EA008667B1 - Применение цитокина, способного связывать il-18bp и ингибировать активность второго цитокина - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к применению цитокина-1 предпочтительно из семейства IL-1, более предпочтительно IL1F7b, или его изоформы, мутеина, слитого белка, функционального производного или фрагмента, способного связываться с IL-18BP или его мутеином, слитым белком, функциональным производным или фрагментом и способного ингибировать рецептор цитокина-2; цитокин-2 является членом семейства IL-1, предпочтительно IL-18; для производства лекарственного средства для лечения или профилактики заболевания, которое вызывается или утяжеляется индуцированием указанного рецептора цитокина-2.

Description

Настоящее изобретение относится к применению цитокина, способного связывать ΙΚ-18связывающий белок и ингибировать активность второго цитокина, причем второй цитокин является членом семейства 1Ь-1.

Уровень техники

В 1989 г. было описано сывороточное активное вещество, индуцированное эндотоксином, которое индуцировало интерферон-γ (ΙΡΝ-γ), полученный из клеток селезенки мыши (Накатига е! а1., 1989). Данное сывороточное активное вещество не действовало как агент, впрямую индуцирующий ΙΡΝ-γ, но скорее как стимулятор, действующий совместно с 1Ь-12, ΙΡΝ-α/β, ΤΝΡ или митогенами. Попытка выделить данную активность из сыворотки мыши после воздействия эндотоксина выявила по-видимому гомогенный белок массой 50-55 кДа (Накатига е! а1., 1993). Поскольку другие цитокины могут действовать как совместные стимуляторы выработки ΙΡΝ-γ, неспособность нейтрализующих антител против 1Ь-1, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-б или ΤΝΡ нейтрализовать указанную сывороточную активность предполагала, что это является другим фактором. В 1995 г. те же исследователи показали, что индуцированный эндотоксином совместный стимулятор выработки ΙΡΝ-γ присутствует в экстрактах печени мышей, предварительно подвергнутых воздействию Р.аспек (Окатига е! а1., 1995). На данной модели популяция макрофагов печени (купферовских клеток) расширяется, и для данных мышей низкая доза бактериального липополисахарида (ЪР8), которая для мышей, не подвергавшихся предварительному воздействию, не является летальной, становится летальной. Фактор, названный ΙΡΝ-γ-индуцирующим фактором (ЮГЕ) и позднее обозначенный как интерлейкин-18 (1Ь-18), был выделен в гомогенном состоянии из 1200 г печени мышей, подвергшихся воздействию Р.аспек. Вырожденные олигонуклеотиды, полученные из аминокислотных последовательностей выделенного 1Ь-18, использовали для клонирования мышиной кДНК 1Ь-18 (Окатига е! а1., 1995). Матричные РНК для 1Ь-18 и интерлейкина-12 (1Ь-12) легко обнаруживаются в активированных макрофагах. 1Ь-18 сам по себе не индуцирует ΙΡΝ-γ, но действует, главным образом, как совместный с митогенами или 1Ь-12 стимулятор. В 199б г. было сообщение о последовательности человеческой ДНК для 1Ь-18.

Интерлейкин 1Ь-18 имеет общие структурные черты с семейством белков 1Ь-1 (№капшга е! а1., 1993, Окатига е1 а1., 1995, ϋδΡίο е! а1., 199б и Вахап е! а1., 199б). В отличие от большинства других цитокинов, которые обладают четырехспиральной пучковой структурой, 1Ь-18 и ΙΠ-1β имеют целиком βскладчатую пластинчатую структуру (ΤδΐιΙδίιί е! а1., 199б). Подобно ΙΠ-1 β, ΙΠ-18 синтезируется как биологически не активный предшественник (ρτοΙΕ-18), не имеющий сигнального пептида (ϋδΡίο е! а1., 199б). Предшественники ΙΠ-1β и ΙΠ-18 расщепляются каспазой-1 ([Р-Ц-превращающим ферментом или Ιί,Έ). которая расщепляет предшественники после остатка аспарагиновой кислоты на позиции Р1. Образованные зрелые цитокины легко высвобождаются из клетки (Ойауит е! а1., 1997, и Си е! а1., 1997).

ΙΠ-18 представляет собой совместный стимулятор выработки цитокинов (ΙΡΝ-γ, ΙΕ-2 и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора) клетками Т-хелперного типа Ι (ТЫ) (Κοίιηο е! а1., 1997), а также совместный стимулятор ΡΑδ-лигандопосредованной цитотоксичности клонов натуральных мышиных клеток-киллеров (Ткийш е! а1., 199б).

Лимфоциты ТЫ участвуют в иммунных ответах против опухолей (8ек1 е! а1., 2000). ТЫ ответы включают секрецию цитокинов ΙΕ-2, ΙΕ-12, ΙΠ-18 и ΙΡΝ-γ, а также дегенерацию специфичных цитотоксических Т-лимфоцитов, распознающих конкретные опухолевые антигены. ТЫ ответ является также жизненно важным оружием для защиты организма-хозяина от многих микроорганизмов. Однако ТЫ ответ также может быть связан с нежелательными эффектами, такими как развитие нескольких аутоиммунных заболеваний, воспаления и отторжения трансплантированного органа.

Цитокинсвязывающие белки (растворимые цитокиновые рецепторы) обычно представляют собой внеклеточные лигандсвязывающие домены соответствующих им цитокиновых рецепторов клеточной поверхности. Они вырабатываются как путем альтернативного сплайсинга, так и путем протеолитического расщепления рецептора клеточной поверхности. Указанные растворимые рецепторы были описаны ранее: например, растворимые рецепторы Ы-б и ΙΡΝ-γ (ΝονίοΚ е! а1., 1989), ЮТ (Епде1тапп е! а1., 1989, и Епде1тапп е! а1., 1990), ΙΠ-1 и ΙΕ-4 (Ма115хе\\ък| е! а1., 1990), ΙΡΝ-α/β (Νονίο1< е! а1., 1994, Νονίο1< е! а1., 1992). Один цитокин-связывающий белок, названный остеопротегерином (ОРС, известный также как фактор, ингибирующий остеокласты - ОС^), член семейства ΤNΡΒ/Ρа8, по-видимому, является первым примером растворимого рецептора, который существует только как секретированный белок (Апбегтоп е! а1., 1997, 8™οπ^ е! а1., 1997, Уакиба е! а1., 1998).

Интерлейкин-18-связывающий белок (Ш-^ВР) был выделен по сродству на колонке с ΙΠ-18 из мочи (Νονίο1< е! а1., 1999). ΙΗ-18ΒΗ отменяет вызываемую ΙΠ-18 индукцию ΙΡΝ-γ и ΙΕ-8, активацию ΝΡ-кВ ίπ νίίτο и индукцию ΙΡΝ-γ ίπ νΐνο. ]Ъ-18ВР представляет собой растворимый циркулирующий белок, который конститутивно экспрессируется в селезенке, и принадлежит к суперсемейству иммуноглобулинов. Наиболее широко распространенная изоформа Ш-^ВР, сплайсированная вариантная изоформа а, обладает высоким сродством с ΙΠ-18 с быстрой скоростью включения и медленной скоростью выключения и константой диссоциации (Кб) приблизительно 400 пМ (К1т е! а1., 1999).

Остатки, участвующие по взаимодействии ΙΚ-18 и ΙΚ-18ВР, были описаны посредством использования компьютерного моделирования (К1т е! а1., 1999) и основаны на взаимодействии ΙΚ-1 β и ΙΕ-1Β типа

- 1 008667

I (У1дегз е! а1., 1997). На модели связывания 1Ь-18 с 1Ь-18ВР остаток О1ц (Е) на позиции 42 и остаток Ьуз (К) на позиции 89 1Ь-18, как предполагали, связываются с Ьуз-130 и С1и-114 в [Ш-18ВР, соответственно (К1т е! а1., 1999).

[Б-18ВР конститутивно присутствует во многих клетках (Ригеп е! а1., 1999) и циркулирует у здоровых людей (ИгизЫБата е! а1., 2000). Высокое сродство [Ш-18ВР с 1Ь-18, а также высокая концентрация 1Ь18ВР, обнаруженная в циркуляции (молярное превышение в 20 раз по сравнению с 1Ь-18), представляют уникальную ситуацию в биологии цитокинов. Таким образом, было высказано предположение, что большинство, если не все, молекул 1Ь-18 в циркуляции связаны с 1Б-18ВР. Циркулирующий 1Б-18ВР, который конкурирует с рецепторами клеточной поверхности для 1Ь-18, может действовать как природная противовоспалительная и иммунодепрессантная молекула.

Вирусные агенты кодируют 1Ь-18ВР-подобные белки, например, вирусные белки М.соп!адюзит МС53 и МС54 обладают значительной гомологичностью с [Ш-18ВР млекопитающих (Ыоуюк е! а1., 1999). Белки М.соп1адюзит МС53 и МС54 обладают способностью связывать и нейтрализовать человеческий 1Б-18, сходной с указанной способностью [Ш-18ВР (Х1апд и Мозз, 1999). Белок поксвируса эктромелии р13, который является гомологичным с 1Б-18ВР, связывает человеческий 1Б-18 и ингибирует его активность ίη У1!го. У мышей, инфицированных делеционным мутантным вирусом р13, наблюдались пониженные уровни инфекционности (Вот е! а1., 2000). Таким образом, степень инфекционности, как представляется, коррелирует с присутствием вирусного 1Б-18ВР.

Высокие уровни циркулирующего 1Б-18ВР могут являться природной защитой против избыточных Т111-ответов на инфекцию и развития аутоиммунных заболеваний.

Цитокины семейства 1Ь-1, включая 1Ь-8, обладают рядом противовоспалительных и иммунорегулирующих свойств во время первичного и вторичного ответа на инфекцию (ОшагеПо. 1996 и ЫакашзЫ, 2001). Шесть новых членов генного семейства интерлейкина-1 (Ш-1) были открыты в результате изучения базы данных экспрессируемых меченых последовательностей (Вайоп, 2000, ВизДеИ, 2000, ПеЬе!з, 20001, Китаг, 2000, Ьт, 2001, Ми1его, 1999, Рап, 2001 и БтИй, 2000). Указанные белки имеют общий (βполый профиль, состоящий из 12 нитей, и значительную аминокислотную гомологичность с антагонистом рецепторов Ш-1 (1Ь-Ша), ΙΕ-1β и [Ш-18. Указанные новые члены семейства 1Ш-1 получены от общего предка, как и 1Ш-1 и [Ш-18 (№ск1ш, 2002, Тау1ог, 2002). За исключением [Ш-18, каждый находится на одной и той же области человеческой хромосомы 2 (№ск1ш, 2002, Ми1его, 2000, Тау1ог, 2002 и ВизДеИ, 2000). Биологическая функция данных гомологов 1Ш-1 до настоящего времени неизвестна. Было описано пять различных сплайсированных вариантов нового гомолога 1Ш-1 1Б-1Н4 (Ш-[Р7а-е) (ВизДеИ, 2000, Китаг, 2000, Рап, 2001, БтИй, 2000, Тау1ог, 2002). Первая описанная изоформа, 1Ь-1Р7а, имеет уникальный Ν-конец, состояний из экзона 3 гена 1Ш-1 Ρ7, который отсутствует в других сплайсированных вариантах гена. Короткие изоформы 1Ь-1Р7с, 1Ь-1Р7б и 1Ь-1Р7е не имеют экзона 4,2 или обоих, соответственно. Только 1Ь-1Р7Ь и с, содержащие экзон 1 и 2, экспрессируют Ν-концевой продомен, который имеет потенциальный сайт (сайты) расщепления каспазой-1 (1СЕ) (Китаг, 2002). Помимо указанных сплайсированных вариантов, в 1Ь-1Р7Ь существуют аминокислотные полиморфизмы (У31С и А42Т), основанные на мутациях двух пар нуклеотидов в экзоне 2 (Китаг, 2002, Рап, 2001). Несмотря на изучение обширной базы данных и секвенирование локуса гена Ш-1, мышиный гомолог 1Ш-1 Н4 до сих пор не обнаружен. 1Ь1Р7Ь имеет значительную гомологичность последовательности с [Ш-18. Отличительным признаком активности 1Ш-18 является его способность индуцировать ΙΡΝ-γ в Т-клетках или натуральных киллерах (ΝΙ<) в присутствии 1Ь-2, Ш-12 или 1Б-15 в качестве совместного стимулятора. Активность [Ш-18 опосредуется комплексом Ш-18К, состоящим Ш-18К.а, заканчивающимся лигандсвязывающей цепью (Топкое, 1997), и [Π-18β, заканчивающимся сигнальной цепью (3 (Вогп, 1998, К1т, 2001). После связывания с цепью Ш-18Ка и образования гетерокомплекса с цепью Ш-18Кв, ГЕ-18 индуцирует активацию киназы, связанной с рецептором [Ш-1, и фактора 6, связанного с рецептором Т№ (ТКАР-6). Указанные активированные киназы в конечном итоге приводят к транслокации ядерного фактора κ-В (ΝΡ-кВ) (Ма!зито!о, КоЬшзоп). [Ш— 1Ш7Ь, как сообщается, связывается с Ш-18К.а, по результатам исследования рецепторов ри11бо\уп аззау (Рап, 2001) или исследований связывания с использованием компьютерного чипа (В1аСоге®) (Ми1его, 2000). Достоверное, но низкоаффинное связывание Кб=130 мМ наблюдалось только для зрелой формы Ш-1Е7Ь, без пропептида, предполагающего биологическую связь с процессингом [Б1Р7Ь со стороны [СЕ (Китаг, 2002). Несмотря на связывание с Ш-18К.а, не было показано активности, подобной [Ш-18, или антагонистической активности как предшественника, так и зрелого Ш-1Б7Ь (Рап, 2001, Китаг, 2002).

Было высказано предположение о том, что интерлейкин [Ш-18 участвует в развитии патогенности при хронических воспалительных заболеваниях, включая эндотоксиновый шок, гепатит и аутоиммунный диабет (Кайтатцга и Окатига, 1998). Дальнейшие указания на возможную роль [Ш-18 в развитии повреждения печени были получены из экспериментов, опубликованных Тзиу е! а1. (Тзиу е! а1., 1999), которые показали повышенный уровень [Ш-18 при индуцированном липополисахаридами остром повреждении печени у мышей. Однако механизм многофункционального фактора [Ш-18 при развитии повреждения печени до сих пор не освещен.

- 2 008667

Поражение или повреждение печени может иметь разнообразные причины. Это может происходить из-за вирусных или бактериальных инфекций, злоупотребления алкоголем, иммунных расстройств или, например, злокачественной опухоли.

Вирусные гепатиты, вызванные вирусом гепатита В и вирусом гепатита С, например, представляет собой плохо поддающиеся лечению заболевания, которые поражают большое количество людей во всем мире. Количество известных вирусов гепатита постоянно растет. Помимо вирусов гепатита В и С, по меньшей мере четыре других вируса, вызывающих вирусный гепатит, были открыты к настоящему времени, называемые вирусами гепатита Α, Ό, Е и С.

Алкогольное заболевание печени представляет собой другое широко распространенное заболевание печени, связанное с хроническим употреблением алкоголя. Иммунный гепатит представляет собой редкое аутоиммунное заболевание, которое плохо поддается лечению. Повреждение печени включает также поражение желчных протоков. Первичный билиарный цирроз (РВС) представляет собой аутоиммунное заболевание печени, которое характеризуется деструкцией внутрипеченочных желчных протоков.

Несколько исследований показали, что повреждение печени при таких заболеваниях, как алкогольный гепатит, цирроз печени, вирусный гепатит и первичный билиарный цирроз, связано с ответами со стороны Клеток Т-хелперов-1 (ТЫ). В одном исследовании была разработана новая модель повреждения печени на мышах путем нацеливания содержащих овальбумин липосом в печень с последующим адоптивным переносом овальбумин-специфичных клеток ТЫ. Комбинированное воздействие на мышей содержащими овальбумин липосомами и переносом клеток ТЫ вызывало повышение активности сывороточных трансаминаз, которое наблюдалось параллельно с повышением сывороточных уровней ΙΕΝ-γ. Резким контрастом являлось то, что перенос овальбумин-специфичных клеток Т112 приводил к повышению уровней 1Ь-4, но не индуцировал повреждения печени. Повреждение печени блокировалось антителами против ΙΕΝ-γ и антителами против фактора некроза опухолей (ТИТ)-а. Указанные факты свидетельствуют о том, что клетки ТЫ являются главными эффекторными клетками при остром повреждении печени (МкЫшига и ОЫа, 1999). В другой серии исследований было показано, что у мышей с чрезмерной экспрессией ΙΕΝ-γ наблюдается спонтанный гепатит, при отсутствии какого бы то ни было патогена или любого другого раздражителя (Окашо1о с1 а1., 1998).

