ES2922824T3 - Mutantes HMGB1 - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a un polipéptido de la caja del grupo 1 de alta movilidad (HMGB1), en el que en dicho polipéptido HMGB1 al menos uno, preferiblemente dos, más preferiblemente tres, lo más preferiblemente los cuatro residuos de tirosina en las posiciones correspondientes a las posiciones de los aminoácidos Y109, Y144, Y155. y/o Y162 de HMGB1 humana se han intercambiado por un residuo de aminoácido seleccionado independientemente de ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico, asparagina, ácido homoglutámico (ácido 2-aminohexanodioico) y homoglutamina (ácido 2,6-diamino-6-oxohexanoico) . La presente invención se refiere además a un polinucleótido que codifica un polipéptido según la presente invención, a un vector que comprende dicho polinucleótido ya una célula huésped que comprende dicho polipéptido, dicho polinucleótido y/o dicho vector. Además, la presente invención se refiere a métodos, kits y usos relacionados con los mismos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Mutantes HMGB1
La presente divulgación se refiere a un polipéptido de caja 1 deL grupo de alta movilidad (HMGB1), en el que en dicho polipéptido HMGB1 se han intercambiado al menos uno, preferentemente dos, más preferentemente tres, lo más preferentemente los cuatro residuos de tirosina en las posiciones correspondientes a las posiciones de aminoácidos Y109, Y144, Y155 y/o Y162 del HMGB1 humano por glutamina o ácido glutámico.
La presente divulgación se refiere además a un polinucleótido que codifica dicho polipéptido, a un vector que comprende dicho polinucleótido y a una célula huésped que comprende dicho polipéptido, dicho polinucleótido y/o dicho vector. Asimismo, la presente divulgación se refiere a procedimientos, kits y usos relacionados con los mismos.
La proteína de la Caja 1 del Grupo de Alta Movilidad (HMGB1) pertenece a la familia de proteínas nucleares High Mobility Group (HMG), cuyo nombre se debe a la inusual alta movilidad de sus miembros en la electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE). Estas proteínas se encuentran, después de las histonas, entre las más abundantes asociadas a la cromatina y desempeñan un papel arquitectónico en el núcleo de la célula eucariota, ya que doblan, distorsionan o modifican de otro modo la conformación del ADN, modificando así también la unión de los factores de transcripción al ADN. Las proteínas HMG han sido implicadas en la génesis de diversos trastornos, como varios tipos de tumores benignos y enfermedades autoinmunes. Además, la liberación de grandes cantidades de HMGB1, en particular de las células NK, es fundamental para la activación de las células dendríticas (Saidi et al. (2008), PloS one 3, e3601) y la quimiotaxis (Yang et al. (2007), Journal of leukocyte biology 81, 59-66). Además, el HMGB1 exhibe una sorprendente actividad antimicrobiana que resulta en la rápida eliminación de bacterias (Zetterstrom et al., (2002), Pediatric research 52, 148-154).
El HMGB1 endógeno también está intrínsecamente implicado en el metabolismo energético de las células y los órganos. Los ratones con anulación de HMGB1 son incapaces de utilizar las reservas de glucógeno en los hepatocitos y mueren debido a la hipoglucemia perinatal. La glucosa rescata temporalmente a los animales, pero los ratones sucumben varios días después debido a la grave atrofia de los órganos internos, los músculos y el tejido graso (Calogero et al. (1999), Nature genetics 22, 276-280). La incubación ex vivo de tejido muscular murino con HMGB1 conduce a un rápido agotamiento de las fibras musculares, y se encuentran elevadas concentraciones de HMGB1 en el mioplasma de los pacientes que sufren polimiositis (Grundtman et al. (2010), The FASEB journal 24, 570-578). En resumen, tanto la falta como el exceso de HMGB1 afectan gravemente al metabolismo energético celular.
El HMGB1 extracelular es una potente citoquina y un fuerte factor de activación para los macrófagos y otras células del sistema inmunitario, lo que conduce a una amplia reacción inflamatoria. Por esta razón, el HMGB1 se ha implicado en enfermedades autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico y la artritis reumatoide. Sin embargo, también se ha descubierto que cantidades elevadas de HMGB1 en sangre indican condiciones inflamatorias graves o potencialmente mortales como la sepsis. Para antagonizar dichas patologías relacionadas con HMGB1, se han descrito inhibidores de la función de HMGB1, como anticuerpos inhibidores o fragmentos de los mismos, variantes de HMGB1 que comprenden mutaciones en la caja A, o conjugados poliméricos del dominio de la caja A (US 6,468,533, WO 02/074337, US 2003/0144201, WO 2006024547y WO 2008031612). Por otra parte, el HMGB1 fue propuesto como agente anticancerígeno (US 2011/0123483 A1, Gdynia et al. (2016), Nature Communications 7:10764. doi: 10.1038/ncomms10764).
Para las proteínas HMGB1 se han descrito varios motivos estructurales: dos dominios de unión al ADN (caja A y caja B), dos secuencias de localización nuclear y un dominio ácido C-terminal. Las proteínas HMGB1 pueden ser ampliamente modificadas postraduccionalmente por acetilación, metilación, ADP-ribosilación, fosforilación o glicosilación. La acetilación de los sitios de localización nuclear es la señal que hace que la proteína HMGB1 sea secretada activamente por las células activadas del sistema inmunitario. Además de la secreción activa, el HMGB1 también se libera de forma pasiva desde las células necróticas.
El tratamiento del cáncer, además de la extirpación quirúrgica del tejido tumoral, se basa esencialmente en la aplicación de medicamentos y/o tratamientos que ejercen una función deletérea sobre las células en división activa. Por su naturaleza, dicho tratamiento también dañará a las células no tumorales y a los tejidos que sufren la división celular en el cuerpo humano, lo que provocará la mayoría de los conocidos y temidos efectos secundarios de la quimio y la radioterapia, como náuseas, distorsiones digestivas, fatiga, caída del cabello, etc. Por lo tanto, es deseable tener a mano nuevos agentes terapéuticos que sean eficaces a través de rutas de acción hasta ahora desconocidas, lo que permitiría reducir la dosis de quimio y/o radioterapia, aliviando los efectos secundarios. El suministro de estos agentes mediante nuevas vías de eliminación de células cancerosas también podría contribuir a la eliminación de las células madre del cáncer, que pueden sobrevivir a la quimioterapia cayendo en un estado de reposo y que, según se ha descubierto recientemente, son responsables de al menos una fracción de todas las recaídas y metástasis.
En los últimos años, se ha descubierto que las células NK tienen un uso potencial en el tratamiento del cáncer. La principal ventaja de las células NK es que forman parte del sistema inmunitario innato y no requieren una activación específica del antígeno. Las células NK pueden separarse en tres subconjuntos principales (células NK libres, aglutinantes y asesinas), en función de su capacidad para aglutinar y eliminar células diana sensibles (Jewett et al.
(1996), J Clin Immunol. 16(1):46-54). Las células NK no aglutinantes y no asesinas son las más inmaduras y pueden activarse para convertirse en aglutinantes y asesinas, y se descubrió que la capacidad de las células NK de secretar TNF-alfa se correlaciona con la etapa funcional de maduración de las células NK (Jewett et al., loc. cit.).
Sin embargo, a medida que las terapias inmunológicas contra el cáncer se vuelven más potentes, más eficaces y más ampliamente disponibles, el manejo óptimo de sus posibles toxicidades es cada vez más importante (Lee et al. (2014), Blood124(2):188). En particular, el síndrome de liberación de citoquinas (CRS), un síndrome asociado a niveles elevados de citoquinas en circulación es una toxicidad potencialmente mortal que se ha observado tras la administración de anticuerpos naturales y biespecíficos y, más recientemente, tras terapias con células T o NK para el cáncer (Lee et al., loc. cit.).
Existe, por tanto, la necesidad de mejorar los procedimientos de tratamiento del cáncer. Este problema se resuelve con los medios y procedimientos que se exponen a continuación.
