KR101015682B1

KR101015682B1 - Ｉｌ-18ｂｐ에 결합할 수 있고 제 2 사이토킨의 활성을저해할 수 있는 사이토킨의 용도

Info

Publication number: KR101015682B1
Application number: KR1020057005571A
Authority: KR
Inventors: 차알스 디나렐로; 수-현 김; 필립 버플레르
Original assignee: 아레스 트레이딩 에스.에이.
Priority date: 2002-10-08
Filing date: 2003-10-03
Publication date: 2011-02-22
Also published as: CA2500577A1; US20090074710A1; EA008667B1; WO2004032837A3; EP1572291A2; US20040120923A1; CA2500577C; US7279155B2; EP1572291A4; IL167769A; AU2003299919B2; BR0315155A; JP2006516953A; CN1909926A; UA86750C2; ES2416510T3; AU2003299919A1; WO2004032837A2; EA200500617A1; NO20052203D0

Abstract

본 발명은 사이토킨-2의 수용체를 유도함으로써 유발되거나 악화되는 질환의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18BP, 또는 이의 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 단편에 결합할 수 있고 IL-1 계통의 구성원인 사이토킨-2의 수용체를 저해할 수 있는 사이토킨-1, 또는 이의 동등형(isoform), 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 단편의 용도에 관한다.

사이토킨-1

Description

ＩＬ-18ＢＰ에 결합할 수 있고 제 2 사이토킨의 활성을 저해할 수 있는 사이토킨의 용도{THE USE OF A CYTOKINE ABLE TO BIND IL-18BP AND OF INHIBITING THE ACTIVITY OF A SECOND CYTOKINE}

본 발명은 IL-18 결합 단백질에 결합할 수 있고 제 2 사이토킨의 활성을 저해할 수 있는 사이토킨의 용도에 관하는데, 상기 제 2 사이토킨은 IL-1 계통의 구성원이다.

1989년에, 생쥐 비장 세포로부터 얻은 인터페론-γ(IFN-γ)을 유도하는 내독소-유도된 혈청 활성이 보고되었다(Nakamura et al. 1989). 상기 혈청 활성은 IFN-γ의 직접 유도물질로서 기능하기 보다는 IL-2, IFN-α/β, TNF 또는 유사분열물질과 함께 보조-자극물질로서 기능하였다. 엔도톡신 처리된 생쥐 혈청으로부터 이런 활성을 좀더 분명하게 확인하려는 시도에서 상동성 50-55 kDa 단백질이 발견되었다(Nakamura et al. 1993). 다른 사이토킨이 IFN-γ 생산에 대한 보조-자극물질로서 기능할 수 있기 때문에, IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 또는 TNF에 대한 중화 항체가 혈청 활성을 차단하지 못한다는 것은 이것이 별개의 인자라는 것을 의미한다. 1995년에, 이들 과학자들은 여드름균(P. acnes)으로 사전-처리된 생쥐의 간 추출물에 IFN-γ 생산을 위한 엔도톡신-유도된 보조-자극물질이 존재함을 확인하였다 (Okamura et al., 1995). 이런 실험 모델에서는 간 대식세포 개체군(쿠퍼 세포)이 확대되기 때문에, 사전-처리되지 않은 생쥐에서는 치명적이지 않은 낮은 용량의 박테리아 리포폴리사카라이드(LPS)도 치명적이다. 처음에 IFN-γ-유도 인자(IGIF)로 불렸고, 이후 인터루킨-18(IL-18)로 명명된 인자가 1,200g의 여드름균(P. acnes)-처리된 생쥐 간으로부터 균질하게 정제되었다. 정제된 IL-18의 아미노산 서열로부터 유래된 축퇴 올리고뉴클레오티드를 이용하여 뮤린 IL-18 cDNA를 클론하였다(Okamura et al. 1995). IL-18과 인터루킨-12(IL-12)에 대한 메신저 RNA는 활성화된 대식세포에서 용이하게 감지된다. IL-18은 자체적으로 IFN-γ을 유도하지 않지만, 유사분열물질 또는 IL-12와 함께 보조-자극물질로서 주로 기능한다. IL-18에 대한 사람 cDNA 서열은 1996년에 보고되었다(Ushio et al. 1996.)

인터루킨 IL-18은 IL-1 계통의 단백질과 구조적 특징을 공유한다(Nakamura et al. 1993, Okamura et al. 1995, Ushio et al. 1996, Bazan et al. 1996). 4개의 나선 번들 구조를 보이는 대부분의 다른 사이토킨과 달리, IL-18과 IL-1β는 β-시트 구조를 보유한다(Tsutsui et al., 1996). IL-1β와 유사하게, IL-18은 신호 펩티드가 부재하는 생물학적 불활성 전구물질(프로IL-18)로 합성된다(Ushio et al. 1996). IL-1β와 IL-18 전구물질은 P1 위치에서 아스파르트산 잔기 뒤에서 카스파제 I(IL-1β-전환 효소 또는 ICE)에 의해 절단된다. 생성된 성숙 사이토킨은 세포로부터 용이하게 방출된다(Guayur et al. 1997; Gu et al. 1997).

IL-18은 T 보조 1형(Th1) 세포에 의한 사이토킨(IFN-γ, IL-2, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자) 생산의 보조-자극물질(Kohno et al. 1997) 및 뮤린 자연 킬러 세포 클론에 의한 FAS 리간드-매개된 세포독성의 보조-자극물질(Tsutsui et al., 1989)이다.

Th1 림프구는 종양에 대한 면역 반응에 관여한다(Seki et al. 2000). Th1 반응은 사이토킨 IL-2, IL-12, IL-18, IFN-γ의 분비 및 특정 종양 항원을 인식하는 특이적인 세포독성 T 림프구의 발생을 수반한다. Th1 반응은 다수의 미생물에 대한 숙주 방어의 매우 중요한 무기이다. 하지만, Th1 반응은 원치않는 효과, 예를 들면, 여러 자가면역 질환, 염증, 장기 이식 거부반응의 발생과 연관될 수도 있다.

사이토킨 결합 단백질(가용성 사이토킨 수용체)은 개별 세포 표면 사이토킨 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인이다. 이들은 세포 표면 수용체의 택일적 절단접합 또는 단백분해 절단에 의해 만들어진다. 이들 가용성 수용체는 이미 보고되었다: 예를 들면, IL-6과 IFN-γ의 가용성 수용체(Novick et al. 1989), TNF의 가용성 수용체(Engelmann et al. 1989; Engelmann et al. 1990), IL-1과 IL-4의 가용성 수용체(Maliszewski et al. 1990), IFN-α/β의 가용성 수용체(Novick et al. 1994, Novick et al. 1992). TNFR/Fas 계통의 구성원인 오스테오프로테게린(OPG 또는 골아세포 저해 인자-OCIF)라고 하는 사이토킨-결합 단백질은 분비된 단백질로서만 존재하는 첫 번째 가용성 수용체로 생각된다(Andeson et al. 1997, Simonet et al. 1997, Yasuda et al. 1998).

인터루킨-18 결합 단백질(IL-18BP)은 IL-18 칼럼에서 소변으로부터 친화성 정제되었다(Novick et al. 1999). IL-18BP는 시험관내에서 IFN-γ의 IL-18 유도와 NF-kB의 IL-18 활성화 및 생체내에서 IFN-γ의 유도를 소멸시킨다. IL-18BP는 비장 에서 본질적으로 발현되고 면역글로불린 대과에 속하는 가용성 순환 단백질이다. 가장 풍부한 IL-18BP 동등형, 즉 절단접합된 변이 동등형 a는 빠른 온-레이트(on-rate)와 느린 오프-레이트(off-rate)로 IL-18에 대한 높은 친화성 및 400 pM의 해리 상수(Kd)를 보인다(Kim et al. 2000).

IL-18과 IL-18BP의 상호작용에 관여하는 잔기는 단백질 IL-1β와 I형 IL-IR의 상호작용(Vigers et al. 1997)에 기초한 컴퓨터 모델링(Kim et al. 2000)을 통하여 보고되었다. IL-18BP에 대한 IL-18 결합 모델에서, IL-18의 42번 위치에서 Glu(E) 잔기와 89번 위치에서 Lys(K) 잔기가 IL-18BP에서 각각 Lys-130과 Glu-114에 결합하는 것으로 제안되었다(Kim et al. 2000).

IL-18BP는 많은 세포에서 본질적으로 존재하고(Puren et al. 1999) 건강한 사람에서 순환한다(Urushihara et al. 2000). IL-18에 대한 IL-18BP의 높은 친화성 및 순환기에서 발견되는 높은 IL-18BP 농도(IL-18의 20배 몰)는 사이토킨 생태에서 독특한 현상을 대표한다. 이런 이유로, 순환기에서 대부분의 IL-18 분자는 IL-18BP에 결합하는 것으로 추정된다. IL-18에 대하여 세포 표면 수용체와 경쟁하는 순환 IL-18BP는 천연 항-염증성 면역억제 분자로 기능할 수 있다.

바이러스 병원체는 IL-18BP 유사 단백질, 예를 들면, 몰루스쿰 콘타지오섬(M. contagiosum) 바이러스 단백질 MC53과 MC54는 포유동물 IL-18BP에 현저한 상동성을 공유한다(Novick etal. 1999). 몰루스쿰 콘타지오섬(M. contagiosum) 단백질 MC53과 MC54는 IL-18에서와 유사한 방식으로 사람 IL-18에 결합하고 이를 중화시키는 능력을 보유한다(Xiang and Moss 1999). IL-18BP에 상동한 엑트로멜리아 폭스바 이러스(ectromelia poxvirus) p13 단백질은 사람 IL-18에 결합하고 시험관내에서 이의 활성을 저해한다. p13 결실 돌연변이 바이러스로 감염된 생쥐는 감소된 수준의 감염도를 보였다(Born et al. 2000). 이런 이유로, 감염도 수준은 바이러스 IL-18BP의 수준과 상관하는 것으로 보인다.

높은 수준의 순환 IL-18BP는 감염에 대한 과도한 Th1 반응 및 자가면역 질환의 발병에 대한 자연 방어를 대표한다.

IL-18을 비롯한 IL-1-계통의 사이토킨은 감염에 대한 1차와 2차 반응 동안 다양한 염증과 면역조절 특성을 보유한다(Dinarello 1996 and Nakanishi 2001). 인터루킨-1(IL-1) 유전자 계통의 6가지 새로운 구성원은 발현된 서열 태그 데이터 기초한 검색으로부터 발견되었다(Barton 2000, Busfield 2000, Debets 2001, Kumar 2000, Lin 2001, Mulero 1999, Pan 2001 and Smith 2000). 이들 단백질은 12개의 β-가닥으로 구성되는 공통의 β-원통 패턴 및 IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra), IL-1β와 IL-18과 현저한 아미노산 상동성을 공유한다. IL-1 계통의 이들 새로운 구성원은 IL-1 및 IL-18과 공통 조상으로부터 유래된다(Nicklin 2002, Taylor2002). IL-18을 제외하고, 이들은 동일 크로모좀 2에 위치한다(Nicklin 2002, Mulero 2000, Taylor 2002 and Busfield 2000). 이들 IL-1 동족체의 생물학적 기능은 현재 알려져 있다. 신규한 IL-1 동족체 IL-IH4의 절단 변이체(IL-IF7a-e)가 보고되었다(Busfield 2000, Kumar 2000, Pan 2001, Smith 2000, Taylor 2002). 첫 번째 동등형, IL-1F7a는 IL-1F7 유전자의 엑손 3으로 구성되는 독특한 N-말단을 보유하는데, 이는 상기 유전자의 다른 절단 변이체에는 존재하지 않는다. 짧은 동등형 IL-IF7c, IL-IF7d, IL-IF7e는 각각 엑손 4, 2 또는 둘 모두 부재한다. 엑손 1과 2를 보유하는 IL-1F7b와 c만 잠재적 카스파제-1(ICE) 절단 부위를 보유하는 N-말단 프로도메인(prodomain)을 발현한다(Kumar 2002). 이들 절단 변이체에 더하여, 엑손 2에서 2개의 염기쌍 돌연변이에 기초하여 아미노산 다형성(V31 G와 A42T)이 IL-1F7b에 존재한다(Kumar 2000, Pan 2001). 광범위한 데이터베이스 검색 및 IL-1-유전자 좌위의 서열분석에도 불구하고, IL-1H4의 뮤린 동족체는 발견되지 않았다. IL-1F7b는 IL-18과 현저한 서열 상동성을 공유한다. IL-18 활성의 특징은 보조-자극물질로서 IL-2, IL-12 또는 IL-15의 존재하에 T-세포 또는 자연 킬러(NK) 세포를 유도하는 능력이다. IL-18의 활성은 IL-18Rα라고 하는 리간드-결합 사슬(Torigoe 1997) 및 IL-18Rβ라고 하는 신호 사슬(Born 1998, Kim 2001)로 구성되는 IL-18R 복합체를 통하여 매개된다. IL-18Rα 사슬에 결합 및 IL-18Rβ 사슬과의 헤테로 복합체 형성 직후에, IL-18은 IL-1 수용체-연관된 키나아제와 TNF 수용체-연관된 인자 6(TRAF-6)의 활성화를 유도한다. 이들 활성화된 키나아제는 궁극적으로, 핵 인자 κ-B(NF-κB)의 전좌를 유도한다(Matsumoto, Robinson). IL-1F7b는 수용체 풀다운 분석(receptor pulldown assay)(Pan 2001) 또는 컴퓨터-기초한 결합 연구(BiaCore?)(Mulero 2000)에서 IL-18Rα에 결합하는 것으로 보고되었다. Kd=130 mM의 유의하지만 낮은 친화성 결합은 프로펩티드가 없는 성숙 형태의 IL-1F7b에서만 관찰되었는데, 이는 ICE에 의한 IL-1F7b 가공에 생물학적 관련성을 암시한다(Kumar 2002). IL-18Rα에 대한 결합에도 불구하고, 미성숙 또는 성숙 IL-1F7b의 IL-18-유사 또는 길항 활성은 존재하지 않는 것으로 확인되었다(Pan 2001, Kumar 2002).

