KR102181384B1 - 골수세포-1 상에 발현되는 촉발 수용체(ｔｒｅｍ－１) trem-유사 전사체 1(ｔｌｔ－１)로부터 유도되는 억제 펩타이드 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2 및 기능-보존 변이체로부터 선택된 적어도 6개의 연속 아미노산을 포함하는 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 아미노산 서열 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2 및 기능-보존 변이체로부터 선택된 적어도 6개의 연속 아미노산을 포함하는, 심혈관 질환의 치료를 위한 펩타이드에 관한 것이기도 하다.

Description

골수세포-1 상에 발현되는 촉발 수용체(ＴＲＥＭ－１) TREM-유사 전사체 1(ＴＬＴ－１)로부터 유도되는 억제 펩타이드 및 그의 용도{INHIBITING PEPTIDES DERIVED FROM TRIGGERING RECEPTOR EXPRESSED ON MYELOID CELLS-1 (TREM-1) TREM-LIKE TRANSCRIPT 1 (TLT-1) AND USES THEREOF}

본 발명은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2 및 기능-보존 변이체로부터 선택된 적어도 6개의 연속 아미노산을 포함하는 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 아미노산 서열 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2 및 기능-보존 변이체로부터 선택된 적어도 6개의 연속 아미노산을 포함하는 펩타이드의 심혈관 질환 치료 용도에 관한 것이기도 하다.

많은 질환 중에서도 심혈관 질환은 전세계적으로 주요한 사망 원인이 되는 질환이다.

심근경색 또는 뇌경색증은 위험하고 장애를 일으키는, 영구적이거나 일시적인 심근성 허혈로부터 야기되는 복잡한 임상 증후군의 일례이다. 이것은 대개 관상동맥/뇌동맥 폐색에 의해 야기되어, 산소 공급과 산소 수요 간의 불균형을 유발한다.

조직 손상은 허혈 기간에 따라 달라진다. 5분 정도의 짧은 허혈의 경우, 허혈 조직은 재관류 후, 경색 증상이나 치사에 이르는 결과 없이, 궁극적으로 회복된다. 그러나, 상당한 기간 허혈이 지속될 경우 경색증 및 염증 반응에 이르게 된다. 실제로, 경색증은 치유 및 상처 형성의 전제조건인 염증 반응과 연계되어 있다 [Entman M.L. 외, 1994 및 Mehta J.L. 외, 1999]. 이 반응은 허혈 조직이 재관류될 때 그 강도와 기간 측면에서 증강된다.

이 반응은 다단계이다: 초기 허혈은 괴사, 자유 래디칼 산소종의 형성, 보체 활성화 및 TNF-알파 방출에 의해 개시되는 시토카인 캐스캐이드를 유발한다. 경색부의 재관류 페이즈는 허혈 부위에서의 백혈구 동원(leukocyte recruitment)에 책임이 있는 증가 및 가속된 염증 반응과 연관이 있다. 동원된 백혈구들은 또한 인 시투(in situ) 및 염증성 매개자의 전신 방출에 참여하여, 경색증의 병생리학적 결과에 책임이 있는, 과활성화된 염증 상태를 일으킨다.

모든 염증성 매개자에는 모순적인 효과들이 있다. 실상, 경색과 관련한 병생리학은 그의 이로운 효과와 해로운 효과 간의 균형과 연관이 있다. 예를 들어, TNF-알파는 심근성 허혈이 일어나는 동안, 시점, 기간 및 그의 발현 수준 및 방출 수준에 따라 세포보호 효과와 유해한 효과를 모두 갖는다 [Harjot K Saini. 외, 2005]. 이것은 이러한 염증성 매개자의 차단에 기초한 치료법의 복잡성을 설명해줄 수 있다.

염증의 매개자(시토카인, 케모카인, ROS...)의 방출 및 대규모 백혈구 동원은 동맥 폐색에 의해 촉발되는 초기 손상 이벤트로부터 허혈후 조직 손상의 근간이 되는 후기 재생 과정에 이르기까지 허혈 캐스케이드의 전 단계에 걸쳐 중요한 역할을 한다. 이 염증성 반응을 표적으로 하는 많은 치료 전략이 어떠한 효능도 입증하지 못하였다. 이제 개별적인 허혈-유도된 염증 매개자에 대해서보다 증폭 루프를 표적으로 삼는 것이 더 가치 있을 것이라는 것이 분명해 보인다.

죽상동맥경화증은 서서히 진행되는 병변 형성 및 동맥 혈관의 협소화를 통해 뇌혈관 질환 및 관상동맥 질환을 야기한다. 플라크 파열 및 혈전증의 경우, 심혈관 질환의 가장 흔한 형태인 이들 증상은 급성 관상동맥 증후군(acute coronary syndrome: ACS), 심근경색 또는 뇌졸중으로서 발현된다. 인간 및 동물을 대상으로 한 연구 결과 죽상동맥경화증은 주로 내인적으로 변형된 구조, 특히 선천성 및 후천성 면역반응 양자 모두를 자극하는 산화된 지단백질에 응답하여 개시되는, 동맥 혈관벽 내의 만성 염증성 프로세스에 의해 발생되는 것으로 확립되었다. 선천적 반응은 혈관 세포 및 단핵구/대식세포 양자 모두의 활성화에 의해 실행되며, 그 후 후천성 면역반응이 항원-제시 세포에 의해 이펙터 T 림프구에 제시되는 잠재적 항원 어레이에 대해 발생한다 [Ait-Oufella H 외, 2011]. 유전적으로 변형된 마우스 모델을 대상으로 한 연구 결과, 순환하는 단핵구가 케모카인에 의해 혈관벽 내로 동원된 다음 대식세포 및 지질-로딩된 거품세포로 되는 것으로 밝혀졌다. 내막(intima) 대식세포들은 세포자멸사 축적 및 프로테아제 생산을 통한 플라크 탈안정화 및 염증 증폭, 시토카인 방출을 통하여 플라크 발달을 촉진한다 [Libby P. 2002].