Así, la presente invención se refiere a un polipéptido de caja 1 del grupo de alta movilidad (HMGB1) de acuerdo con la reivindicación 1. Además se divulga un polipéptido HMGB1, en el que en dicho polipéptido HMGB1 al menos uno, preferentemente dos, más preferentemente tres, lo más preferentemente los cuatro residuos de tirosina en las posiciones correspondientes a las posiciones de aminoácidos 22, 57, 68 y 75 de la SEQ ID NO: 1 han sido intercambiados por glutamina o ácido glutámico.
Tal y como se utiliza en lo que sigue, los términos "tener", "comprender" o "incluir" o cualquier variación gramatical arbitraria de los mismos se utilizan de forma no exclusiva. Por lo tanto, estos términos pueden referirse tanto a una situación en la que, además de la característica introducida por estos términos, no hay otras características presentes en la entidad descrita en este contexto como a una situación en la que hay una o más características adicionales. A modo de ejemplo, las expresiones "A tiene B", "A comprende B" y "A incluye B" pueden referirse tanto a una situación en la que, además de B, no hay ningún otro elemento presente en A (es decir, una situación en la que A consiste única y exclusivamente en B) como a una situación en la que, además de B, hay uno o varios elementos más presentes en la entidad A, como el elemento C, los elementos C y D o incluso otros elementos.
Además, tal como se utiliza en lo que sigue, los términos "preferentemente", "más preferentemente", "lo más preferentemente", "particularmente", "más particularmente", "específicamente", "más específicamente" o términos similares se utilizan junto con características opcionales, sin restringir otras posibilidades. Por lo tanto, las características introducidas por estos términos son características opcionales y no pretenden restringir el alcance de las reivindicaciones de ninguna manera. La invención puede, como reconocerá el experto, realizarse utilizando características alternativas. Del mismo modo, las características introducidas por "en una realización de la invención" o expresiones similares pretenden ser características opcionales, sin ninguna restricción en cuanto a otras realizaciones de la invención, sin ninguna restricción en cuanto al alcance de la invención y sin ninguna restricción en cuanto a la posibilidad de combinar las características introducidas de tal manera con otras características opcionales o no opcionales de la invención. Además, si no se indica lo contrario, el término "aproximadamente" se refiere al valor indicado ±20 %.
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "polipéptido de la caja 1 del grupo de alta movilidad" (polipéptido HMGB1) se refiere a un miembro del grupo de polipéptidos de alta movilidad conocido por la persona experta, que tiene las modificaciones especificadas en las reivindicaciones; incluyendo secuencias parciales o derivados de las mismas como se especifica a continuación. Así, el polipéptido HMGB1 de la presente invención, preferentemente, no es un polipéptido HMGB1 de origen natural. También preferentemente, el polipéptido HMGB1 de la presente invención no es HMGB1 humano, y no es HMGB1 humano fosforilado en los aminoácidos Y109, Y144, Y155 y/o Y162. Preferentemente, el polipéptido HMGB1 de la presente invención tiene la actividad especificada en otra parte del presente documento, preferentemente la actividad citotóxica y/o la actividad de activación de las células NK, preferentemente como se especifica en los Ejemplos. Preferentemente, el polipéptido HMGB1 es un derivado del polipéptido HMGB1 humano (Genbank ACC No: Np_002119.1 GI:4504425, SEQ ID No : 3). En los Ejemplos adjuntos se describen ensayos adecuados para medir las actividades mencionadas anteriormente. El polipéptido HMGB1 puede purificarse a partir de células o tejidos o puede sintetizarse químicamente o, preferentemente, puede fabricarse de forma recombinante. El polipéptido HMGB1 puede comprender otros aminoácidos que pueden servir como etiqueta para la purificación o la detección, y/o el polipéptido HMGB1 puede estar compuesto por un polipéptido de fusión, como se especifica en otra parte del presente documento.
Así, en una realización preferida de un polipéptido o péptido de la presente invención, el polipéptido o péptido comprende además una etiqueta detectable. El término "etiqueta detectable" se refiere a un tramo de aminoácidos que se añaden o introducen en el polipéptido o péptido. Preferentemente, la etiqueta se añadirá en el extremo C o N del polipéptido o péptido; dicho tramo de aminoácidos puede, por ejemplo, permitir la detección del polipéptido o péptido mediante un anticuerpo que reconozca específicamente la etiqueta o permitirá formar una conformación funcional, como un quelante o permitirá la visualización mediante etiquetas fluorescentes. Las etiquetas preferidas son la etiqueta Myc, la etiqueta f La G, la etiqueta 6-His, la etiqueta HA, la etiqueta GST o la etiqueta GFP. Todas estas etiquetas son bien conocidas en la técnica.
Una realización preferida del polipéptido HMGB1 es un polipéptido que comprende el motivo de la caja B del polipéptido HMGB1, preferentemente que comprende la caja B del HMGB1 humano, más preferentemente que comprende un derivado de la SEQ ID NO: 1 con las mutaciones que se especifican en el presente documento, más preferentemente comprendiendo una caja B mutada de HMGB1 humana, preferentemente como se especifica en el presente documento.
En el polipéptido HMGB1 de la presente invención, al menos uno, preferentemente dos, más preferentemente tres, lo más preferentemente los cuatro residuos de tirosina en las posiciones correspondientes a las posiciones de aminoácidos 22, 57, 68 y 75 de la SEQ ID NO: 1 han sido intercambiados por un residuo de aminoácido de acuerdo con la reivindicación 1.
Como puede entender el experto, las posiciones de aminoácidos mencionadas corresponden a los aminoácidos Y109, Y144, Y155 e Y162 del HMGB1 humano (SEQ ID NO: 3). Preferentemente, en dicho polipéptido HMGB1 al menos uno, preferentemente dos, más preferentemente tres, lo más preferentemente los cuatro residuos de tirosina en dichas posiciones se han intercambiado por un residuo de aminoácido seleccionado independientemente del ácido glutámico o la glutamina.
Más preferentemente, en dicho polipéptido HMGB1 al menos uno, preferentemente dos, más preferentemente tres, lo más preferentemente los cuatro residuos de tirosina en dichas posiciones se han intercambiado por residuos de ácido glutámico o se han intercambiado por residuos de glutamina. Aún más preferentemente, en dicho polipéptido HMGB1 al menos uno, preferentemente dos, más preferentemente tres, lo más preferentemente los cuatro residuos de tirosina en dichas posiciones han sido intercambiados por residuos de glutamina; así, preferentemente, el polipéptido HMGB1 comprende preferentemente la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, más preferentemente comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6. Lo más preferentemente, en dicho polipéptido HMGB1 al menos uno, preferentemente dos, más preferentemente tres, lo más preferentemente los cuatro residuos de tirosina en dichas posiciones han sido intercambiados por residuos de ácido glutámico; así, preferentemente, el polipéptido HMGB1 comprende preferentemente la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, más preferentemente comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8.
En una divulgación, el polipéptido HMGB1 o un derivado del mismo es un polipéptido HMGB1 oligofosforilado, es decir, un polipéptido HMGB1 en el que al menos uno, preferentemente dos, más preferentemente tres, lo más preferentemente los cuatro residuos de tirosina se han intercambiado por una glutamina.
En otra divulgación, el polipéptido HMGB1 o un derivado del mismo es un fosfomímico de un polipéptido HMGB1, es decir, un polipéptido Hm GB1 en el que al menos uno, preferentemente dos, más preferentemente tres, lo más preferentemente los cuatro residuos de tirosina se han intercambiado por un ácido glutámico.