Другое исследование включало изучение ответов ТЫ при первичном билиарном циррозе (РВС). РВС представляет собой аутоиммунное заболевание печени, характеризующееся деструкцией внутрипеченочных желчных протоков. Обычно полагают, что клеточные иммунные механизмы, особенно вовлекающие Т-клетки, приводят к повреждению желчных протоков. Относительная сила ответов ТЫ и Т112. как предположили недавно, является важным фактором патофизиологии различных аутоиммунных заболеваний. В данном исследовании баланс субпопуляций при РВС оценивали путем выявления цитокинов, специфичных для двух субпопуляций Т-клеток, т.е., ΙΕΝ-γ для клеток ТЫ и 1Ь-4 для клеток Т112. Клетки, положительные по матричной РНК (мРНК) ΙΕΝ-γ и 1Ь-4, подсчитывали в срезах печени от 18 пациентов с РВС и 35 контролей заболевания, включая хронический активный гепатит С, внепеченочную билиарную обструкцию и нормальную печень, с использованием неизотопной гибридизации и иммуногистохимического анализа ίη 8Йи. Мононуклеарные клетки, экспрессирующие мРНК ΙΕΝ-γ и ΙΕ-4, были агрегированы в воспаленных портальных путях печени с РВС, но редко присутствовали в срезах печени при внепеченочной билиарной обструкции, алкогольном фиброзе или нормальной печени. Клетки, положительные по мРНК ΙΕΝ-γ и ΙΕ-4, в печени с РВС выявляли в достоверно более высоких количествах, чем в контрольной печени (Р<0,01). Кроме того, экспрессия мРНК ΙΕΝ-γ выявлялась чаще, чем экспрессия 1Б-4 в печени с РВС, и уровни экспрессии мРНК ΙΕΝ-γ тесно коррелировал со степенью портальной воспалительной активности. Клетки, положительные по мРНК ΙΕΝ-γ выявляли, главным образом, вокруг поврежденных желчных протоков, которые были окружены лимфоидными агрегатами. Данные показывают, что клетки ТЫ являются наиболее распространенной субпопуляцией Т-клеток в лимфоидных инфильтратах при РВС (Натаба с1 а1., 1997).

Цитокиновый профиль для распознавания вирусных антигенов, как полагают, оказывает выраженное влияние на разрешение вирусных инфекций и вирусный клиренс. В одном исследовании изучали, играет ли роль дисбаланс цитокинов, ориентированный в сторону ответа типа ТИ2, при хроническом гепатите В. Цитокиновые профили мононуклеарных клеток периферической крови, связанные с хроническим гепатитом В, анализировали с помощью ВТ-РСК. После стимуляции поверхностным антигеном гепатита В (НЬкАд) экспрессию ΙΕΝ-γ, Ш-2, Ш-4 и ТШ-10 выявляли у 41, 8, 41 и 50% пациентов, соответственно. Среди указанных цитокинов экспрессия ТЫ цитокина ΙΕΝ-γ была связана с высокими уровнями сывороточных АСТ/АЛТ (аспартатаминотрансферазы/аланинаминотренсферазы) которые являются типичными маркерами повреждения печени. Не было выявлено защитного эффекта в отношении гепатитов, вызываемого цитокинами типа Т112. В заключение, выработка цитокина ТЫ, ΙΕΝ-γ, НЬкАдреактивными клетками была связана с повреждением гепатоцитов при хроническом гепатите В (Ъее с1 а1., 1999). Высокие уровни лиганда ΕΑ8 и его рецептора (СИ95) были выявлены в печени пациентов с гепатитом В (Ьио е1 а1., 1997). Лиганд ΕΑ8 считают одним из главных цитотоксических агентов, который приводит к апоптозу гепатоцитов.

- 3 008667

В другом исследовании идентифицировали факторы, связанные с прогрессированием повреждения печени у 30 пациентов, положительных по вирусу гепатита С/РНК (НСУ/ΚΝΑ), с хроническим гепатитом. Некротическое/воспалительное и структурное повреждение оценивали с использованием шкалы Пйак. Активированные печеночные звездчатые клетки (Н8С) визуализировали иммуногистохимическим анализом на гладкомышечный α-актин (α-8ΜΑ) и определяли их количество морфометрически. НСУ/ΚΝΑ в плазме крови оценивали с использованием методики конкурентной КТ-РСК. Для того, чтобы изучить тип иммунного ответа, участвующего в прогрессировании повреждения печени, ΙΕΝ-γположительные клетки (как экспрессия ТЫ-подобного ответа) оценивали с использованием иммуногистохимического анализа, определяли их количество морфометрически. Было установлено, что НБС обнаруживали, главным образом, вблизи от областей лобулярного некроза/воспаления или от выстилки фиброзных перегородок. Паренхима, положительная по α-8ΜΑ и сириусу красному, коррелировала достоверно с суммой баллов по некрозу/воспалению и структурному повреждению. ΙΡΝ-γ-положительные клетки выявляли в перипортальных областях, связанных с воспалительными инфильтратами, и они достоверно коррелировали со структурным повреждением. Таким образом, было сделано заключение о том, что активация НБС и прогрессирование повреждения печени связаны с Тй1-подобным ответом (Вагош е! а1., 1999). Подобно случаю с гепатитом В, ΕΑ8 лиганд и его рецептор были обнаружены в печени и сыворотке крови пациентов с гепатитом С (Штатами е! а1., 1994; Окахак! е! а1., 1996; Ью е! а1., 1998).

Цитокины Т111 и другие маркеры ТЬ1, как было установлено, связаны с алкогольным гепатитом и циррозом печени. Воспалительные раздражители и перекисное окисление липидов активируют нуклеарный фактор кВ (ΝΕ-кВ) и повышают выработку провоспалительных цитокинов и хемокинов. В одном исследовании оценивали взаимоотношения между патологическим повреждением печени, эндотоксемией, перекисным окислением липидов и активацией ΝΡ-кВ и дисбалансом между про- и противовоспалительными цитокинами. Крысам (5 на группу) давали этанол и корм, содержавший насыщенный жир, пальмовое масло, кукурузное масло или рыбий жир через желудочный зонд. У контрольных мышей этанол изокалорически заменяла декстроза. Выполняли патологоанатомический анализ и осуществляли определение эндотоксина, перекисного окисления липидов, ΝΡ-кВ и уровни матричной РНК (мРНК) провоспалительных цитокинов (ТЛР-а, 1Ь-1 β, ΙΕΝ-γ и 1Б-12), С-С хемокинов (регуляцию после активации, нормальную экспрессию и секрецию Т-клетками |РЛНТЕ8|. моноцитарный хемотаксический белок [МСР]-1, макрофагальный воспалительный белок [ΜΙΡ]-1-α), С-Х-С хемокинов (индуцированный цитокинами нейтрофильный хемоаттрактант [СЕЛС], ΜΙΡ-2, ΙΡ-10 и эпителиальный нейтрофилактивирующий белок [ΕΝΑ]-78) и противовоспалительных цитокинов (ТС-10, ΙΕ-4 и ΙΕ-13). Активация ΝΡ-кВ и повышенная экспрессия провоспалительных цитокинов С-С и С-Х-С хемокинов наблюдалась у крыс, имеющих некротически-воспалительное повреждение (рыбий жир-этанол и кукурузное маслоэтанол). В данных группах также наблюдались самые высокие уровни эндотоксина и перекисного окисления липидов. Уровни мРНК ΙΠ-10 и ΙΕ-4 были ниже в группе с воспалительным повреждением печени. Таким образом, активация ΝΡ-кВ наблюдается в присутствии провоспалительных раздражителей и приводит к повышению экспрессии Т111 провоспалительных цитокинов и хемокинов (ΝΗ_)ί е! а1., 1999). ЕЛ8 лиганд и его рецептор также повышены при алкогольных заболеваниях печени, что вновь наводит на мысль о том, что цитокины Т111 участвуют в аутоиммунных процессах, индуцированных при алкогольном гепатите (Са11е е! а1., 1995; ТшеЬ е! а1., 1998; Йоге е! а1., 1999).

ΕΝΕ-ο. также возникал как распространенный путь при патогенезе связанного в алкоголем некрозавоспаления печени. Повышенные уровни печеночного и сывороточного ΈΝΕ были зафиксированы документально у экспериментальных животных с алкогольным заболеванием печени и при алкогольном заболевании печени у человека. Было высказано предположение о том, что указанная дисрегуляция метаболизма ТИЕ играет роль во многих метаболических осложнениях и повреждении печени при алкогольном заболевании печени (Сгосе е! а1., 1997; МсС1ат апб Сойеи, 1989). Например, в одном исследовании было установлено, что пациенты с алкогольным гепатитом имеют более высокие уровни ТИЕ-а (в среднем 26,3 нг/л; 95% СТ, от 21,7 до 30,9), чем у нормальных субъектов (6,4 нг/л; СТ, от 5,4 до 7,4). Пациенты, которые впоследствии умирали, имели более высокий уровень ТИЕ-а (34,7 нг/л; СТ, от 27,8 до 41,6), чем те, которые выживали (16,6 нг/л; О, от 14,0 до 19,2). У пациентов с алкогольным гепатитом уровни ТИЕ-а положительно коррелировали с сывороточным билирубином (г=0,74; Р=0,0009) и с сывороточным креатинином (г=0,81; Р=0,0003). Пациенты с алкогольным гепатитом имели более высокие уровни ТИЕ-а по сравнению с пациентами с неактивным алкогольным циррозом (11,1 нг/л; СТ, от 8,9 до 13,3) и с лицами, злоупотребляющими алкоголем, без заболевания печени (6,4 нг/л; О, от 5,0 до 7,8). Пациенты с нарушенной функцией почек имели более низкие уровни ΪΝΈ-α (14,1 нг/л; О, от 5,4 до 22,8), чем у пациентов с алкогольным гепатитом. Таким образом, было сделано заключение о том, что повышение ТИЕ-а при алкогольном гепатите наиболее выражено в тяжелых случаях, что наводит на мысль о том, что ТИЕα играет роль в патогенезе (В1гб е! а1., 1990).

Т№ опосредует многие биологические действия эндотоксина. Недавние исследования показали, что введение Т№ может вызывать повреждение печени и что ТИЕ может опосредовать летальность ге

- 4 008667 патотоксина галактозамина. Одним из наиболее мощных индукторов ΤΝΡ является эндотоксин. Поскольку у пациентов с алкогольным заболеванием печени часто наблюдается эндотоксемия, и поскольку многие клинические проявления алкогольного гепатита представляют собой известные биологические действия ΤΝΡ, его активность оценивали у пациентов с алкогольным гепатитом. Базальное и стимулированное липополисахаридами высвобождение ΤΝΡ из моноцитов периферической крови, главного источника выработки ΤΝΡ, определяли у 16 пациентов с алкогольным гепатитом и у 16 здоровых добровольцев. У восьми из 16 пациентов с алкогольным гепатитом и только у двух из 16 здоровых добровольцев имелась поддающаяся выявлению спонтанная активность ΤΝΡ (р менее 0,05). После стимуляции липополисахаридами средне высвобождение ΤΝΡ из моноцитов пациентов с алкогольным гепатитом достоверно возрастало более чем в два раза по сравнению со здоровыми контролями (25,3 ± -3,7 против 10,9 ± -2,4 единицы на мл, р менее 0,005). Таким образом, было сделано заключение о том, что моноциты от пациентов с алкогольным гепатитом имели достоверно повышенное спонтанное и стимулированное липополисахаридами высвобождение ΤΝΤ по сравнению с моноцитами от здоровых добровольцев (МсС1аш аиб Сойеп. 1989).

Липополисахарид(ЬР8)-связывающий белок (ЬВР) и СЭ14 играют ключевую промежуточную роль в активации клеток эндотоксином. Было высказано предположение о том, что полученный из кишечника ЬР8 участвует в прогрессировании патологического повреждения печени при алкогольном заболевании печени. Было показано, что крысы, которым давали через желудочный зонд этанол в масле в течение 4 недель, имели повышенные уровни СЭ14 и ЬВР в купферовских клетках и гепатоцитах, соответственно. Экспрессия мРНК СЭ14 была также повышена в немиелоидных клетках. Повышенная экспрессия ЬВР и СЭ14 быстро повышает ЬР8-индуцированную экспрессию различных провоспалительных цитокинов и коррелирует с присутствием патологического повреждения печени при алкогольном повреждении печени (8и е! а1., 1998; Ьиккап е! а1., 1999).

Артрит представляет собой заболевание, включающее воспаление суставов. В суставах наблюдается распухание, ригидность, болезненность, покраснение или гипертермия. Симптомы могут сопровождаться снижением массы тела, лихорадкой или слабостью. В случае, когда указанные симптомы длятся более двух недель, причиной может являться воспалительный артрит, например, ревматоидный артрит. Воспаление суставов также может вызывать инфекция, которая может приводить к септическому артриту. Весьма распространенным типом артрита является дегенеративное заболевание суставов (остеоартрит).

Лекарственными средствами, которые наиболее часто назначают при артрите и родственных состояниях, являются нестероидные противовоспалительные средства (НПВС - Ν8ΑΙΌ). НПВС включают аспирин и аспириноподобные лекарственные средства. Они уменьшают воспаление, которое является причиной боли в суставах, ригидности и распухания суставов. Однако НПВС представляют собой неспецифические лекарственные средства, имеющие ряд побочных эффектов, включая желудочное кровотечение (Страница в интернете по артриту отделения ортопедии Вашингтонского университета, Ртебепск Ма18еи (председатель), \\л\лу.ог11юр.\\'а51ипд1оп.еби). Помимо НПВС, Се1еЬтех™, ингибитор циклоокигеназы (СОХ-2), используется для облегчение признаков и симптомов остеоартрита и ревматоидного артрита у взрослых людей. Он также показан для лечения пациентов с врожденным семейным аденоматозным полипозом.

В АО 01/00229 описана комбинация антагонистов фактора некроза опухолей (ΤΝΡ) и ингибиторов СОХ-2 для лечения воспаления.

Антагонисты ΤΝΡ используются также для лечения артрита. Антагонисты ΤΝΡ описаны, например, в АО 9103553.

Исследования показывают, что интерлейкин ΙΠ-18 играет провоспалительную роль в метаболизме суставов. О1ее е! а1. (1999) показали, что ΙΠ-18 вырабатывается хондроцитами суставов и индуцирует провоспалительный и катаболический ответы. мРНК ΙΠ-18 была индуцирована ΙΠ-1β в хондроцитах. Хондроциты вырабатывали предшественник ΙΠ-18, и в ответ на стимуляцию ΙΠ-1 секретировали зрелую форму ΙΕ-18. Изучение влияния ΙΠ-18 на хондроциты далее показало, что он ингибирует ΤΟΕ-βиндуцированную пролиферацию и повышает выработку оксида азота. ΙΠ-18 стимулировал экспрессию нескольких генов в нормальных хондроцитах суставов человека, включая индуцируемую синтазу оксида азота, индуцируемую циклооксигеназу, ΙΕ-6 и стромелизин. Экспрессия генов была связана с синтезом соответствующих белков. Воздействие ΙΠ-18 на нормальный суставной хрящ человека повышало высвобождение гликозаминогликанов. Указанные открытия идентифицировали ГБ-18 как цитокин, который регулирует ответы хондроцитов и вносит свой вклад в деградацию хряща.

Локализация интерлейкин-в-превращающего фермента (ЮЕ)/каспазы-1 в остеоартритических тканях человека и его роль в созревании интерлейкина-1в и интерлейкина-18 была показана 8айа е! а1. (1999). 8айа е! а1. изучали экспрессию и выработку каспазы-1 в нормальном и остеоартритическом (ОА) хряще и синовиальной оболочке человека, количественно определяли уровень ΙΟΕ в ОА хондроцитах и изучали взаимоотношения между топографическим распределением ΙΟΕ, интерлейкина-1в (ΙΠ-1 β) и ΙΕ18, а также апоптозом хондроцитов. Эксперименты, выполненные в данном исследовании, показали, что

- 5 008667

1СЕ экспрессируется и синтезируется как в синовиальной оболочке, так и в хряще человека; при этом количество клеток, окрашивающихся положительно в ОА ткани достоверно выше, чем в нормальной ткани. Выработка 1СЕ была преимущественно локализована в поверхностном и верхнем промежуточном слоях суставного хряща. Выработка зрелого 1Ь-1бета в экплантатах и хондроцитах ОА хряща была полностью блокирована воздействием специфичного ингибитора 1СЕ, который также выраженно уменьшал количество 1Ь-18-положительных клеток. Взаимоотношения между активным 1Ш-1Ц и 1СЕ наводят на мысль о том, что 1СЕ может способствовать прогрессированию ОА путем активации данного провоспалительного цитокина, и что 1Б-18 может играть роль в патологии хряща.