단핵구/대식세포들은 PRRs(Pathogen Recognition Receptors의 약칭: 병원체 인식 수용체)과 상호반응하는 PAMPs(Pathogen Associated Molecular Patterns의 약칭: 병원체 관련 분자 패턴)라 명명된 몇몇 매개자들에 의해 자극된다. 몇몇 PRRs은 죽상동맥경화증의 병생리학에서 암시되어 왔다. 예를 들어, Toll-유사 수용체는 인간 및 동물의 죽상동맥경화성 병변에서 발현된다. TLR 억제는 마우스에 있어서 죽상동맥경화증의 발병을 감소시키는데 이는 이러한 경로를 표적화하는 것이 죽상동맥경화증 보호(atheroprotective)에 도움이 될 수 있음을 시사하는 것이다 [Bjorkbacka H 외, 2004].

최근, 골수세포 상에서 발현되는 수용체의 새로운 패밀리, 즉: 골수세포 상에 발현되는 촉발 수용체(Triggering Receptors Expressed on Myeloid cells (TREMs))가 보고된 바 있다. 이 패밀리들 중, TREM-1은 단핵구/대식세포 및 호중구에서 발현된다. TREM-1 활성화는 호중구의 급속한 탈과립화 및 산화적 폭발(oxidative burst)을 수반하여 시토카인과 케모카인의 생산을 유도한다(TNF-α, IL-6, IL-8, MCP-1 및 -3, MIP-1α...) [Radsak MP 외, 2004 및 Hara H, 외, 2009].

TREM-1 기능은 과도한 면역 반응을 촉발하기 위해 TLRs과의 협업에 의해 염증을 활성화/개시하는 것이라기 보다는 이를 조절/증폭시키기 위한 것이다. TREM-1의 병생리학적 역할은 감염성 질환에서 최초로 동정되었다. TREM-1은 급성(장간막 허혈-재관류, 출혈성 초크, 췌장염...) 및 만성(염증성 장질환, 류마티스성 질환) 양자 모두의 무균성 염증 동안 중대한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

TLT-1 (Trem-Like Transcript-1)은 TREM의 멤버이지만 메가카리오사이트(megakaryocytes)와 혈소판에서만 독점적으로 발견된다. TLT-1은 피브리노겐 결합 및 혈소판 응집체의 안정화에 의해 혈소판 응집 동안 어떤 역할을 하는 것으로 처음 동정되었다. 그러나 TLT-1, 가용성 TLT-1 및 sTLT-1-유도된 폴리펩타이드들에 대한 본 발명자들의 실험실 연구 결과, TLT-1이 TREM-1을 특이적으로 억제함으로써 염증이 일어나는 동안 어떤 역할을 한다는 것이 새롭게 밝혀졌다 [Derive M 외, 2012, WO2010/124685].

Washington 등은 TLT-1이 혈관 손상 부위에서의 혈소판 응집을 용이하게 함으로써 염증이 일어나는 동안 보호 역할을 하는 것으로 설명한 바 있다(Washington 외 J Clin Invest. 2009).

혈소판 응집은 심혈관 질환의 경과 중 최악의 결과와 관련된 것이므로 (예컨대 심근경색 및 죽상동맥경화증), TLT-1-유도된 펩타이드들이 심혈관 질환에 치료 효과를 나타낸다는 것은 매우 놀라운 발견이었다.

본 발명자들은 본 명세서를 통해 TREM-1이 1) 대동맥, 장간막 동맥(mesenteric artery) 및 미세혈관 세포로부터의 내피 세포에 의해 발현되고, 2) 심근 조직에 의해 발현되며 그의 발현이 심근성 허혈(영구적 심근성 허혈 및 일시적 심근성 허혈)에 이어 경색부에서 상향조절된다는 것, 그리고 3) 죽상판 내로 동원된 대식세포에 의해 발현된다는 것을 설명한다.

본 발명자들은 또한 TREM-1 및 TLT-1-유도된 펩타이드들이 양자 모두 심근경색과 죽상동맥경화증에 있어서, TREM-1을 특이적으로 억제하고, TREM-1 연관된 염증 반응을 감소시킬 수 있음도 보여준다.

그 결과, 심근 허혈의 2 가지 서로 다른 모델(영구적 허혈 및 일시적 허혈)의 급성 페이즈 동안 이들 펩타이드들을 투여한 것이 인 시투 염증 반응의 조절 및 뒤따르는 백혈구 트래피킹(trafficking)에 책임이 있고, 그에 따라 허혈후 심장 재형성 및 질병 진행의 후기 단계를 한정하였다. 실제로, 심장 기능은 일시적 허혈(허혈-재관류) 이벤트는 물론 영구적 허혈의 경우에도 6주일 후 극적으로 향상되었다. 이것은 생존능 증가로 이어진다.

본 발명자들은 마지막으로 TREM-1의 특이적 억제에 의해 죽상판 형성의 확장을 저감시키는데 있어서의 TREM-1 및 TLT-1-유도된 펩타이드들의 역할을 입증하였다.