Preferentemente, el polipéptido HMGB1 o un derivado del mismo es el polipéptido HMGB1 tal como se especifica en el presente documento; el término, preferentemente, incluye además un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 70% al polipéptido HMGB1 o a la caja B del polipéptido HMGB1 tal como se especifica en el presente documento y que tiene la actividad de inducir un aumento de la muerte celular en las células cancerosas, por ejemplo, en la célula SW480. Así, preferentemente, el polipéptido HMGB1 tiene la actividad de inducir un aumento de la muerte celular en células SW480 cultivadas a una concentración de 0,8 pM en comparación con un polipéptido que comprende, preferentemente, una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:3. Más preferentemente, dicho polipéptido HMGB1 induce un aumento de la muerte celular en células SW480 cultivadas a una concentración de 0,8 pM en comparación con un polipéptido que comprende, preferentemente, una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6. También, preferentemente, el término, preferentemente, incluye además un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 70% idéntica al polipéptido HMGB1 o a la caja B del polipéptido HMGB1 como se especifica en el presente documento y que tiene la actividad de inducir un aumento de la muerte de las células cancerosas por parte de las células NK; más preferentemente, induce un aumento de la muerte de las células SW480 cultivadas por las células NK-92 Cl a una concentración de 0,8 pM en comparación con un polipéptido que comprende, preferentemente, una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3; más preferentemente induce una mayor muerte de las células SW480 cultivadas por las células NK-92 Cl a una concentración de 0,8 pM en comparación con un polipéptido que comprende, preferentemente, una secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 6. También preferentemente, el término, preferentemente, incluye además un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 70% idéntica al polipéptido HMGB1 o a la caja B del polipéptido HMGB1 como se especifica en el presente documento y que tiene la actividad de inducir la maduración de las células NK, preferentemente aumenta la secreción del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) por las células NK-92 Cl cultivadas a una concentración de 0,8 pM en comparación con un polipéptido que comprende, preferentemente, una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. Más preferentemente, dicho polipéptido HMGB1 aumenta la secreción del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) por las células NK-92 Cl cultivadas a una concentración de 0,8 pM en comparación con un polipéptido que comprende, preferentemente, una secuencia de aminoácidos de la SeQ ID NO: 6.
El término "TNF-alfa" o "factor de necrosis tumoral alfa" es conocido por el experto como una citoquina que participa en la inflamación sistémica, en particular en la reacción de fase aguda. Preferentemente, el TNF-alfa es TNF-alfa humano.
Preferentemente, el polipéptido HMGB1 comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 70%, preferentemente al menos el 80%, más preferentemente al menos el 90%, incluso más preferentemente el 95%, lo más preferentemente al menos el 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 y/o comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 70%, preferentemente al menos el 80%, más preferentemente al menos el 90%, incluso más preferentemente el 95%, lo más preferentemente al menos el 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3, y, más preferentemente, tiene al menos una, más preferentemente al menos dos, lo más preferentemente las tres actividades mencionadas. Más preferentemente, el polipéptido HMGB1 comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 70%, preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 90%, incluso más preferentemente un 95%, lo más preferentemente al menos un 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5 a 8, preferentemente SEQ ID NO: 6 u 8, y, más preferentemente, tiene al menos una, más preferentemente al menos dos, lo más preferentemente las tres actividades mencionadas.
El término "agente que proporciona el polipéptido HMGB1", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier agente o composición que tenga la capacidad de proporcionar o liberar un polipéptido HMGB1 como se especifica en el presente documento a un sistema biológico. Preferentemente, el agente que proporciona el polipéptido HMGB1 se utiliza a una dosis que induce una concentración plasmática de 1 nM a 5 pM, más preferentemente de 10 nM a 1 pM, lo más preferentemente de 50 nM a 900 nM. Preferentemente, el término también se refiere a un agente que se une específicamente a una célula tumoral que comprende el polipéptido HMGB1. Preferentemente, dicho agente que se une específicamente a una célula tumoral es un anticuerpo, un aptámero, una lectina o algo similar. También es preferible que el término agente que proporciona el polipéptido HMGB1 se refiera a una célula secretora de HMGB1 inducida a secretar el polipéptido Hm GB1. Las células que pueden ser inducidas a secretar HMGB1 y los procedimientos para hacerlo son conocidos en la técnica e incluyen, preferentemente, los procedimientos mostrados en los ejemplos; las células preferidas que pueden ser inducidas a secretar HMGB1 son los macrófagos y las células NK. También preferentemente, el término agente que proporciona el polipéptido HMGB1 se refiere a un polinucleótido expresable que codifica el polipéptido HMGB1. Como comprenderá el experto, dicho polinucleótido está, preferentemente, comprendido en un vector o en una célula huésped, preferentemente como se especifica a continuación.
El término "derivado", tal como se utiliza en el contexto de un compuesto químico de la presente invención, se refiere a una molécula química que tiene una estructura relacionada con dicho compuesto químico de la presente invención. Preferentemente, un derivado puede producirse a partir de un compuesto químico de la presente invención mediante a lo sumo tres, más preferentemente a lo sumo dos, lo más preferentemente a lo sumo una reacción de derivación química. Preferentemente, el derivado es un compuesto que se metaboliza en un cuerpo de mamífero, preferentemente humano, en un compuesto químico de la presente invención. También preferentemente, un derivado es un compuesto a partir del cual se puede obtener por hidrólisis un compuesto químico de la presente invención. En caso de que el compuesto químico sea un péptido o un polipéptido, el derivado, preferentemente, es un compuesto que tiene al menos un grado de similitud como se especifica a continuación con el compuesto del que deriva. Tal como se utiliza en el presente documento, un derivado del polipéptido de la caja 1 del grupo de alta movilidad (HMGB1), tal como se especifica en el presente documento, tiene al menos la actividad de inhibir las células cancerosas tal como se especifica en el presente documento.
Preferentemente, el término "derivado" relativo a un polipéptido o péptido incluye variantes de la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido o péptido, teniendo dichas variantes una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido o péptido y conservando dichas variantes la función del polipéptido o péptido como se especifica en el presente documento. Los valores de identidad porcentual se calculan, preferentemente, sobre toda la región de la secuencia de aminoácidos. El trabajador especializado dispone de una serie de programas basados en diversos algoritmos para comparar diferentes secuencias. En este contexto, los algoritmos de Needleman y Wunsch o Smith y Waterman dan resultados especialmente fiables. Para llevar a cabo los alineamientos de secuencias, el programa PileUp (J. Mol. Evolution, 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 51989: 151-153) o los programas Gap y BestFit (Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970)) y Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981), que forman parte del paquete de programas informáticos GCG (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE.UU. 53711 (1991)). Los valores de identidad de la secuencia mencionados anteriormente en porcentaje (%) deben determinarse, preferentemente, utilizando el programa GAP en toda la región de la secuencia con los siguientes ajustes: Peso de la brecha: 50, Peso de la longitud: 3, Partido Promedio: 10.000 y el desajuste promedio: 0.000.
Además, los derivados de polipéptidos o péptidos abarcan además variantes de las secuencias de aminoácidos específicas antes mencionadas que pueden representar ortólogos, parálogos u otros homólogos de los polipéptidos o péptidos específicos. Las variantes, preferentemente, comprenden una secuencia de aminoácidos caracterizada porque la secuencia puede derivarse de las secuencias de polipéptidos o péptidos antes descritas mediante al menos una sustitución y/o adición y/o supresión de aminoácidos.
El término derivado también incluye polipéptidos modificados químicamente, por ejemplo, polipéptidos que contienen aminoácidos modificados o polipéptidos que están, por ejemplo, biotinilados, o están acoplados a fluoróforos, como la fluoresceína, o Cy 3, están restringidos conformacionalmente, por ejemplo, por puentes disulfuro o por grapado (Walensky 2004, Science 305(5689): 1466-1470), o están vinculados a polipéptidos de penetración celular o a dominios de transducción de proteínas (Snyder 2004, Pharm Res 21(3): 389-393). Dichas modificaciones pueden mejorar las propiedades biológicas de los polipéptidos, por ejemplo, la penetración celular, la unión, la estabilidad, o pueden utilizarse como etiquetas de detección.
Preferentemente, el polipéptido HMGB1 se proporciona como una preparación farmacéuticamente compatible. Los términos "preparación farmacéuticamente compatible" y "composición farmacéutica", tal y como se utilizan aquí, se refieren a las composiciones que comprenden al menos un compuesto de la presente invención y, opcionalmente, uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Los compuestos de la presente invención pueden formularse como sales farmacéuticamente aceptables. Las sales aceptables preferidas son acetato, metiléster, HCl, sulfato, cloruro y similares. Las composiciones farmacéuticas se administran, preferentemente, por vía tópica o, más preferentemente, por vía sistémica. Las vías de administración adecuadas utilizadas convencionalmente para la administración de fármacos son la oral, la intravenosa o la parenteral, así como la inhalación. Sin embargo, dependiendo de la naturaleza y el modo de acción de un compuesto, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse también por otras vías. Además, los compuestos pueden administrarse en combinación con otros fármacos, ya sea en una composición farmacéutica común o como composiciones farmacéuticas separadas, tal como se especifica en el presente documento, en las que dichas composiciones farmacéuticas separadas pueden suministrarse en forma de kit de piezas.