인터루킨 IL-18은 내독소 쇼크, 간염, 자가면역-당뇨병을 비롯한 만성 염증 질환에서 병인의 진행에 관여하는 것으로 제안되었다(Kahiwamura and Okamura, 1998). 간 손상의 발생에서 IL-18의 가능 역할은 생쥐 모델에서 리포폴리사카라이드-유도된 급성 간 손상에서 상승된 수준의 IL-18을 입증한 Tsuij et al.(Tsuij et al., 1999)에 의해 더욱 뒷받침되었다. 하지만, 간 손상의 발생에서 다중-기능성 인자 IL-18의 기전은 아직까지 밝혀지지 않고 있다.

간 상해 또는 손상은 다양한 원인에 기인할 수 있다. 이는 예로써 바이러스 또는 박테리아 감염, 알코올 남용, 면역학적 질환, 또는 암에 기인할 수 있다.

예로써 B형 간염 또는 C형 간염과 같은 바이러스 간염은 전세계적으로 수많은 사람을 괴롭히는 통제하기 어려운 질환이다. 알려진 간염 바이러스의 수가 지속적으로 증가하고 있다. B형과 C형 간염 이외에, 바이러스-연관된 간염을 유발하는 적어도 4가지 다른 바이러스, 다시 말하면, A, D, E, G-바이러스가 발견되었다.

알코올성 간 질환은 알코올의 만성 소비와 연관된 다른 만연된 질환이다. 면역 간염(immune hepatitis)은 매우 드물게 나타는 통제하기 어려운 질환이다. 간 손상은 담관의 손상을 또한 유도한다. 원발성 담도성 간경변증(primary biliary cirrhosis)(PBC)은 간내담도(intrahepatic bile duct)의 파괴로 특성화되는 자가면역 간 질환이다.

여러 연구 결과는 알코올성 간염, 간경변증, 바이러스 간염, 원발성 담도성 간경변증과 같은 질환에서 간 손상이 T-보조 세포-1(Th1) 반응과 연관한다는 것을 입증하였다. 한 연구에서, 오브알부민-함유 리포솜의 간으로의 표적화, 이후 오브 알부민-특이적 Th1 세포의 입양 전이에 의해 생쥐에서 새로운 간 손상 모델이 확립되었다. 오브알부민-함유 리포솜과 Th1 세포 전이에 의한 생쥐의 복합 치료는 혈청 IFN-γ 수준의 상승에 대응하는 혈청 트랜스아미나아제 활성의 증가를 유도하였다. 극히 대조적으로, 오브알부민-특이적 Th2 세포 전이는 혈청 IL-4 수준의 증가를 유도하긴 했지만 간 손상을 유도하지는 않았다. 간 손상은 항-IFN-γ 항체와 항-종양 괴사 인자(TNF)-항체에 의해 차단되었다. 이들 조사 결과는 Th1 세포가 급성 간 손상에서 주요 주효체 세포임을 지시한다(Nishimura and Ohta, 1999). 다른 일단의 연구에서, IFN-γ을 과다-발현하는 생쥐는 임의의 병원균 또는 임의의 다른 자극물질 없이 자발적인 간염을 보이는 것으로 밝혀졌다(Okamoto et al., 1998).

다른 연구에서는 원발성 담즙성 간경변증(PBC)에 Th1 반응을 연관시켰다. PBC는 간내담도의 파괴로 특성화되는 자가면역 간 질환이다. 일반적으로, 세포 면역 기전, 특히 T 세포와 관련된 세포 면역 기전이 이런 담관 손상을 유발하는 것으로 생각된다. 최근, Th1과 Th2 반응의 상대적인 강도가 다양한 자가면역 질환의 병태생리에서 중요한 인자로서 제안되었다. 상기 연구에서는 2가지 T-세포 하위집합에 특이적인 사이토킨, 다시 말하면, Th1 세포에서 IFN-γ 및 Th2 세포에서 IL-4에 특이적인 사이토킨의 감지로 PBC에서 하위집합 균형을 평가하였다. IFN-γ과 IL-4 메신저 RNA(mRNA) 양성 세포는 비동위원소 in situ 혼성화와 면역조직화학을 이용하여 18명의 PBC 환자 및 만성 활성 C형 간염, 간외성 담관 폐쇄(extrahepatic biliary obstruction), 정상적인 간을 비롯한 35명의 질환 대조로부터 얻은 간 절편에서 계산하였다. IFN-γ과 IL-4 mRNA를 발현하는 단핵 세포는 PBC 간에서 문맥 주위 염증 부위에 집중되지만 간외성 담관 폐쇄, 알코올성 경변증 또는 정상적인 간 절편에는 거의 존재하지 않았다. PBC 간에서 IFN-γ와 IL-4 mRNA 양성 세포는 대조 간에서보다 유의하게 높은 숫자로 감지되었다(P < 0,01). 게다가, IFN-γ mRNA 발현은 PBC 간에서 IL-4 발현보다 더욱 빈번하게 감지되었고, IFN-γ mRNA 발현 수준은 문맥 염증 활성과 밀접하게 상관하였다. IFN-γ mRNA-양성 세포는 림프구 집합체에 의해 둘러싸인 손상된 담관 주변에서 주로 감지되었다. 상기 데이터는 Th1 세포가 PBC에서 림프구 침윤물의 주요 T-세포 하위집합임을 지시한다(Harada et al., 1997).

바이러스 항원 인식에 대한 사이토킨 패턴 역시 바이러스 감염의 소멸과 바이러스 청소(viral clearance)에 상당한 영향을 발휘하는 것으로 생각된다. 한 연구에서는 Th2 형 반응을 지향하는 사이토킨 불균형이 만성 B형 간염에서 일정한 역할을 하는 지를 조사하였다. 만성 B형 간염과 연관된 말초혈 단핵 세포의 사이토킨 프로필을 RT-PCR로 분석하였다. B형 간염 표면 항원(HbsAg) 자극 직후에, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-10의 발현은 각각 환자의 41%, 8%, 41%, 50%에서 감지되었다. 이들 사이토킨 중에서, Th1 사이토킨 IFN-γ의 발현은 높은 수준의 혈청 AST/ALT(Aspartate aminotransferase/Alanine aminotransferase)와 연관하고 간 손상의 전형적인 마커를 대표한다. Th2형 사이토킨은 간세포에 대한 보호 효과를 발휘하지 않는 것으로 밝혀졌다. 결론적으로, HBsAg-반응 세포에 의한 Th1 사이토킨, IFN-γ의 생산은 만성 B형 간염에서 간세포 손상과 연관하였다(Lee et al., 1999). 높은 수준의 FAS 리간드 및 이의 수용체(CD95)는 B형 간염 환자의 간에서 보고되었 다(Luo et al., 1997). FAS 리간드는 간세포 아폽토시스를 유발하는 주요 세포독성제중 하나로 간주된다.

다른 연구에서는 치료받지 않은 30명의 C형 간염 바이러스/RNA(HCV/RNA)-양성 만성 간염 환자에서 간 손상의 진행과 연관한 인자를 확인하였다. Ishak 스코어를 이용하여 괴사염증성 구조적 손상을 평가하였다. 활성화된 간 성상 세포(hepatic stellate cell)(HSC)는 α-평활근 액틴(αSMA)에 대하여 면역조직화학으로 가시화시키고 계측검사(morphometry)로 정량하였다. 혈장 HCV/RNA는 경쟁 RT-PCR 방법을 이용하여 평가하였다. 간 손상의 진행에 관여하는 면역 반응의 유형을 조사하기 위하여, IFN-γ-양성 세포(Th1-유사 반응의 발현)는 면역조직화학으로 평가하고 계측검사로 정량하였다. HSC는 대부분 소열편 괴사염증 또는 내부 섬유성 격막 부위에 근접하여 감지되었다. αSMA-와 Sirius Red-양성 연조직(parenchyma)은 괴사염증성 구조적 스코어와 현저하게 상관하였다. IFNγ-양성 세포는 염증 침윤물과 연관된 간문맥 주위 부위에서 감지되었고 구조적 손상과 현저하게 상관하였다. 이런 이유로, HSC 활성화 및 간 손상의 진행은 Th1-유사 반응과 연관하는 것으로 결론되었다(Baroni et al, 1999). B형 간염의 경우와 유사하게, FAS 리간드 및 이의 수용체가 C형 간염 환자의 간과 혈청에서 발견되었다(Hiramatsu et al, 1994; Okazaki et al, 1996; Lio et al., 1998)

Th1 사이토킨 및 다른 Th1 마커는 알코올성 간염 및 간경병증과 연관하는 것으로 밝혀졌다. 염증성 자극과 지질 과산화는 핵 인자 κB(NF-κB)를 활성화시키고 친염증성 사이토킨과 케모킨을 상향-조절한다. 한 연구에서, 병리학적 간 손상, 내 독혈증(endotoxemia), 지질 과산화(lipid peroxidation), NF-κB 활성화, 친-염증성 사이토킨과 항-염증성 사이토킨 간의 불균형 사이의 상관관계를 평가하였다. 위내 주입(intragastric infusion)으로 쥐(군당 5마리)에 에탄올 및 포화된 지방, 팜유(palm oil), 옥수수유(corn oil) 또는 어유를 함유하는 사료를 제공하였다. 대조 쥐에서는 에탄올을 동등 칼로리의 덱스트로스로 대체하였다. 병리학적 분석을 실시하고 내독소, 지질 과산화, NF-κB 및 친염증성 사이토킨(TNFα, IL-1베타, IFN-γ, IL-12), C-C 케모킨(활성화 직후에 조절됨, 정상적인 T 세포 발현되고 분비된 [RANTES], 단핵구 화학주성 단백질 [MCP]-1, 대식세포 염증성 단백질 [MIP]-1-α), C-X-C 케모킨(사이토킨 유도된 호중구 화학주성인자 [CINC], MIP-2, IP-10, 상피 호중구 활성화 단백질 [ENA]-78), 항-염증성 사이토킨(IL-10, IL-4, IL-13)의 RNA(mRNA) 수준을 측정하였다. NF-κB의 활성화 및 친염증성 사이토킨 C-C와 C-X-C 케모킨의 증가된 발현은 괴사염증성 손상을 보이는 쥐(어유-에탄올 및 옥수수유-에탄올)에서 관찰되었다. 또한, 이들 군은 최고 수준의 내독소와 지질 과산화를 보였다. 염증성 간 손상을 보이는 군에서는 IL-10과 IL-4 mRNA 수준이 낮았다. 따라서, NF-κB의 활성화는 친염증성 자극의 존재하에 발생하고 Th1 친염증성 사이토킨과 케모킨의 증가된 발현을 유발한다(Naji et al., 1999). FAS 리간드 및 이의 수용체 역시 알코올성 간 질환에서 상승하는데, 이는 Th1 사이토킨이 알코올성 간염에서 유도된 자가면역 과정에 관여한다는 것을 더욱 뒷받침한다(alle et al., 1995; Taieb et al, 1998; Fiore et al., 1999).

TNF-α 역시 알코올-관련된 간 괴사-염증의 병인에서 공통 경로로서 부상하 였다. 상승된 수준의 간과 혈청 TNF는 알코올성 간 질환의 동물 모델 및 사람 알코올성 간 질환에서 상세하게 보고되었다. 이런 조절장애 TNF 기전은 다양한 대사 합병증 및 알코올성 간 질환의 간 손상에서 일정한 역할을 하는 것으로 간주된다(Grove et al., 1997; McClain and Cohen, 1989). 가령, 한 연구에서 알코올성 간염 환자(평균, 26.3 ng/L; 95% CI, 21.7 내지 30.9)가 정상 피험자(6.4 ng/L; CI, 5.4 내지 7.4)보다 높은 TNF-α 수준을 보이는 것으로 밝혀졌다. 이후에 사망한 환자(34.7 ng/L; CI, 27.8 내지 41.6)는 생존자(16.6 ng/L; CI, 14.0 내지 19.2)보다 높은 TNF-α 수준을 보였다. 알코올성 간염 환자에서, TNF-α 수준은 혈청 빌리루빈(r = 0.74; P = 0.0009) 및 혈청 크레아티닌(r = 0.81; P = 0.0003)과 양성으로 상관하였다. 알코올성 간염 환자는 비활성 알코올성 경변증 환자(11.1 ng/L; CI, 8.9 내지 13.3) 및 간 질환이 없는 심각한 알코올중독 환자(6.4 ng/L; CI, 5.0 내지 7.8)보다 높은 TNF-α 수준을 보였다. 신장 기능이 비정상적인 환자(14.1 ng/L; CI, 5.4 내지 22.8)는 알코올성 간염 환자보다 낮은 TNF-α 수준을 보였다. 이런 이유로, 알코올성 간염에서 TNF-α 상승은 중증 사례에서 가장 현저하게 나타나는 것으로 결론되었는데, 이는 TNF-α가 병인에 일정한 역할을 한다는 것을 암시한다(Bird et al., 1990).