따라서, 본 발명은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2 및 기능-보존 변이체로부터 선택된 적어도 6개의 연속 아미노산을 포함하는 펩타이드에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 심혈관 질환 치료에 사용되기 위한, 본 발명에 따른 아미노산 서열 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2 및 기능-보존 변이체로부터 선택된 적어도 6개의 연속 아미노산을 포함하는 펩타이드 또는 분리된 핵산, 발현 벡터, 숙주 세포에 관한 것이기도 하다.

발명의 개요

본 발명의 한 가지 목적은 펩타이드의 심혈관 치료에 사용되기 위한, 아미노산 서열 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2 및 기능-보존 변이체로부터 선택된 적어도 6개의 연속 아미노산을 포함하는 펩타이드를 제공하는 것이다.

일 구체예에서, 상기 펩타이드는 심혈관 질환의 치료에 사용되기 위한, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12로 이루어진 군으로부터 선택된 6개의 연속 아미노산 서열을 포함하는 것이다.

일 구체예에서, 심혈관 질환은 심근경색증이다.

또 다른 구체예에서, 심혈관 질환 죽상동맥경화증이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2 및 기능-보존 변이체로부터 선택된 적어도 6개의 연속 아미노산을 포함하는 펩타이드이다.

일 구체예에서, 상기 펩타이드는 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 6개의 연속 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 상기 펩타이드는 SEQ ID NO: 8 또는 SEQ ID NO: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 상기 펩타이드는 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12에 제시된 아미노산 서열로 구성된다.

본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같은 펩타이드를 코딩하는 분리된 핵산 서열이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같은 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.

본 발명의 또 다른 목적은 적어도 1종의 전술한 바와 같은 펩타이드, 전술한 바와 같은 핵산 또는 전술한 바와 같은 발현 벡터 또는 전술한 바와 같은 숙주 세포의 치료적 유효량 및 적어도 1종의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 의약 조성물이다.

발명의 상세한 설명

정의

명세서 전반에 걸쳐, 몇몇 용어들이 사용되었으며, 하기 문단에 그에 관하여 정의하였다.

본 발명에서, "TREM-유사 전사체 1"에 상응하는 "TLT-1"이라는 용어는 TREM 패밀리의 일원이다. Mcvicar 그룹의 초기 연구 결과 [Washington A.V. 외, 2004] TLT-1은 풍부하고, 혈소판 및 메가카리오사이트 계통에 특이적이며, 혈소판 α입자 내에 격리되어 있는 것으로 입증되었다. 트롬빈이나 LPS에 의한 혈소판 활성화시, TLT-1은 혈소판 표면으로 전좌된다. TLT-1은 v-set Ig 타입-세포외 도메인, 막관통 영역 및 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프(ITIM: immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) 및 폴리프롤린이 풍부한 도메인을 포함하는 세포질 테일을 포함한다. 다른 TREM 패밀리 멤버와 달리, TLT-1은 DAP 12 활성화 사슬과 커플링하지 않는 반면 래트의 호염기성 백혈병(RBL) 세포 내 Ca⁺⁺ 시그널링을 증강시키는 것으로 나타났는데, 이는 TLT-1이 보조-활성화 수용체(co-activating receptor)임을 시사하는 것이다. TLT-1의 아미노산 서열은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 1로 설명된다.

본 명세서에서, "골수세포 1 상에 발현되는 촉발 수용체 (Triggering receptor expressed on myeloid cells 1)"에 상응하는 "TREM-1"이라는 용어는 인간과 쥐의 다형핵 호중구 및 성숙한 단핵구 양자 모두에서 동정된 세포-표면 분자를 가리킨다. 이것은 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하며 DAP12라 칭해지는 어댑터 단백질의 도움을 받아 하향 시그널링 경로를 활성화시킨다. TREM-1의 발현은 감염된 환자로부터의 조직 샘플과 세포 배양체 양자 모두에서 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 같은 세균 존재 하에 호중구 및 단핵구에서 크게 상향조절된다. 이와는 크게 대조적으로, TREM-1은 건선, 궤양성대장염, 맥관염과 같이 면역 복합체에 의해 야기되는 비감염성 염증 질환 환자로부터의 샘플에서는 상향조절되지 않는다. 뿐만 아니라, TREM-1이 그의 리간드에 결합하면, TNF-α와 같은 전염증성 시토카인의 증폭된 합성과 LPS의 상승 효과가 IL-10 생성 억제와 함께 관찰된다. TREM-1의 아미노산 서열은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2로서 설명된다.

TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드라고도 칭해지는 본 발명의 펩타이드들을 하기 표 1에 나타내었다.