6гас1е с1 а1. (1999) предположили провоспалительную роль 1Б-18 при ревматоидном артрите. Сгас1е с1 а1. выявили мРНК и белок Ш-18 в синовиальных тканях при ревматоидном артрите в достоверно более высоких уровнях, чем у остеоартритических контролей. Было показано также, что комбинация 1Б-12 или Ш-15 с Ш-18 индуцирует выработку ΙΕΝ-γ синовиальными тканями ίη νίΐτο. Кроме того, введение 1Б-18 мышам, иммунизированным коллагеном/неполным адъювантом Фрейнда, облегчало развитие эрозивного воспалительного артрита, что наводит мысль о том, что 1Б-18 может обладать провоспалительными свойствами ίη νίνο.

Однако к настоящему времени, не считая химических соединений, только блокада ΤΝΕ-α и 1Ш-1Ц путем использования растворимых рецепторов или моноклональных антител, как было показано, уменьшает индуцированный коллагеном артрит у мышей (С1А, который представляет собой модель ревматоидного артрита на мышах) (ЭДййашз е1 а1., 1994), и, таким образом, она была предложена в качестве способа лечения ревматоидного артрита.

Термин хронические или идиопатические воспалительные заболевания кишечника охватывают по меньшей мере два состояния: болезнь Крона и язвенный колит. Оба они являются заболеваниями желудочно-кишечного тракта, причем болезнь Крона наиболее часто поражает тонкий кишечник. В случае, когда она также вовлекает толстый кишечник, дифференциальный диагноз с язвенным колитом (см. ниже) может быть проблематичным.

Хроническое воспаление и изъязвление при болезни Крона обычно начинается тонкокишечной непроходимостью или болями в животе, которые могут имитировать острый аппендицит; другие проявления могут относиться к ее осложнениям. Течение заболевания является хроническим, и, несмотря на лечение, могут наступать обострения и ремиссии. Начало заболевания обычно приходится на начало взрослой жизни; около половины всех случаев начинается между 20 и 30 годами и 90% - между 10 и 40 годами. Мужчины заболевают несколько чаще, чем женщины.

Исследование под микроскопом отражает общую картину. Воспаление не является непрерывным: оно наблюдается фокусами или участками. Скопление лимфоцитов и плазматических клеток наблюдаются, главным образом, в слизистой оболочке и подслизистом слое, но обычно поражаются все слои (трансмуральное воспаление). Классическим микроскопическим признаком болезни Крона является наличие гранулярных клеток, окруженных скоплением лимфоцитов. Распространенность идиопатических воспалительных заболеваний кишечника значительно подвержена географическим вариациям. Указанные заболевания намного чаще встречаются в северной Европе и Соединенных Штатах, чем в странах южной Европы, Африки, Южной Америки и Азии, хотя растущая урбанизация и благосостояние населения приводит к большей распространенности заболевания в областях южной Европы и Японии (Сепега1 апб БуНетаЦс Ра11ю1оду. С1шгс1и11 ЬМпд81опе, 3-е издание, 1СЕ Ипбегоооб, Еб.).

При болезни Крона клинически различают две главные группы: первую, включающую пациентов, чье заболевание переходит в длительную ремиссию в течение трех лет после начала, и вторую, включающую пациентов с заболеванием, персистирующим свыше трех лет.

Какой бы ни была причина заболевания, имеются сведения о персистенции и патологической активации Т-клеток и макрофагов при болезни Крона, с повышенной выработкой провоспалительных цитокинов, в частности, интерлейкинов (1Ь) 1, 2, 6 и 8, интерферона (ΙΕΝ)-γ и фактора некроза опухолей (ΤΝΡ)α. Болезнь Крона характеризуется продолжительным (хроническим) воспалением, сопровождающимся фиброзом. Процесс пролиферации фибробластов и отложения коллагена может опосредоваться трансформирующим фактором роста (β, который обладает определенными противовоспалительными свойствами, а именно, рекруитментом фибробластов, синтезом матрикса и понижающей регуляцией клеток воспаления, но, вероятно, в процессе участвует множество других медиаторов.

Язвенный колит представляет собой неспецифическое воспалительное заболевание толстого кишечника, которое обычно начинается в прямой кишке и распространяется проксимально на различном протяжении. В отличие от болезни Крона, язвенный колит ограничивается толстым кишечником.

Все больше данных свидетельствуют о том, что язвенный колит является следствием измененной аутоиммунной реактивности, но поражение слизистой оболочки также может возникать вследствие патологической активации Т-клеток и непрямого повреждения, вызываемого цитокинами, протеиназами и реакционноспособными кислородными метаболитами из макрофагов и нейтрофилов. Данный последний механизм повреждения эпителия толстого кишечника получил название повреждения невинного свидетеля. Свидетельством в пользу аутоиммунного механизма является присутствие аутореактивных Т

- 6 008667 лимфоцитов и аутоантител, направленных против эпителиальных и эндотелиальных клеток толстой кишки, а также антинейтрофильных цитоплазматических аутоантител (ЛЫСА). Однако не следует думать, что язвенный колит является аутоиммунным заболеванием, при котором поражение слизистой оболочки является прямым следствием иммунной реакции на аутоантиген (Оеиега1 апб 8уз!ета!ю Ра!йо1оду, см. выше).

Что касается лечения болезни Крона, большинство людей сначала лечат лекарственными средствами, содержащими мезаламин, вещество, которое помогает бороться с воспалением. Пациентов, которым оно не помогает или которые его не переносят, можно перевести на другие лекарственные средства, содержащие мезаламин, обычно известные как 5-АЗА агенты. Возможные побочные эффекты препаратов мезаламина включают тошноту, рвоту, изжогу, диарею и головную боль.

Некоторые пациенты для борьбы с воспалением принимают кортикостероиды. Указанные лекарственные средства являются наиболее эффективными для лечения активной болезни Крона, но они могут вызывать серьезные побочные эффекты, включая повышенную чувствительность к инфекции.

Лекарственные средства, которые подавляют иммунную систему, также можно использовать для лечения болезни Крона. Чаще всего назначают 6-меркаптопурин и родственное лекарственное средство, азатиоприн. Иммунодепрессантные агенты действуют путем блокирования иммунной реакции, которая вносит свой вклад в воспаление. Указанные лекарственные средства могут вызывать такие побочные эффекты как тошнота, рвота и диарея, и могут снижать сопротивляемость организма по отношению к инфекции. В случае, когда пациентов лечат комбинацией кортикостероидов и иммунодепрессантных лекарственных средств, дозу кортикостероидов можно в конечном итоге снизить. Некоторые исследования предполагают, что иммунодепрессантные лекарственные средства могут повысить эффективность кортикостероидов.

Администрация по пищевым продуктам и лекарственным средствам США разрешила использование лекарственного средства инфликсимаб для лечения умеренной и тяжелой болезни Крона, которая не поддается стандартной медикаментозной терапии (мезаламиновым веществам, кортикостероидам, иммунодепрессантным агентам), и для лечения открытых, дренирующихся свищей. Инфликсимаб, первое лекарственное средство, разрешенное для использования конкретно при болезни Крона, представляет собой моноклональное антитело против фактора некроза опухолей (ΤΝΡ). Анти-ΤΝΡ удаляет ΤΝΡ из кровотока до того, как он достигает кишечника, предотвращая, таким образом, воспаление.

Антибиотики используют для лечения избыточного размножения бактерий в тонком кишечнике, вызванного стриктурой, свищами или перенесенными оперативными вмешательствами. По поводу данной распространенной проблемы врач может назначить один или более из следующих антибиотиков: ампициллин, сульфонамид, цефалоспорин, тетрациклин или метронидазол.

Диарея и схваткообразные боли в животе часто облегчаются, когда исчезает воспаление, но может потребоваться дополнительное медикаментозное лечение. Можно использовать несколько агентов против диареи, включая дифеноксилат, лоперамид и кодеин. Пациентов, которые обезвожены вследствие диареи, обычно лечат жидкостями и электролитами.

Все еще остается потребность в эффективном лекарственном средстве для лечения и/или профилактики воспалительных заболеваний кишечника, в частности, болезни Крона (СИ) и язвенного колита (ИС), которое имеет уменьшенные побочные эффекты или, в идеале, не имеет побочных эффектов.

Как гистологические, так и иммунологические исследования показывают, что клеточноопосредованный иммунитет и активация Т-клеток являются главными признаками СИ. Исследования на людях и экспериментальных моделях предполагают, что при СИ локальный иммунный ответ представляет собой преимущественно ответ Т11 типа (Оезгеитаих е! а1., 1997) и что локально высвобожденные цитокины, такие как ΙΡΝ-γ, 1Ь-1 β и ΤΝΡ-α, вносят свой вклад в развитие и распространение воспалительного ответа (Решшпб е! а1., 1996).

Цитокин 1Ь-18 играет важную роль в ΤЫ-опосредованном иммунном ответе совместно с цитокинов 1Ь-12 путем стимуляции секреции ΙΡΝ-γ, усиления цитотоксичности клеток натуральных киллеров и стимуляции дифференцировки клеток Τ11 (ИзсЫ!о е! а1., 1996).

1Ь-18 действует совместно с 1Ь-12, 1Ь-2, антигенами, митогенами и, возможно, другими факторами, индуцируя выработку ΙΡΝ-γ. 1Ь-18 также увеличивает выработку ОМ-С8Р и 1Ь-2, потенцирует анти-СИЗ индуцированную пролиферацию Т-клеток и повышает Раз-опосредованное уничтожение клеток натуральных киллеров. Зрелый 16-18 производится из его предшественника с участием 1Ь-1в-превращающего фермента (1СЕ, каспазы-1). Рецептор 1Ь-18 состоит по меньшей мере из двух компонентов, которые действуют совместно при связывании лиганда. Сайты связывания с 1Ь-18 высокой и низкой аффинности были обнаружены в стимулированных мышиным 1Ь-12 Т-клетках (Окато!о е! а1., 1998), предполагающие рецепторный комплекс, состоящий из множества цепей. К настоящему времени идентифицированы две рецепторные субъединицы, оба принадлежащие к семейству рецепторов 1Ь-1 (Окато!о е! а1., 1999). В сигнальной трансдукции Ш-18 участвует активация ΝΡ-кВ (Ма!зито!о е! а1., 1997).

Недавно было высказано предположение, что Ш-18 принимает некоторое участие при воспалительных заболеваниях кишечника (Ρί/агго е! а1., 1999; Моп!е1еопе е! а1., 1999).

- 7 008667

ΡίζακΓΟ е! а1. (1999) описали экспрессию и локализацию 1Ь-18 в образцах толстого кишечника и изолированных популяциях клеток слизистой оболочки от пациентов с болезнью Крона. Используя полуколичественный протокол КТ-РСК, количество транскриптов мРНК 1Ь-18, как было установлено, возрастает в только что выделенных эпителиальных клетках кишечника и мононуклеарных клетках 1ашша ргорпа при СИ, по сравнению с пациентами с язвенным колитом и с контрольными пациентами. не имеющими воспаления. Транскрипты мРНК 1Ь-18 наблюдались в большем количестве в эпителиальных клетках кишечника по сравнению с мононуклеарными клетками 1аш1па ргорпа. Иммуногистохимический анализ хирургически резецированных тканей толстого кишечника показал локализацию ΙΕ-18 как в мононуклеарных клетках 1аш1па ргорпа (особенно, в макрофагах и дендритных клетках), так и в эпителиальных клетках кишечника. Анализ вестерн-блот показал, что полосу 18,3 кДа, соответствующую как рекомбинантному, так и зрелому человеческому белку 1Ь-18, обнаруживали преимущественно в биоптатах слизистой оболочки при СИ по сравнению с ИС; вторую полосу 24 кДа, соответствующую неактивному предшественнику 1Ь-18, обнаруживали в невоспаленных участках биоптатов как при СИ, так и при ИС, и она была единственной формой, которую находили у контролей, не имевших воспаления.

Моп1е1еопе е! а1. (1999) подтвердили указанные данные. Цельную ткань слизистой оболочки кишки и мононуклеарные клетки 1аш1па ргорпа от 12 пациентов с болезнью Крона и 9 пациентов с язвенным колитом и от 15 контролей с невоспалительными заболеваниями кишечника подвергали анализу на предмет 1Ь-18 с использованием полуколичественной КТ-РСК и анализа вестерн-блот. Транскрипты для 1Ь-18 обнаружили во всех анализировавшихся образцах. Однако повышенное скопление мРНК 1Ь-18 было выявлено в образцах как слизистой оболочки, так и мононуклеарных клеток 1аш1па ргорпа при болезни Крона, по сравнению с язвенным колитом и контролями. При болезни Крона транскрипты для 1Ь-18 наблюдались в большем количестве в образцах слизистой оболочки, взятых из пораженных областей. Полосу 18 кДа, соответствующую зрелому 1Ь-18, обнаруживали преимущественно в образцах слизистой оболочки при болезни Крона. В образцах слизистой оболочки контролей без ΙΒΌ 1Ь-18 присутствовал в виде полипептида 24 кДа. Постоянно активная субъединица (р20) 1Ь-1в-превращающего фермента (1СЕ) экспрессировалась в образцах как при СИ, так и при ИС, в то время как в слизистой оболочке толстой кишки контролей без ΙΒΌ 1СЕ синтезировался только в виде предшественника (р45).

0111а е! а1. в 2001 г. показали, что экспрессия 1Ь-18 возрастает в коже, пораженной псориазом, по сравнению с экспрессией в нормальной коже. Их данные показывают, что 1Ь-18, полученный из кератиноцитов, участвует в развитии Т11 ответа в псориатических поражениях и что его биологическая активность, как оказалось, строго регулируется при воспалении кожи.

На нескольких моделях экспериментальных животных было показано, что антитела, которые нейтрализуют эндогенный 1Ь-18, уменьшают тяжесть заболевания. Летальность, связанная с эндотоксином, предотвращается при использовании анти-1Е-18. Даже на моделях, которые являются независимыми от интерферона-γ, нейтрализация 1Ь-18 пролонгирует выживание. Анти-1Ь-18 также защищают печень от клеточного повреждения, индуцированного токсинами или активированными Т-клетками. На моделях метастазов меланомы в печень блокада 1Ь-18 снижает адгезию злокачественных клеток путем предотвращения повышающей регуляции 1Ь-18 в отношении экспрессии молекулы адгезии-1 эндотелия сосудов. 1Ь-18 и 1Ь-12 действуют синергически в отношении стимуляции выработки ΙΕΝ-γ Ι-клетками и клетками натуральными киллерами, но нейтрализация 1Ь-18 предотвращает индукцию ΙΕΝ-гамма. 1Ь-18, подобно нескольким цитокинам, можно использовать для усиления защиты хозяина против опухолей у мышей, механизм, которые наиболее часто является зависимым от ΙΕΝ-гамма. Тем не менее, именно провоспалительные свойства [Л-18, вероятно, вносят свой вклад в усиление защиты хозяина. На моделях артрита, повреждения легких или воспалительного заболевания кишечника нейтрализация ГЛ-18 выявляет важную роль данного цитокина в опосредовании воспаления (Пшате11о, 2000).

Опубликованные данные свидетельствуют, что !Л-18 может играть патологическую роль в воспалительных заболеваниях ЦНС. Как было показано, нейтрализация [Л-18 защищает экспериментальных животных от повреждения головного мозга (УаЫу е! а1., 2002), ишемического повреждения (Ма11а! е! а1., 2002), сердечной дисфункции (КаеЬитп, 2002) и неврита (Υυ е! а1., 2002).

Однако имеются свидетельства, что !Л-18 способствует защите хозяина от опухолей у мышей. Например, у сингенных мышей клетки мышиной карциномы молочной железы, экспрессирующие мышиный ΙΕ-12 или мышиный [Л-18, были менее онкогенными и образовывали опухоли более медленно, чем контрольные, не экспрессирующие, клетки (СоидЫш е! а1., 1998). Исследования по нейтрализации антител показали, что противоопухолевые эффекты требуют наличия ΙΕΝ-γ. В исследовании, проведенном Такакт, наблюдался защитный иммунитет, индуцированный в клетках мышиной карциномы толстого кишечника, посредством экспрессии интерлейкина-18. Клетки рака толстого кишечника, трансдуцированные векторами, кодирующими ген ЕЛ-18, не могли образовывать подкожных опухолей после введения иммунокомпетентным мышам, и становились резистентными к инокулированным нетрансдуцированным клеткам рака толстого кишечника. Иммуногистохимический анализ показал, что количество кровеносных сосудов в опухолях толстого кишечника с клетками, трансдуцированными векторами ЕЛ-18, значительно уменьшалось. Утрата онкогенности трансдуцированными ЕЛ-18 клетками толстого кишечника не

- 8 008667 наблюдалась у иммуноскомпрометированных мышей. Таким образом, 1Ь-18, секретированный из опухолевых клеток, действует как адъювант, поскольку он стимулирует Т-хелперные клетки типа I индуцировать противоопухолевый ответ (Такак1 с1 а1., 2000).