TNF는 내독소의 다양한 생물학적 작용을 매개한다. 최근 연구에서, TNF 투여가 간 손상을 유발하고 간독소 갈락토사민(hepatotoxin galactosamine)의 치사성(lethality)을 매개하는 것으로 밝혀졌다. 가장 강력한 TNF 유도물질중의 하나는 내독소이다. 알코올성 간 질환 환자에서 내독혈증이 빈번하게 발생하고 알코올성 간염의 다양한 임상적 징후가 TNF의 공지된 생물학적 작용이기 때문에, 알코올성 간염 환자에서 이의 활성을 평가하였다. 16명의 알코올성 간염 환자 및 16명의 건강한 지원자에서 TNF 생산의 주요 출처인 말초혈 단핵구로부터 기부와 리포폴리사카라이드-자극된 TNF 방출을 측정하였다. 16명의 알코올성 간염 환자 중에서 8명 및 16명의 건강한 지원자 중에서 2명만 자발적 TNF 활성이 감지되었다(p < 0.05). 리포폴리사카라이드 자극이후, 알코올성 간염 환자로부터 TNF 방출은 건강한 대조의 2배 이상으로 현저하게 증가하였다(25.3 +/- 3.7 vs. 10.9 +/- 2.4 unit/㎖, p < 0.005). 이런 이유로, 알코올성 간염 환자로부터 단핵구가 건강한 지원자로부터 단핵구에 비하여 자발적인 리포폴리사카라이드-자극된 TNF 방출을 현저하게 증가시키는 것으로 결론되었다(McClain and Cohen, 1989).

리포폴리사카라이드(LPS)-결합 단백질(LBP)과 CD14는 내독소에 의한 세포 활성화에 핵심적인 매개 역할을 수행한다. 장-유래된 LPS는 알코올성 간 질환에서 병리학적 간 손상을 조장하는 것으로 간주된다. 오일에 녹인 에탄올을 4주동안 위내 공급한 쥐는 각각 쿠퍼 세포와 간세포에서 상승된 수준의 CD14와 LBP를 보이는 것으로 확인되었다. CD14 mRNA의 발현 역시 비골수성 세포에서 상승하였다. 강화된 LBP와 CD14 발현은 다양한 친염증성 사이토킨의 LPS-유도된 발현을 급격하게 증가시키고 알코올성 간 손상에서 병리학적 간 손상의 존재와 상관한다(Su et al., 1998; Lukkari et al., 1999).

관절염은 관절 염증을 수반하는 질환이다. 관절은 부종, 경직, 압통, 홍조 또는 발열을 보인다. 이들 증상은 체중 감소, 발열 또는 허약을 동반할 수 있다. 이들 증상이 2주 이상 지속되면, 염증성 관절염, 예를 들면, 류머티스 관절염이 원인일 수 있다. 관절 염증은 화농성 관절염을 유발할 수 있는 감염에 기인할 수도 있다. 매우 일반적인 유형의 관절염은 퇴행성 관절 질환(골관절염)이다.

관절염 및 관련된 이상에 일반적으로 처방되는 약물은 비-스테로이드성 항-염증성 약물(NSAID)이다. NSAID에는 아스피린 및 아스피린-유사 약물이 포함된다. 이들은 관절의 관절통, 경직, 부종의 원인인 염증을 감소시킨다. 하지만, NSAID는 위출혈을 비롯한 다양한 부작용을 유발하는 비-특이적인 약물이다(Homepage of the Department of Orthopaedics of the University of Washington on Artritis, Frederick Matsen(Chairman), www.orthop.washington.edu). NSAID에 더하여, 사이클로옥시게나제(COX-2) 저해물질인 Celebrex^TM이 성인 골관절염과 류머티스 관절염의 징후와 증상을 완화시키는데 사용된다. 이는 가족성 용종증(familial adenomatous polyposis) 환자의 치료에도 처방된다.

WO 01/00229에서는 염증 치료를 위한 종양 괴사 인자(TNF) 길항제 및 COX-2 저해물질을 기술한다.

TNF 길항제 역시 관절염 치료에 사용된다. TNF 길항제는 WO 9103553에서 기술한다.

여러 연구 결과는 인터루킨 IL-18이 관절 대사에서 친염증성 역할을 수행함을 입증한다. Olee et al.(1999)에서는 IL-18이 관절 연골세포에 의해 생산되고 친염증성과 이화 반응을 유도한다는 것을 확인하였다. IL-18 mRNA는 연골세포에서 IL-1β에 의해 유도되었다. 연골세포는 IL-18 전구물질을 생산하고, IL-1 자극에 반응하여 성숙 형태의 IL-18을 분비하였다. 연골세포에 대한 IL-18 효과의 연구 결과는 IL-18이 TGF-β-유도된 증식을 저해하고 산화질소 생산을 강화시킨다는 것을 더욱 입증하였다. IL-18은 정상적인 사람 관절 연골세포에서 유도성 산화질소 합성효소, 유도성 사이클로옥시게나제, IL-6, 스트로멜리신(stromelysin)을 비롯한 여러 유전자의 발현을 자극하였다. 유전자 발현은 상응하는 단백질의 합성과 연관하였다. 정상적인 사람 관절 연골을 IL-18로 처리하면 글리코사미노글리칸의 방출이 증가하였다. 이들 조사 결과는 연골세포 반응을 조절하고 연골 분해의 원인이 되는 사이토킨이 IL-18임을 확증하였다.

사람 골관절염 조직에서 인터루킨-1-전환 효소(ICE)/카스파제-1의 국재화 및 인터루킨-1베타와 인터루킨-18의 성숙에서 이의 역할은 Saha et al.(1999)에 의해 밝혀졌다. Saha et al.(1999)에서는 사람의 정상 연골과 골관절염(OA) 연골 및 활액막에서 카스파제-1의 발현과 생산을 조사하고 OA 연골세포에서 CE 수준을 정량하고 ICE, 인터루킨-1(IL-1), IL-18의 지형적 분포간 상관관계를 조사하고, 또한 연골세포의 아폽토시스를 조사하였다. 상기 연구에서 실시된 실험의 결과는 ICE가 사람 활액막과 연골 모두에서 발현되고 합성되며 정상 조직에서보다 OA 조직에서 양성으로 염색되는 세포의 총수가 현저하게 증가한다는 것을 지시하였다. ICE 생산은 관절 연골의 표피와 상부 중간층에서 주로 진행되었다. OA 연골 외식체 및 연골세포에서 성숙 IL-1베타의 생산은 특이적인 ICE 저해물질 처리에 의해 완전히 차단되었는데, 상기 ICE 저해물질은 IL-18-양성 세포 역시 현저하게 감소시켰다. 활성 IL-1베타와 ICE의 상관관계는 ICE가 상기 친염증성 사이토킨을 활성화시켜 OA 진행을 조장하고 IL-18이 연골 병리에서 일정한 역할을 수행한다는 것을 암시한다.

Gracie et al.(1999)에서는 류머티스 관절염에서 IL-18에 대한 친염증성 역할을 제안하였다. Gracie et al.(1999)에서는 골관절염 대조에서보다 류머티스 관절염 활액막 조직 내에서 현저하게 높은 수준의 IL-18 mRNA와 단백질을 감지하였다. 또한, IL-12 또는 IL-15와 IL-18의 조합이 시험관내에서 활액막 조직에 의한 IFN-γ 생산을 유도한다는 것을 확인하였다. 게다가, 콜라겐/불완전 Freund 어쥬번트-면역된 생쥐에 IL-18 투여가 미란성 염증성 관절염의 발생을 조장하였는데, 이는 IL-18이 생체내에서 친염증성임을 암시한다.

하지만, 화학적 화합물 이외에 가용성 수용체 또는 단클론 항체를 이용한 TNFα와 IL-1β의 차단만 뮤린 콜라겐-유도된 관절염(CIA, 류머티스 관절염의 생쥐 모델)을 감소시키는 것으로 확인되었었고(Williams et al., 1994), 이런 이유로 류머티스 관절염의 치료제로서 제안되었다.

“만성 또는 특발성 염증성 장 질환”은 적어도 2가지 질환을 포함한다: 크론병과 궤양성 대장염. 이들은 위장관 질환이며, 크론병은 주로 소장에 영향을 준다. 크론병이 결장으로 확대되면, 궤양성 대장염으로부터 감별 진단이 문제가 될 수 있다.

일반적으로, 크론병에서 만성 염증과 궤양 형성은 급성 맹장염과 유사한 소장 폐색 또는 복통으로 시작된다; 다른 증상은 이의 합병증에 관련될 수 있다. 상기 질환의 원인은 만성적이며, 치료에도 불구하고 악화와 완화가 반복된다. 일반적 으로, 초기 성인 단계에서 발병하는데, 모든 사례의 절반 정도가 20세 내지 30세, 90%가 10세 내지 40세에서 시작된다. 여성보다 남성에서 좀더 많이 발병한다.

검경은 불량한 외형을 반영한다. 염증 침범은 불연속적이다: 염증은 집중되거나 산재한다. 림프구와 혈장 세포의 집합체는 점막과 점막하에서 주로 발견되지만 일반적으로 모든 층(경점막)에 영향을 준다. 크론병의 고전적인 검경 특징은 림프구에 둘러싸인 과립 세포의 존재이다. 특발성 염증성 장 질환의 발생률은 상당한 지리적 편차를 보인다. 이들 질환은 도시화와 부의 축적으로 인하여 일부 남유럽과 일본에서 발생률이 증가하고 있긴 하지만, 남유럽, 아프리카, 남아메리카, 아시아보다는 북유럽과 미국에서 훨씬 높은 비율로 발생한다(General and Systematic Pathology, Churchill Livingstone, 3^rd edition 2000, JCE Underwood, Ed.).

크론병에는 임상적으로 2가지 주요 군이 존재하는데, 첫 번째 군은 질환이 발병 3년 이내에 완화되는 환자로 구성되고, 두 번째 군은 질환이 3년 이상 지속되는 군으로 구성된다.

원인에 상관없이, 친염증성 사이토킨, 특히 인터루킨(IL) 1, 2, 6, 8, 인터페론(IFN)-γ, 종양 괴사 인자(TNF)α의 증가된 생산과 함께 크론병에서 부적절한 T-세포와 대식세포 활성화가 지속적으로 나타난다. 크론병은 섬유증을 동반하는 지속적인(만성) 염증으로 특성화된다. 섬유모세포(fibroblastic) 증식과 콜라겐 침착 과정은 특정한 항-염증성 기능, 다시 말하면, 섬유아세포 동원, 세포간질 합성, 염증 세포의 하향-조절을 수행하는 형질전환 성장 인자 β에 의해 매개되긴 하지만, 다른 매개물질이 관여할 가능성도 있다.

궤양성 대장염은 일반적으로, 직장에서 시작하여 가변적인 범위로 확대되는 대장의 비-특이적 염증성 질환이다. 크론병과 달리, 궤양성 대장염은 대장에 국한된다.

궤양성 대장염이 변형된 자가면역 반응성의 결과이긴 하지만, 점막 손상이 대식세포와 호중구로부터 유래된 사이토킨, 프로테아제, 반응성 산소 대사물질에 의해 유발된 부적절한 T-세포 활성화와 간접적인 손상에 기인할 수도 있다. 결장 상피에 대한 후자 손상 기전은 “순수성 방관자(innocent bystander)” 손상이라 한다. 자가면역의 증거는 자가-반응성 T-림프구; 결장 상피 세포와 내피 세포에 대한 자가-항체; 항-호중구 세포질 자가-항체(ANCA)의 존재이다. 하지만, 궤양성 대장염은 자가면역 질환으로 간주되지 않는데, 여기서 점막 손상은 자가-항원에 대한 면역학적 반응의 직접적인 결과이다(General and Systematic Pathology, supra).

크론병 치료와 관련하여, 대부분의 사람들은 염증 조절에 도움을 주는 물질인 메살라민(mesalamine)을 함유하는 약물로 먼저 치료를 받게 된다. 이의 복용으로부터 효과가 없거나 이를 견뎌낼 수 없는 환자는 5-ASA 약물로 알려진 다른 메살라민-함유 약물을 처방받게 된다. 메살라민 제형의 가능한 부작용은 메스꺼움, 구토, 가슴앓이, 설사, 두통 등이다.

일부 환자는 염증을 조절하기 위하여 코르티코스테로이드를 복용한다. 이들 약물은 활성 크론병에 가장 유효하긴 하지만, 감염에 대한 상승된 취약성을 비롯한 심각한 부작용을 초래할 수 있다.

크론병 치료에는 면역계를 억제하는 약물 역시 사용된다. 가장 일반적으로 처방되는 약물은 6-멀캡토퓨린 및 관련된 약물, 아자티오프린(azathioprine)이다. 면역억제제는 염증의 원인이 되는 면역 반응을 차단함으로써 작용한다. 이들 약물은 메스꺼움, 구토, 설사와 같은 부작용을 유발하고 감염에 대한 개체의 저항성을 저하시킬 수 있다. 환자가 코르티코스테로이드와 면역억제제의 조합으로 치료를 받는 경우에, 코르티코스테로이드의 용량이 궁극적으로 감소될 수 있다. 일부 연구 결과는 면역억제제가 코르티코스테로이드의 효능을 강화시킬 수 있음을 암시한다.