Los compuestos se administran, preferentemente, en formas de dosificación convencionales preparadas mediante la combinación de los fármacos con portadores farmacéuticos estándar según procedimientos convencionales. Estos procedimientos pueden consistir en mezclar, granular y comprimir o disolver los ingredientes según convenga para la preparación deseada. Se apreciará que la forma y el carácter del portador o diluyente farmacéuticamente aceptable están dictados por la cantidad de ingrediente activo con el que se va a combinar, la vía de administración y otras variables conocidas.
El (los) portador(es) debe(n) ser aceptable(s) en el sentido de que sea(n) compatible(s) con los demás ingredientes de la formulación y no sea(n) perjudicial(es) para el receptor de la misma. El portador farmacéutico empleado puede ser, por ejemplo, un sólido, un gel o un líquido. Ejemplos de portadores sólidos son la lactosa, la terra alba, la sacarosa, el talco, la gelatina, el agar, la pectina, la acacia, el estearato de magnesio, el ácido esteárico y similares. Ejemplos de portadores líquidos son la solución salina tamponada con fosfato, el jarabe, el aceite, como el aceite de cacahuete y el aceite de oliva, el agua, las emulsiones, varios tipos de agentes humectantes, las soluciones estériles y similares. Del mismo modo, el portador o diluyente puede incluir material de retardo de tiempo bien conocido en la técnica, como el monoestearato de glicerilo o el diestearato de glicerilo solos o con una cera. Dichos portadores adecuados comprenden los mencionados anteriormente y otros bien conocidos en la técnica, véase, por ejemplo Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.
El o los diluyentes se seleccionan de manera que no afecten a la actividad biológica del compuesto o los compuestos. Ejemplos de tales diluyentes son el agua destilada, la solución salina fisiológica, las soluciones de Ringer, la solución de dextrosa y la solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica también puede incluir otros portadores, adyuvantes o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y similares.
Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a una cantidad de los compuestos a utilizar en una composición farmacéutica de la presente invención que previene, mejora o trata los síntomas que acompañan a una enfermedad o condición referida en esta especificación. La eficacia terapéutica y la toxicidad de dichos compuestos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, la ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) y la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos terapéuticos y los tóxicos es el índice terapéutico, y puede expresarse como la relación, LD50/ED50.
El régimen de dosificación será determinado por el médico tratante y otros factores clínicos; preferentemente de acuerdo con cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente. Como es bien sabido en las artes médicas, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto particular que se va a administrar, el sexo, el tiempo y la vía de administración, la salud general y otros medicamentos que se administran simultáneamente. Los progresos pueden ser controlados mediante evaluaciones periódicas. Una dosis típica puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 1 a 1000 |jg; sin embargo, se prevén dosis por debajo o por encima de este intervalo ejemplar, especialmente teniendo en cuenta los factores mencionados. Generalmente, el régimen de administración regular de la composición farmacéutica debe estar en el intervalo de 1 jg a 10 mg de unidades por día. Si el régimen es una infusión continua, también debe estar en el intervalo de 1 jg a 10 mg de unidades por kilogramo de peso corporal por minuto, respectivamente. Los progresos pueden ser controlados mediante evaluaciones periódicas. Las dosis y concentraciones preferidas de los compuestos de la presente invención se especifican en el presente documento. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas a las que se hace referencia en el presente documento se administran, preferentemente, al menos una vez para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección mencionada en esta especificación. Sin embargo, dichas composiciones farmacéuticas pueden administrarse más de una vez, por ejemplo de una a cuatro veces al día hasta un número no limitado de días.
Las composiciones farmacéuticas específicas se preparan de una manera bien conocida en el arte farmacéutico y comprenden al menos un compuesto activo mencionado en el presente documento en mezcla o asociado de otro modo con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Para la elaboración de estas composiciones farmacéuticas específicas, el o los compuestos activos se mezclarán normalmente con un portador o el diluyente, o se encerrarán o encapsularán en una cápsula, bolsita, cápsula lisa, papel u otros contenedores o vehículos adecuados. Las formulaciones resultantes se adoptarán al modo de administración, es decir, en forma de comprimidos, cápsulas, supositorios, soluciones, suspensiones o similares. Las recomendaciones de dosificación se indicarán en las instrucciones de los prescriptores o de los usuarios con el fin de anticipar los ajustes de dosis en función del receptor considerado.
Ventajosamente, se encontró en el trabajo subyacente a la presente invención que los polipéptidos HMGB1 mutados de la presente invención tienen actividades incrementadas en comparación con el HMGB1 de tipo salvaje, siendo el Glu-HMGB1 aún más activo que el Gln-HMGB1. Además, se descubrió que utilizando diferentes mutantes de HMGB1, el nivel de citotoxicidad para las células cancerosas y de activación del sistema inmunitario puede ajustarse según las necesidades.
Las definiciones anteriores se aplican, mutatis mutandis, a lo siguiente. Las definiciones y explicaciones adicionales que se hacen más adelante también se aplican a todas las realizaciones descritas en esta especificación mutatis mutandis.
La presente invención se refiere además a un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 6.
El término "polinucleótido", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene la actividad biológica descrita anteriormente, y que preferentemente comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 y/u 8 o un derivado de los mismos como se especifica en el presente documento. Debe entenderse que un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos como la detallada anteriormente puede ser codificado debido al código genético degenerado por más de una especie de polinucleótido. Además, el término "polinucleótido", tal y como se utiliza de acuerdo con la presente invención, abarca además variantes de los polinucleótidos específicos antes mencionados. Dichas variantes pueden representar ortólogos, paralogos u otros homólogos del polinucleótido de la presente invención. Las variantes de polinucleótidos, preferentemente, comprenden una secuencia de ácido nucleico caracterizada porque la secuencia puede derivarse de las secuencias específicas de ácido nucleico antes mencionadas mediante al menos una sustitución, adición y/o supresión de nucleótidos, por lo que la secuencia de ácido nucleico variante seguirá codificando un polipéptido que tenga la(s) mutación(es) y la actividad especificada anteriormente. Las variantes también abarcan los polinucleótidos que comprenden una secuencia de ácido nucleico que es capaz de hibridarse con las secuencias de ácido nucleico específicas antes mencionadas, preferentemente, en condiciones de hibridación estrictas. Estas condiciones estrictas son conocidas por el trabajador especializado y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Un ejemplo preferido de condiciones de hibridación estrictas son las condiciones de hibridación en 6 * cloruro de sodio/citrato de sodio (= SSC) a aproximadamente 45°C, seguidas de uno o más pasos de lavado en 0,2 * SSC, 0,1% SDS a 50 a 65°C. El trabajador experto sabe que estas condiciones de hibridación difieren según el tipo de ácido nucleico y, por ejemplo, cuando hay disolventes orgánicos, en cuanto a la temperatura y la concentración del tampón. Por ejemplo, en las "condiciones estándar de hibridación" la temperatura difiere según el tipo de ácido nucleico entre 42°C y 58°C en un tampón acuoso con una concentración de 0,1 a 5 * SSC (pH 7,2). Si hay disolvente orgánico en el tampón mencionado, por ejemplo formamida al 50%, la temperatura en condiciones estándar es de aproximadamente 42°C. Las condiciones de hibridación para los híbridos de ADN:ADN son preferentemente, por ejemplo, 0,1 * SSC y 20°C a 45°C, preferentemente entre 30°C y 45°C. Las condiciones de hibridación para los híbridos de ADN:ARN son preferentemente, por ejemplo, 0,1 * SSC y 30°C a 55°C, preferentemente entre 45°C y 55°C. Las temperaturas de hibridación mencionadas se determinan, por ejemplo, para un ácido nucleico con una longitud de aproximadamente 100 pb (= pares de bases) y un contenido de G C del 50% en ausencia de formamida. El trabajador experto sabe cómo determinar las condiciones de hibridación necesarias consultando libros de texto como el mencionado anteriormente.
