N=12) 20 **São indicadas as diferenças que foram estatisticamente significativas (bilateral, p<0,01) em relação ao B16-CM utilizando a análise de variância (ANOVA) e o teste F de Scheffe.

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Lisboa, 22 de Junho de 2007

Claims (6)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de inibidores da produção e/ou acção de il- 18 para a preparação de medicamentos para inibir a metástase de tumores de melanoma, em que o inibidor da IL-18 é seleccionado de anticorpos contra a IL-18, anticorpos contra qualquer uma das subunidades do receptor de IL-18, antagonistas de IL-18 que competem com a IL-18 e bloqueiam o receptor da IL-18 e proteínas de ligação à IL-18, proteínas mutantes, proteínas fundidas, derivados funcionais, fracções activas ou derivados permutados circularmente daquelas possuindo a mesma actividade que a proteína de ligação à IL-18 (IL-18BP).

2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o melanoma é o melanoma hepático.

3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor da produção de IL-18 é um inibidor da caspase-1 que se liga especifica e irreversivelmente à IL-18.

4. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor da IL-18 é um anticorpo contra a IL-18.

5. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor da acção da IL-18 é uma IL-18BP, ou uma proteína mutante, derivado ou fragmento desta que tem a mesma actividade que a IL-18BP.

6. Utilização de um vector de expressão que codifica um inibidor da produção e/ou acção da IL-18 como definida na reivindicação 1 para a preparação de medicamentos para inibir a metástase de tumores de melanoma. Lisboa