Было высказано предположение, что ΙΡΝ-α проявляет свое противовоспалительное действие ίη νίνο у пациентов с хроническим гепатитом С, помимо прочего, посредством индукции 1Ь-18ВР (Какег с1 а1., 2002).

В предыдущей работе было установлено, что по сравнению со здоровыми лицами, уровни 1Ь-18ВР были значительно повышены при многих заболеваниях, таких как сепсис (ΝονίοΚ. 2001), острая реакция трансплантат против хозяина (2еееЫпа, 2001), болезнь Крона (СогЬах, 2002). Однако также было установлено, что у данных пациентов уровни 1Б-18 в циркуляции являются очень высокими и, следовательно, уровни 1Б-18ВР, присутствующие в циркуляции могут быть недостаточными для полной нейтрализации 1Б-18.

Таким образом, существует потребность в обеспечении средств для лечения и/или профилактики заболеваний, при которых в их патогенезе участвует цитокин из семейства 1Ь-1, такой как 1Б-18.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к применению цитокина-1, предпочтительно, из семейства 1Ь-1, более предпочтительно, 1Ь-1Р7Ь, или его изоформы, мутеина, слитого белка, функционального производного или фрагмента, способного связываться с 1Б-18ВР или его мутеином, слитым белком, функциональным производным или фрагментом, и способного ингибировать рецептор цитокина-2; цитокин-2 является членом семейства 1Ь-1, предпочтительно, 1Б-18; для производства лекарственного средства для лечения или профилактики заболевания, которое вызывается или утяжеляется индуцированием указанного рецептора цитокина-2.

Более конкретно, цитокин-1 ингибирует активность цитокина-2 путем связывания с сигнальной цепью рецептора цитокина-2. Таким образом, цитокин-1 можно применять для лечения или профилактики воспалительных заболеваний, выбранных из летальности, связанной с эндотоксином (сепсиса), повреждения печени, индуцированного токсинами или активированными Т-клетками, или гепатита С, артрита, повреждения легких, псориаза, воспалительного заболевания кишечника, повреждения головного мозга, ишемического повреждения, дисфункции сердца и неврита, или для лечения или профилактики образования метастазов. Если это желательно, лекарственное средство по настоящему изобретению может дополнительно содержать 1Б-18ВР или его мутеин, слитый белок, функциональное производное или фрагмент.

Вместо белка цитокина-1, можно использовать вектор, кодирующий указанный цитокин-1, для производства лекарственного средства для лечения или профилактики заболевания, которое вызывается или утяжеляется индуцированием указанного рецептора цитокина-2.

Указанные выше белок (белки) и/или векторы по настоящему изобретению можно вводить системно, подкожно и/или внутримышечно.

Кроме того, настоящее изобретение относится к вектору для эндогенной генной активации цитокина-1, предпочтительно, из семейства 1Ь-1, более предпочтительно, 1Ь-1Р7Ь, способного связываться с 1Ь18ВР или его мутеином, слитым белком, функциональным производным или фрагментом, и способного ингибировать рецептор цитокина-2; цитокин-2 является членом семейства 1Ь-1, предпочтительно, 1Б-18; для лечения или профилактики заболевания, которое вызывается или утяжеляется индуцированием указанного рецептора цитокина-2. Более конкретно, цитокин-1 ингибирует активность цитокина-2 путем связывания с сигнальной цепью рецептора цитокина-2. Более конкретно, настоящее изобретение относится к применению цитокина-1 для лечения или профилактики воспалительных заболеваний, таких как летальность, связанная с эндотоксином (сепсис), повреждение печени, индуцированное токсинами или активированными Т-клетками, или гепатит С, артрит, повреждение легких, псориаз, воспалительное заболевание кишечника, повреждение головного мозга, ишемическое повреждение, дисфункция сердца и неврит, или для лечения или профилактики образования метастазов. Если это желательно, лекарственное средство по настоящему изобретению может дополнительно содержать 1Б-18ВР или его мутеин, слитый белок, функциональное производное или фрагмент.

Вектор для эндогенной генной активации по настоящему изобретению можно вводить системно, подкожно и/или внутримышечно.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к применению ингибитора цитокина-1, предпочтительно, из семейства 1Ь-1, более предпочтительно, 1Ь-1Р7Ь, или его изоформы, мутеина, слитого белка, функционального производного или фрагмента, способного связываться с 1Б-18ВР или его мутеином, слитым белком, функциональным производным или фрагментом, и способного ингибировать рецептор цитокина-2; цитокин-2 язляется членом семейства 1Ь-1, предпочтительно, 1Б-18; для лечения или профилактики заболевания, которое предотвращается или облегчается индуцированием указанного рецептора цитокина-2. Более конкретно, изобретение относится к применению ингибитора цитокина-1 по настоящему изобретению для лечения или профилактики вирусного заболевания или для лечения или профилактики злокачественной опухоли.

Ингибиторы цитокина-1 включают, например, антитела, бессмысленную нуклеиновую кислоту,

- 9 008667

ΡΗΚί или растворимый рецептор цитокина-2 или его фрагмент, способный связываться с цитокином-1.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу ингибирования рецептора цитокина-2; цитокин-2 является членом семейства 1Ь-1, предпочтительно, 1Б-18; у пациента, который в этом нуждается, включающему введение терапевтически эффективного количества цитокина-1, предпочтительно, 1Ь1Р7Ь, или его изоформы, мутеина, слитого белка или фрагмента, способного связываться с 1Б-18ВР или его изоформой, мутеином, слитым белком, или фрагментом. Более конкретно, цитокин-1 ингибирует активность цитокина-2 путем связывания с сигнальной цепью рецептора цитокина-2. Более конкретно, изобретение относится к применению цитокина-1 для лечения или профилактики воспалительных заболеваний, выбранных из летальности, связанной с эндотоксином (сепсиса), повреждения печени, индуцированного токсинами или активированными Т-клетками, или гепатита С, артрита, повреждения легких, псориаза, воспалительного заболевания кишечника, повреждения головного мозга, ишемического повреждения, дисфункции сердца и неврита, или для лечения или профилактики образования метастазов. Если это желательно, 1Ь-18ВР или его изоформу, мутеин, слитый белок, функциональное производное или фрагмент можно вводить совместно с цитокином-1. Цитокин-1 по настоящему изобретению можно вводить системно, подкожно и/или внутримышечно.

Альтернативно, способ по настоящему изобретению включает введение векторов, кодирующих указанный цитокин-1.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу ингибитора рецептора цитокина-2; цитокин-2 является членом семейства 1Ь-1, предпочтительно, 1Б-18; у пациента, который в этом нуждается, включающему введение терапевтически эффективного количества вектора для генной активации цитокина-1, предпочтительно, 1Ь-1Е7Ь, или его изоформы, мутеина, слитого белка или фрагмента, способного связываться с 1Ь-18ВР или его изоформой, мутеином, слитым белком или фрагментом. Более конкретно, цитокин-1 ингибирует активность цитокина-2 путем связывания с сигнальной цепью рецептора цитокина-2. Циокина-1 можно применять для лечения или профилактики воспалительных заболеваний, таких как летальность, связанная с эндотоксином (сепсис), повреждение печени, индуцированное токсинами или активированными Т-клетками, или гепатит С, артрит, повреждение легких, псориаз, воспалительное заболевание кишечника, повреждение головного мозга, ишемическое повреждение, дисфункция сердца и неврит, или для лечения или профилактики образования метастазов. Если это желательно, 1Ь-18ВР или его мутеин, слитый белок, функциональное производное или фрагмент можно вводить совместно с цитокином-1. Вектор для генной активации по настоящему изобретению можно вводить системно, подкожно и/или внутримышечно.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу ингибирования цитокина-1, предпочтительно, из семейства 1Ь-1, более предпочтительно, 1Ь-1Е7Ь, или его изоформы, мутеина, слитого белка, функционального производного или фрагмента, способного связываться с 1Ь-18ВР или его изоформой, мутеином, слитым белком или фрагментом и способного ингибировать активность цитокина-2; цитокин2 является членом семейства 1Ь-1, предпочтительно, 1Б-18; для лечения или профилактики заболевания, которое предотвращается или облегчается индуцированием указанного рецептора цитокина-2. Более конкретно, способ по настоящему изобретению включает ингибитор цитокина-1 для лечения или профилактики вирусного заболевания или для лечения или профилактики злокачественной опухоли.

Краткое описание рисунков

Фиг. 1. Сходство последовательностей человеческого 1Б-18 и 1Ь-1Е7Ь.

Показаны человеческий 1Ь-18 (№ в каталоге Ό49950) и человеческий 1Ь-1Е7Ь (№ в каталоге АЕ200496). Линейное строение было создано с использованием системы Ехрей Рго1еш Аиа1у818 8уз1ет (ЕхРазу®) с дополнительной доводкой вручную.

Аминокислотная идентичность 1Б-18 с 1Ь-1Е7Ь составляет 28%, а сходство - 55%. Подчеркнутые аминокислоты представляют сайт расщепления 1СЕ в 1Б-18 и прогнозируемый сайт расщепления в 1Ь1Е7Ь.

Фиг. 2 показывает, что 1Ь-1Е7Ь ни стимулирует, ни ингибирует выработку ΙΕΝ-γ, индуцированную Ш-18.

Фиг. 2А. На человеческие клетки ΝΚΟ, культуры цельной человеческой крови, РВМС (стимулированные совместно с 1Б-12 (1 нг/мл) и клетки КС-1 (стимулированные совместно с ΤΝΕ-α (10 нг/мл) воздействовали 100 нг/мл рекомбинантного 1Ь-1Е7Ь (предшественника и зрелой формы) или 1Б-18. Через 18 ч (48 ч для КС-1) определяли ΙΕΝ-γ в надосадочной жидкости. Результаты показаны как среднее ± СОС трем независимым экспериментам.

Фиг. 2В. Индукция ΙΠ-18 (20 нг/мл) клеток ΝΚ в присутствии 1Ь-12 (1 нг/мл) и повышение концентраций предшественника и зрелой формы 1Ь-1Е7Ь. Данные представляют среднее ± СОС трем независимым экспериментам.

Фиг. ЗА и 3В показывают перекрестное сшивание 1Ь-1Е7Ь и внеклеточного домена 3 1Ь-18К.а.

Фиг. ЗА. Восстановительный 8Э8-РАСЕ 1Ь-1Е7Ь, поперечно сшитого с 1Ь-18Ва: ИЗ. После блоттинга на нитроцеллюлозе поперечно сшитые белки визуализировали моноклональным тАЬ антителом против 1Ь-18Ва.

- 10 008667

Фиг. 3В. Образование трехкомпонентного комплекса 1Ь-18К.а- и β-ЕСЭ в присутствии 1Ь-18, но не 1Ь-1Е7Ь, после химического поперечного сшивания. После вестерн-блоттинга комплексы визуализировали меченным анти-Ь18₆ моноклональным антителом против меченного 1ιίδ₆ ΙΕ-18Ρβ.

Фиг. 4А и 4В показывают перекрестное сшивание 1Ь-1Е7Ь и 1Ь-18ВР.

Фиг. 4А. Выявление поперечно сшитых белков (1,5 мкг каждого) с помощью анализа вестерн-блот с использованием кроличьей анти-1Ь-18ВР сыворотки.

Фиг. 4В. Иммунопреципитация поперечно сшитых белков (10 мкг каждого) с помощью тАЬ против 1Ь-18ВР. Полосы поперечно сшитых 1Ь-1Е7Ь/1Е-18ВР и контроля (1Ь-18ВР ± В83, поперечно сшивающий агент) окрашивали с использованием кроличьей анти-1Ь-1Е7Ь сыворотки. Комплекс 1Е-18/1Ь-18ВР выявляли с использованием кроличьей анти-1Ь-18 сыворотки.

Фиг. 5 А и 5В показывают, что 1Ь-1Е7Ь усиливает способность 1Ь-18ВР ингибировать индуцированное 1Ь-18 высвобождение ΙΕΝ-γ клетками ΝΚΟ.

Зрелый 1Ь-1Е7Ь 250 нг/мл (А, 0=9) (фиг. 5А) или предшественник 1Ь-1Е7Ь (фиг. 5В) 250 нг/мл (В, 0=8), 1Ь-18 (25 нг/мл) и разведение 1Ь-18ВР в КРМ1/РС8 10% инкубировали в 96-луночных микротитрационных планшетах в течение 1 ч до добавления клеток ΝΚΟ (0,5 х 10^б/мл) и 1Ь-12 1 нг/мл. После 16 ч инкубации с клетками надосадочную жидкость собирали и измеряли ΙΕΝ-γ. Величины выражали как процентную долю ΙΕΝ-γ, выработанного клетками ΝΚΟ, стимулированными 1Ь-18 25 нг/мл плюс 1Ь-12 1 нг/мл, в отсутствии 1Ь-1Е7Ь или 1Ь-18ВР. Статистический анализ осуществляли с использование парного ΐ-критерия Стьюдента (*** величина р < 0,001).

Фиг. 6 показывает экспрессию 1Ь-1Е7Ь в трансфектированных РА\¥264.7.

После стабильной трансфекции лизаты отдельных клонов (5 х 10⁶ клеток) разделяли с помощью δΌδ-РАОЕ и анализировали на экспрессию 1Ь-1Е7Ь с использованием анализа вестерн-блот. Кроличья анти-1Ь-1Е7Ь сыворотка (разведение 1:500) специфичным образом окрашивала 1Ь-1Е7Ь-положительные клоны.

Подробное описание изобретения

Изобретение относится к применению цитокина-1 (например, 1Ь-1Е7Ь), способного связываться с 1Ь-18ВР или его изоформой, мутеином, слитым белком, функциональным производным или фрагментом и способного ингибировать рецептор цитокина-2; цитокин-2 является членом семейства 1Ь-1 (например, 1Ь-18В); для производства лекарственного средства для лечения или профилактики заболевания, которое вызывается или утяжеляется индуцированием указанного рецептора цитокина-2. В настоящем описании термины ингибирование рецептора цитокина-2 и ингибирование активности цитокина-2 являются взаимозаменяемыми. Таким образом, изобретение относится к применению цитокина-1, способного связываться с 1Ь-18ВР или его изоформой, мутеином, слитым белком, функциональным производным или фрагментом и способного ингибировать активность цитокина-2, представляющего собой цитокин-2, являющийся членом семейства цитокинов 1Ь-1. Изобретение основано на открытии того факта, что 1Ь1Е7Ь, как было показано, усиливает ингибирование активности 1Ь-18 с помощью 1Ь-18ВР. Было установлено, что 1Ь-1Е7Ь связывается с 1Б-18ВР, а комплекс ингибирует активацию 1Ь-18К. с помощью 1Ь-18, возможно, с привлечением сигнальной цепи 1Ь-18В (т.е., ΙΕ-18Ββ).

Цитокин-1, согласно настоящему изобретению, может, предпочтительно, являться членом семейства ГЬ-1, таким как ГЕ-1Е7Ь, ΙΕ-18, ΙΕ-1 и ГБ-ГКа. Согласно настоящему изобретению, цитокин-1 и цитокин-2 являются двумя различными цитокинами. Например, выбирают следующие комбинации цитокина1 и цитокина-2: [Б-1Р7Ь (цитокин-1) и ΙΕ-18 (цитокин-2), [Б-1Р7Ь (цитокин-1) и ΙΕ-1 (цитокин-2), ΙΕ-18 (цитокин-1) и ΙΕ-1 (цитокин-2), ΙΕ-1 (цитокин-1) и ΙΕ-18 (цитокин-2), I^-1Ε7Ь (цитокин-1) и ΙΕ-1Κη (цитокин-2), ΙΕ-1Κη (цитокин-1) и ΙΕ-18 (цитокин-2) и ΙΕ-18 (цитокин-1) и ΙΕ-1Κη (цитокин-2).

^-^76 (называемый также ΙΕ-1Η4) был открыт недавно как новый член растущего семейства белков, имеющий гомологичность последовательности с ΙΕ-1 α/β, ΙΕ-1Κη и ΙΕ-18 (семейство ΙΕ-1). Хотя ΙΕ1Е7Ь связывается с одной из субъединиц рецептора ΙΕ-18, единицей ΙΕ-18Ка, указанное связывание не имеет результатом агонистическую или антагонистическую функцию ΙΕ-18. В соответствии с настоящим изобретением, используя химическое поперечное сшивание, ^-^70 связывается с ΙΕ-18Κη, но в отличие от ΙΕ-18, I^-1Ε7Ь не привлекает цепь ΙΕ-18Ρβ для образования функционально активного трехкомпонентного комплекса.