본 명세서에서, "기능-보존 변이체(Function-conservative variants)"라는 용어는 단백질 또는 효소 중 주어진 어떤 아미노산 잔기가 펩타이드의 전반적인 배열과 기능을 변경시킴이 없이 대체된 것인 본 발명의 펩타이드로부터 유도된 펩타이드들을 가리키는데, 그 비제한적인 예로는, 어떤 아미노산이 그것과 유사한 특성 (예컨대 극성, 수소결합 전위, 산성, 염기성, 소수성, 방향성 등)을 갖는 다른 아미노산으로 대체되는 것을 들 수 있다. 어떤 단백질에서 보존된 것으로 표시된 것 이외의 다른 아미노산들은 다를 수 있으므로 유사한 기능을 갖는 2종의 단백질들 간의 단백질 또는 아미노산 서열의 백분율 유사성 역시 달라질 수 있으며 예컨대, 유사성이 MEGALIGN 알고리듬에 기반하는 Cluster 방식과 같은 정렬법에 따라 결정시 70% 내지 99%일 수 있다. "기능-보존 변이체"에는 또한 BLAST 또는 FASTA 알고리듬에 의해 결정시 그것과 비교되는 천연 또는 모(母) 단백질과 적어도 20% 아미노산 동일성, 좋기로는 40%, 더욱 좋기로는 60%, 더욱 좋기로는 적어도 75%, 가장 좋기로는 적어도 85% 및 더더욱 좋기로는 적어도 90%의 동일성을 갖고, 그와 동일하거나 실제로 유사한 특성 또는 기능을 갖는 펩타이드도 포함된다.

본 명세서에서, "유도체(derivative)"라는 표현은 시험관내 또는 생체내에서 당해 펩타이드의 배열, 활성, 특이성, 효능 또는 안전성을 변형시키기 위해, 당해 펩타이드에 대한 여하한 종류의 분자의 공유 부착, 그 서열의 여하한 아미노산 중 화학적 화합물의 부가에 의해 변형된 본 발명의 펩타이드 변이체 또는 그의 기능-보정 변이체를 지칭하는 것이다.

본 명세서에서, "치료/처리하다(treating)" 또는 "치료/처리(treatment)"라는 용어는, 이 용어가 적용되는 질환 또는 상태 또는 이러한 질환이나 상태의 한 가지 이상의 증상의 진행을 보류, 완화, 억제시키거나 또는 예방하는 것을 가리킨다.

본 발명에 따라 "약학적으로" 또는 "약학적으로 허용가능한" 이라는 용어는 포유동물 특히 인간에게 투여된 경우 유해하거나, 알레르기를 유발하거나 또는 기타 바람직하지 못한 반응을 일으킴이 없이 적절히 투여되리 수 있는 물질 및 조성물과 관련하여 사용된다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제라 함은 비독성의 고체, 반고체 또는 액상 충전제, 희석제, 캡슐화 재료 또는 여하한 타입의 포뮬레이션 보조제를 가리킨다.

본 발명에 따라, "환자" 또는 치료될 "개체"라는 표현은 염증 질환에 걸리거나 걸릴 가능성이 있는 인간 또는 비인간 동물 (예컨대 설치류(마우스, 래트)), 고양이, 개 또는 영장류)을 가리킨다. 좋기로는 상기 대상자는 인간인 것이 바람직하다.

본 발명의 펩타이드

본 발명의 제1 측면은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2 및 기능-보존 변이체로부터 선택된 적어도 6개의 연속 아미노산을 포함하는 펩타이드에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 1 및 기능-보존 변이체로부터 선택된 적어도 6개의 연속 아미노산을 포함하는 펩타이드에 관한 것이다.

일 구체예에서, 상기 펩타이드는 SEQ ID NO: 1이 아니다.

일 구체예에서, 상기 펩타이드는 SEQ ID NO: 2가 아니다.

일 구체예에서, 펩타이드는 그 길이가 50 아미노산 미만, 40 아미노산 미만, 35, 30, 25, 20 아미노산 미만인 것이다.

바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 펩타이드는 길이가 6 내지 20 아미노산이거나 또는 10 내지 20 아미노산, 또는 12 내지 18 아미노산 또는 14 내지 16개 아미노산이다.

바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 펩타이드는 길이가 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 펩타이드는 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 6개의 연속 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 펩타이드는 SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 펩타이드는 SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 펩타이드는 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 펩타이드는 D- 또는 L-배열을 가질 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 펩타이드의 아미노 말단으로부터의 아미노산은 아실화된 말단 아미노기를 가지며, 카르복실 말단으로부터의 아미노산은 아미드화된 말단 카르복시기를 갖는다. 따라서, 본 발명은 아미노-말단이 아실화되고 카르복시-말단은 아미드화된 본 발명의 펩타이드의 유도체도 포함한다.

이에 더해, 본 발명에 따른 펩타이드는 그의 생체이용성(안정성 및 지용성(fat solubility)를 포함한다)과 혈관-뇌 장벽 및 상피조직을 통과하는 그의 능력을 증가시키기 위해, 가역적인 화학 변형을 거칠 수 있다. 이러한 가역적인 화학 변형의 예로는 글루탐 및 아스파르트 아미노산의 카르복시기를 알코올에 의해 에스테르화시킴으로써 아미노산의 음전하를 제거하여 그의 소수성을 증가시키는 것을 들 수 있다. 이 에스테르화는 가역적인데, 이는 형성된 에스테르 링크가 이것을 가수분해하는 세포내 에스테라제에 의해 인식되어, 아스파르트 잔기와 글루탐 잔기에 전하를 저장하기 때문이다. 순(net) 효과는 세포내 펩타이드의 축적인데, 이는 내면화된, 탈-에스테르화 펩타이드는 세포막을 통과할 수 없기 때문이다.

이러한 가역적 화학 변형의 또 다른 예로는 TAT 펩타이드 또는 페네트라틴(Penetratin) 펩타이드와 같이, 막 투과성을 증가시켜주는, 추가적인 펩타이드 서열의 부가를 들 수 있다 (참조: Charge-Dependent Translocation of the Trojan. A Molecular View on the Interaction of the Trojan Peptide Penetratin with the 15 Polar Interface of Lipid Bilayers. Biophysical Journal, Volume 87, Issue 1, 1 July 2004, Pages 332-343).