Alternativamente, las variantes de polinucleótidos se pueden obtener mediante técnicas basadas en la PCR, como la amplificación del ADN basada en cebadores oligonucleótidos mixtos, es decir, utilizando cebadores degenerados contra dominios conservados de los polipéptidos de la presente invención. Los dominios conservados de los polipéptidos de la presente invención pueden identificarse mediante una comparación de la secuencia de ácido nucleico del polinucleótido o de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos, como se ha especificado anteriormente. Las condiciones de PCR adecuadas son bien conocidas en la técnica. Como plantilla, se puede utilizar el ADN o el ADNc de los AAV. Además, las variantes incluyen polinucleótidos que comprenden secuencias de ácido nucleico que son al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 98% o al menos un 99% idénticas a las secuencias de ácido nucleico detalladas anteriormente. Los valores porcentuales de identidad se calculan, preferentemente, como se ha indicado anteriormente.
Un polinucleótido que comprende un fragmento de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico mencionadas anteriormente también se abarca como un polinucleótido de la presente invención. El fragmento deberá codificar un polipéptido que siga teniendo la actividad biológica especificada anteriormente. En consecuencia, el polipéptido puede comprender o estar formado por los dominios del polipéptido de la presente invención que confieren dicha actividad biológica. Un fragmento, tal como se entiende en el presente documento, comprende preferentemente al menos 50, al menos 100, al menos 250 o al menos 500 nucleótidos consecutivos de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos mencionadas anteriormente o codifica una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 20, al menos 30, al menos 50, al menos 80, al menos 100 o al menos 150 aminoácidos consecutivos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente.
El polinucleótido de la presente invención se proporcionará, preferentemente, como polinucleótido aislado (es decir, aislado de su contexto natural) o en forma modificada genéticamente. El polinucleótido, preferentemente, es ADN, incluyendo ADNc o ARN. El término abarca tanto los polinucleótidos de cadena simple como los de cadena doble. Además, también se incluyen polinucleótidos modificados químicamente, incluyendo polinucleótidos modificados de forma natural, como polinucleótidos glicosilados o metilados, o modificados artificialmente, como polinucleótidos biotinilados.
Los polinucleótidos de la presente invención consisten esencialmente en las secuencias de ácido nucleico mencionadas o comprenden las secuencias de ácido nucleico mencionadas. Por lo tanto, también pueden contener otras secuencias de ácido nucleico. Específicamente, la presente invención también se refiere a un vector que comprende el polinucleótido de la presente invención.
La presente invención se refiere además a un vector de acuerdo con la reivindicación 7.
El término "vector", preferentemente, abarca los vectores fágicos, plasmídicos, virales o retrovirales, así como los cromosomas artificiales, como los cromosomas artificiales bacterianos o de levadura. Más preferentemente, el término se refiere a un vector derivado de un virus, dicho virus, preferentemente, infecta preferentemente las células tumorales (virus tumorotrópico) o un virus que lisa preferentemente las células cancerosas (virus oncolítico). Además, el término también se refiere a las construcciones de orientación que permiten la integración aleatoria o dirigida de la construcción de orientación en el ADN genómico. Dichas construcciones de orientación, preferentemente, comprenden ADN de longitud suficiente para la recombinación homóloga o heteróloga. El vector que engloba el polinucleótido de la presente invención, preferentemente, comprende además marcadores seleccionables para la propagación y/o selección en un huésped. El vector puede incorporarse a una célula huésped mediante diversas técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, un vector plasmídico puede introducirse en un precipitado como el de fosfato de calcio o el de cloruro de rubidio, o en un complejo con un lípido cargado o en agrupaciones basadas en el carbono, como los fullerenos. Alternativamente, se puede introducir un vector plasmídico mediante técnicas de choque térmico o electroporación. Si el vector es un virus, puede ser empaquetado in vitro utilizando una línea celular de empaquetado adecuada antes de su aplicación a las células huésped. Los vectores virales pueden ser competentes para la replicación o defectuosos para la replicación.
Preferentemente, en el vector de la invención el polinucleótido de la invención está operativamente unido a secuencias de control de expresión que permiten la expresión en células procariotas o eucariotas o en fracciones aisladas de las mismas. La expresión de dicho polinucleótido comprende la transcripción del polinucleótido, preferentemente en un ARNm traducible. Los elementos reguladores que garantizan la expresión en células eucariotas, preferentemente de mamíferos, son bien conocidos en la técnica. Preferentemente, comprenden secuencias reguladoras que aseguran el inicio de la transcripción y, opcionalmente, señales poli-A que aseguran la terminación de la transcripción y la estabilización del transcrito. Otros elementos reguladores pueden incluir potenciadores transcripcionales y traslacionales. Los posibles elementos reguladores que permiten la expresión en células procariontes incluyen, por ejemplo, el promotor lac, trp o tac en E. coli, y ejemplos de elementos reguladores que permiten la expresión en células eucariontes son el promotor AOX1 o GAL1 en la levadura o el promotor CMV, SV40, RSV (virus del sarcoma de Rous), el potenciador CMV, el potenciador SV40 o un intrón de globina en células de mamíferos y otros animales. Además, pueden utilizarse secuencias de control de expresión inducible en un vector de expresión comprendido en la presente invención. Dichos vectores inducibles pueden, preferentemente, comprender secuencias operadoras tet o lac o secuencias inducibles por choque térmico u otros factores ambientales. Las secuencias de control de expresión adecuadas son bien conocidas en la técnica. Además de los elementos responsables de la iniciación de la transcripción, dichos elementos reguladores también pueden comprender señales de terminación de la transcripción, como el sitio SV40-poly-A o el sitio tk-poly-A, corriente abajo del polinucleótido. En este contexto, se conocen vectores de expresión adecuados en la técnica, como el vector de expresión de ADNc Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pBluescript (Stratagene), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (InVitrogene) o pSPORT1 (GIBc O BRL). Los vectores de expresión derivados de virus como los retrovirus, el virus vaccinia, el virus adeno-asociado, los virus del herpes o el virus del papiloma bovino, pueden utilizarse para el suministro de los polinucleótidos o el vector de la invención en la población celular objetivo. Para construir vectores virales recombinantes pueden utilizarse procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia; véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y. (1994).
Además, la presente invención se refiere a una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 8.
El término "célula huésped", preferentemente, se refiere a una célula compatible con ser administrada a un sujeto. Más preferentemente, dicha célula es inmunológicamente compatible con el sujeto. Lo más preferentemente, la célula es una célula obtenida de dicho sujeto. La célula huésped de la presente invención, preferentemente, es una célula con tendencia a migrar a la vecindad de las células cancerosas, Más preferentemente, la célula huésped es una célula inmune, y lo más preferentemente es una célula del sistema inmune que reconoce específicamente un antígeno específico del tumor, como, por ejemplo, una célula T específica del antígeno del tumor.
Además, la célula huésped que comprende el polinucleótido o vector de la presente invención, preferentemente, es una célula capaz de producir un polipéptido HMGB1 de la presente invención, por ejemplo, una célula bacteriana, de levadura, de insecto o de mamífero.
La presente invención se refiere además a un polipéptido, un polinucleótido, un vector y/o una célula huésped para su uso como medicamento de acuerdo con la reivindicación 9.
Asimismo, la presente invención se refiere a un polipéptido, un polinucleótido, un vector y/o una célula huésped para su uso en el tratamiento del cáncer y/o en la modulación inmunológica de acuerdo con la reivindicación 10.
El término "cáncer", tal y como se utiliza aquí, se refiere a una enfermedad de un animal, preferentemente el hombre, caracterizada por el crecimiento inapropiado y/o incontrolado de un grupo de células del cuerpo. Este crecimiento incontrolado puede ir acompañado de la intrusión y la destrucción del tejido circundante y, posiblemente, de la propagación de las células que proliferan de forma inapropiada a otros lugares del cuerpo. Así, preferentemente, el polinucleótido, el vector y/o la célula huésped de acuerdo con la presente invención son para su uso en el tratamiento del cáncer.