Последовательности ^-^70 и ΙΕ-18 сравнивали, и было установлено, что белки имеют две общие консервативные аминокислоты, т.е., аминокислоты Е35 и К124 в ΙΕ-1Е7Ь и Е42 и К89 в ΙΕ-18. Остатки Е42 и К89 в ΙΕ-18 являются важными как для активности, так и для ингибирования ΙΕ-18, поскольку они участвуют в связывании с ΙΕ-18Ρα (активация) и с Ш-^ВР (ингибирование).

Помимо этого, заявители установили с помощью экспериментов по поперечному сшиванию, что ΙΕ1Е7Ь связывается с Ш-ЩВР и что аналогично с ΙΕ-18, I^-1Ε7Ь может связываться с Ш-ЩВР через те же два остатка консервативных аминокислот, которые являются важными для связывания с ΙΕ-18Ρα (т.е., аминокислоты Е35 и К124). Таким образом, после образования ^-^70 комплекса с ΙΕ-18ВР. ΙΕ-1Ε7Ε возможно, более не способен связываться с ΙΕ-18Ρα. Было установлено, что I^-1Ε7Ь не только связывается с Ш-^ВР, но и повышает его активность, т.е., усиливает ингибирование активности ΙΕ-18. Данная

- 11 008667 активность была обнаружена как у предшественника, так и у зрелого белка 1Ь-1Б7Ь. Поскольку 1Ь-1Б7Ь в комплексе с 1Б-18ВР не способен связываться с 1Ь-18Ка, ингибирование активности 1Б-18, возможно, вызывается связыванием указанного комплекса с сигнальной цепью ΙΕ-18Κβ. Таким образом, β-цепь может быть привлечена в комплекс, что лишает β-цепь возможности формировать функциональный рецепторный комплекс с 1Ь-18Ка и 1Ь-18.

Таким образом, изобретение охватывает ингибирование передачи сигнала через рецептор цитокина2; цитокин-2 является членом семейства 1Ь-1; другим цитокином (цитокином-1) или его изоформой, мутеином, аллельным вариантом или фрагментом, способным связываться с 1Ь-18ВР или его изоформой, мутеином, аллельным вариантом или фрагментом.

Иммуногистохимические исследования по локализации показали присутствие 1Ь-1Б7Ь в популяции моноцитов, что подтверждает роль 1Ь-1Б7Ь как натурального экспрессируемого модулятора биологической активности 1Ь-18.

Используемый в настоящем документе термин мутеины относится к аналогам цитокина-1, таким как 1Ь-1Б7Ь, в которых один или более аминокислотных остатков цитокина-1, например, 1Ь-1Б7Ь, заменены на другие аминокислотные остатки или опущены, или один или более аминокислотных остатков добавлены к 1Ь-1Б7Ь, без значительного изменения активности полученных продуктов по сравнению с 1Ь-1Б7Ь. Более конкретно, один или более аминокислотных остатков 1Ь-1Б7Ь, но не более 30, предпочтительно не более 20, более предпочтительно не более 10, наиболее предпочтительно один или два аминокислотных остатка могут быть заменены на другие аминокислотные остатки или отсутствовать или могут быть добавлены. Указанные мутеины получают с использованием известных методик синтеза и/или сайт-направленного мутагенеза или с использованием любой другой подходящей для данной цели методики.

Мутеины в соответствии с настоящим изобретением включают белки, кодируемые нуклеиновой кислотой, такой как ДНК или РНК, которая гибридизируется с ДНК или РНК, которая кодирует цитокин-1, такой как 1Ь-1Б7Ь, в соответствии с настоящим изобретением, при строгих условиях. Термин строгие условия относится к условиям гибридизации и последующего отмывания, которые специалистами обычно относятся к строгим. См. ЛикиЬе1 е! а1., СитгеШ Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, кирга, 1п1егкс1еисе, Ν.Υ., §§ 6.3 и 6.4 (1987, 1992) и 8ашЬтоок е! а1., кирга. Без ограничения, примеры строгих условий включают условия отмывания при 12-20°С, ниже рассчитанной Тм изучаемого гибрида, в, например, 2 х 88С и 0,5% 8Ό8 в течение 5 мин, 2 х 88С и 0,1% 8Ό8 в течение 15 мин, 0,1 х 88С и 0,5% 8Ό8 при 37°С в течение 30-60 мин, а затем, 0,1 х 88С и 0,5% 8Ό8 при 68°С в течение 30-60 мин. Специалисты в данной области понимают, что строгие условия также зависят от длины последовательностей ДНК, олигонуклеотидных зондов (таких как 10-40 нуклеотидов) или смешанных олигонуклеотидных зондов. Если используются смешанные зонды, предпочтительно использовать хлорид тетраметиламмония (ТМАС) вместо 88С. См. ЛикиЬе1, кирга.

Любой подобный мутеин предпочтительно имеет аминокислотную последовательность, достаточно дупликативную последовательности цитокина-1, такого как 1Ь-1Б7Ь, таким образом, чтобы он обладал активностью, практически аналогичной активности 1Ь-1Б7Ь. Одной активностью 1Ь-1Б7Ь является его способность связываться с 1Б-18ВР. Таким образом, можно определить, обладает ли любой данный мутеин практически такой же активностью как у 1Ь-1Б7Ь, посредством рутинного экспериментирования, включающего подвергание указанного мутеина, например, простому конкурентному сандвич-анализу для того, чтобы определить, связывается ли он с соответствующим образом меченным 1Б-18ВР или нет, такому как радиоиммуноанализ или анализ ЕЬ18Л.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения любой подобный мутеин обладает по меньшей мере 40% идентичностью или гомологичностью с аминокислотной последовательностью 1Ь-1Б7Ь. Более предпочтительно, он обладает по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью или гомологичностью с указанной аминокислотной последовательностью.

Мутеины цитокина-1, такого как 1Ь-1Б7Ь, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, или кодирующие их нуклеиновые кислоты включают ограниченный ряд практически соответствующих последовательностей как замещающие пептиды или полинуклеотиды, которые может получить обычным способом специалист, без излишнего экспериментирования, на основе идей и руководства, представленных в настоящем документе.

Предпочтительные изменения для мутеинов в соответствии с настоящим изобретением представляют собой изменения, которые известны как консервативные замены. Консервативные аминокислотные замены цитокина-1, такого как 1Ь-1Б7Ь, могут включать синонимические аминокислоты в пределах группы, которая имеет достаточно сходные физико-химические свойства, таким образом, что замена между членами группы будет сохранять биологическую функцию молекулы (СтапШаш, 1974). Понятно, что врезки и делеции аминокислот также могут быть произведены в указанных выше последовательностях без изменения их функции, особенно, если врезки или делеции затрагивают только малое количество аминокислот, например, меньше тридцати и, предпочтительно, меньше десяти, и не удаляют или пере

- 12 008667 мещают аминокислоты, которые являются ключевыми для функциональной комформации, например, остатки цистеина. Белки и мутеины, полученные в результате подобных делеций и/или врезок, входят в объем настоящего изобретения.

Предпочтительно, группы синонимических аминокислот являются теми, которые определены в табл. 1. Более предпочтительно группы синонимических аминокислот являются теми, которые определены в табл. 2; и наиболее предпочтительно группы синонимических аминокислот являются теми, которые определены в табл. 3.

Таблица 1. Предпочтительные группы синонимических аминокислот Аминокислота

Бег

Синонимическая группа

Бег, ТЬг, Сг1у, Азп

Аг§, С1п, Ьуз, С1и, ΗΪ3

Не, РЬе, Туг, МеГ, Уа1, Ьеи

С1у, А1а, ТЬг, Рго

Рго, Бег, А1а, О1у, Ηΐβ, С1п, ТЬг

С1у, ТЬг. Рго, А1а

МеГ, Туг, РЬе, Не, Ьеи, Уа1

А1а, ТЬг, Рго, Бег, <31у

МеГ, Туг, РЬе, Уа1, Ь'ёи, Пе

Тгр, Мег, Туг, Пе, Уа1, Ьеи, РЬе Тгр, Мег, РЬе, Не, Уа1, Ьеи, Туг Бег, ТЬг, Суз

С1и, Ьуз, 61п, ТЬг, Аг§, ΗΪ3 (Ни, Ьуз, Азп, Из, ТЬг, Аг§, (Ип

С1п, Азр, Бег, Азп

С1и, 6И1, Ηίβ, Аг£, Ьуз (Ии, Азп, Азр

Азр, Ьуз, Азп, С1п, ΗΪ3, Аг§, С1и

РЬе, Не, Уа1, Ьеи, Мег

Тгр

Аг§

Ьеи

Рго

ТЬг

А1а

Уа1 (Ну

Не

РЬе

Туг

Суз

ΗΪ8 (Ип

Азп

Ьуз

Азр (Ли

МеГ

Тгр

Таблица 2. Более предпочтительные группы синонимических аминокислот Аминокислота

Синонимическая группа

- 13 008667

Таблица 3. Наиболее предпочтительные группы синонимических аминокислот Аминокислота Синонимическая группа

Примеры осуществления аминокислотных замен в белках, которые можно использовать для получения мутеинов цитокина-1, таких как полипептиды или белки 1Ь-1Г7Ь, для использования в настоящем изобретении включают любые известные стадии методов, такие как представленные в патентах США 4 959 314, 4 588 585 и 4 737 462, выданных Магк е! а1.; 5 116 943, выданном ΚοίΙΐδ е! а1.; 4 965 195, выданном Патеп е! а1.; 4 87 9 111, выданном Скопд е! а1., и 5 017 691, выданном Бее е! а1.; и лизин-замещенные белки, представленные в патенте США № 4 904 584 (8ка^ е! а1.).

Термин слитый белок относится к полипептиду, включая цитокин-1, предпочтительно 1Ь-1Г7Ь, или его мутеину или фрагменту, слитому с другим белком, который, например, более продолжительно существует в жидкостях организма. 1Ь-1Г7Ь, таким образом, может быть слит с другим белком, полипептидом и т. п., например, иммуноглобулином или его фрагментом.

Функциональные производные, как используется в настоящем документе, относятся к производным цитокина-1, предпочтительно 1Ь-1Г7Ь, и его мутеинам и слитым белкам, которые можно получить из функциональных групп, которые присутствуют как боковые цепи на остатках или Ν- или С-концевых группах, с использованием известных специалистам методик, и включены в настоящее изобретение, если только они остаются фармацевтически приемлемыми, т.е. они не нарушают активность белка, которая является практически аналогичной активности 1Ь-1Г7Ь, и не придают токсических свойств содержащим их композициям.

Указанные производные могут, например, включать полиэтиленгликолевые боковые цепи, которые могут маскировать антигенные сайты и продлевать существование цитокина-1, предпочтительно Ш1Г7Ь, в жидкостях организма. Другие производные включают алифатические сложные эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп путем взаимодействия с аммиаком или с первичными или вторичными аминами, Ν-ацильные производные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованные с ацильными частями (например, алканоильными или карбоциклическими ароильными группами) или О-ацильные производные свободных гидроксильных групп (например, остатков серина или треонина), образованные с ацильными частями.

Под фрагментами цитокина-1, предпочтительно 1Ь-1Г7Ь или его мутеинов и слитых белков в настоящем изобретении подразумевают любой фрагмент или предшественники полипептидной цепи белковой молекулы в отдельности или вместе с ассоциированными молекулами или остатками, присоединенными с ним, например, остатками сахара или фосфата, или агрегаты белковой молекулы или сами остатки сахара, при условии, что указанная фракция обладает практически аналогичной активностью с 1Ь-1Г7Ь, такой как связывание с 1Ш8БР и ингибирование рецептора цитокина-2.

- 14 008667

Настоящее изобретение относится также к цитокину-1, предпочтительно, изоформам ГБ-1Е7Ь, мутеинам, слитым белкам, функциональным производным, активным фракциям или их производным с циклическими перестановками. Указанные изоформы, мутеины, слитые белки или функциональные производные сохраняют биологическую активность цитокина-1, в частности, связывание с ГБ-18ВР и, предпочтительно, усиление ингибирования цитокина-2. Например, мутеины ГБ-1Е7Ь сохраняют способность связываться с 1Ь-18ВР и, предпочтительно, усиливать ингибирование 1Ь-18. Мутеины сохраняют аминокислоту, участвующую в связывании цитокина-1 с 1Ь-18ВР. Например, в случае 1Ь-1Р7Ь мутеины сохраняют аминокислоты Е35 и К124. В идеале указанные мутеины обладают повышенной биологической активностью по сравнению с немодифицированным цитокином-1. Предпочтительные активные фракции обладают активностью, которая превосходит активность цитокина-1 или которая имеет дополнительные преимущества, такие как более высокая стабильность или более низкая токсичность или иммуногенность, или их легче производить в больших количествах или легче очищать.

Цитокин-1, предпочтительно 1Ь-1Е7Ь, можно использовать в фармацевтической композиции для лечения или профилактики воспалительных заболеваний или образования метастазов, которые вызываются или утяжеляются цитокином-2, предпочтительно 1Ь-18. Было установлено, что при нескольких воспалительных заболеваниях уровень циркулирующего 1Ь-18ВР у пациентов является высоким, однако концентрация 1Ь-18ВР может быть недостаточной для полной нейтрализации высоких концентраций ГЕ18, обнаруживаемых в циркуляции у данных пациентов. Таким образом, введение цитокина-1, предпочтительно, 1Ь-1Е7Ь, указанным пациентам, имеющим уже повышенный уровень ГБ-18ВР, может помочь полностью ингибировать действие 11-18.

Альтернативно, 1Ь-1Е7Ь и 1Б-18ВР можно вводить пациентам совместно для лечения или профилактики воспалительных заболеваний, выбранных из летальности, связанной с эндотоксином (сепсиса), повреждения печени, индуцированного токсинами или активированными Т-клетками, или гепатита С, артрита, повреждения легких, псориаза, воспалительного заболевания кишечника, повреждения головного мозга, ишемического повреждения, дисфункции сердца и неврита, или для лечения или профилактики образования метастазов.

Поскольку было установлено, что 1Ь-1Е7Ь не только связывается с ГБ-18ВР, но также повышает его активность (ингибирование активности ГБ-18), совместное введение ГБ-1Е7Ь с ГБ-18ВР может иметь преимущества, если желательно введение ГБ-18ВР в более низких количествах.

Цитокин-1, предпочтительно ГБ-1Е7Ь, вводят подходящим путем, в зависимости от заболевания. Так, его можно вводить, например, местно, системно, подкожно и внутримышечно.

Нейтрализация ГБ-18 у экспериментальных животных выявила важную роль указанного цитокина в опосредовании воспаления (ГпГег1еикш-18, а рго1пПашша1огу еу1окше. О1пагс11о С.А. Еиг. Су1окше ΝοΙ\ν. 2000 8ер.; 11(3): 483-6). Таким образом, настоящее изобретение относится к применению цитокина-1 или экспрессирующего вектора, включающего кодирующую последовательность цитокина-1, предпочтительно, ГБ-1Е7Ь, для изготовления лекарственного средства для лечения или профилактики воспаления. Таким образом, цитокин-1, предпочтительно ГБ-1Е7Ь, можно вводить для лечения или профилактики воспалительных заболеваний, при которых известно, что ГБ-18 участвует в их патогенезе, таких как летальность, связанная с эндотоксином (сепсис), повреждение печени, индуцированное токсинами или активированными Т-клетками, или гепатит С, артрит, повреждение легких, псориаз, воспалительное заболевание кишечника, повреждение головного мозга, ишемическое повреждение, дисфункция сердца и неврит.

Настоящее изобретение относится также к применению экспрессирующего вектора для изготовления лекарственного средства для профилактики образования метастазов, поскольку блокада ГБ-18 снижает адгезию злокачественных клеток путем предотвращения повышающей регуляции ГБ-18 в отношении экспрессии молекулы адгезии-1 эндотелия сосудов. Таким образом, рассматривается подход генной терапии с целью доставки цитокина-1 к сайту, где он требуется. Для того, чтобы лечить заболевания, вектор генной терапии, включающий последовательность цитокина-1 (например, ГБ-1Е7Ь), можно инъецировать непосредственно в пораженную ткань, что позволяет избежать проблем, связанных с системным введением векторов генной терапии, таких как разведение вектора, достижение и нацеливание на клетки или ткани-мишени или побочные эффекты. Альтернативно, экспрессирующий вектор, включающий кодирующую последовательность цитокина-1 по настоящему изобретению, можно вводить с помощью внутримышечной инъекции.

Цитокин-1, предпочтительно ГБ-1Е7Ь, и его изоформы, мутеины, слитые белки, функциональные производные или активные фракции, как описано выше, являются предпочтительными активными ингредиентами фармацевтических композиций. ГБ-18ВР и его изоформы, мутеины, слитые белки, функциональные производные или активные фракции, как описано выше, могут быть дополнительно включены в качестве активного ингредиента в фармацевтические композиции.