본 발명에 따른 펩타이드는 고상 화학 펩타이드 합성 Fmoc 및/또는 Boc-기반 20 방법론에 따라 고상 화학 펩타이드 합성의 통상적인 방법을 통해 수득 될 수도 있다(참조: Pennington, M.W. 및 Dunn, B.N. (1994). Peptide synthesis protocols. Humana Press, Totowa.).

별법으로, 본 발명에 따른 펩타이드는 재조합 DNA 기술, 예컨대, 간략히 설명하면 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 적절한 플라스미드 또는 벡터에 삽입하고, 상기 플라스미드 또는 벡터로 적격 세포(compenent cells)를 형질전환시켜, 상기 세포를 본 발명의 펩타이드가 발현될 수 있는 조건 하에서 성장시키고, 필요한 경우, 본 발명이 속한 기술 분야의 전문가에게 잘 알려진 통상적인 수단을 통하여 본 발명의 펩타이드를 분리 및 (임의로) 정제하는 것을 포함하는 방법에 의해 수득될 수도 있다. 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 아미노산과 그러한 아미노산을 코딩하는 뉴클레오타이드 코돈 간에 존재하는 상응성으로부터 쉽게 유추될 수 있다. 이 경우, 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 분리된 핵산 서열이다. 특정한 일 구체예에서, 상기 핵산은 단일-가닥 DNA, 이중-가닥 DNA, 및 RNA로부터 선택된다. 본 발명의 부가적인 목적은 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 상기 핵산 서열을 함유하는 플라스미드 및 발현 벡터 및 본 발명의 펩타이드를 발현하는 원핵세포 또는 진핵세포이다. 재조합 DNA 기술의 원리에 관한 고찰은 예컨대 "Principles of Gene Manipulation: An 5 Introduction to Genetic Engineering," R.W. Old & S.B. Primrose, published by Blackwell Scientific Publications, 4th Edition (1989)라는 교과서에서 찾아볼 수 있다.

설명된 바와 같이, 본 발명은 또한 본 발명의 펩타이드 또는 "기능-보존 변이체"와 기능적으로 균등한 펩타이드도 포함한다. 이 설명에 사용된 의미로, "기능적으로 균등한(functionally equivalent)"라는 표현은 문제의 펩타이드가 예컨대 염증 감소능과 같은 본 발명의 펩타이드의 생물학적 활성을 적어도 한 가지 갖는다.

본 발명의 펩타이드의 효과는 당업자가 펩타이드로 인한 심혈관 질환에서 염증 감소를 평가하는 간단한 테스트를 실시함으로써 명백히 이해될 것이다. 예를 들어, 5x10⁵개의 분리된 인간 호중구 또는 대식세포 또는 내피 세포들을 37℃ / 5 % CO₂에서 24 시간 동안 20 ㎍/mL의 폴리펩타이드의 존재 또는 부재 하에 100 ng/mL LPS 및/또는 10 ㎍/mL 항-TREM-1 mAb의 존재 하에 인큐베이션시킨다. 이어서 상등액을 수집하고 TNF-α, IL-6 및 GM-CSF 농도를 ELISA에 의해 측정한다. 만일 연구된 펩타이드가 TREM-1을 억제하면, 시토카인 농도는 그 펩타이드가 없는 조건에 비해, 30% 이상 감소될 것이다.

본 발명의 핵산, 벡터 및 재조합 숙주 세포

본 발명의 두 번째 측면은 본 발명에 따른 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.

바람직한 일 구체예에서, 본 발명은 서열 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12를 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.

"코딩 서열" 또는 RNA, 펩타이드, 단백질 또는 효소와 같은 발현 산물을 "인코딩"하는 서열은, 발현될 경우 그 RNA, 펩타이드, 단백질 또는 효소의 생산을 야기하는 뉴클레오타이드 서열, 즉 그 RNA, 펩타이드, 단백질 또는 효소에 대한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이다. 어떤 단백질에 대한 코딩 서열은 개시 코돈(대개 ATG) 및 종결 코돈을 포함할 수 있다.

이들 핵산 분자들은 통상의 기술자에게 잘 알려진 상법, 특히 천연 단백질을 코딩하는 유전자의 위치-지향된 돌연변이에 의해 수득가능하다. 일반적으로, 상기 핵산은 플라스미드, 코스미드, 에피좀, 인공 염색체, 파지 또는 바이러스 벡터와 같은 적절한 벡터 내에 포함될 수 있는 DNA 또는 RNA 분자이다.

따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 핵산 분자가, 전사 및 필요에 따라 번역을 조절하는데 적합한 요소들 (특히 프로모터, 인핸서 및 임의로 터미네이터)와 연계되어 있는 벡터 및 발현 카세트, 및 본 발명에 따른 핵산 분자가 삽입되어 있는 재조합 벡터에 관한 것이다. 이들 재조합 벡터들은 예를 들어 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있다.

"벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"라는 용어는 숙주 세포 내로 DNA 또는 RNA 서열 (예컨대 외래 유전자)를 도입하여, 그 숙주를 형질전환시켜 도입된 서열의 발현 (예컨대 전사 및 번역)을 촉진할 수 있는 비히클을 의미한다.

본 발명의 펩타이드 또는 키메라 유도체를 코딩하는 유전자가 삽입 및 발현될 수만 있다면, 여하한 동물 세포용 발현 벡터든 이용가능하다. 적절한 벡터의 예로는 pAGE107, pAGE103, pHSG274, pKCR, pSG1 베타 d2-4 등을 들 수 있다.