미국 식품 의약국(U.S. Food and Drug Administration)은 표준 치료제(메살라민 물질, 코르티코스테로이드, 면역억제제)에 반응하지 않는 중등도 내지 중증도 크론병의 치료 및 개방성 배수 누관(open draining fistulas)의 치료용 약물로 인플릭시맙(infliximab)을 승인하였다. 크론병 목적으로 승인된 첫 번째 치료제인 인플릭시맙은 항-종양 괴사 인자(TNF) 단클론 항체이다. 항-TNF는 TNF가 소장에 도달하기에 앞서 이를 혈류로부터 제거함으로써 염증을 예방한다.

협착, 누관, 또는 이전 수술에 의해 유발된 소장에서 박테리아 과다성장을 치료하기 위하여 항생제가 사용된다. 이런 통상적인 문제를 위하여, 의사는 아래의 항생제 중에서 하나이상을 처방할 수 있다: 암피실린, 설폰아마이드, 세팔로스포린, 테트라사이클린, 또는 메트로니다졸.

염증이 가라앉으면 설사와 급격한 복통이 종종 완화되긴 하지만, 추가의 약물이 필요할 수도 있다. 디페녹실레이트, 로페라마이드, 코데인을 비롯한 여러 항-설사제가 사용될 수 있다. 설사로 인하여 탈수된 환자는 체액과 전해질 치료를 받 게 된다.

염증성 장 질환, 특히, 크론병(CD)과 궤양성 대장염(UC)의 치료 및/또는 예방에 유효하고 부작용이 감소되거나 부작용이 없는 치료제가 필요하다.

조직학적ㆍ면역학적 관찰 결과는 세포-매개된 면역과 T 세포 활성화가 CD의 핵심 특징임을 지시한다. 사람과 실험 모델로부터 달성된 연구 결과는 CD에서 국부적 면역 반응이 주로 Th1형이고(Desreumaux, et al. 1997), 국소적으로 방출된 사이토킨, 예를 들면, IFN-γ, IL-1, TNF-α가 염증성 반응을 조장하고 확대하는 원인임을 암시한다(Reimund et al. 1996).

사이토킨 IL-18은 IFN-γ 분비를 자극하고 자연 킬러 세포 세포독성을 강화시키며 Th1 세포 분화를 자극함으로써 사이토킨 IL-12와 공동으로 Th1 매개된 면역 반응에서 중요한 역할을 수행한다(Uschito et al, 1996).

IL-18은 IL-12, IL-2, 항원, 유사분열원 및 다른 인자와 함께 작용하여 IFN-γ의 생산을 유도한다. 또한, IL-18은 GM-CSF와 IL-2의 생산을 강화시키고 항-CD3 유도된 T 세포 증식을 강화시키며 자연 킬러 세포의 Fas-매개된 사멸을 증가시킨다. 성숙 IL-18은 IL-1β 전환 효소(ICE, 카스파제-1)에 의해 전구물질로부터 생산된다. IL-18 수용체는 리간드 결합에서 협력하는 적어도 2가지 성분으로 구성된다. 뮤린 IL-12 자극된 T 세포에서 IL-18에 대한 높은 친화성 부위와 낮은 친화성 부위가 발견되었는데(Okamoto et al., 1998), 이는 다중 연쇄 수용체 복합체를 암시한다. 현재, 2가지 수용체 아단위가 확인되었는데, 둘 모두 IL-1 수용체 계통에 속한다(Okamoto et al., 1999). IL-18의 신호 전달은 NF-κB의 활성화를 수반한다 (Matsumoto, et al. 1997).

최근에, IL-18은 염증성 장 질환에 일부 관여하는 것으로 제안되었다(Pizarro, et al. 1999; Monteleone, et al. 1999).

Pizarro et al.(1999)에서는 크론병 환자로부터 분리된 결장 시료 및 점막 세포 개체군에서 IL-18의 발현과 국재성(localization)을 특성화하였다. 반-정량적 RT-PCR 프로토콜을 이용하여, 궤양성 대장염 환자와 염증이 없는 대조 환자에 비하여 CD로부터 새로 분리된 장 상피 세포와 고유판 단핵 세포(lamina propria mononuclear cell)에서 IL-18 mRNA 전사체가 증가한다는 것을 확인하였다. IL-18 mRNA 전사체는 고유판 단핵 세포에 비하여 장 상피 세포에서 더욱 풍부하게 존재하였다. 외과적으로 절개된 결장 조직의 면역조직화학적 분석에서, 장 상피 세포와 고유판 단핵 세포(구체적으로, 대식세포와 수상돌기 세포) 모두에서 IL-18이 집중적으로 발견되었다. 웨스턴 블랏 분석에서, 재조합 IL-18 단백질과 성숙 IL-18 단백질에 일치하는 18.3-kDa 밴드가 CD vs UC 장 점막 생검에서 주로 발견되었다; 비활성 IL-18 전구물질에 일치하는 24 kDa의 두 번째 밴드는 CD와 UC 생검의 비-염증 부위에서 감지되었고, 염증이 없는 대조에서 단독으로 발견되었다.

Monteleone et al.(1999)에서는 이들 조사 결과를 뒷받침하였다. 12명의 크론병 환자와 9명의 궤양성 대장염 환자 및 15명의 비-염증성 장 질환 대조의 전체 점막 장 조직과 고유판 단핵 세포에서 반-정량적 RT-PCR과 웨스턴 블랏 분석으로 IL-18을 검사하였다. IL-18에 대한 전사체는 모든 검사 시료에서 발견되었다. 하지만, 궤양성 대장염 및 대조에 비하여 점막과 고유판 단핵 세포 모두에서 증가된 IL-18 mRNA 축적이 감지되었다. 크론병에서, IL-18에 대한 전사체는 침범된 영역으로부터 채취된 점막 시료에서 더욱 풍부하게 존재하였다. 성숙 IL-18에 일치하는 18-kDa 밴드는 주로 크론병 점막 시료에서 발견되었다. 비-IBD 대조로부터 유래된 점막 시료에서, IL-18은 24-kDa 폴리펩티드로서 존재하였다. 일관되게, 활성 IL-1베타-전환 효소(ICE) 아단위(p20)는 CD 또는 UC로부터 유래된 시료에서 발현되는 반면, 비-IBD 대조로부터 유래된 결장 점막에서 ICE는 전구물질(p45)로만 합성되었다.

Ohta et al.(2001)에서는 IL-18의 발현이 정상적인 피부에 비하여 건선성 병소 피부에서 증가한다는 것을 확인하였다. 이런 조사 결과는 각화 세포-유래된 IL-18이 건성성 병소에서 Th1 반응의 발생에 참여하고, 이의 생물활성이 피부 염증에서 엄격하게 조절된다는 것을 지시한다.

여러 동물 모델에서 내인성 IL-18을 중화시키는 항체는 질환의 심각도를 감소시킨다. 내독소 치사는 항-IL-18에 의해 예방된다. 인터페론-γ 독립성 모델에서도, IL-18의 중화는 생존을 연장시킨다. 또한, 항-IL-18은 독소 또는 활성화된 T 세포에 의해 유도된 세포 손상으로부터 간을 보호한다. 간 흑색종 전이 모델에서 IL-18 차단물질은 혈관 내피 부착-1 분자 발현의 IL-18 상향조절을 예방함으로써 악성 세포의 부착을 감소시킨다. IL-18과 IL-12는 상승적으로 작용하여 I 세포와 자연 킬러 세포를 자극하고 IFN-감마를 생산하는 반면, IL-18의 중화는 IFN-감마의 IL-12 유도를 예방한다. 여러 사이토킨과 유사하게 IL-18은 생쥐에서 대부분의 경우에 IFN-감마-의존성 기전인 종양에 대한 숙주 방어를 강화시키는데 사용될 수 있 다. 그럼에도 불구하고, 이런 숙주 방어를 강화시키는데 기여하는 것은 IL-18의 친염증성 포트폴리오이다. 관절염, 폐 손상 또는 염증성 장 질환 모델에서, IL-18의 중화는 염증 매개에서 상기 사이토킨의 중요한 역할을 입증한다(Dinarello 2000).

공개된 데이터는 IL-18이 염증성 CNS 질환에서 병리학적 역할을 수행한다는 것을 암시한다. IL-18의 중화는 동물 모델에서 뇌 손상(Yatsiv et al. 2002), 허혈성 손상(Mallat et al. 2002), 심장 기능장애(Raeburn 2002), 신경염(Yu et al 2002)으로부터 보호 기능을 제공하는 것으로 밝혀졌다.

하지만, IL-18이 생쥐에서 종양에 대한 숙주 방어를 촉진하는 것은 분명하다. 가령, 동계 생쥐에서 뮤린 IL-12 또는 뮤린 IL-18을 발현하는 뮤린 유선 암종 세포는 대조 비-발현 세포보다 종양원성이 덜하고 종양이 느리게 형성되었다(Coughlin et al. 1998). 항체 중화 연구에서 항종양 효과가 IFN-γ을 요구하는 것으로 확인되었다. Tasaki에 의한 연구에서, 인터루킨-18의 발현에 의해 뮤린 결장 암종 세포에서 보호 면역이 유도되는 것으로 관찰되었다. IL-18 유전자를 인코딩하는 벡터로 형질도입된 결장 암 세포는 면역적격 생쥐에 도입되는 경우에 피하 종양을 형성할 수 없었고 형질도입되지 않은 접종된 결장 암 세포에 저항하였다. 면역조직화학적 분석에서, IL-18 벡터로 형질도입된 세포를 보유하는 결장 종양에서 혈관의 수가 현저하게 감소하는 것으로 확인되었다. 결장 IL-18 형질도입된 세포의 종양원성 감소는 면역약화된 생쥐에서 관찰되지 않았다. 따라서, 종양 세포로부터 분비된 IL-18은 T 보조 1형 세포를 자극하여 항종양 반응을 유도하기 때문에, 어쥬번트로서 기능한다(Tasaki et al 2000).

IFN-α은 IL-18BP의 유도에 의해 만성 C형 간염 환자에서 생체내 항-염증성 기능을 발휘하는 것으로 제안되었다(Kaser et al. 2002).

기존 연구에서, 건강한 개체와 비교하여 패혈증(Novick 2001), 급성 이식편 대 숙주 질환(Zecchina 2001), 크론병(Corbaz 2002)과 같은 여러 질환에서 IL-18BP의 수준이 현저하게 상승하는 것으로 밝혀졌다. 하지만, 이들 환자에서 순환되는 IL-18의 수준 역시 매우 높기 때문에, 순환기에 존재하는 IL-18BP의 수준이 IL-18의 완전한 중화에 불충분한 것으로 밝혀졌다.

이런 이유로, IL-18과 같은 IL-1 계통 사이토킨이 병리에 관여하는 질환을 치료 및/또는 예방하는 수단이 요구된다.

본 발명의 요약

본 발명은 사이토킨-2의 수용체를 유도함으로써 유발되거나 악화되는 질환의 치료 또는 예방용 약물의 제조에서 IL-18BP, 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 단편에 결합할 수 있고 IL-1 계통의 구성원으로서 사이토킨-2, 바람직하게는 IL-18의 수용체를 저해할 수 있는 사이토킨-1, 바람직하게는 IL-1 계통의 구성원, 더욱 바람직하게는 IL-1F7b, 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 단편의 용도에 관한다.

더욱 구체적으로, 사이토킨-1은 사이토킨-2의 수용체 신호 사슬에 결합함으로써 사이토킨-2 활성을 저해한다. 따라서, 사이토킨-1은 내독소 치사(패혈증), 독소 또는 활성화된 T 세포 또는 C형 간염에 의해 유도된 간 손상, 관절염, 폐 손상, 건선, 염증성 장 질환, 뇌 손상, 허혈성 손상, 심장 기능장애, 신경염에서 선택되 는 염증성 질환, 또는 전이 형성의 치료 또는 예방에 사용된다. 원하는 경우, 본 발명에 따른 약물은 IL-18BP, 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 단편을 추가로 함유할 수 있다.

사이토킨-1 단백질 대신에, 이런 사이토킨-1을 인코딩하는 벡터가 사이토킨-2의 수용체를 유도함으로써 유발되거나 악화되는 질환의 치료 또는 예방용 약물의 제조에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 단백질 및/또는 벡터는 전신, 피하 및/또는 근육내 투여될 수 있다.