Определение фармацевтически приемлемый включает любой носитель, который не мешает эффективности биологической активности активного ингредиента и не является токсичным для хозяина, которому его вводят. Например, для парентерального введения активный белок (белки) можно изготавливать в виде стандартной лекарственной формы для инъекций, в таких носителях как физиологический

- 15 008667 раствор, раствор декстрозы, сывороточный альбумин и раствор Рингера.

Активные ингредиенты фармацевтической композиции по настоящему изобретению можно вводить индивидууму различными путями. Пути введения включают внутрикожный, чрескожный (например, в композициях с замедленным высвобождением), внутримышечный, интраперитонеальный, внутривенный (системный), подкожный, пероральный, интракраниальный, эпидуральный, местный и интраназальный пути. Можно использовать любой другой терапевтически эффективный путь введения, например, всасывание через эпителиальные или эндотелиальные ткани, или с помощью генной терапии, при которой пациенту вводят молекулу ДНК, кодирующую активный агент (например, посредством вектора), что вызывает экспрессию и секрецию активного агента ίη νίνο. Кроме того, белок (белки) по настоящему изобретению можно вводить вместе с другими компонентами биологически активных агентов, такими как фармацевтически приемлемые поверхностно-активные агенты, наполнители, носители и разбавители.

Для парентерального введения (например, внутривенного, подкожного, внутримышечного) активный белок (белки) можно изготавливать в виде раствора, суспензии, эмульсии или лиофилизированного порошка, совместно с фармацевтически приемлемым парентеральным носителем (например, водой, физиологическим раствором, раствором декстрозы) и вспомогательными агентами, которые поддерживают изотоничность (например, маннитом) или химическую стабильность (например, консервантами и буферными агентами). Композицию стерилизуют с помощью обычных технологий.

Биологическую доступность активного белка (белков) по настоящему изобретению можно также улучшить с помощью процедур конъюгации, которые увеличивают полупериод существования молекулы в организме человека, например, связывая молекулу с полиэтиленгликолем, как описано в патентной заявке РСТ АО 92/13095.

Цитокин-1, предпочтительно ΙΕ-1Ε7Ε или его изоформы, мутеины, слитые белки, функциональные производные или активные фракции, как описано выше, можно использовать для ингибирования активности цитокина-2 у пациентов, страдающих воспалительными заболеваниями, такими как сепсис, повреждение печени, индуцированное токсинами или активированными Т-клетками, артрит, повреждение легких, псориаз или воспалительное заболевание кишечника. Цитокин-1 по настоящему изобретению или его изоформы, мутеины, слитые белки, функциональные производные или активные фракции, как описано выше, можно также использовать для профилактики образования метастазов, поскольку блокада ГБ18 снижает адгезию злокачественных клеток, путем предотвращения повышающей регуляции БС-18 в отношении экспрессии молекулы адгезии-1 эндотелия сосудов. Указанные выше способы включают введение терапевтически эффективного количества цитокина-1, например, !Ш-1Е7Ь, пациенту, который в этом нуждается, цитокин-1 можно вводить совместно с ЕБ-18ВР или его изоформами, мутеинами, слитыми белками, функциональными производными или активными фракциями, как описано выше.

Терапевтически эффективные количества активного белка (белков) будут зависеть от многих факторов, включая тип мутеина, аффинность мутеина по отношению к ЕБ-18ВР, любая остаточная цитотоксическая активность, присущая мутантам, путь введения, клиническое состояние пациента.

Терапевтически эффективное количество означает такое количество циттокина-1, такого как ΙΕЕЕ7Ь, которое после введения приводит к повышению ингибирующей активности ЕБ-18ВР или его изоформ, мутеинов, слитых белков, функциональных производных или активных фракций, как описано выше, в отношении ΙΕ-18. Вводимая индивидууму доза, однократная или множественная, может варьировать в зависимости от ряда факторов, включая путь введения, состояние и характеристики пациента (пол, возраст, масса тела, здоровье, размер), распространение симптомов, сопутствующее лечение, частота лечения и желаемый эффект. Подбор и манипуляции с установленными пределами доз находятся в компетенции специалистов, как и ίη νίίτο и ίη νίνο методы определения активности цитокина-1.

Применение вектора для индуцирования и/или повышения эндогенной выработки цитокина-1, предпочтительно, !Ш-1Р7Ь, в клетке, обычно не экспрессирующей цитокин-1 или экспрессирующей недостаточные количества цитокина-1, также входит в объем настоящего изобретения. Вектор может включать регуляторные последовательности, функциональные в клетках, для которых желательна экспрессия цитокина. Данные регуляторные последовательности включают промоторы или энхансеры.

Регуляторную последовательность затем вводят в соответствующий локус генома путем гомологичной рекомбинации, оперативно связывая регуляторную последовательность с геном, экспрессию которого требуется индуцировать или повысить. Данную технологию обычно называют эндогенной генной активацией (ЕСА), и она описана, например, в АО 91/09955.

Специалисту будет понятно, что возможно также прекратить экспрессию цитокина-1 с помощью тех же самых методик, например, введением элемента отрицательной регуляции, такого как молчащий элемент, в локус гена цитокина-1, что приводит к понижающей регуляции или предотвращению экспрессии цитокина-1. Специалисту будет понятно, что подобная понижающая регуляция или введение молчащего элемента в цитокин-1 оказывает такое же действие как использование ингибитора цитокина-1 с целью профилактики и/или лечения заболевания.

Таким образом, в случае, когда желательно уменьшение эффекта ΙΖ-18, такого как воспалительные заболевания, или для ингибирования образования метастазов, будет желательным повышение количества или активности цитокина-1, например, !Ш-1 Е7Ь, в клетке. Ш-18ВР можно вводить совместно с цитоки

- 16 008667 ном-1, например, ГБ-1Р7Ь, для лечения субъекта, который в этом нуждается.

Однако уменьшение количества или активности цитокина-1, например, будет желательным в ситуациях, когда требуется усиление эффекта ГБ-18, например, для лечения/профилактики опухоли или для лечения или профилактики вирусного заболевания. Таким образом, использование цитокина-1 и, предпочтительно, ГБ-1Р7Ь, в качестве мишени также входит в объем настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1. Влияние ГБ-1Р7Ь на стимуляцию выработки ΙΡΝ-γ.

На основании описанного связывания 1Ь-1Р7Ь с цепью 1Ь-18Ка (Рап, 2001, Китаг, 2002), были спланированы эксперименты для того, чтобы установить, стимулирует ли 1Ь-1Р7Ь, подобно ГБ-18, после связывания с рецептором ГБ-18а, выработку ΙΡΝ-γ в клетках. Молекула полной длины (предшественник 1Ь-1Р7Ь) или зрелая молекула (зрелый 1Ь-1Р7Ь), использующие Е21 в качестве Ν-конца в предсказанном сайте расщепления 1СЕ (см. фиг. 1), использовалась в следующих экспериментах. Человеческие клетки ΝΚΟ (К1т, 2000), культуры цельной человеческой крови, мононуклеарные клетки человеческой крови (РВМС) (совместно стимулированные 1Ь-12 от Ргерго!есй в дозе 1 нг/мл) (получение РВМС см. в примере 8) или клетки КС-1 (совместно стимулированные ΤΝΡ-α в дозе 10 нг/мл) (линию получали из АТСС ЕоскуШе, МО) стимулировали 100 нг/мл рекомбинантного 1Ь-1Р7Ь (предшественником или зрелой формой из примера 5) или ГБ-18. ГРИ-у определяли (с помощью электрохемилюминесценции в жидкой фазе (ЕСЬ) в Ригеп, 1998) в кондиционированной среде клеток через 18 часов после стимуляции (48 часов для КС-1). В то время как ГБ-18 выражено стимулировал выработку ГРИ-у (фиг. 2А), ни предшественник, ни зрелая форма 1Ь-1Р7Ь не стимулировали никакой выработки ГРК-у в указанных клетках.

Таким образом, в отличие от ГБ-18, связывание 1Ь-1Р7Ь с цепью ГБ-18Ка не запускает выработку ΨΝ-γ, т.е., связывание 1Ь-1Р7Ь с цепью ГБ-18Ка не привлекает цепь ΙΕ-18Κβ и, таким образом, не образуется функционально активный трехкомпонентный комплекс.

Были выполнены эксперименты для того, чтобы установить, действует ли 1Ь-1Р7Ь как антагонист ЕС-18, предотвращающий связывание ГБ-18 с цепью ГБ-18Ка и, следовательно, ингибирующий его биологическую активность и выработку ГРК-у. Линию человеческих клеток ΝΚ стимулировали ГБ-18 (20 нг/мл) в присутствии ГБ-12 (1 нг/мл), с возрастающими концентрациями предшественника и зрелого ГБ1Р7Ь, и мониторировали выработанный ГРХ-у. Полученные результаты не показали ингибирования предшественником или зрелым ГБ-1Р7Ь индуцированного ГБ-18 ГРХ-у, даже когда ГБ-1Р7Ь использовали в концентрации, до 40 раз превышающей концентрацию ГБ-18 (фиг. 2В) или когда ГБ-1Р7Ь предварительно инкубировали в течение длительного периода времени с испытуемыми клетками до добавления ГБ-18. Сходные результаты были получены для человеческих РВМС (данные не представлены).

Данные результаты показывают, что ГБ-1Р7Ь ни стимулирует, ни ингибирует выработку ГРХ-у, индуцированную ГБ-18.

Пример 2. Изучение связывания ГБ-1Р7Ь с рецептором ГБ-18.

Имеется сообщение о том, что ГБ-18 связывается с ГБ-18Ка через третий внеклеточный домен (ГБ18Κα: Ό3) (Ахат. 2002). Для того, чтобы изучить связывание ГБ-1Р7Ь с ГБ-18Ка, третий внеклеточный домен СИ3 ГБ-18Ка индивидуально экспрессировали в Е.сой в виде меченного Ык6 белка и выделяли с использованием аффинной хроматографии Та1оп. Затем ГБ-1Р7Ь инкубировали с указанным очищенным ГБ-18Ка: Ό3 и осуществляли поперечное сшивание химическим путем (пример 7). Как показано на фиг. 3А, БИБ-РАСЕ и анализ вестерн-блот выявили комплекс 43 кДа, соответствующий поперечно сшитым ГБ-1Р7Ь и ГБ-18Ка: Ό3. Поперечное сшивание с ГБ-18Ка наблюдалось как с предшественником, так и со зрелым ГБ-1Р7Ь. Указанные результаты предполагают, что ГБ-18Ка: Ό3 является принципиально важным для связывания с ГБ-1Р7Ь, тот же самый домен, который, как было показано ранее, является важным для связывания с ГБ-18.

После связывания ГБ-18 с ГБ-18Ка привлекается ГБ-18Кв и образуется активный трехкомпонентный комплекс: ГБ-18/ГБ-18К.а/ГБ-18К.р. Таким образом, следующий эксперимент был разработан для того, чтобы проверить, запускает ли связывание ГБ-18Ка с ГБ-1Р7Ь, подобно ГБ-18, образование трехкомпонентного комплекса ^-^7^^-18^/^-18^. Внеклеточные домены ГБ-18Ка и ГБ-18Кв вырабатывались в клетках Сок для того, чтобы гарантировать правильную посттрансляционную модификацию, такую как гликозилирование (Ахат, 2002). После инкубации и химического поперечного сшивания ГБ-18, ГБ-18Ка и ГБ-18Кв высокомолекулярный комплекс, состоящий из ГБ-18Ка, ГБ-18Кв и ГБ-18, наблюдался при использовании анализа БИБ-РАСЕ поперечно сшитых белков (фиг. 3В). Однако, в отличие от ГБ-18, когда предшественник или зрелый ГБ-1Р7Ь инкубировали с ГБ-18Ка и ГБ-18Кв, указанный трехкомпонентный комплекс не наблюдался (фиг. 3В).

Таким образом, данные результаты показывают, что активный трехкомпонентный комплекс не образуется после связывания ГБ-1Р7Ь с ГБ-18Ка, т.е. ГБ-18Кв не привлекается.

Пример 3. Связывание ГБ-1Р7Ь с ГБ-18ВР.

Сравнивали аминокислотную последовательность ГБ-18 и ГБ-1Р7Ь. Как показано на фиг. 1, ГБ-1Р7Ь имеет две общие аминокислоты с ГБ-18, которые в последнем являются консервативными, Е42 и К89.

- 17 008667

Как было показано, Е42 и К89 играют ключевую роль для активности 1Ь-18 и для связывания с 1Ь-18ВР (Νονκ&, 1999). Таким образом, на основании сходности последовательностей 1Ь-1Р7Ь и 1Ь-18 изучали возможность связывания 1Ь-1Р7Ь с 1Ь-18ВР.

1Ь-1Р7Ь (предшественник или зрелую форму, 1,5 мкг) или 1Ь-18 (1,5 мкг) инкубировали в присутствии или в отсутствии 1Ь-18ВР и воздействовали поперечно сшивающим реагентом В83 (пример 7). Изготавливали две контрольные группы, содержавшие только белок 1Ь-18ВР; одну контрольную группу инкубировали в присутствии, а другую - в отсутствии поперечно сшивающего реагента В83. Белки растворяли на 10% δϋδ-РАСЕ в восстанавливающих условиях и проводили блоттинг на нитроцеллюлозе. Белки выявляли в блотах с помощью поликлональных антител, специфичных в отношении 1Ь-1Р7Ь или 1Ь-

18. Результаты, суммированные на фиг. 4А, показывают новые полосы, которые выявляются только в группах, содержащих, помимо 1Ь-18ВР, предшественник 1Ь-1Р7Ь, зрелый 1Ь-1Р7Ь или 1Ь-18, но не в контрольных группах. В блотах идентифицировали новую полосу приблизительно 66 кДа, которая содержит предшественник 1Ь-1Р7Ь, связанный с 1Ь-18ВР, и новую полосу приблизительно 64 кДа, которая содержит зрелый 1Ь-1Р7Ь, связанный с 1Ь-18ВР (фиг. 4А).

Помимо этого, осуществляли исследования иммунопреципитации с 1Ь-1Р7Ь (10 мкг) или 1Ь-18 (10 мкг), инкубированными в присутствии или отсутствии 1Ь-18ВР (10 мкг) и поперечно сшитыми. Белки, связанные и поперечно сшитые с 1Ь-18ВР, подвергали совместной иммунопреципитации с использованием моноклональных антител, специфичных в отношении 1Ь-18ВР. Иммунные комплексы растворяли на δΌδ-РАСЕ и проводили блоттинг на нитроцеллюлозе. Блоты проявляли антителами, специфичными в отношении 1Ь-1Р7Ь или 1Ь-18.

Наблюдали те же полосы 64 и 66 кДа в исследованиях совместной преципитации с 1Ь-18ВР (фиг. 4В) . Данные поперечно сшитые полосы 64 и 66 кДа отражают комплексы зрелый 1Ь-1Р7Ь/1Ь-18ВР и предшественник 1Ь-1Р7Ь/1Ь-18ВР, соответственно. Данные результаты подтверждают, что 1Ь-1Р7Ь связывается с 1Ь-18ВР.

Пример 4. Влияние 1Ь-1Р7Ь на ингибирование активности 1Ь-18, опосредованной 1Ь-18ВР.

В свете открытия того факта, что 1Ь-1Р7Ь связывается с 1Ь-18ВР (см. предыдущий пример), возможно, через тот же домен, с которым связывается 1Ь-18, изучали влияние 1Ь-1Р7Ь на ингибирование активности 1Ь-18, опосредованной 1Ь-18ВР. Рабочая гипотеза заключалась в том, что 1Ь-1Р7Ь может конкурировать с 1Ь-18 за связывание с 1Ь-18ВР, и, следовательно, 1Ь-18 будет в меньшей степени нейтрализован 1Ь-18ВР в присутствии 1Ь-1Р7Ь.

Зрелый 1Ь-1Р7Ь 250 нг/мл или предшественник 1Ь-1Р7Ь 250 нг/мл инкубировали с 1Ь-18 (25 нг/мл) и возрастающими концентрациями 1Ь-18ВР (1,56 - 50 нг/мл) на 96-луночных микротитрационных планшетах в течение 1 ч и добавляли вместе с 1Ь-12 (1 нг/мл) к клеткам ΝΚΟ (0,5 х 10^б/мл). После 16 ч инкубации надосадочную жидкость собирали и мониторировали ΙΡΝ-γ (с помощью электрохемилюминесценции в жидкой фазе (ЕСЬ) в ге£ Ригеп 1998).