플라스미드의 또 다른 예로는 복제 원점을 포함하는 복제 플라스미드, 예컨대 pUC, pcDNA, pBR 등과 같은 통합(integrative) 플라스미드를 들 수 있다.

바이러스 벡터의 다른 예로는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스 및 AAV 벡터를 들 수 있다. 이러한 재조합 바이러스는 헬퍼 플라스미드 또는 30 바이러스에 의해 일시적으로 형질감염(transfection) 되거나 또는 패키징 세포의 형질감염에 의한 것과 같은 공지 기술에 의해 생성될 수 있다. 바이러스 패키징 세포의 전형적인 예로는 PA317 세포, PsiCRIP 세포, GPenv+ 세포, 293 세포 등을 들 수 있다. 이러한 복제-결손 재조합 바이러스를 생산하기 위한 상세 프로토콜은 예컨대 WO 95/14785, WO 96/22378, US 5,882,877, US 6,013,516, US 4,861,719, US 5,278,056 및 WO 94/19478에서 찾아볼 수 있다.

동물 세포용 발현 벡터에 사용되는 프로모터와 인핸서의 예로는 SV40의 조기 프로모터와 인핸서 (Mizukami T. 외 1987), 멀로니(Moloney) 마우스 백혈병 바이러스의 LTR 프로모터 및 인핸서 (Kuwana Y 외 1987), 면역글로불린 H 사슬 등의 프로모터(Mason JO 외 1985) 및 인핸서(Gillies SD 외 1983)를 들 수 있다.

본 발명은 또한 생체내 또는 생체외에서 유전자 치료법에 사용가능한, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 유전자 전달 시스템을 포함한다. 이것은 예를 들어, 유전자 치료 분야에서 통상적으로 사용되는 것들인 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 렌티바이러스로부터 유도된 것들과 같은 바이러스 전달 벡터를 포함한다. 이것은 또한 본 발명의 핵산 분자 및 비바이러스 유전자 전달 비히클을 포함하는 유전자 전달 시스템도 포함한다. 비바이러스 유전자 전달 비히클의 예로는 리포좀 및 폴리머 예컨대 폴리에틸렌이민, 시클로덱스트린, 히스티딘/라이신(HK) 폴리머 등을 들 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 적어도 1종의 핵산 분자에 의해 유전적으로 형질전환된 원핵 또는 진핵 숙주 세포이다.

"형질전환(transformation)"이라는 용어는 숙주 세포 내로 "외래" (즉, 외인성 또는 세포외의) 유전자, DNA 또는 RNA 서열을 도입함으로써, 그 숙주 세포가 상기 도입된 유전자 또는 서열을 발현시켜 목적하는 물질, 전형적으로는 상기 도입된 유전자 또는 서열에 의해 코딩되는 단백질이나 효소를 생산하는 것을 의미한다. 도입된 DNA 또는 RNA를 수용하여 발현하는 숙주 세포는 "형질전환된" 것이다.

좋기로는, 펩타이드, 특히 본 발명에 따른 펩타이드를 발현 및 생산하기 위해, 진핵세포, 특히 포유동물 세포, 및 더욱 특히는 인간 세포가 선택되는 것이 바람직하다.

일반적으로, 당해 유도체의 올바른 번역후 변형을 진행시키는 능력을 감안하여 CHO, BHK-21, COS-7, C127, PER.C6 또는 HEK293 25와 같은 세포주들이 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 발현 벡터의 구축, 숙주 세포의 형질전환은 통상적인 분자 생물학 기술을 이용함으로써 수행가능하다. 본 발명의 V-ATPase c-서브유닛 유도체는 예컨대, 본 발명에 따라 유전학적으로 형질전환된 세포들을 배양하여, 상기 세포에 의해 발현된 유도체를 배양체로부터 회수함으로써, 30 수득될 수 있다. 이들은 이어서, 필요한 경우, 분할 침전, 특히 암모늄 설페이트 침전, 전기영동, 겔여과, 친화도 크로마토그래피 등과 같이 통상의 기술자에게 잘 알려진 통상적인 방법에 의해 정제될 수 있다.

특히, 재조합 단백질을 제조 및 정제하기 위한 통상적인 방법을 본 발명에 따른 단백질 제조시 이용할 수 있다.

치료 방법, 용도 및 의약 조성물

본 발명의 세 번째 목적은 본 발명에 따른 펩타이드의 심혈관 질환 치료용 용도에 관한 것이다.

본 발명의 한 가지 목적은 심혈관 질환의 치료를 필요로 하는 대상자에게 전술한 펩타이드의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 심혈관 질환의 치료 방법이다. 일 구체예에서, 상기 방법은 전술한 펩타이드를 투여하는 것을 포함하는데 여기서 상기 펩타이드는 TREM-1을 억제하는 것이다.

본 발명에 따른 심혈관 질환으로는 심근경색 및 뇌경색증, 급성 심근경색, 허혈, 관상심장 질환, 급성 관상동맥 증후군, 뇌졸중, 동맥류, 안정형 또는 운동형 협심증, 심근병증, 고혈압성 심장질환, 심부전(만성 및 급성), 폐심장증, 부정맥, 염증성 심장 질환 예컨대 심장내막염, 심근염, 말초동맥 질환, SIRS-관련된 심근장애 및 맥관장애, 죽상동맥경화증을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

일 구체예에서, 심혈관 질환 상태는 심근경색이다.