이에 더하여, 본 발명은 사이토킨-2의 수용체를 유도함으로써 유발되거나 악화되는 질환의 치료 또는 예방을 위하여 IL-18BP, 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 단편에 결합할 수 있고 IL-1 계통의 구성원으로서 사이토킨-2, 바람직하게는 IL-18의 수용체를 저해할 수 있는 사이토킨-1, 바람직하게는 IL-1 계통의 구성원, 더욱 바람직하게는 IL-1F7b의 내인성 유전자 활성화용 벡터에 관한다. 더욱 구체적으로, 사이토킨-1은 사이토킨-2의 수용체 신호 사슬에 결합함으로써 사이토킨-2 활성을 저해한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 내독소 치사(패혈증), 독소 또는 활성화된 T 세포 또는 C형 간염에 의해 유도된 간 손상, 관절염, 폐 손상, 건선, 염증성 장 질환, 뇌 손상, 허혈성 손상, 심장 기능장애, 신경염에서 선택되는 염증성 질환, 또는 전이 형성의 치료 또는 예방을 위한 사이토킨-1의 용도에 관한다. 원하는 경우, 본 발명에 따른 약물은 IL-18BP, 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 단편을 추가로 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 내인성 유전자 활성화용 벡터는 전신, 피하 및/또는 근육내 투여될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 사이토킨-2의 수용체를 유도함으로써 예방되거나 완화되는 질환의 치료 또는 예방을 위하여 IL-18BP, 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 단편에 결합할 수 있고 IL-1 계통의 구성원으로서 사이토킨-2, 바람직하게는 IL-18의 수용체를 저해할 수 있는 사이토킨-1, 바람직하게는 IL-1 계통의 구성원, 더욱 바람직하게는 IL-1F7b, 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 단편의 저해물질의 용도에 관한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 바이러스 질환이나 암의 치료 또는 예방을 위한 본 발명에 따른 사이토킨-1의 저해물질의 용도에 관한다.

사이토킨-1의 저해물질에는 예로써 항체, 안티센스 핵산, RNAi, 또는 사이토킨-1에 결합할 수 있는 가용성 사이토킨-2 수용체 또는 이의 단편 등이 포함된다.

이에 더하여, 본 발명은 IL-18BP, 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 단편에 결합할 수 있는 사이토킨-1, 바람직하게는 IL-1F7b, 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 단편의 치료 효과량을 투여하여 IL-1 계통의 구성원으로서 사이토킨-2, 바람직하게는 IL-18의 수용체를 저해하는 방법에 관한다. 더욱 구체적으로, 사이토킨-1은 사이토킨-2의 수용체 신호 사슬에 결합함으로써 사이토킨-2 활성을 저해한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 내독소 치사(패혈증), 독소 또는 활성화된 T 세포 또는 C형 간염에 의해 유도된 간 손상, 관절염, 폐 손상, 건선, 염증성 장 질환, 뇌 손상, 허혈성 손상, 심장 기능 장애, 신경염에서 선택되는 염증성 질환, 또는 전이 형성의 치료 또는 예방을 위한 사이토킨-1의 용도에 관한다. 원하는 경우, 사이토킨-1은 IL-18BP, 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 단편과 동시-투여될 수 있다. 본 발명의 방법에 따른 사이토킨-1은 전신, 피하 및/또는 근육내 투여될 수 있다.

대안으로, 본 발명의 방법은 사이토킨-1을 인코딩하는 벡터의 투여로 구성된다.

이에 더하여, 본 발명은 IL-18BP, 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 단편에 결합할 수 있는 사이토킨-1, 바람직하게는 IL-1F7b, 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 단편의 유전자 활성화용 벡터의 치료 효과량을 투여하여 IL-1 계통의 구성원으로서 사이토킨-2, 바람직하게는 IL-18의 수용체를 저해하는 방법에 관한다. 더욱 구체적으로, 사이토킨-1은 사이토킨-2의 수용체 신호 사슬에 결합함으로써 사이토킨-2 활성을 저해한다. 사이토킨-1은 내독소 치사(패혈증), 독소 또는 활성화된 T 세포 또는 C형 간염에 의해 유도된 간 손상, 관절염, 폐 손상, 건선, 염증성 장 질환, 뇌 손상, 허혈성 손상, 심장 기능장애, 신경염에서 선택되는 염증성 질환, 또는 전이 형성의 치료 또는 예방에 사용된다. 원하는 경우, 사이토킨-1은 IL-18BP, 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 단편과 동시-투여될 수 있다. 본 발명의 방법에 따른 유전자 활성화용 벡터는 전신, 피하 및/또는 근육내 투여될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 사이토킨-2의 수용체를 유도함으로써 예방되거나 완화되는 질환의 치료 또는 예방을 위하여 IL-18BP, 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융 합 단백질, 기능성 유도체 또는 단편에 결합할 수 있고 IL-1 계통의 구성원으로서 사이토킨-2, 바람직하게는 IL-18의 수용체를 저해할 수 있는 사이토킨-1, 바람직하게는 IL-1 계통의 구성원, 더욱 바람직하게는 IL-1F7b, 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 단편을 저해하는 방법에 관한다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 방법은 바이러스 질환이나 암의 치료 또는 예방을 위하여 사이토킨-1의 저해물질을 수반한다.

도 1. 사람 IL-18과 IL-IF7b의 서열 유사성.

사람 IL-18(수탁 번호 D49950)과 사람 IL-IF7b(수탁 번호 AF200496)를 도시한다. 추가로 조정된 Expert Protein Analysis System(ExPasy?)을 이용하여 정렬시켰다. IL-18과 IL-IF7b의 아미노산 상동성은 28%이고, 유사성은 55%이다. 밑줄로 표시된 아미노산은 IL-18에서 ICE-절단 부위 및 IL-IF7b에서 예상 절단 부위를 나타낸다.

도 2에서는 IL-IF7b가 IL-18에 의해 유도된 IFNγ 생산을 자극하지 않는다는 것을 보여준다.

도 2A. 사람 NKO 세포, 전체 사람 혈액의 배양액, PBMC(IL-12(1 ng/㎖)로 동시-자극됨), KG-1 세포(TNFα(10 ng/㎖)로 동시-자극됨)는 100 ng/㎖의 재조합 IL-IF7b(미성숙 또는 성숙 형태) 또는 IL-18로 처리하였다. 18시간(KG-1의 경우 48시간)이후, IFNγ을 상층액에서 측정하였다. 결과는 3회 독립된 실험의 평균 +/- SEM으로 표시한다.

도 2B. IL-12(1 ng/㎖)와 증가하는 농도의 미성숙 또는 성숙 IL-IF7b의 존재하에 IL-18(20 ng/㎖)에 의한 NK 세포 유도. 데이터는 3회 독립된 실험의 평균 +/- SEM으로 표시한다.

도 3A와 3B에서는 IL-IF7b와 IL-18Ra-세포외 도메인 3의 가교-결합을 보여준다.

도 3A. IL-18Ra: D3에 가교-결합된 IL-1F7b의 SDS-PAGE 환원. 니트로셀룰로오스에서 블랏팅이후, 가교-결합된 단백질은 IL-18Rα에 대한 단클론 mAb로 가시화시켰다.

도 3B. 화학적 가교-결합이후, IL-IF7b가 아닌 IL-18의 존재하에 IL-18Rα-와 β-ECD의 삼원 복합체 형성. 웨스턴 블랏팅이후, 상기 복합체는 his₆-표식된 IL-18Rβ에 대한 항-his₆표식 단클론 항체로 가시화시켰다.

도 4는 IL-IF7b와 IL-18BP의 가교-결합을 도시한다.

도 4A. 토끼 항-IL-18BP 혈청을 이용한 웨스턴 블랏에서 가교-결합된 단백질(각각 1.5 ㎍)의 감지.

도 4B. IL-18BP에 대한 mAb로 가교-결합된 단백질(각각 10 ㎍)의 면역침전. 가교-결합된 IL-1F7b/IL-18BP 및 대조 레인(IL-18BP +/- BS3, 가교결합제)은 토끼 항-IL-1F7b 혈청으로 염색하였다. IL-18/IL-18BP 복합체는 토끼 항-IL-18 혈청으로 감지하였다.

도 5. IL-IF7b는 NKO 세포에 의한 IL-18 유도된 IFNγ 방출을 저해하는 IL- 18BP의 능력을 강화시킨다.

성숙 IL-IF7b 250 ng/㎖(A, 0=9)(도 5A) 또는 미성숙 IL-IF7b 250 ng/㎖(B, 0=8)(도 5B), IL-18(25 ng/㎖), RPMI/FCS 10%에서 IL-18BP 희석액은 NKO 세포(0.5 x 10⁶/㎖)와 IL-12 I ng/㎖의 첨가에 앞서 1시간동안 96-웰 마이크로역가 평판에 배양하였다. 이들 세포와 함께 16시간 배양한 이후, 상층액은 수집하고 IFNγ을 측정하였다. 수치는 IL-IF7b 또는 IL-18BP의 부재하에 IL-18 25 ng/㎖ + IL-12 I ng/㎖로 자극된 NKO 세포에 의해 생산된 IFNγ의 비율로 표시한다. 통계학적 분석은 스튜던트 대응짝 t-검정(Student's paired t-test)으로 실시하였다(^*** p-값 < 0.001).

도 6에서는 트랜스펙션된 RAW264.7에서 IL-IF7b의 발현을 도시한다.

안정적인 트랜스펙션이후, 개별 클론(5X10⁶세포)의 용해질은 SDS-PAGE에서 분리하고 웨스턴 블랏 분석을 이용하여 IL-1F7b 발현을 검사하였다. 토끼 항 IL-1F7b 혈청(1:500 희석)은 IL1F7b-양성 클론을 특이적으로 염색하였다.

본 발명은 사이토킨-2의 수용체를 유도함으로써 유발되거나 악화되는 질환의 치료 또는 예방용 약물의 제조에서 IL-18BP, 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 단편에 결합할 수 있고 IL-1 계통의 구성원으로서 사이토킨-2(예, IL-18)의 수용체를 저해할 수 있는 사이토킨-1(예, IL-1F7b), 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 단편의 용도에 관한다. 본 명세서에서 “사이토킨-2의 수용체를 저해하는”과 “사이토킨-2의 활성을 저해하는”는 동일한 의미이다. 따라서, 본 발명은 IL-18BP, 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 단편에 결합할 수 있고 IL-1 계통의 구성원으로서 사이토킨-2(예, IL-18)의 활성을 저해할 수 있는 사이토킨-1의 용도에 관한다. 본 발명은 IL-1F7b가 IL-18BP에 의한 IL-18 활성의 저해를 강화시킨다는 조사 결과에 기초한다. IL-1F7b는 IL-18BP에 결합하고, 상기 복합체는 아마도 IL-18R(즉, IL-18Rα)의 신호 사슬을 동원함으로써 IL-18에 의한 IL-18R의 활성화를 저해하는 것으로 밝혀졌다.

적절하게는, 본 발명에 따른 사이토킨-1은 IL-1F7b, IL-18, IL-1, IL-1Ra와 같은 IL-1 계통의 구성원이다. 본 발명에서, 사이토킨-1과 사이토킨-2 서로 상이한 사이토킨이다. 가령, 아래의 사이토킨-1과 2 조합이 선택된다: IL-1F7b(사이토킨-1)와 IL-18(사이토킨-2); IL-1F7b(사이토킨-1)와 IL-1(사이토킨-2); IL-18(사이토킨-1)과 IL-1(사이토킨-2); IL-1(사이토킨-1)과 IL-18(사이토킨-2); IL-1F7b(사이토킨-1)와 IL-1Ra(사이토킨-2); IL-1Ra(사이토킨-1)와 IL-18(사이토킨-2); IL-18(사이토킨-1)과 IL-1Ra(사이토킨-2).

IL-1F7b(IL-1H4)는 IL-1 α/β, IL-1Ra, IL-18(IL-1 계통)에 서열 상동성을 공유하는 단백질 계통의 신규한 구성원으로서 최근에 발견되었다. IL-1F7b가 IL-18 수용체의 아단위중 하나, IL-18Rα 단위에 결합하긴 하지만, 이런 결합은 IL-18 촉진 기능 또는 길항 기능을 유도하지 않는다. 본 발명에 따라, 화학적 가교-결합을 이용함으로써 IL-1F7b는 IL-18Rα에 결합하지만, IL-18과 달리 IL-18Rα 사슬을 동원하여 기능적 활성 삼원 복합체를 형성하지 않는다.

IL-1F7b와 IL-18의 서열을 비교하였는데, 이들 단백질은 2가지 보존된 아미노산, 다시 말하면, IL-1F7b에서 아미노산 E35와 K124 및 IL-18에서 E42와 K89를 공유한다. IL-18에서 잔기 E42와 K89는 IL-18 활성과 저해 모두에 중요한데, 그 이유는 이들이 IL-18Rα(활성화)와 IL-18BP(저해)에 대한 결합에 관여하기 때문이다.

이에 더하여, 가교-결합 실험에 의해 IL-1F7b는 IL-18BP에 결합하는데, IL-18과 유사하게 IL18Rα에 대한 결합에 중요한 동일한 2가지 보존된 아미노산 잔기(즉, 아미노산 E35와 K124)를 통하여 IL-18BP에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, IL-1F7b는 IL-18BP와 복합체를 형성한 이후, 더 이상 IL-18Rα에 결합할 수 없는 것으로 보인다. IL-1F7b는 IL-18BP에 결합할 뿐만 아니라 이의 활성, 다시 말하면, IL-18 활성의 저해를 강화시킨다. 이런 활성은 미성숙과 성숙 IL-F7b 단백질 모두에서 관찰되었다. IL-18BP와 복합된 IL-1F7b는 IL-18Rα에 결합할 수 없기 때문에, IL-18 활성의 저해는 신호 IL-18Rβ 사슬에 대한 이런 복합체의 결합에 의해 유발되는 것으로 보인다. 이런 이유로, β-사슬이 복합체에 동원되고, IL-18Rα 및 IL-18과 기능성 수용체 복합체를 형성하는 β-사슬이 박탈된다.

따라서, 본 발명은 상이한 사이토킨(사이토킨-1), 또는 이의 동등형, 뮤테인, 대립 변이체, 또는 단편에 의한 IL-1 계통의 구성원으로서 사이토킨-2를 통한 신호의 저해를 포함한다.