Результаты показывают, что, в противоположность гипотезе, при низкой концентрации 1Ь-18ВР присутствие 1Ь-1Р7Ь повышает способность 1Ь-18ВР ингибировать ΙΡΝ-γ, индуцированный 1Ь-18 (фиг. 5А и В). При 6,25 нг/мл 1Ь-18ВР и в присутствии зрелого 1Ь-1Р7Ь активность 1Ь-18 уменьшается с 76 до 55% (21% дополнительное снижение активности). При 3,12 нг/мл 1Ь-18ВР и в присутствии зрелого 1Ь1Р7Ь активность 1Ь-18 уменьшается с 59 до 40% (19% дополнительное снижение активности). Предшественник 1Ь-1Р7Ь в данном исследовании был менее активным, чем зрелый 1Ь-1Р7Ь (фиг. 5В). Данный эффект 1Ь-1Р7Ь имел высокую воспроизводимость и наблюдался только при низкой концентрации 1Ь-18ВР. Сходные результаты были получены при использовании РВМС (данные не представлены).

Пример 5. Локализация 1Ь-1Р7Ь.

1дС, специфичные в отношении 1Ь-1Р7Ь, были получены из поликлональной кроличьей анти-1Ь1Р7Ь сыворотки и использованы для изучения экспрессии 1Ь-1Р7Ь в человеческих РВМС. Специфичность кроличьей анти-1Ь-1Р7Ь сыворотки и препарата 1дС изучали двумя различными способами, с использованием трансфекции КА. XV264.7 клеток макрофагов кДНК 1Ь-1Р7Ь. Сначала 1Ь-1Р7Ь антисыворотка специфично распознавала 1Ь-1Р7Ь в лизате 1Ь-1Р7Ь трансфектированных клеток КА ЭД264.7 (фиг. 6). Затем, с помощью конфокальной цифровой микроскопии очищенные по сродству анти-1Ь-1Р7Ь 1дС распознавали экспрессию 1Ь-1Р7Ь в трансфектированных КА ЭД264.7, но не в имитирующих контрольных клетках (не показано). Свежевыделенные человеческие РВМС (пример 8) окрашивали против 1Ь1Р7Ь с помощью очищенных по сродству поликлональных кроличьих 1дС против человеческого 1Ь-1Р7Ь в концентрации 1 мкг/мл. С помощью конфокального лазерного микроскопа получали суммарную картину моноцитов человеческой крови, экспрессирующих 1Ь-1Р7Ь. Наблюдалась экспрессия 1Ь-1Р7Ь как в цитоплазме, локализованной на внутренней поверхности плазматической мембраны, так и в ядре (не показано). Окрашивания в популяции лимфоцитов не наблюдалось.

Пример 6. Экспрессия и выделение белк.

Следующие олигонуклеотидные праймеры использовали для клонирования кДНК 1Ь-1Р7Ь из библиотеки селезенки человека (С1оп1есй®НЬ0011В, ВЭ Вюзаепсез С1оп1есй, Ра1о А11о, СА): смысловой праймер 5'СТТСАСТААТАААСТСААСС (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1), обратный праймер 5’СТТСААТСССССА

- 18 008667

СТТТС (8ЕС) ΙΌ N0: 2) (специфичный для клона АР2004 96 (СепВапк®) (Китаг, 2000). КДНК 1Ь-1Р7Ь реамплифицировали с использованием второй пары праймеров, с вводом сайтов расщепления для ЕсоШ на конце 5' и ХЬа1 на конце 3' (смысловой праймер 5'-АТАТСААТТСАТСТССТ1ТСТСССССАС (8Е0 ΙΌ N0: 3); обратный праймер 5'-ТАТАТСТАСААСТТТССТААТСССТСАСС (8ЕС) ΙΌ N0: 4). Используя ТА-клонирование, кДНК 1Ь-1Р7Ь переносили в рСЕМ-Т Еаку® (Рготеда Согр. Меб1коп, ^Ι), согласно инструкциям производителя, и верифицировали корректную последовательность. КДНК РЕ-1Р7Ь затем лигировали в рРКОЕХТМНТа (61Ьсо-ВКЬ) для бактериальной экспрессии, с использованием сайта ЕсоШ и ХЬаЕ Вектор рРКОЕХТМНТа содержит Ν-концевую метку Н1кх6 для аффинной очистки экспрессированного белка. Плазмиду рРКОЕХТМНТа/ΙΈ-ΙΗ4 трансформировали в компетентный штамм Е.сой БН5а (СШсо-ВКЕ). Инкубированную в течение ночи культуру (10 мл) добавляли к 200 мл среды ЬВ, содержавшей 100 мкг/мл ампициллина, и выращивали до достижения плотности 0,6-1 ОП₆₀₀.

Экспрессию белка индуцировали добавлением изопропилтиогалактозида (0,3 мМ) и инкубацией при 37°С при встряхивании в течение 3 ч. Бактерии собирали центрифугированием (5000 х д в течение 15 мин при 4°С) и центрифужный осадок суспендировали в 25 мл буфера Та1оп (50 мМ NаΗ₂РО₄, 10 мМ Тпк-НС1 100 мМ №С1, рН 8). Клетки лизировали ультразвуком (4 х 10-секундных серии) на льду, с последующим центрифугированием (4000 х д в течение 30 мин при 4°С. РЕ-1Р7Ь получали из телец включения путем обработки мочевиной 8М. Надосадочную жидкость после обработки мочевиной осветляли центрифугированием, диализировали против буфера Та1оп и помещали на 2 мл колонку мини-Та1оп. Колонку промывали 30-кратными объемами буфера Та1оп, а затем элюировали 5 мл 100 мМ имидазола в буфере Та1оп. Элюент, содержавший очищенный по сродству РЕ-1Р7Ь, отделяли с использованием препаративной 8Б8-РАСЕ. Гель окрашивали с использованием Соотакые В1ие® (Вю-Каб ЬаЬогаШйек Шс., Негси1ек, СА) и вырезали полосу, содержавшую ШИШ. Гель, содержавший РЕ-1Р7Ь, использовали для получения поликлональных сывороток от кроликов, согласно стандартным протоколам (Коск1апб Шс. СПЬсг^куШс, АР). Полная длина (предшественник) и зрелый ΙΚ-1Р7Ь (Ν-конец Е21), использованные в биологических анализах и для исследований по поперечному сшиванию, вырабатывались в Е.сой, как описано ранее (Китаг, 2002).

Пример 7. Поперечное сшивание белков.

Очищенные белки смешивали в 30 мкл РВ8 и инкубировали в течение 2 ч на льду. Затем В83 (Бис(сульфосукцининидил)суберат) (Р1егсе Вю1есйпо1оду Шс., КоскРогб, ГЬ) добавляли до конечной концентрации 1 мМ и смесь инкубировали в течение 1 ч при КТ. Реакцию гасили добавлением Тпк-СР рН

7,4 (конечная концентрация 20 мМ). После кипячения в течение 5 мин белки разделяли с использованием 10% 8Б8-РАСЕ в восстанавливающих условиях и проводили блоттинг на нитроцеллюлозе. Поперечно сшитые белки выявляли с помощью кроличьей антисыворотки против человеческого РЕ-18ВР, ΙΚ-1Р7Ь или РЪ-18 в разведении 1:500.

Пример 8. Выделение РВМС.

РВМС выделяли из остаточных лейкоцитов, лишенных тромбоцитов, или из гепаринизированной крови здоровых доноров. Лейкоциты, лишенные тромбоцитов, или цельную кровь разбавляли 1:1 физиологическим раствором и помещали на градиенты Рюо11-Н1кШрадие® (81дта), как описано ранее (К1т, 2001). После центрифугирования клетки на разделе слоев собирали, промывали три раза в физиологическом растворе и ресуспендировали в КРМР Изолированные РВМС держали на льду до начала исследования.

Список литературы

Ссылки, приведенные ниже и включенные в заявку, включены в настоящий документ в качестве ссылок.

1. Апбегкоп, Б.М., Ма^аккονкку, Е., В1Шпдк1еу, ^.Ь., Боида11, ^.С., ТотеРкко, М.Е., Коих, Е.К., Теере, М.С., БиВоке, К..Р, Соктап, Б. , СаПЬей, Ь. (1997) А. йото1одие оР Ше ЮТ гесерЮг апб йк Ндапб епйапсе Т-се11 дгоШй апб бепбгШс-се11 Рипсйоп. №Шге, 390, 175-179.

2. Ахат, Т., ШЛск, Б., Ви£1ег, Р., ^ζω^ν, Ь. Ь., Уооп, Б. Υ., КиЬтк1еШ, М. Бтаге11О, С А. & К1т,

8. Н. (2002) 1 Iттиηο1 киЬтШеб.

3. Вайоп, I. Ь., НегЬкр К., Вок1кю, Б., ШддШк, Ь. & №ск1Ш, М. I. (2000) Еиг I Iттиηο1 30, 3299-308.

4. ВикР1е1б, 8. I., Сотгаск, С А., Υυ, С., СЫскеппд, Т. ^., 8ти1ко, I. 8., 2йои, Н., Ье1Ьу, К. К., Но1тдгеп, Ь. М., Сеаппд, Б. Р. & Рап, Υ. (2000) Сепотюк 66, 213-6.

5. Ваζаη, 1. Р., Т1тапк, 1. С апб Каке1еШ, К. А. (1996) А пе\\'1у беПпеб т!ег1еикт-1? №11иге 379, 591.

6. Вот, Т.Ь., Моткоп, Ь.А., ЕйеЬап, Б.Е, УапбепБок, Т., ТйеЬеаи, Ь.С., Сйеп, Ν., 8рпддк, М..К., 81тк, ЕЕ., Ви11ег, К.М. (2000) А рохуйик рго1ет 11иИ Шпбк Ю апб тасШ'аЮк РЪ-18, апб 1пШЬйк ΝΙ< се11 гекропке. I Iттиηο1 164, 3246-54.

7. ^ι^ζ е1 а1.: I Iттиηο1 2002 Арг 1; 168(7):3608-16).

8. СоидЫШ, С.М., 8аШапу, К.Е., ^укоска, М., Агида, Е., Китаба, Н., Сйапд, А.Е., Нип1ег, С.А., Рох, ЕС., ТппсЫеп, С. апб Бее, \У.М. (1998) Ш1ег1еикт-12 апб т!ег1еикт-18 купегд1кбса11у тбисе типпе 1итог гедгеккюп ^Ысй тхоКек тЫЬбюп оР апдюдепеык. 1 С1Ш ШускР Маг, 101, 1441-52.

9. БеЬеРк, К., Т1тапк, I. С, Нотеу, В., 2ига^кк1, 8., 8апа, Т. К., Ьа, 8., ^адпег, I., Еб^агбк, С., С11РРогб, Т., Мепоп, 8., Ваζаη, Е Р. & КакРе1еШ, К. А. (2001) I Iттиηο1 167, 1440-6.

- 19 008667

10. Пезгеитаих, Р., Вгапб!, Е., СатЫех, Ь., ЕшШе, Ό., СеЬоез, К., К1ет, О., Ес!огз, Ν., Сойо!, А., Саргоп, М., Со1отЬе1, БЕ. (1997) Сазйоеп!его1оду 113, 118-26.

11. СтигеНо, С. А. (1996) В1ооб87, 2095-147.

12. Ойпагс11о 'Чп(ег1еик1п-18. а рго1пДатта!огу су!окте. Еиг Су!окте №гу 2000 8ер; 1Ь(3):483-6.

13. Епде1тапп, Н., Абегка, Ό., ЯиЬтз!ет, М., Яо!тап, Ό. апб Аа11асЬ. Ό. (1989) Α !итог песгозйз Гас!ог-Ьтбтд рго!ет ригйГйеб !о Ьотодепейу Ггот Ьитап иппе рго!ес!з се11з Ггот !итог песгозйз Гас!ог Юхйсййу

I. Вю1. СЬет. 264, 11974-11980.

14. Епде1тапп, Н., ΝονκΕ Ό. апб Аа11асЬ, Ό. (1990) Τ\\ό !итог песгозйз Гас!ог-Ьтбтд рго!етз рипПеб Ггот Ьитап иппе. Е\ибепсе Гог ^шшиπо1од^са1 сгозз-геас!ЮТу уйЬ се11 зийасе !итог песгозйз Гас!ог гесер!огз. I. Вю1. СЬет. 265, 1531-1536.

15. СЬауиг, Т., Вапецее, 8., Нидишп, М., ВиЙег, Ό., Негход, Ь., Сайег, А., фи1п1а1, Ь., 8еки!, Ь., Τа1ашап, Я., Разктб, М., Аопд, А., Катеп, Я., Τι-асеу, Ό., апб А11еп, Н. (1997) Сазразе-1 ргосеззез ΙΕΝдатта-йпбисйпд Гас!ог апб геди1а!ез ЬР8-тбисеб ΙΕΝ-датта ргобисйоп. №11иге 386, 619-623.

16. Сопд, I. Н., Мак1, С., КЬпдетагт, Н. С. (1994) СЬагасйепхаПоп оГ а Ьитап се11 Ьпе (ΝΚ-92) уйЬ рЬепо1урйса1 апб Гипс!юпа1 сЬагас!егйзйсз оГ ас!та!еб па!ига1 кШег се11з. Ееикет1а 8:652.

17. Си, Υ., Кшба, К., Τδη!8ηί, Н., Ки, С., Нзйао, К., ЕЯттд, М. А., НауазЫ, КГНйдазЬто, К., Окатига, Н., ШкапЫи, К.; Кипто!о, М., Τап^то!о, Т., Е^е11, Я. А., 8а!о, V., Нагбтд, М. А., ЬМпдз!оп, Ό. I., апб 8и, М. 8. (1997) Ас!шайоп оГ 1п!егГегоп-датта йпбисйпд Гас!ог теб1а!еб Ьу т!ег1еикт-1Ье!а сот'еПйпд епгуте. 8сйепсе 275, 206-209.

18. Казег А., №\иск Ό., ЯиЬтз!ет М., 81едтипб В., ЕпгйсЬ В., КосЬ Я.О., Vоде1 А., Кйт 8.Н., Эйпагуе11о С.А., апб Τΐ^ Н. С1ш Ехр Iшшипо1 2002 Аид; 129 (2) :332-8.

19. К1т, 8.Н., Ейзепз!ет, М., Яеζп^коν, Ь., Еап!ихх1, С., Но^иск, Ό., ЯиЬтз!ет, М. апб Ойпагейо,

С.А.(2000) 8йис!ига1 гес|и1гетегйз оГ зйх па!ига11у осситпд йзоЙоггЬз оГ !Ье ЕЪ-18 Ьйпбйпд ргойейп !о йпЫЬй ΙΕ-18. Ргос №Й Асаб 8с1 И8А 97, 1190-5.

20. КоЬпо, К.,к Ка!аока, ТО^зиИ, Υ.8ието!о, Ι. Окато!о, М. Изш, М. Жеба, апб М. Кипто!о. (1997) IЕN-датша-^πбис^πд Гас!ог (ЮТЕ) Йз а созйти1а!огу Гас!ог оп !Ье ас^айоп оГ ΤΗ1 Ьи! по! ΤΗ2 се11з апб ехейз йз еГГес! тберепбепйу оГ ΙΕ-12. I. Iшшипо1. 158:1541-1550.

21. Китаг, 8., МсОоппеЙ, Р. С, ЬеЬг, Я., ^етеу, Ь., Τζ^таз, М. Ν., Спзуо1б, Ό. Е. Саррег, Е. А., Τη18тдег, Я., Ае11з, С. Ь, Поу1е, М. Ь. & Υоипд, Р. Я. (2000) I. Вю1. СЬет. 275,10308-14.

22. Ьш, Н., Но, А. 8., На1еуАюеп!е, Ό., 2Ьапд, I., Вегпа1-Еиззе11, I., Расе, А. М., Напзеп, Ό., 8сЬуейдЬоГег, К., МЙхе, Ν. К. & Еогб, I. Е. (2001) I ВЫ СЬет 276, 20597-602.

23. Ма11а!, 81Яезйе I., Ье Яйсоиззаппе 8., Ьесот!е-Яас1е! Ь., СогЬах А., С1егдие М., Эипех М., Вага!еаи V., Акпа 8., Τебди^ А., ШЬе1ет С., СЬкайсЬко Υ. апб Б-е^у В. Ι. (2002) Оге Яез. 91 (5), 441-8.

24. Ма!зито!о, 8., Τзи^^-Τакауати, К., Айхауа, Υ., Койбе, К., ΤакеисЬ^, М., ОЬ!а, Т., Кигйто!о, М. (1997) ВйосЬет. ВйорЬуз. Яез. Соттип. 234, 454-7.

25. Моп!е1еопе, С., ^араззо, Е., Рагге11о, Т., Вйапсопе, Ь., 8!е11а, А., 1и1йапо, Я., Бихха, Е., Еизсо,.А., Ра11опе, Е. (1999) I. Iшшипо1. 163, 143-7.

26. Ми1его, I. I., Расе, А. М., №1кеп, 8. Т., ЬоеЬ, Ό. В., Соггеа, Τ. Я., Огтапас, Я. & Еогб, I, Е. (1999) ВйосЬет ВюрЬуз Яез Соттип 263, 702-6.