또 다른 구체예에서, 심혈관 질환 상태는 동맥경화이다.

또 다른 구체예에서, 심혈관 질환 상태는 SIRS-관련된 심근장애 및 혈관장애이다.

일 구체예에서, 심혈관 질환은 장간막 허혈 재관류가 아니다.

또 다른 구체예에서, 심혈관 질환은 복합균성 패혈증이 일어나는 동안 심혈관 보호를 포함하지 않는다.

일 구체예에서, 본 발명의 펩타이드는 패혈증을 치료하는데 이용되지 않는다.

일 구체예에서, 본 발명의 펩타이드는 허혈 및 재관류 증후군을 치료하는데 이용되지 않는다.

일 구체예에서, 본 발명의 펩타이드는 과응집(hypercoagulatory) 상태의 환자를 치료하는데 이용되지 않는다.

일 구체예에서, 본 발명의 펩타이드는 염증-관련 출혈을 치료하는데 이용되지 않는다.

일 구체예에서, 본 발명의 펩타이드는 급성 바이러스성 심근염을 치료하는데 이용되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 펩타이드는 심근경색 및 뇌경색, 심근성 허혈, 관상심장 질환, 뇌졸중, 안정형 또는 운동형 협심증, 심근병증, 고혈압성 심장 질환, 심부전(만성 및 급성), 폐심장증, 부정맥, 염증성 심장 질환 예컨대 심장내막염, 심근염, 말초동맥 질환, SIRS-관련 심근장애 및 혈관장애, 및 죽상동맥경화증을 치료하는데 이용된다.

특정 구체예에서, 본 발명은 심혈관 질환 치료에 이용가능한, 아미노산 서열 SEQ ID NO 2 및 기능-보존 변이체로부터 선택된 적어도 6개의 연속 아미노산을 포함하는 펩타이드 또는 아미노산 서열 SEQ ID NO 1 및 기능-보존 변이체로부터 선택된 적어도 6개의 아미노산을 포함하는 펩타이드에 관한 것이다.

특정 구체예에서, 본 발명은 심혈관 질환 치료에 이용가능한, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 펩타이드에 관한 것이다.

일 구체예에서, 본 발명은 또한 심혈관 질환 치료에 이용가능한, 본 발명에 따른 분리된 핵산 또는 본 발명에 따른 플라스미드 또는 본 발명에 따른 발현 벡터 또는 본 발명에 따른 숙주 세포에 관한 것이기도 하다.

본 발명에 따른 펩타이드는 그의 디코이(decoy) 수용체의 특성을 통해 염증 상태를 치료할 수 있다.

"디코이 수용체(decoy receptor)"라 함은 본 발명에 따른 폴리펩타이드들(TREM-1 및 TLT-1-유도된 펩타이드들)이 TREM-1 리간드를 포집하여 TREM-1 상에서의 그의 생리 효과를 예방하는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 펩타이드들은 따라서 심혈관 질환을 보다 효과적으로 중단시킨다는 목적에 따라 복합 치료법(몇 가지 치료 표적을 갖는다)의 일부를 형성할 수 있다.

본 발명의 부가적인 목적은 적어도 1종의 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께, 본 발명에 따른 적어도 1종의 펩타이드의 치료적 유효량을 포함하는 의약 조성물이다. 특정한 일 구체예에서, 상기 의약 조성물은 또한 1 이상의 (COOH) 펩타이드를 함유하기도 한다. 별법으로, 본 발명의 의약 조성물은 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 이와 함께 적하나의 아쥬반트 및/또는 약학적으로 허용가능한 부형제를 함유하는 벡터의 치료적 유효량을 포함할 수 있다. 상기 벡터는 유전자 치료에 사용될 수 있다.

"치료적 유효량"이라는 표현은 여하한 의학적 치료에 있어서 합리적인 이익/위험 비율로 심혈관 질환을 치료하기 위한 본 발명의 키메라 유도체의 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 화합물 및 조성물의 총 일일 투여량은 건전한 의학적 판단 범위 내에서 담당의의 재량에 따라 결정될 것이다. 특정 환자에 대한 특정한 치료적 유효 투여량은 치료하고자 하는 질환과 그 질환의 위중도; 사용된 특정 화합물의 활성; 사용된 특정 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별, 환자의 식이; 투여 기간, 투여 경로, 사용된 특정 화합물의 배설률; 치료 기간; 사용된 특정 펩타이드와 조합되거나 동시 사용되는 약물; 등 의료 분야에 잘 알려진 인자들을 비롯한 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 이 기술분야에는 화합물의 투여량을 소망되는 치료 효과가 달성되는데 필요한 수준 미만의 투여량으로부터 시작하여 이를 차츰 증가시켜 소망되는 효과가 달성되는 투여량까지 증가시켜 투여하는 방식이 잘 알려져 있다. 그러나, 생성물의 일일 투여량은 성인 1일 당0.01 내지 1,000 mg의 범위로 매우 다양할 수 있다. 좋기로는 조성물이 치료하고자 하는 환자에게 투여량을 증상에 따라 조정할 수 있도록 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100, 250 및 500 mg의 활성 성분을 함유하는 것이 바람직하다. 의약은 일반적으로 약 0.01 mg 내지 약 500 mg의 활성 성분, 좋기로는 1 mg 내지 약 100 mg의 활성 성분을 함유하는 것이 바람직하다. 약물의 유효량은 보통 1일 0.0002 mg/kg 내지 약 20 mg/kg 체중, 특히 1일 약 0.001 mg/kg 내지 7 mg/kg 체중의 투여량 수준으로 공급된다.