면역조직화학적 국재성 연구에서 단핵구 개체군에서 IL-1F7b의 존재가 입증되었는데, 이는 IL-18 생활성의 자연 발현된 조절물질로서 IL-1F7b의 역할을 뒷받침한다.

본원에서 “뮤테인”은 사이토킨-1, 예를 들면, IL-1F7b의 유사체를 의미하는데, 여기서 사이토킨-1, 예를 들면, IL-1F7b의 아미노산 잔기중 적어도 하나가 상이한 아미노산 잔기로 치환되거나 결실되고, 대안으로 하나이상의 아미노산 잔기가 IL-1F7b에 부가되는데, 이때 IL-1F7b와 비교하여 생성된 산물의 능력에는 큰 변화가 없어야 한다. 더욱 구체적으로, IL-1F7b의 1개 내지 30개, 바람직하게는 1개 내지 20개, 더욱 바람직하게는 1개 내지 10개, 가장 바람직하게는 1-2개 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나 결실되거나 또는 부가될 수 있다. 이들 뮤테인은 공지된 합성 방법이나 특정부위-돌연변이유발 기술, 또는 임의의 적합한 다른 공지된 기술을 활용하여 만들 수 있다.

본 발명에 따른 뮤테인에는 엄격한 조건하에 핵산, 예를 들면 본 발명에 따른 사이토킨-1, 예를 들면, IL-1F7b를 인코딩하는 DNA 또는 RNA에 혼성화되는 DNA 또는 RNA에 의해 인코딩되는 단백질이 포함된다. “엄격한 조건”은 당분야에 공지된 “엄격한”혼성화 및 후속 세척 조건을 의미한다(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., &&6.3 and 6.4(1987, 1992); Sambrook et al., supra.). 제한없이, 엄격한 조건의 예에는 조사중인 하이브리드의 계산된 Tm보다 12-20℃ 낮은 세척 조건, 예를 들면 5분동안 2 x SSC와 0.5% SDS, 이후 15분동안 2 x SSC와 0.1% SDS; 30-60분동안 37℃에서 0.1 x SSC와 0.5% SDS, 이후 30-60분동안 68℃에서 0.1 x SSC와 0.5% SDS. 당업자가 인지하는 바와 같이, 엄격한 조건은 DNA 서열, 올리고뉴클레오티드 프로브(예, 10-40개 염기) 또는 혼성 올리고뉴클레오티드 프로브의 길이에도 좌우된다. 혼성 프로브가 이용되면, SSC 대신에 테트라메틸 염화암모늄(TMAC)을 사용하는 것이 바람직하다(Ausubel, supra.).

임의의 이런 뮤테인은 사이토킨-1, 예를 들면, IL-1F7b의 서열과 충분히 유사한 아미노산 서열을 가지기 때문에, IL-1F7b와 실제 유사한 활성을 가진다. IL-1F7b의 한가지 활성은 IL-18BP에 결합하는 능력이다. 따라서, 통상적인 실험 방법으로 임의의 뮤테인이 IL-1F7b와 실질적으로 동일한 활성을 가지는 지를 결정할 수 있는데, 상기 실험 방법은 적절히 표지된 IL-18BP와 뮤테인이 결합하는 지를 측정하는 간단한 샌드위치 경합 분석 단계, 예를 들면, 방사능면역검사 또는 ELISA 분석에 이런 뮤테인을 적용하는 단계로 구성된다.

바람직한 구체예에서, 이런 뮤테인은 IL-1F7B의 아미노산 서열과 적어도 40% 상동성 또는 동일성을 보유한다. 더욱 바람하게는, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 가장 바람직하게는 적어도 90% 상동성 또는 동일성을 보유한다.

본 발명에 사용될 수 있는 사이토킨-1, 예를 들면, IL-1F7b의 뮤테인, 또는 이를 인코딩하는 핵산에는 본원에 제시된 교시와 보도에 기초하여 과도한 실험없이 당업자가 용이하게 수득할 수 있는 치환된 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 일단의 실질적으로 상응하는 서열이 포함된다.

본 발명에 따른 뮤테인에 대한 바람직한 변화는 “보존성” 치환이다. 사이토킨-1, 예를 들면, IL-1F7b의 보존성 아미노산 치환에는 분자의 생물학적 기능을 보존하면서 유사한 물리화학적 성질을 가지는 일군의 동질성 아미노산간 치환이 포함된다(Grantham, 1974). 기능의 변화없는 아미노산의 부가 또는 결실이 상기 정의된 서열에서 실시될 수 있는데, 특히 30개 이하, 바람하게는 10개 이하의 아미노산이 부가 또는 결실되고 기능적 구조에 중요한 아미노산(예, 시스테인 잔기)이 결실 또는 치환되지 않는 경우에, 기능의 변화없는 아미노산의 부가 또는 결실이 가능하다. 이런 결실 및/또는 부가에 의해 만들어진 단백질 및 뮤테인은 본 발명의 목적에 포함된다.

바람직한 동질성 아미노산 군은 표 1에 제시한다. 더욱 바람직한 동질성 아미노산 군은 표 2에 제시한다; 가장 바람직한 동질성 아미노산 군은 표 3에 제시한다.

표 1

바람직한 동질성 아미노산 군

아미노산 동질성 군

Ser Ser, Thr, Gly, Asn

Arg Arg, Gln, Lys, Glu, His

Leu Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu

Pro Gly, Ala, Thr, Pro

Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr

Ala Gly, Thr, Pro, Ala

Val Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val

Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly

Ile Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile

Phe Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe

Tyr Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr

Cys Ser, Thr, Cys

His Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His

Gln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln

Asn Gln, Asp, Ser, Asn

Lys Glu, Gln, His, Arg, Lys

Asp Glu, Asn, Asp

Glu Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu

Met Phe, Ile, Val, Leu, Met

Trp Trp

표 2

더욱 바람직한 동질성 아미노산 군

아미노산 동질성 군

Ser Ser

Arg His, Lys, Arg

Leu Leu, Ile, Phe, Met

Pro Ala, Pro

Thr Thr

Ala Pro, Ala

Val Val, Met, Ile

Gly Gly

Ile Ile, Met, Phe, Val, Leu

Phe Met, Tyr, Ile, Leu, Phe

Tyr Phe, Tyr

Cys Cys, Ser

His His, Gln, Arg

Gln Glu, Gln, His

Asn Asp, Asn

Lys Lys, Arg

Asp Asp, Asn

Glu Glu, Gln

Met Met, Phe, Ile, Val, Leu

Trp Trp

표 3

가장 바람직한 동질성 아미노산 군

아미노산 동질성 군

Ser Ser

Arg Arg

Leu Leu, Ile, Met

Pro Pro

Thr Thr

Ala Ala

Val Val

Gly Gly

Ile Ile, Met, Leu

Phe Phe

Tyr Tyr

Cys Cys, Ser

His His

Gln Gln

Asn Asn

Lys Lys

Asp Asp

Glu Glu

Met Met, Ile, Leu

Trp Met

본 발명에 사용될 수 있는 사이토킨-1, 예를 들면, IL-1F7b 폴리펩티드 또는 단백질의 뮤테인을 수득하는데 활용할 수 있는 단백질에서 아미노산 치환의 유도 방법의 예에는 임의의 공지된 방법이 포함되는데, 이들 방법은 예로써 미국 특허 RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585, 4,737,462(Mark et al); 5,116,943(Koths et al.,) 4,965,195(Namen et al.,); 4,879,111(Chong et al.,); 5,017,691(Lee et al.,); 미국 특허 4,904,584(Shaw et al.,)(리신 치환된 단백질의 경우)에서 제시한다.

“융합단백질”은 예로써 체액에서 연장된 체류 시간을 갖는 다른 단백질과 융합되는 사이토킨-1, 예를 들면, IL-1F7b, 또는 이의 뮤테인 또는 단편으로 구성되는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, IL-1F7b는 다른 단백질, 폴리펩티드 등, 예를 들면, 면역글로불린 또는 이의 단편과 융합될 수 있다.

본 명세서에서 “기능성 유도체”에는 사이토킨-1, 바람직하게는, IL-1F7b, 이의 뮤테인, 융합 단백질이 포함되는데, 이들은 당분야에 공지된 수단으로 잔기 또는 N-이나 C-말단기에서 측쇄로 생성되는 작용기로부터 만들 수 있고, 이들이 제약학적으로 수용가능하면, 다시 말하면 IL-1F7b의 활성과 실질적으로 유사한 단백질의 활성을 파괴하지 않고 이를 함유하는 조성물에 독성을 공여하지 않는다면 본 발명에 포함된다.

가령, 이들 유도체는 폴리에틸렌 글리콜 측쇄를 보유하는데, 이는 항원성 부위를 차단하고 체액에서 사이토킨-1, 바람직하게는, IL-1F7b의 체류를 연장시킬 수 있다. 다른 유도체에는 카르복실기의 지방족 에스테르, 암모니아 또는 일ㆍ이차 아민과의 반응에 의한 카르복실기의 아마이드, 아실 부분(가령, 알카노일 또는 카르보사이클릭 아로일 작용기)으로 형성된 아미노산 잔기의 유리 아미노기의 N-아실 유도체, 또는 아실 성분으로 형성된 유리 하이드록실기(가령, 세릴 또는 테레오닐 잔기)의 O-아실 유도체 등이 포함된다.

본 발명에서 사이토킨-1, 바람직하게는, IL-1F7b, 이의 뮤테인, 융합단백질의 “단편”은 단독으로, 또는 연결된 분자 또는 이에 결합된 잔기(예, 당이나 인산염 잔기, 또는 단백질 분자나 당 잔기의 자체적인 응집체)와 공동으로 단백질 분자의 폴리펩티드 사슬의 임의 단편이나 전구물질을 포괄하는데, 이들 단편은 IL-18BP에 결합 및 사이토킨-2 수용체의 저해와 같은 IL-1F7b와 실질적으로 유사한 활성을 보유해야 한다.

또한, 본 발명은 사이토킨-1, 바람직하게는, IL-1F7b, 이의 동등형, 뮤테인, 융합단백질, 기능성 유도체, 활성 단편 또는 순환 치환된 유도체에 관한다. 이들 동등형, 뮤테인, 융합단백질 또는 기능성 유도체는 사이토킨-1의 생물학적 활성, 특히 IL-18BP에 대한 결합 능력, 바람직하게는 사이토킨-2 저해의 강화 능력을 유지한다. 가령, IL-1F7b의 뮤테인은 IL-18BP에 대한 결합 능력, 바람직하게는 IL-18 저해의 강화 능력을 유지한다. 이들 뮤테인은 IL-18BP에 대한 사이토킨-1의 결합에 관련된 아미노산을 유지한다. 가령, IL-1F7b의 경우에 뮤테인은 아미노산 E35와 K124를 유지한다. 이상적으로는, 이런 뮤테인은 변형되지 않은 사이토킨-1과 비교하여 강화된 생물학적 활성을 보유한다. 적절한 활성 단편은 사이토킨-1의 활성보다 높은 활성, 바람직하게는 더욱 높은 안정성 또는 더욱 낮은 독성이나 면역원성을 보유하거나, 대량으로 좀더 용이하게 생산 또는 정제된다.

사이토킨-1, 바람직하게는, IL-1F7b는 사이토킨-2, 바람직하게는 IL-18에 의해 유발되거나 악화되는 염증성 질환 또는 전이 형성의 치료 또는 예방용 제약학적 조성물에 사용될 수 있다. 여러 염증성 질환에서 환자에서 순환하는 IL-18BP의 수준이 높긴 하지만, IL-18BP의 농도는 이런 환자의 순환기에서 발견되는 높은 농도의 IL-18을 완전히 중화시킬 만큼 충분하지 않다. 따라서, IL-18BP가 이미 상승된 이런 환자에 사이토킨-1, 바람직하게는 IL-1F7b의 투여는 IL-18 작용의 완전한 저해에 유용하다. 대안으로, IL-1F7b와 IL-18BP는 내독소 치사(패혈증), 독소 또는 활성화된 T 세포 또는 C형 간염에 의해 유도된 간 손상, 관절염, 폐 손상, 건선, 염증성 장 질환, 뇌 손상, 허혈성 손상, 심장 기능장애, 신경염에서 선택되는 염증성 질환, 또는 전이 형성의 치료 또는 예방을 위하여 환자에 공동-투여될 수 있다.

IL-1F7b가 IL-18BP에 결합할 뿐만 아니라 이의 활성(IL-18 활성의 저해)을 강화시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, IL-1F7b와 IL-18BP의 동시-투여는 적은 함량의 IL-18BP가 요구되는 경우에 유익할 수 있다.

사이토킨-1, 바람직하게는 IL-1F7b는 질환에 따라 적절한 방식으로 투여된다. 따라서, 이는 예로써 국소, 전신, 피하 또는 근육내 투여될 수 있다.