Preferentemente, el cáncer se selecciona de la lista que consiste en leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, linfoma relacionado con el sida, cáncer anal, cáncer de apéndice, astrocitoma, teratoide atípico, carcinoma de células basales, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, glioma de tronco cerebral, cáncer de mama, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, astrocitoma cerebeloso, cáncer cervical, cordoma, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craneofaringioma, cáncer de endometrio, ependimoblastoma, ependimoma, cáncer de esófago, tumor de células germinales extracraneal, tumor de células germinales extragonadal, cáncer de vías biliares extrahepáticas, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor del estroma gastrointestinal, tumor trofoblástico gestacional, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular, linfoma de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, glioma de la vía hipotalámica y visual, melanoma intraocular, sarcoma de Kaposi, cáncer de laringe, meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, cáncer de boca, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, micosis fungoide, cáncer de cavidad nasal y senos paranasales, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, tumor neuroendocrino (NET)/carcinoma, linfoma no hodgkin, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario, tumor de células germinales de ovario, tumor de ovario de bajo potencial maligno, cáncer de páncreas, papilomatosis, cáncer de senos paranasales y cavidad nasal, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, feocromocitoma, tumor hipofisario, blastoma pleuropulmonar, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer de recto, cáncer de células renales, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, síndrome de Sezary, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de células escamosas, cáncer de cuello escamoso, cáncer de testículo, cáncer de garganta, carcinoma tímico, timoma, cáncer de tiroides, cáncer de uretra, sarcoma uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom y tumor de Wilms.
Más preferentemente, el cáncer es una leucemia, un linfoma, un cáncer relacionado con el VPH, un carcinoma colorrectal, un cáncer gástrico, un cáncer de páncreas, un cáncer de pulmón, un cáncer cerebral o un cáncer de mama. Un carcinoma colorrectal preferido es el carcinoma de colon. Aún más preferentemente, el cáncer es una leucemia, lo más preferentemente una leucemia linfocítica crónica (CLL).
El término "terapia contra el cáncer" incluye todos los medios y procedimientos conocidos por el experto como adecuados para tratar el cáncer. Preferentemente, el término se refiere a terapias aprobadas para el tratamiento del cáncer en humanos. El término "terapia inmunológica celular contra el cáncer", se refiere preferentemente a un procedimiento de tratamiento del cáncer que comprende la administración de células, preferentemente autólogas, a un sujeto, por ejemplo, preferentemente, células B, células T, y/o células NK, o células predecesoras de las mismas, por ejemplo, células madre hematopoyéticas. Preferentemente, dichas células administradas son células NK o células predecesoras de las mismas. Más preferentemente, dichas células son células NK reconocedoras de tumores o células predecesoras de las mismas. Aún más preferentemente, dichas células son células NK que reconocen tumores, lo más preferentemente son células NK autólogas que reconocen tumores.
Preferentemente, el tratamiento del cáncer y la modulación inmunitaria comprenden la terapia inmunitaria celular contra el cáncer.
También preferentemente, el tratamiento del cáncer y/o en la modulación inmunológica comprende inducir la secreción de TNF-alfa por las células NK, preferentemente es inducir la maduración de las células NK. También preferentemente, el tratamiento del cáncer y/o en la modulación inmunológica comprende evitar la inducción de eventos adversos, más preferentemente comprende evitar la inducción del síndrome de liberación de citoquinas (CRS).
Los términos "células asesinas naturales" y "células NK" son conocidos por el experto para referirse a los linfocitos citotóxicos que forman parte del sistema inmunitario innato y que, mediante receptores que incluyen NKG2D, NKp44, NKp46, NKp30 y otros, reconocen una serie de ligandos, incluyendo ULBP y MICA, que se expresan típicamente en las células tumorales. El término "maduración de células NK" es entendido por el experto. Preferentemente, la maduración de las células NK es un aumento de la fracción de células NK que se unen y/o matan a las células tumorales en la fracción total de células NK.
Los "acontecimientos adversos" relacionados con el tratamiento con HMGB1 y con la terapia inmunitaria celular, así como los marcadores y síntomas de los mismos y los tratamientos adecuados son conocidos por los expertos (por ejemplo, como se revisa en Tey, S-K (2014), Clinical and Translational Immunology 3, e17; doi:10.1038/cti.2014.11). Los acontecimientos adversos incluyen, preferentemente, neurotoxicidad (que provoca, por ejemplo, pérdida de audición, convulsiones o coma), vitíligo, colitis, aumento de las enzimas hepáticas, infiltrados pulmonares agudos, depleción de células B, hipogammaglobulinemia y síndrome de liberación de citoquinas. El término "síndrome de liberación de citoquinas" y sus síntomas y marcadores son conocidos por el experto, por ejemplo, por Lee et al. (loc. cit ). Preferentemente, el marcador para prevalecer o impedir la CRS una proteína C-reactiva, IL-6, y/o TNF-alfa, preferentemente el marcador es TNF-alfa.
Además, la presente divulgación describe un procedimiento para tratar el cáncer y/o para inducir la modulación inmunológica en un sujeto que comprende
a) poner en contacto a dicho sujeto con un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 18, un polinucleótido de acuerdo con la realización 19, un vector de acuerdo con la realización 20, y/o una célula huésped de acuerdo con la realización 21, y, de este modo
b) tratar el cáncer y/o inducir una modulación inmunitaria en dicho sujeto.
Los procedimientos de la presente divulgación, preferentemente, son procedimientos in vivo. Además, pueden comprender otras etapas además de las mencionadas explícitamente. Por ejemplo, un paso más del procedimiento para tratar el cáncer y/o para inducir la modulación inmunitaria puede estar relacionado, por ejemplo, con la eliminación quirúrgica del tejido tumoral antes o después de la administración de dichos compuestos farmacéuticamente activos. Preferentemente, los procedimientos se llevan a cabo con los pasos realizados en el orden indicado. Además, una o varias de dichas etapas pueden ser realizadas por equipos automatizados.
El término "sujeto", tal y como se utiliza aquí, se refiere a un animal, preferentemente un animal de granja o de compañía, más preferentemente un mamífero, LO más preferentemente un humano. Preferentemente, el sujeto es un sujeto que padece cáncer, más preferentemente como se ha especificado anteriormente.
El término "tratar" se refiere a la mejora de las enfermedades o trastornos mencionados en el presente documento o de los síntomas que los acompañan en una medida significativa. Dicho tratamiento, tal y como se utiliza aquí, también incluye, preferentemente, un restablecimiento completo de la salud con respecto a las enfermedades o trastornos a los que se hace referencia aquí. Debe entenderse que el tratamiento utilizado de acuerdo con la presente invención puede no ser eficaz en todos los sujetos a tratar. Sin embargo, el término requerirá, preferentemente, que una porción estadísticamente significativa de los sujetos que padecen una enfermedad o trastorno a los que se refiere el presente documento pueda ser tratada con éxito. El experto en la materia puede determinar sin más si una porción es estadísticamente significativa utilizando diversas herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, la determinación de los intervalos de confianza, la determinación del valor p, la prueba t de Student, la prueba de Mann-Whitney, etc. Los intervalos de confianza preferidos son al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99%. Los valores p son, preferentemente, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 o 0,0001. Preferentemente, el tratamiento será eficaz para al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90% de los sujetos de una cohorte o población determinada.
El término "modulación inmunitaria", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la inducción de un cambio en la medida en que el sistema inmunitario de un sujeto reacciona a un antígeno. Preferentemente, la modulación inmunológica es una activación. Preferentemente, el antígeno es un antígeno tumoral, más preferentemente un antígeno específico del tumor, es decir, preferentemente, un antígeno expresado y/o presentado sólo por las células tumorales del sujeto. Más preferentemente, la modulación de la respuesta inmunitaria de un sujeto consiste en inducir la secreción de TNF-alfa por parte de las células NK, lo más preferentemente en inducir la maduración de las células NK, preferentemente como se ha especificado anteriormente.