27. Nакап^зЬ^, К., ΥозЬ^то!о, Т., Τзи!зи^, Н. & Окатига, Н. (2001) Аппи Яеν Iшшипо 119, 423-74.

28. Nакати^а, К., Окатига, Н., Ааба, М., №дайа, К. апб Τати^а, Τ. (1989). Епбо!охт-йпбисеб зегит Гас!ог !Ьа! зйти1а!ез датта йп1егГегоп ргобисйоп. IпГес!-Iшшип 57, 590-5 Йззп: 0019-9567.

29. Nакати^а, К., Окатига, Н., №да!а, К., Кота!зи, Τ. апб Τаши^а, Τ. (1993) РпгйПсаййоп оГ а Гас!ог уЬйсЬ ргсуйбез а созйти1а!огу зйдпа1 Гог датта йШегГегоп ргобисйоп. йпйссй. Iшшип. 61, 64-70.

30. Копск, Ό., Епде1тапп, Н., Аа11асЬ, Ό. апб ЯиЬйпз!ет. М. (1989) 8о1иЬ1е су!окйпе гесер!огз аге ргезеп! ίπ потай Ьитап иппе. I. Ехр. Меб. 170, 1409-14.

31. Ш^иск, Ό., СоЬеп, В. апб ЯиЬйпз!ет, М. (1992) 8о1иЬ1е Iπ!ейе^оπ-а1рЬа Яесер!ог Мо1еси1ез Аге Ргезеп! йп Вобу Е1шбз. ЕЕВ8 Ье!! 314, 445-8.

32. Ш^иск, Ό., СоЬеп, В. апб ЯиЬйпз!ет, М. (1994) 'ТЬе Нитап Шейегоп а1рЬа/Ье!а Яесер!огСЬагасйепхаййоп апб Мо1еси1аг С1опйпд. Се11 77,391- 400.

33. ΝΘνκ&, Ό., Кйт,8., Еап!иххй, С., Яеζη^коν, Ь.Ь., Ойпагейо, С.А. апб ЯиЬйпз!ет, М. (1999) 'Тйег1еикйп-18 Вйпбйпд Ргойейп: А Nоνе1 Моби1а!ог оГ !Ье ΤΗ1 Суйокйпе Яезропзе. Iшшиη^ίу 10, 127,36.

34. Копск, Ό., 8сЬуайзЬигб, В., Рйпкиз, Я., 8шззе, Ό., Векег, Ι., 8!Ьоедег, Ζ., Кеапе, А. Е., ОкайсНко, Υ., Кйт, 8. Н., Еап!иххй, С., Ойпагейо, С А. & ЯиЬйпз!ет, М. (2001) Суйокйпе 14, 334-42.

35. ОЬйа Υ., Натаба Υ., Ка!зиока К. АгсЬ Пета!о1 Яез 2001 Йп1; 293(7):334-42.

36. Окатига, Н., Τзи!зи^, Н., Кота!зи, Т., Υи!зибо, М., Накига, А., Τаπ^то!о, Т., Ш^дое, К., Окига, Т., Nикаба, Υ., Найогй, К., Ак1!а, К., NашЬа, М. , ΤаπаЬе, Е., КошзЫ, К. , Еикиба, 8., апб Кигйто!о, М. (1995) С1опйпд оГ а пеу су!окйпе !Ьа! йпбпсез ^^датта ргобисйоп Ьу Τ се11з. Νπ!ιιιό 378, 88-91.

37. Рап, С., Яйззег, Р., Мао, А., Ва1бут, Ό. Т., Ζ^^, А. А., ЕйкагоГГ, Е., Υаπзи^а, Ό., Ьеуйз, Ь., Е1депЬго!, С., Непхек А. I. & Vаπб1еπ, Я. (200 Ι) Су!окйпе 13, 1-7.

38. Рйхагго, Τ.Τ., МюЬйе, М.Н., ВепЩ, М. , Аогага1апабЬат, I., 8ш!Ь, М.Е., Ео1еу, Е., Мозка1ик, С.А., Вйскз!оп, 86., СотйпеШ, Е. (1999) I. Iшшиπо1. 162, 6829-35.

- 20 008667

39. Ригеп, А. 1., Ραηΐαζζί, 6., би, Υ., 8и, М. 8. & ЭшагеИо, С. А. (1998) 1 Скп Ιηνβδΐ 101, 711-21.

40. Ригеп, А. 1., КжедЫ, Р., Ραηΐαζζί, 6. & ЭтагеИо, С. А. (1998) 1. 1пРес1 Э1з 178,1830-4.

41. Ригеп, А.1., Ραηΐπζζί, 6., ЭтагеПо, С.А. (1999) Ргос №111 Асаб 8с1 И8А 96,2256-61.

42. ВаеЬигп, С.И., ЭтатеНо, С.А., 21ттегтап, М.А., Са1ктз, С.М., РотегапЩ, В.1., Мс1пГуге, КС. 1г, Нагкеп, А.Н. апб Мепд, X. (2002) АМ 1 РН¥81О1. НЕАВТ С1ВС РН¥81О1. 283(2), Н650-7.

43. Веппипб. 1.М., ^1йег8ке1т, С., Эитоп1. 8., Ми11ег, С.Э.. Кегтеу, 1.8., Ваитапп, В., Рошбгоп, Р., Оис1оз, В. (1996) 6и1 39, 684-9.

44. 8ек1 8, НаЬи Υ., Катеатига Т., Такеба К., Ооказк1 Н., Оккатеа Т., Нйа1бе Н. (2000) Тке Нуег аз а сгисЫ огдап ш 1ке Пг5( 1ше о! коз! беГепзе: 1ке го1ез о! КирГГег се11з, паГига1 кШег (ΝΚ) се11з апб ΝΚ1.1 Ад+ Т се11з 1п Т ке1рег 1 1ттипе гезропзез. 1ттипо1 Веν 174,35-46.

45. 81топеГ ν.8., Ьасеу Ό.Ε., ОипзГап С.В., Ке11еу, М., Скапд М.8., ЬиГку В., Мдиуеп Н.Ц., ХУообе 8., Веппей Ь., Воопе Т., 8к1татоГо 6., ИеВозе М., ЕШой В., Со1отЬего А., Тап, Н.Ь., Тгаб 6., 8и11кап 1., Оауу Е., Висау Ν., Вепзкате-6едд, Ь., Нидкез Т.М., Н111 Ό., РаШзоп V., СатрЬе11 Р., Воу1е VI. (1997). ОзГеоргоГедепп: а ηоνе1 зесге!еб ргоГеш ккоКеб ш !ке геди1айоп о! Ьопе бепзйу. Се11, 89, 309-19.

46. 8тйк, Ό.Ε., Вепзкате, В.В., КеГскет, В.В., КиЫп, М., 6агка, К.Е. & 81тз, 1. Е. (2000) 1. Вю1 Скет 275, 1169-75.

47. Тазак1 еГ а1. (2000) Сапсег 6епе Ткег (2):247-54. ТзиГзш, Н., К. Макап1зк1, К. МаГзш, К. ШдазЫпо, Н. Окатига, Υ. М^уаζатеа, апб К. Капеба. (1996) 1Р№датта-тбистд ГасГог ир-геди1а!ез Раз кдапбтеб1а!еб суГоГох1с асГМГу о! тийпе паГига1 кШег се11 с1опез. 1. 1ттипо1. 157,3967-73 1ззп: 0022-1767.

48. ИгизЫкага, Ν., 1теадак1, Н., Уадк Т., Кокка, Н., КоЬазЫ, К., Мойто1о, Υ., Υозк^ηо, Т., ТаштоГо, Т., КиптоГо, М., Тапака, N. (2000) Е1е\^гаОоп о! зегит 1п(ег1еик1п-18 1еуе1з апб асГйабоп о! КирГГег се11з т ЬШагу аГгез1а. 1 Реб1аГг 8игд 35,446-9.

49. ИзЫо, 8., Матка, М., Окига, Т., НаГГоп, К., Nикаба, Υ., Акка, К., ТапаЬе, Р., КошзЫ, К., М1са11е!, М., РиЩ, М., Топдое, К., ТаштоГо, Т., Рикиба, 8., 1кеба, М., Окатига, Н., апб КиптоГо, М. (1996) 1. 1ттипо1. 156, 4274-9

50. У1дегз, 6.Р., Апбегзоп, Ь.1., 6а!Гез, Р., ВгапбкиЬег, В.1. (1997) СгузГа1 зГгисГиге о! Гке Гуре-Ι тГег1еикт-1 гесерГог сотр1ехеб текк шГег1еикш-1 ЬеГа. Майне 386,190-4.

51. Х1апд, Υ. апб Мозз, В.(1999) 1Ь-18 Ьтбшд апб шЫЬйюп о! шГегГегоп датта тбисГюп Ьу китап рох\'1гиз-епсобеб ргоГетз. Ргос №111 Асаб 8с1 И8А 96,11537-42.

52. Υазиба, Н., 8Ыта, Ν., Макадатеа, Ν., Моск^ζик^,, 8.Ι., Υιμ, К., Рицзе, Ν., 8аГо, Υ., 6оГо, М., ΥιтадисЫ, К., Кипуата, М., Каппо, Т., Мигакат1, А., Тзиба, Е., Мойпада, Т., ШдазЫо, К. (1998) ЛбепГйу о! озГеос1азГодепез1з шЫЬйогу ГасГог (ОС1Р) апб озГеоргоГедепп (ОР6): а тескашзт Ьу теЫск ОР6/ОС1Р тк1Ь1Гз озГеос1азГодепез1з т ν^Г^о. Епбосппо1оду, 139, 1329-37.

53. ΥηΜν I., Могдапй-Коззтапп М.С., Регех Ό., ЭтагеПо С.А., №\лск Ό., ВиЬшзГет М., ОГГо ν.Ι., Вапсап М., Коззтапп Т., ВебаеШ С.А., Тгепах О., 8кокат1 Е., апб 8Гаке1 Р.Р. 1. СегеЬ В1ооб МеГаЬ 2002 Аид; 22 (8):971-8.

54. Υυ 8., Скеп 2, М1х Е., 2ки 8.ν., ’№тЬа1б В., Ципддгеп Н.6., 2ки 1. 1. №игораГко1 Ехр №иго1 2002; 61 (7):614-22.

55. 2есскта еГ а1., 1. НетаГоГкег 8Гет Се11 Вез 2001.

Claims (34)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Применение цитокина-1 или его изоформы, мутеина, слитого белка, функционального производного или фрагмента, способного связываться с 1Ь-18ВР или его мутеином, слитым белком, функциональным производным или фрагментом и способного ингибировать рецептор цитокина-2, причем цитокин-2 является членом семейства 1Ь-1, для производства лекарственного средства для лечения или профилактики заболевания, которое вызывается или утяжеляется индуцированием указанного рецептора цитокина-2.
2. 2. Применение по п.1, в котором цитокин-1 принадлежит к семейству 1Ь-1.
3. 3. Применение по п.2, в котором цитокин-1 представляет собой 1Ь-1Р7Ь.
4. 4. Применение по любому из пп.1-3, в котором рецептор цитокина-2 представляет собой 1Ь-18В.
5. 5. Применение по любому из пп.1-4, в котором в ингибировании цитокином-1 участвует связывание цитокина-1 с сигнальной цепью рецептора цитокина-2.
6. 6. Применение по любому из пп.1-5 для лечения или профилактики воспалительных заболеваний, выбранных из летальности, связанной с эндотоксином (сепсиса), повреждения печени, индуцированного токсинами или активированными Т-клетками, или гепатита С, артрита, повреждения легких, псориаза, воспалительного заболевания кишечника, повреждения головного мозга, ишемического повреждения, дисфункции сердца и неврита.
7. 7. Применение по любому из пп.1-5 для профилактики образования метастазов.
8. 8. Применение по любому из пп.1-7, в котором лекарственное средство дополнительно содержит 1Ь-18ВР или его мутеин, слитый белок, функциональное производное или фрагмент.
9. 9. Применение по любому из предыдущих пунктов, в котором цитокин-1 вводят системно, подкож

   - 21 008667 но и/или внутримышечно.
10. 10. Применение вектора, содержащего кодирующую последовательность цитокина-1 или его изоформы, мутеина, слитого белка, функционального производного или фрагмента, способного связываться с ГБ-18ВР или его мутеином, слитым белком, функциональным производным или фрагментом и способного ингибировать рецептор цитокина-2, причем цитокин-2 является членом семейства ГЬ-1, для производства лекарственного средства для лечения или профилактики заболевания, которое вызывается или утяжеляется индуцированием указанного рецептора цитокина-2.
11. 11. Применение по п.10, в котором цитокин-1 принадлежит к семейству ГЬ-1.
12. 12. Применение по п.11, в котором цитокин-1 представляет собой ГЬ-1Е7Ь.
13. 13. Применение по любому из пп.10-12, в котором рецептор цитокина-2 представляет собой ГБ-18К.
14. 14. Применение по любому из пп.10-13, в котором в ингибировании цитокином-1 участвует связывание цитокина-1 с сигнальной цепью рецептора цитокина-2.
15. 15. Применение по любому из пп.10-14 для лечения или профилактики воспалительных заболеваний, выбранных из летальности, связанной с эндотоксином (сепсиса), повреждения печени, индуцированного токсинами или активированными Т-клетками, или гепатита С, артрита, повреждения легких, псориаза, воспалительного заболевания кишечника, повреждения головного мозга, ишемического повреждения, дисфункции сердца и неврита.
16. 16. Применение по любому из пп.10-14 для профилактики образования метастазов.
17. 17. Применение по любому из пп.10-16, в котором лекарственное средство дополнительно содержит ГБ-18ВР или его мутеин, слитый белок, функциональное производное или фрагмент.
18. 18. Применение по любому из предыдущих пунктов, в котором вектор, кодирующий цитокин-1, вводят системно, подкожно и/или внутримышечно.
19. 19. Применение вектора для эндогенной генной активации цитокина-1, способного связываться с ГБ-18ВР или его мутеином, слитым белком, функциональным производным или фрагментом и способного ингибировать рецептор цитокина-2, причем цитокин-2 является членом семейства ГЬ-1, для лечения или профилактики заболевания, которое вызывается или утяжеляется индуцированием указанного рецептора цитокина-2.
20. 20. Применение по п.19, в котором цитокин-1 принадлежит к семейству ГЬ-1.
21. 21. Применение по п.20, в котором цитокин-1 представляет собой ГЬ-1Е7Ь.
22. 22. Применение по любому из пп.19-21, в котором рецептор цитокина-2 представляет собой ГБ-18К.
23. 23. Применение по любому из пп.19-22, в котором в ингибировании цитокином-1 участвует связывание цитокина-1 с сигнальной цепью рецептора цитокина-2.
24. 24. Применение по любому из пп.19-23 для лечения или профилактики воспалительных заболеваний, выбранных из летальности, связанной с эндотоксином (сепсиса), повреждения печени, индуцированного токсинами или активированными Т-клетками, или гепатита С, артрита, повреждения легких, псориаза, воспалительного заболевания кишечника, повреждения головного мозга, ишемического повреждения, дисфункции сердца и неврита.
25. 25. Применение по любому из пп.19-24 для профилактики образования метастазов.
26. 26. Применение по любому из пп.19-25, в котором лекарственное средство дополнительно содержит ГБ-18ВР или его мутеин, слитый белок, функциональное производное или фрагмент.
27. 27. Применение по любому из предыдущих пунктов, в котором вектор, кодирующий цитокин-1, вводят системно, подкожно и/или внутримышечно.
28. 28. Применение ингибитора цитокина-1 или его изоформы, мутеина, слитого белка, функционального производного или фрагмента, способного связываться с ГБ-18ВР или его мутеином, слитым белком, функциональным производным или фрагментом и способного ингибировать рецептор цитокина-2, причем цитокин-2 является членом семейства ГЬ-1, для лечения или профилактики заболевания, которое предотвращается или облегчается индуцированием указанного рецептора цитокина-2.
29. 29. Применение ингибитора цитокина-1 по п.28, в котором цитокин-1 принадлежит к семейству ГЬ-1.
30. 30. Применение ингибитора цитокина-1 по п.29, в котором цитокин-1 представляет собой ГЬ-1Е7Ь.
31. 31. Применение ингибитора цитокина-1 по любому из пп.28-30, в котором рецептор цитокина-2 представляет собой ГБ-18К.
32. 32. Применение ингибитора цитокина-1 по любому из пп.28-31, в котором в ингибировании цитокином-1 участвует связывание цитокина-1 с сигнальной цепью рецептора цитокина-2.
33. 33. Применение ингибитора цитокина-1 по любому из пп.28-32 для лечения или профилактики вирусного заболевания.
34. 34. Применение ингибитора цитокина-1 по любому из пп.28-32 для лечения или профилактики злокачественной опухоли.