동물 모델에서 IL-18의 중화는 염증 매개에서 상기 사이토킨의 중요 역할을 뒷받침한다(Interleukin-18, a proinflammatory cytokine. Dinarello CA. Eur Cytokine Netw 2000 Sep; 11(3): 483-6). 이런 이유로, 본 발명은 염증의 치료 또는 예방용 약물의 제조에서 사이토킨-1, 또는 사이토킨-1, 바람직하게는 IL-1F7b의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터의 용도에 관한다. 따라서, 사이토킨-1, 바람직하게는 IL-1F7b는 IL-18이 병리에 관여하는 것으로 알려진 염증성 질환, 예를 들면, 내독소 치사(패혈증), 독소 또는 활성화된 T 세포 또는 C형 간염에 의해 유도된 간 손상, 관절염, 폐 손상, 건선, 염증성 장 질환, 뇌 손상, 허혈성 손상, 심장 기능장애, 신경염의 치료 또는 예방을 위하여 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 IL-18 차단물질이 혈관 내피 부착-1 분자 발현의 IL-18 상향-조절을 예방함으로써 악성 세포의 부착을 감소시키기 때문에, 전이 형성의 예방용 약물의 제조를 위한 발현 벡터의 용도에 관한다. 따라서, 사이토킨-1을 목표 부위에 전달하기 위하여 유전자 치료 방식이 고려된다. 질환을 치료하기 위하여, 사이토킨-1(예, IL-1F7b)의 서열을 포함하는 유전자 치료 벡터는 병든 조직에 직접 주사하여 유전자 치료 벡터의 전신 투여에 관련된 문제점, 예를 들면, 벡터의 희석, 목표 세포 또는 조직으로의 표적화, 부작용을 회피한다. 대안으로, 본 발명에 따른 사이토킨-1의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터는 근육내 주사로 투여할 수 있다.

사이토킨-1, 바람직하게는 IL-1F7b, 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 활성 단편은 제약학적 조성물에 적합한 활성 성분이다. IL-18BP, 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 활성 단편은 제약학적 조성물의 활성 성분으로서 추가로 포함될 수 있다.

“제약학적으로 수용가능한”은 활성 성분의 생물학적 효능을 방해하지 않고 투여된 숙주에 독성을 보이지 않는 임의의 담체를 의미한다. 가령, 장관외 투여에서 활성 단백질은 식염수, 덱스트로스 용액, 혈청 알부민, 링거액과 같은 운반제에 녹인 주사용 단위 약형으로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 제약학적 조성물의 활성 성분은 다양한 방법으로 개체에 투여될 수 있다. 투여 루트에는 피내, 경피(예, 서방 제형), 근육내, 복강내, 정맥내(전신), 피하, 경구, 경막외, 국소, 비강내 루트가 포함된다. 치료에 유효한 임의의 투여 루트, 예를 들면 상피나 내피 조직을 통한 흡수, 또는 활성 성분을 인코딩하는 DNA 분자를 환자에 투여하고(예, 벡터를 통하여) 상기 DNA 분자가 생체내에서 활성 성분을 발현 및 분비하도록 하는 유전자 요법이 이용될 수 있다. 이에 더하여, 본 발명에 따른 단백질은 제약학적으로 수용가능한 계면활성제, 부형제, 담체, 희석제, 운반제와 같은 다른 생물학적 활성 성분과 함께 투여될 수 있다.

장관외(예, 정맥내, 피하, 근육내) 투여에서, 활성 단백질은 제약학적으로 수용가능한 장관외 운반제(예, 물, 식염수, 덱스트로스 용액) 및 등장성(예, 만니톨) 또는 화학적 안정성(예, 방부제와 완충제)을 유지시키는 첨가제와 혼합된 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 냉동 건조된 분말 형태로 제조될 수 있다. 상기 제제는 통상의 기술로 멸균된다.

본 발명에 따른 활성 단백질의 생체이용효율은 사람 체내에서 분자의 반감기를 증가시키는 공액 과정, 예를 들면 상기 분자에 폴리에틸렌글리콜을 부착시켜 개선할 수 있다(PCT 특허 출원 WO 92/13095).

사이토킨-1, 바람직하게는 IL-1F7b, 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 활성 단편은 염증성 질환, 예를 들면, 내독소 치사(패혈증), 독소 또는 활성화된 T 세포 또는 C형 간염에 의해 유도된 간 손상, 관절염, 폐 손상, 건선, 염증성 장 질환, 뇌 손상, 허혈성 손상, 심장 기능장애, 신경염으로 고생하는 환자에서 사이토킨-2 활성을 저해하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 사이토킨-1, 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 활성 단편은 전이 형성의 예방에도 사용될 수 있는데, 그 이유는 IL-18 차단물질이 혈관 내피 부착-1 분자 발현의 IL-18 상향조절을 예방함으로써 악성 세포의 부착을 감소시키기 때문이다. 상기한 방법은 사이토킨-1, 예를 들면, IL-1F7b의 치료 효과량을 병든 환자에 투여하는 단계로 구성된다. 사이토킨-1은 IL-18BP, 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 활성 단편과 동시-투여될 수 있다.

치료 효과량의 활성 단백질은 뮤테인의 유형, IL-18BP에 대한 뮤테인의 친화성, 뮤테인에 의한 임의 잔류 세포독성, 투여 루트, 환자의 임상적 상태를 비롯한 다양한 변수의 함수다.

“치료요법적 효과량”은 사이토킨-1, 예를 들면, IL-1F7b가 IL-18BP, 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 활성 단편의 IL-18 저해 활성의 강화를 유도하는 투여량이다. 단일 또는 다중 분량으로 개체에 투여된 용량은 투여 루트, 환자 상태와 특성(성별, 연령, 체중, 건강, 크기), 증상의 정도, 병행 치료법, 치료 빈도, 목적 효과를 비롯한 다양한 인자에 따라 달라진다. 개체에서 사이토킨-1의 활성을 측정하는 시험관내와 생체내 방법을 비롯하여, 기존 용량 범위의 조정은 당업자에게 자명하다.

정상적으로는 사이토킨-1의 발현에 침묵하거나 충분한 양의 사이토킨-1을 발현하지 못하는 세포에서 사이토킨-1, 바람직하게는 IL-1F7b의 내인성 생산을 유도 및/또는 강화하기 위한 벡터의 용도 역시 본 발명에서 고려된다. 벡터는 세포에서 사이토킨을 발현시키는 기능을 하는 조절 서열을 포함한다. 이런 조절 서열은 프로모터 또는 인헨서를 포함한다. 이후, 조절 서열은 상동성 재조합으로 게놈의 적절한 좌위에 도입되고, 발현의 도입이나 강화가 요구되는 유전자에 작동가능하게 결합된다. 일반적으로, 이런 기술은 “내인성 유전자 활성화”(EGA)라고 한다(WO 91/09955).

당업자가 인지하는 바와 같이, 동일한 기술, 다시 말하면, 음성 조절 요소, 예를 들면, 침묵화 요소(silencing element)를 사이토킨-1의 유전자 좌위에 도입하여 사이토킨-1 발현의 하향-조절 또는 예방을 유도함으로써 사이토킨-1 발현을 차단할 수도 있다. 사이토킨-1 발현의 이런 하향-조절 또는 침묵화는 질환의 예방 및/또는 치료에서 사이토킨-1 저해물질의 사용과 동일한 효과를 갖는다.

따라서, 감소된 IL-18 효과가 요구되는 경우, 예를 들면, 염증성 질환에서 또는 전이 형성의 저해를 위하여, 세포에서 사이토킨-1, 예를 들면, IL-1F7b의 양이나 활성의 증가가 바람직하다. IL-18BP는 병든 개체의 치료를 위하여 사이토킨-1, 예를 들면, IL-1F7b와 동시-투여될 수 있다.

하지만, 강화된 IL-18 효과가 요구되는 경우, 예를 들면, 종양의 치료/예방 또는 바이러스 질환의 치료/예방에는 사이토킨-1의 양이나 활성의 감소가 바람직하다.

실시예 1: IFNγ생산의 자극에 대한 IL-1 F7b의 효과

IL-18Rα사슬에 대한 IL-1F7b의 보고된 결합(Pan 2001, Kumar 2002)에 기초하여, IL-18과 유사한 IL-1F7b가 IL-18α수용체에 결합한 직후에 세포에서 IFNγ 생산을 자극하는 지를 평가하는 실험을 설계하였다. 예측된 ICE-절단 부위(도 1)에서 E21을 N-말단으로 이용한 전장 분자(미성숙 IL-1F7b) 또는 성숙 분자(성숙 IL-1F7b)를 아래의 실험에 사용하였다. 사람 NKO 세포(Kim 2000), 전체 사람 혈액의 배양액, 말초혈 단핵 세포(PBMC)(IL-12로 동시-자극됨, 1 ng/㎖, Preprotech)(제조용 PBMC, 실시예 8) 또는 KG-1 세포(TNFα로 동시-자극됨, 10 ng/㎖)(상기 세포주는 ATCC Rockville, MD로부터 입수하였다)는 100 ng/㎖의 재조합 IL-1F7b(미성숙 또는 성숙 형태, 실시예 5) 또는 IL-18로 자극하였다. 자극이후 18시(KG-1의 경우 48시) 시점에 이들 세포의 조건 배지에서 IFNγ을 측정하였다(액체상 전기화학형광(ECL), Puren 1998). IL-18은 IFNγ생산을 현저하게 자극하지만(도 2A), 미성숙과 성숙 IL-1 F7b는 이들 세포에서 IFNγ 생산을 자극하지 않았다.

따라서, IL-18과 달리, IL-18Rα사슬에 대한 IL-1F7b 결합은 IFNγ 생산을 유인하지 않았다, 다시 말하면, IL-18Rα사슬에 대한 IL-1F7b의 결합은 IL-18Rβ 사슬을 동원하지 않고, 따라서 기능적 활성 삼원 복합체가 형성되지 않는다.

IL-1F7b가 IL-18 길항제로 기능하여 IL-18Rα사슬에 대한 IL-18 결합을 예방 하고, 결과적으로 이의 생물학적 활성과 IFNγ 생산을 예방하는 지를 검사하는 실험을 실시하였다. 사람 NK 세포주는 IL-12(1 ng/㎖)의 존재하에, 증가하는 농도의 미성숙 또는 성숙 IL-1F7b와 함께 IL-18(20 ng/㎖)로 자극하고 생산된 IFNγ을 모니터하였다. 달성된 결과는 IL-1F7b가 IL-18보다 최대 40배의 몰 농도로 사용되거나(도 2B) IL-1F7b가 IL-18의 첨가에 앞서 연장된 기간동안 검사 세포와 함께 사전-배양되는 경우에도 미성숙 또는 성숙 IL-1F7b에 의한 IL-18-유도된 IFNγ의 저해가 나타나지 않음을 입증한다. 사람 PBMC에서 유사한 결과가 달성되었다(데이터 제시하지 않음).

이들 결과는 IL-1F7b가 IL-18에 의해 유도된 IFNγ 생산을 자극하지도 저해하지도 않음을 지시한다.

실시예 2: IL-18 수용체에 대한 IL-1F7b 결합의 특성화.

IL-18은 제 3 세포외 도메인(IL-18Rα: D3)을 통하여 IL-18Rα에 결합하는 것으로 보고되었다(Azam 2002). IL-18Rα에 대한 IL-1F7b의 결합을 특성화하기 위하여, IL-18Rα의 제 3 세포외 도메인(CD3)은 대장균(E. coli)에서 his6 표식된 단백질로서 개별적으로 발현시키고 Talon-친화성 크로마토그래피를 통하여 정제하였다. 이후, IL-1F7b는 이런 정제된 IL-18Rα: D3과 함께 배양하고 화학적으로 가교-결합시켰다(실시예 7). 도 3A에 도시된 바와 같이, SDS-PAGE와 웨스턴 블랏팅 분석에서 가교-결합된 IL-1F7b와 IL-18Rα: D3에 상응하는 43 kDa의 복합체가 확인되었다. IL-18Rα에 대한 가교-결합은 미성숙과 성숙 IL-1F7b 모두에서 관찰되었다. 이들 결과는 IL-18에 대한 결합에 중요한 것으로 이미 입증되었던 IL-18Rα: D3 도메 인이 IL-1F7b 도메인에 대한 결합에 결정적임을 암시한다.

IL-18Rα에 대한 IL-18의 결합 직후에, IL-18Rβ가 동원되고 활성 삼원 복합체: IL-18/IL18Rα/IL-18Rβ가 형성된다. 따라서, IL-18과 유사하게 IL-1F7b에 의한 IL-18Rα의 결합이 삼원 복합체 형성: IL-1F7b/IL18Rα/IL-18Rβ을 유인하는 지를 검사하는 아래의 실험을 실시하였다. IL-18Rα와 IL-18Rβ의 세포외 도메인은 당화와 같은 정확한 번역후 수식을 담보하기 위하여 Cos 세포에서 생산하였다(Azam 2002). IL-18, IL-18Rα, IL-18Rβ의 배양과 화학적 가교-결합이후, IL-18Rα, IL-18Rβ, IL-18로 구성되는 고분자량 복합체가 가교-결합된 단백질의 SDS-PAGE 분석에서 관찰되었다(도 3B). 하지만, IL-18과 달리 미성숙 또는 성숙 IL-1F7b를 IL-18Rα 및 IL-18Rβ와 함께 배양하는 경우에, 이런 삼원 복합체는 관찰되지 않았다(도 3B).

따라서, 이들 결과는 IL-18Rα에 대한 IL-1F7b의 결합 직후에 활성 삼원 복합체가 형성되지 않고 IL-18Rβ가 동원되지 않는다는 것을 입증한다.