La presente divulgación describe además un procedimiento para proporcionar un tratamiento con HMGB1 a un sujeto evitando inducir un evento adverso, preferentemente evitando inducir el síndrome de liberación de citoquinas (CRS) que comprende
a) administrar un agente que proporcione HMGB1 a dicho sujeto
b) determinar al menos un parámetro de eventos adversos, preferentemente de CRS en una muestra de dicho paciente,
c) continuar la administración de un agente que proporciona HMGB1 con un agente alternativo que proporciona HMGB1,
en el que dicho agente alternativo que proporciona HMGB1 proporciona un polipéptido HMGB1 con una actividad disminuida en la inducción de la secreción de TNF-alfa y/o una actividad disminuida en la inducción de la muerte de células por parte de las células NK en caso de que dicho parámetro determinado en el paso b) sea indicativo de un aumento de la probabilidad de un evento adverso, preferentemente el CRS; y/o
donde dicho agente alternativo que proporciona HMGB1 proporciona un polipéptido HMGB1 con una actividad aumentada en la inducción de la secreción de TNF-alfa y/o una actividad disminuida en la inducción de la muerte de las células por parte de las células NK en caso de que dicho parámetro determinado en el paso b) sea indicativo de una baja probabilidad de un evento adverso, preferentemente el CRS;
d) proporcionando así el tratamiento con HMGB1 a un sujeto evitando un evento adverso, preferentemente evitando inducir la CRS.
Preferentemente, el polipéptido HMGB1 con una actividad disminuida en la inducción de la secreción de TNF-alfa y/o una actividad disminuida en la inducción de la muerte de células por parte de las células NK es el polipéptido HMGB1 de la realización 5, preferentemente un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 o 6. También preferentemente, el polipéptido HMGB1 con una actividad aumentada en la inducción de la secreción de TNF-alfa y/o una actividad aumentada en la inducción de la muerte de células por parte de las células NK es el polipéptido HMGB1 de la realización 4, preferentemente un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8. Preferentemente, el parámetro de CRS es la concentración de TNF-alfa.
Además, la presente divulgación se refiere a un procedimiento para modular la respuesta inmunitaria de un sujeto, que comprende
a) administrar un agente que proporcione un polipéptido HMGB1 a dicho sujeto, en el que dicho polipéptido HMGB1 es un polipéptido de acuerdo con la presente invención, y, por tanto
b) modular la respuesta inmunitaria de dicho sujeto.
Preferentemente, dicha modulación de la respuesta inmunitaria de un sujeto es inducir la secreción de TNF-alfa por parte de las células NK, preferentemente es inducir la maduración de las células NK, preferentemente como se ha especificado anteriormente
Asimismo, la presente invención se refiere a un kit de acuerdo con la reivindicación 13.
El término "kit", tal y como se utiliza en este documento, se refiere a una colección que comprende al menos los medios mencionados anteriormente, suministrados por separado o combinados, preferentemente dentro de un único contenedor. El contenedor, también preferentemente, comprende además instrucciones para llevar a cabo el procedimiento de la presente invención. Los componentes del kit se suministran, preferentemente, de forma "lista para usar", por ejemplo, las concentraciones se ajustan en consecuencia, etc. Preferentemente, el kit comprende además células asesinas naturales (células NK) y/o un medio para aislarlas. Los medios para el aislamiento de las células NK son medios para el uso específico en el aislamiento de las células NK e incluyen en particular anticuerpos que se unen específicamente a las células NK.
Leyendas de las figuras
Figura 1: Potente activación de las células Asesinas Naturales (NK-92 Cl) porGlu-HMGB1 (n=3, p<0,05). WT=HMGB1 WT, Variante E=Glu-HMGB1 (SEQ ID NO: 8), Variante Q=Gln-HMGB1 (SEQ ID NO: 6).
Los siguientes ejemplos se limitan a ilustrar la invención. No deben interpretarse, en absoluto, como una limitación del alcance de la invención.
Ejemplo 1: Procedimientos
Ensayo de liberación de Cr-51
Las células de cáncer de colon SW480 se cultivaron en placas de 96 pocillos (20000 células/pocillo) y se marcaron con 51Cr (25|jC¡/pocillo) durante 2 h. A continuación, las células se trataron con HMGB1 y células NK durante 24 horas. Se retiró el medio y se contó la radiactividad (cpml). Las células se lavaron 4 veces con medio y se solubilizaron con 100jl de NaOH 0,5n . Se contó la radiactividad de los lisados (cpm2).
Recuento de radiactividad
Las muestras se mezclaron con 10 ml de UltimaGoId y se contaron en un contador de centelleo líquido
cpm1
Cálculo de muerte celular: --------------------- x 100 = % de muerte celular.
cpm1 cpm2
Generación de GluHMGBI, GInHMGBI y HMGB1 de tipo salvaje
Los plásmidos que codifican un polipéptido HMGB1 con los cuatro residuos de tirosina del dominio B-Box sustituidos por residuos de glutamato o glutamina, respectivamente, se transfectaron en células HEK (cultivo celular en suspensión sin suero, 1.000 ml (app. 2.5*10® células/ml), y luego complementado con ácido valproico). Para la generación de HMGB1 de tipo salvaje, el dominio B-Box no se modificó en sus residuos de tirosina. La pella celular se homogeneizó y se purificó mediante resinas IMAC y TALON (Clontech) y se eluyó con imidazol. l5 eluatos se analizaron mediante SDS-PAGE (tinción de Coomassie). Tras agrupar los eluidos positivos, la proteína se filtró en gel (Superdex) y finalmente se analizó por SDS-PAGE. en los experimentos se utilizaron 800 nM de la proteína purificada.
Activación de las células NK
La activación de la línea de células Asesinas Naturales NK-92 Cl se midió mediante la detección de la liberación de TNF-alfa en el sobrenadante utilizando 400.000 células NK estimuladas con 800 nM de la proteína HMGB1 indicada durante 24 h. La detección de TNF-alfa se realizó con un kit ELISA (Avia Systems Biology, catálogo n° OKAA00027_96W) según las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 2: Resultados y discusión
Las diferentes formas de HMGB1 muestran tanto una citotoxicidad distinta hacia las células cancerosas como diferencias en la potenciación de la citotoxicidad de las Asesinas Naturales hacia las células cancerosas y la activación de las células NK
Utilizando tanto un período de tiempo muy corto para la evaluación de la citotoxicidad de HMGB1 de 24 h como el ensayo estándar de oro de liberación de 51Cr (cromo 51) altamente sensible para la detección de la muerte celular, revelamos nuevos y sorprendentes perfiles de citotoxicidad de diferentes formas de HMGB1, modificadas en su dominio B-Box. Gln-HMGB1 mostró un 43% más de muerte celular hacia las células cancerosas en comparación con el HMGB1 de tipo salvaje mientras que Glu-HMGB1 mostró incluso un 83% más de muerte celular en comparación con el HMGB1 de tipo salvaje (Tabla 1).
A continuación, se incubaron células efectoras (E) (línea de células Asesinas Naturales NK-92 Cl) con células diana (T) marcadas con 51Cr (células de cáncer de colon SW480) en varias relaciones E:T: 5:1, 10:1 y 20:1 (Tabla 1). Gln-HMGB1 más células NK mostraron hasta un 55% más de muerte celular hacia las células cancerosas en comparación con la actividad lítica de las células NK sin estimulación mientras que Glu-HMGB1 mostró hasta un 94% más de muerte celular hacia las células cancerosas en comparación con la actividad lítica de las células NK sin estimulación (E:T 5:1 respectivamente) (Tabla 1). Además, las células NKcon Gln-HMGB1 mostraron hasta un 13% más de muerte celular hacia las células cancerosas en comparación con la actividad lítica de las células NKtras la estimulación con HMGB1 de tipo salvaje, mientras que Glu-HMGB1 mostró hasta un 25% más de muerte celular hacia las células cancerosas en comparación con la actividad lítica de las células NKtras la estimulación con HMGB1 de tipo salvaje (E:T 5:1 respectivamente) (Tabla 1).
En resumen, las tres diferentes isoformas de HMGB1 muestran distintos perfiles de citotoxicidad. El Glu-HMGB1 es superior tanto al HMGB1 de tipo salvaje como al Gln-HMGB1 en cuanto a la citotoxicidad hacia las células cancerosas y en cuanto a la potenciación de la actividad lítica de las células NK hacia las células cancerosas. El Gln-HMGB1 es superior al HMGB1 de tipo salvaje en lo que respecta a la citotoxicidad hacia las células cancerosas y a la potenciación de la actividad lítica de las células NK hacia las células cancerosas. Así, el HMGB1 de tipo salvaje muestra el perfil de citotoxicidad más pobre en comparación con el Glu-HMGB1 y el Gln-HMGB1. Gln-HMGB1 sigue ejerciendo una fuerte citotoxicidad hacia las células cancerosas (aunque menos que GIu-HMGB1) con un aumento moderado de la actividad lítica de las células NK (que se sitúa entre el HMGB1 de tipo salvaje (baja actividad lítica de las células NK) y Glu-HMGB1 (alta actividad lítica de las células NK)).