실시예 3: IL-18BP에 대한 IL-1F7b의 결합

IL-18과 IL-1F7b의 아미노산 서열을 비교하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, IL-1F7b는 IL-18과 2개의 보존된 아미노산, E42와 K89를 공유한다. E42와 K89는 IL-18 활성 및 IL-18BP 결합에 결정적인 것으로 밝혀졌다(Novick 1999). 따라서, IL-1F7b와 IL-18의 서열 상동성에 기초하여, IL-1F7b가 IL-18BP에 결합하는 가능성을 조사하였다.

IL-1F7b(미성숙과 성숙 1.5 ㎍) 또는 IL-18(1.5 ㎍)은 IL-18BP의 존부하에 배양하고 가교결합제 BS3으로 처리하였다(실시예 7). 각각 IL-18BP 단백질 단독을 함유하는 2개의 대조군을 준비하였는데, 한 대조군은 가교결합제 BS3의 존재하에 배양하고, 다른 대조군은 가교결합제 BS3의 부재하에 배양하였다. 이들 단백질은 환원 조건하에 10% SDS-PAGE에 용해시키고 니트로셀룰로오스에 블랏하였다. 단백질은 IL-1F7b 또는 IL-18에 특이적인 다클론 항체를 이용하여 이들 블랏에서 감지하였다. 도 4A에 요약된 결과는 IL-18BP 이외에 미성숙 IL-1F7b, 성숙 IL-1F7b 또는 IL-18을 함유하는 군에서만 감지되고 대조군에서는 감지되지 않은 새로운 밴드를 보여준다. IL-18BP에 연결된 미성숙 IL-1F7b를 보유하는 대략 66kDa의 새로운 밴드 및 IL-18BP에 결합된 성숙 IL-1F7b를 보유하는 대략 64kDa의 새로운 밴드(도 4A)가 이들 블랏에서 확인되었다.

이에 더하여, IL-18BP(10 ㎍)의 존부하에 배양되고 가교-결합된 IL-1F7b(10 ㎍) 또는 IL-18(10 ㎍)로 면역침전 연구를 실시하였다. IL-18BP에 가교-결합된 단백질은 IL-18BP에 특이적인 단클론 항체를 이용하여 동시-면역침전시켰다. 면역복합체는 SDS-PAGE에 용해시키고 니트로셀룰로오스에 블랏하였다. 이들 블랏은 IL-1F7b 또는 IL-18 특이적 항체로 진전시켰다.

IL-18BP를 이용한 동시-침전 연구에서 동일한 64와 66 kDa 밴드가 관찰되었다(도 4B). 이들 가교-결합된 64와 66 kDa는 각각 성숙 IL-1F7b/IL-18BP와 미성숙 IL-1F7b/IL-18BP의 복합체를 반영한다. 이들 결과는 IL-1F7b가 IL-18BP에 결합함을 확증하였다.

실시예 4: IL-18BP에 의해 매개된 IL-18 활성의 저해에 대한 IL-1F7b의 효과

IL-1F7b가 IL-18BP, 특히 IL-18이 결합하는 동일한 도메인에 결합한다는 조사 결과(선행 실시예 참조)에 비추어, IL-18BP에 의한 IL-18의 활성에 대한 IL-1F7b의 효과를 탐구하였다. 작업 가설은 IL-1F7b가 IL-18BP와의 결합에 대하여 IL-18과 경쟁하고, 이런 이유로 IL-18이 IL-1F7b의 존재하에 IL-18BP에 의해 덜 중화된다는 것이었다.

성숙 IL-1F7b 250 ng/㎖ 또는 미성숙 IL-1F7b 250 ng/㎖는 96-웰 마이크로역가 평판에서 IL-18(25 ng/㎖) 및 증가하는 농도의 IL-18BP(1.56-50 ng/㎖)와 함께 배양하고 IL-12(1 ng/㎖)와 함께 NKO 세포(0.5 x 10⁶/㎖)에 첨가하였다. 16시간 배양이후, 상층액은 수집하고 IFNγ을 모니터하였다(액체상 전기화학형광(ECL), Puren 1998).

이의 결과는 가설과 대조적으로, 낮은 농도의 IL-18BP에서 IL-1F7b의 존재가 IL-18-유도된 IFNγ을 저해하는 IL-I8BP의 능력을 증가시킨다는 것을 입증한다(도. 5A와 B). 6.25 ng/㎖의 IL-18BP 및 성숙 IL-1F7b의 존재에서, IL-18의 활성은 76에서 55%(활성에서 21% 추가 감소)로 감소하였다. 3.12 ng/㎖의 IL-18BP 및 성숙 IL-1F7b의 존재에서, IL-18의 활성은 59에서 40%(활성에서 19% 추가 감소)로 감소하였다. 상기 분석에서 미성숙 IL-1F7b는 성숙 IL-1F7b보다 덜 활발하였다(도 5B). IL-1F7b의 이런 효과는 고도로 재현가능하고 낮은 농도의 IL-18BP에서만 관찰된다. PBMC에서 유사한 결과가 달성되었다(데이터 제시하지 않음).

실시예 5: IL-1F7b의 국재성

IL-1F7b에 특이적인 IgG는 다클론 토끼 항 IL-1F7b 혈청으로부터 정제하고 사람 PBMC에서 IL-1F7b의 발현을 연구하는데 사용하였다. 토끼 항-IL-1F7b 혈청과 IgG 제형의 특이성은 IL-1F7b cDNA에 의한 RAW264.7 대식세포의 트랜스펙션을 이용한 2가지 상이한 방법으로 검사하였다. 첫째, IL-1F7b 항혈청은 IL-1F7b 트랜스펙션된 RAW264.7 세포의 용해질에서 IL-1F7b를 특이적으로 인식하였다(도 6). 둘째, 공초점 디지털 검경에서, 친화성 정제된 항-IL-1F7b IgG는 트랜스펙션된 RAW264.7에서 IL-1F7b 발현을 인식하였지만 가성 대조 세포에서는 이를 인식하지 못하였다(데이터 제시하지 않음). 새로 분리된 사람 PBMC(실시예 8)는 1 ㎍/㎖에서 친화성-정제된 다클론 토끼 항-사람 IL-1F7b-IgG를 이용하여 IL-1F7b에 대하여 염색하였다. 공초점 레이저 현미경을 이용하여, IL-1F7b를 발현하는 사람 혈액 단핵구의 적층도(stacking view)를 산출하였다. IL-1F7b는 혈장막의 내부 표면에 국한된 세포질 및 핵 모두에서 발현되는 것으로 관찰되었다. 림프구 개체의 염색은 관찰되지 않았다.

실시예 6: 단백질 발현과 정제

아래의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 사람 비장 라이브러리(Clontech^?HLOOllB, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)로부터 IL-1F7b cDNA를 클론하였다: 센스 프라이머 5' GTTGAGTAATAAACTCAACG(SEQ ID NO: 1), 역 프라이머 5' GTTCAATGGGGCAGTTTC(SEQ ID NO: 2)(클론 AF200496(GenBank^?)에 특이적)(Kumar 2000). IL-1F7b cDNA는 5' 말단에 EcoRI 및 3' 말단에 XbaI에 대한 절단 부위를 도 입하는 2번째 프라이머 쌍을 이용하여 재증폭시켰다(센스 프라이머5'-ATATGAATTCATGTCCTlTGTGGGGGAG(SEQ ID NO: 3); 역 프라이머 5'-TATATCTAGAAGTTTCCTAATCGCTGACC(SEQ ID NO: 4). TA-클로닝을 이용하여, IL-1F7b cDNA는 제조업자의 사용설명서에 따라 pGEM-T Easy^?(Promega Corp. Medison, WI)에 전달하고 정확한 서열을 확인하였다. IL-1F7b cDNA는 EcoRI과 XbaI 부위를 이용한 박테리아 발현용 pPROEXTMHTa(Gibco-BRL)에 결찰시켰다. 상기 pPROEXTMHTa 벡터는 발현된 단백질의 친화성 정제를 위하여 N-말단 Hisx6 표식을 보유한다. pPROEXTMHTa/IL-IH4 플라스미드는 콤피던트 대장균(E. coli) 균주 DH5a(Gibco-BRL)에 형질전환시켰다. 하룻밤 배양액(10 ㎖)은 100 ㎍/㎖ 앰피실린을 함유하는 200 ㎖의 LB 배지에 첨가하고 0.6-1 OD₆₀₀의 밀도까지 성장시켰다.

단백질 발현은 이소프로필티오갈락토시드(0.3 mM) 첨가 및 교반하면서 37℃에서 3시간동안 배양으로 유도하였다. 박테리아는 원심분리(5,000 x g, 15분, 4℃)로 수집하고, 펠렛은 25 ㎖의 Talon 완충액(50 mM NaH₂PO₄, 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 8)에 부유시켰다. 세포는 얼음 위에서 초음파처리(4 x 10초 버스트), 이후 원심분리(4,000 x g, 30분, 4℃)로 용해시켰다. IL-1F7b는 요소 8M 처리로 봉입체(nclusion body)로부터 회수하였다. 요소 처리이후 상층액은 원심분리로 정화하고 Talon 완충액에 투석하며 2 ㎖ 미니-Talon 칼럼에 가하였다. 칼럼은 30 충전 부피(bed volume)의 Talon 완충액으로 세척하고 Talon 완충액에 녹인 5 ㎖의 100 mM 이미다졸로 용리하였다. 친화성-정제된 IL-1F7b를 함유하는 용리액은 예비 SDS- PAGE를 이용하여 분리하였다. 겔은 Coomassie Blue?(Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA)로 염색하고, IL-IH4에 상응하는 밴드를 절제하였다. IL-1F7b-함유 겔은 표준 프로토콜(Rockland Inc. Gilbertsville, AP)에 따라 토끼에서 다클론 항체를 생산하는데 사용하였다. 생물분석 및 가교-결합 연구에 이용된 전장(미성숙)과 성숙 IL-1F7b(N-말단 E21)는 기존 문헌에서 밝힌 바와 같이 대장균(E. coli)에서 생산하였다(Kumar 2002).

실시예 7: 단백질의 가교-결합

정제된 단백질은 30 ㎕ PBS에서 혼합하고 얼음 위에서 2시간동안 배양하였다.

이후, BS3(Bis(sulfosuccinimidyl) suberate)(Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL)을 1 mM 최종 농도로 첨가하고, 혼합물은 실온에서 1시간동안 배양하였다. 반응물은 Tris-CI, pH 7.4(20 mM 최종 농도)의 첨가로 급랭시켰다. 5분동안 끓인 이후, 단백질은 환원 조건(50 mM DTT)하에 10% SDS-PAGE를 이용하여 분리하고 니트로셀룰로오스에 블랏하였다. 가교-결합된 단백질은 1:500 희석액으로 사람 IL-18BP, IL-1F7b 또는 IL-18에 대한 토끼 항혈청을 이용하여 감지하였다.

실시예 8: PBMC의 분리.

PBMC는 혈소판-고갈된 잔류 백혈구 또는 건강한 공여자의 헤파린-처리된 혈액으로부터 정제하였다. 혈소판-고갈된 백혈구 또는 전혈은 염수로 1:1 희석하고 기존 문헌에서 밝힌 바와 같이 Ficoll-Histopaque? gradients(Sigma)에 가하였다(Kim 2001). 원심분리이후, 접촉면으로부터 세포를 수집하고 염수에서 3회 세척하 며 RPMI에 재부유시켰다. 분리된 PBMC는 분석을 시작할 때까지 얼음 위에 보관하였다.

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Claims

전이, 바이러스성 감염 또는 염증성 질환 치료 또는 예방을 위한 활성 성분으로 IL-18BP 및 IL-18R, IL-18BP에 결합할 수 있는 IL-1F7b를 포함하는 약학 조성물, 이때 상기 염증성 질환은 내독소 치사(패혈증), 독소 또는 활성화된 T 세포 또는 C형 간염에 의해 유도된 간 손상, 관절염, 폐 손상, 건선, 염증성 장 질환, 뇌 손상, 허혈성 손상, 심장 기능장애, 또는 신경염에서 선택된다.
제 1 항에 있어서, 내독소 치사(패혈증), 독소 또는 활성화된 T 세포 또는 C형 간염에 의해 유도된 간 손상, 관절염, 폐 손상, 건선, 염증성 장 질환, 뇌 손상, 허혈성 손상, 심장 기능장애, 또는 신경염에서 선택되는 염증성 질환 치료용 약학 조성물.
삭제
삭제
제 1 항에 있어서, 전이 형성 예방용 약학 조성물.
삭제
제 1 항, 제 2 항 또는 제 5 항중 어느 한 항에 있어서, IL-1F7b는 피하 또는 근육내 투여되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
전이, 바이러스성 감염 또는 염증성 질환 치료 또는 예방을 위한 활성 성분으로 IL-18BP 및 IL-18R, IL-18BP에 결합할 수 있는 IL-1F7b의 코딩 서열을 포함하는 벡터로 구성된 약학 조성물, 이때 상기 염증성 질환은 내독소 치사(패혈증), 독소 또는 활성화된 T 세포 또는 C형 간염에 의해 유도된 간 손상, 관절염, 폐 손상, 건선, 염증성 장 질환, 뇌 손상, 허혈성 손상, 심장 기능장애, 또는 신경염에서 선택된다.
제 8 항에 있어서, 전이 형성 예방용 약학 조성물.
제 8 항, 또는 제 9 항에 있어서, IL-1F7b를 인코드하는 벡터는 피하 또는 근육내 투여되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 8 항에 있어서, 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 8 항에 있어서, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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