Además, las tres isoformas diferentes de HMGB1 muestran actividades distintas en la activación de las células NK. Se midió la secreción del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) por parte de las células NK-92 Cl tras su activación por estimulación con HMGB1. El Glu-HMGB1 estimuló de forma más potente la secreción de TNF-alfa y, por tanto, activó de forma más potente las células NK para que se convirtieran en aglutinantes y asesinas.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido de la caja 1 del grupo de alta movilidad (HMGB1), en el que en dicho polipéptido HMGB1 al menos uno, preferentemente dos, más preferentemente tres, lo más preferentemente los cuatro residuos de tirosina en las posiciones correspondientes a las posiciones de aminoácidos 22, 57, 68 y 75 de la SEQ ID NO: 1 han sido intercambiados por residuos de ácido glutámico o han sido intercambiados por residuos de glutamina.
2. El polipéptido HMGB1 de la reivindicación 1, en el que en dicho polipéptido HMGB1 al menos uno, preferentemente dos, más preferentemente tres, lo más preferentemente los cuatro residuos de tirosina en dichas posiciones se han intercambiado por residuos de ácido glutámico.
3. El polipéptido HMGB1 de la reivindicación 1, en el que en dicho polipéptido HMGB1 al menos uno, preferentemente dos, más preferentemente tres, lo más preferentemente los cuatro residuos de tirosina en dichas posiciones han sido intercambiados por residuos de glutamina.
4. El polipéptido HMGB1 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho polipéptido HMGB1 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70%, preferentemente al menos el 80%, más preferentemente al menos el 90%, incluso más preferentemente el 95%, lo más preferentemente al menos el 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 y/o comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70%, preferentemente al menos el 80%, más preferentemente al menos el 90%, incluso más preferentemente el 95%, lo más preferentemente al menos el 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3.
5. El polipéptido HMGB1 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho polipéptido HMGB1 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70%, preferentemente al menos el 80%, más preferentemente al menos el 90%, incluso más preferentemente el 95%, lo más preferentemente al menos el 98% de identidad de secuencia con al menos uno de los SEQ ID NO: 5 a 8, preferentemente SEQ ID NO: 6 u 8.
6. Un polinucleótido que codifica el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Un vector que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 6.
8. Una célula huésped que comprende el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 6 y/o el vector de acuerdo con la reivindicación 7.
9. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 6, el vector de acuerdo con la reivindicación 7, y/o la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 8 para su uso como medicamento.
10. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 6, el vector de acuerdo con la reivindicación 7, y/o la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 8 para su uso en el tratamiento del cáncer y/o en la modulación inmunológica.
11. El polipéptido, polinucleótido, vector y/o célula huésped para el uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho uso en el tratamiento del cáncer y en la modulación inmunitaria comprende la terapia inmunitaria celular contra el cáncer.
12. El polipéptido, polinucleótido, vector y/o célula huésped para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, en el que dicho uso en el tratamiento del cáncer y/o en la modulación inmunitaria comprende evitar la inducción de un evento adverso, preferentemente comprende evitar la inducción del síndrome de liberación de citoquinas (CRS).
13. Un kit que comprende el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 6, el vector de acuerdo con la reivindicación 7, y/o la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 8 en una carcasa.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108367049A (zh) 2015-12-11 2018-08-03 海德堡吕布莱希特-卡尔斯大学 Pkm2调节剂和hmgb1的组合制剂
WO2019173459A1 (en) * 2018-03-07 2019-09-12 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Compositions and methods for treating cancer
AU2019245243A1 (en) * 2018-03-29 2020-09-03 Genentech, Inc Modulating lactogenic activity in mammalian cells
WO2020084069A1 (en) 2018-10-24 2020-04-30 Enfin Gmbh Means and methods for determining metabolic adaptation
US10610280B1 (en) 2019-02-02 2020-04-07 Ayad K. M. Agha Surgical method and apparatus for destruction and removal of intraperitoneal, visceral, and subcutaneous fat

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6303321B1 (en) 1999-02-11 2001-10-16 North Shore-Long Island Jewish Research Institute Methods for diagnosing sepsis
ITMI20010562A1 (it) 2001-03-16 2002-09-16 Marco E Bianchi Inibitori o antagonisti della proteina hmg1 per il trattamento di disordini vascolari
US7304034B2 (en) 2001-05-15 2007-12-04 The Feinstein Institute For Medical Research Use of HMGB fragments as anti-inflammatory agents
DE60326453D1 (de) 2002-07-03 2009-04-16 Ct Cardiologico Monzino S P A Die verwendung von hmgb1 zur behandlung von gewebeverletzungen und/oder zur unterstützung der gewebewiederherstellung
JP2006506441A (ja) 2002-11-20 2006-02-23 ノース ショア−ロング アイランド ジュ−イッシュ リサ−チ インスティチュ−ト 免疫応答を増大させるためのｈｍｇｂポリペプチドの使用
BRPI0514835A (pt) * 2004-09-03 2008-06-24 Creabilis Therapeutics Spa variante de polipetìdeo de box de domìnio de ligação por alta afinidade de hmbg1 humano e/ou não humano ou de fragmento biologicamente ativo de box-a de hmgb1, molécula de ácido nucléico, uso, composição farmacêutica e dispositivo médico
KR20080011011A (ko) 2006-07-28 2008-01-31 주식회사 굿셀라이프 전구자연살해세포로부터 성숙자연살해세포로의 분화유도제
AU2007296843C1 (en) 2006-09-15 2012-08-16 Creabilis Therapeutics S.P.A. Polymer conjugates of Box-A of HMGB1 and Box-A variants of HMGB1
US20080103086A1 (en) 2006-10-25 2008-05-01 Jeon-Soo Shin Methods for the treatment of diseases associated with the secretion of hmgb1
US20110218176A1 (en) * 2006-11-01 2011-09-08 Barbara Brooke Jennings-Spring Compounds, methods, and treatments for abnormal signaling pathways for prenatal and postnatal development
WO2009025781A1 (en) * 2007-08-16 2009-02-26 Beth Israel Deaconess Medical Center Activators of pyruvate kinase m2 and methods of treating disease
CA2758071C (en) * 2009-04-06 2018-01-09 Agios Pharmaceuticals, Inc. Pyruvate kinase m2 modulators, therapeutic compositions and related methods of use
US20110123483A1 (en) * 2009-11-23 2011-05-26 Deutsches Krebsforschungszentrum Hmgb1 for cancer treatment
EP2365332B1 (en) 2010-03-10 2013-05-29 Institut Pasteur HMGB1 and anti-HMGB1 antibodies in HIV infected patients especially with neurological disorders
JP2015163592A (ja) * 2012-10-31 2015-09-10 アステラス製薬株式会社 抗癌剤の併用による癌治療方法
WO2014016417A1 (en) * 2012-07-26 2014-01-30 Ospedale San Raffaele Srl Hmgb1 variants and uses thereof
EP2821790A1 (en) 2013-07-04 2015-01-07 Universität Heidelberg Tumor energy metabolism profiling
EP3052523B1 (en) * 2013-10-01 2021-03-10 Medimmune Limited Methods of treating and diagnosing alpha-v-beta-6 overexpressing cancer
JP6508785B2 (ja) * 2013-10-25 2019-05-08 ファーマサイクリックス エルエルシー ブルトンチロシンキナーゼ阻害剤および免疫療法を使用する処置
GB201508337D0 (en) * 2015-05-15 2015-06-24 Hmgbiotech S R L Novel peptides
CN108367049A (zh) 2015-12-11 2018-08-03 海德堡吕布莱希特-卡尔斯大学 Pkm2调节剂和hmgb1的组合制剂

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Publication number Publication date
RU2018118985A (ru) 2020-01-13
EP3551649B1 (en) 2022-04-20
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US20200289560A1 (en) 2020-09-17
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