본 발명의 활성 산물(펩타이드, 핵산, 플라스미드, 발현 벡터 또는 숙주 세포)은 심혈관 질환 치료에 사용되기 위해 투여될 수 있다.

투여되어야 하는 본 발명의 활성 산물[펩타이드 또는 벡터(구조물)]의 치료적 유효량 및, 본 발명의 펩타이드 및/또는 의약 조성물에 의한 질병 상태의 치료를 위한 투여량은, 환자의 연령 및 상태, 장애 또는 질병의 위중도, 투여방법 및 투여빈도, 및 사용될 특정 펩타이드를 비롯한 많은 인자에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 펩타이드 또는 벡터(구조물)을 함유하는 의약 조성물의 제공은 투여에 적합한 여하한 형태, 예컨대 고체, 액체 또는 반고체 예를 들어 크림, 연고, 겔 또는 용액제의 여하한 형태일 수 있으며, 이들 조성물들은 여하한 적절한 수단, 예컨대 경구, 비경구, 흡입 또는 국소 방식으로 투여될 수 있으며, 이들은 바람직한 투여 형태를 구성하는데 필요한 약학적으로 허용가능한 부형제도 포함할 것이다. 예컨대 문헌 ["Tratado de Farmacia Gal nica" (Treatise on Galenic Pharmacy), C. FauliTrillo, 1993, Luz n 5, S.A. Ediciones, Madrid]에는 의약 투여를 위한 상이한 의약 제형들 및 이를 수득하는데 필요한 부형제들에 관한 리뷰가 실려있다.

경구, 설하, 피하, 근육내, 정맥내, 피내, 국소, 폐 또는 직장 투여를 위한 본 발명의 의약 조성물에 있어서, 활성 성분은 단독으로 또는 다른 활성 성분과 조합적으로 동물 및 인간에게, 통상적인 제약 보조제와 함께 혼합물로서 단위 투여 제형으로서 투여될 수 있다. 적절한 단위 투여 제형은 정제, 겔 캡슐, 분말, 과립 및 경구용 현탁액 또는 용액, 설하 및 구강(buccal) 투여 제형, 에어로졸, 임플란트, 피하(subcutaneous), 경피(transdermal), 국소, 복강내, 근육내, 정맥내, 피하(subdermal), 경피 경막내 및 경비 투여 형태 및 직장 투여 형태를 포함한다.

좋기로는, 의약 조성물은 주사될 수 있는 포뮬레이션에 있어서 약학적으로 허용가능한 비히클을 함유한다. 이들은 특히 등장성의 멸균 식염수 용액 (모노소듐 또는 다이소듐 포스페이트, 소듐, 포타슘, 칼슘 또는 마그네슘 클로라이드 등 또는 이들 염들의 혼합물), 또는 경우에 따라, 멸균수 또는 생리식염수 첨가시, 주사가능한 용액을 구성하는 건조, 특히 동결건조되니 조성물일 수 있다.

주사용으로 적합한 의약 형태는 멸균수용액 또는 현탁액; 참기름, 낙화생유 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 포뮬레이션; 및 주사용 멸균 용액 또는 분산액의 즉석 조제용 멸균분말을 포함한다. 모든 경우에 있어서, 제형은 멸균성이어야 하고 용이한 시린지이용성(syringability)이 얻어질 수 있는 정도로 유체여야 한다. 이것은 제조 및 보관 조건 하에 안정하여야 하고 세균이나 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해서도 안전히 보존되어야 한다.

본 발명의 화합물을 유리 염기 또는 약학적으로 허용가능한 염으로서 포함하는 용액을 히드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 물을 적절히 혼합하여 조제할 수 있다. 분산액 역시 글리세롤, 액상 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 및 오일 중에 조제할 수 있다. 일상적인 보관 및 사용 조건 하에서, 이 조제물들은 미생물의 성장을 방지하는 보존제를 함유한다.

본 발명에 따른 펩타이드들은 중성 또는 염 형태의 조성물로 조성될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염에는 산부가염(단백질의 유리 아미노기와 함께 형성됨)이 포함되며 이들은 예를 들어 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산에 의해 형성된다. 유리 카르복실기와 함께 형성되는 염들은 또한 예를 들어 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘 또는 수산화철(ferric hydroxides)와 같은 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래될 수 있다.

캐리어는 또한 예컨대 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적절한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 분산 매질 또는 용매일 수 있다. 적절한 유동성은 예컨대, 레시틴과 같은 코팅을 사용하거나, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기를 유지하는 것, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용을 예방하는 것은 다양한 항균제 및 항진균제를 이용함으로써 달성가능한데 이들의 예로는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등을 들 수 있다. 많은 경우, 예컨대 슈가 또는 염화나트륨과 같은 등장화제를 포함하는 것이 바람직하다. 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수지연제를 조성물에 사용함으로써 주사가능한 조성물의 흡수기간을 연장시킬 수 있다.

멸균 주사용액은 적절한 용매 중에 필요량의 활성 펩타이드를 필요에 따라 전술한 몇몇 기타 성분들과 함께 혼입시킨 다음, 멸균 여과함으로써 조제한다. 일반적으로, 분산액은 멸균된 다양한 활성 성분들을 기초분산 매질과 전술한 몇가지 필요 성분들을 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시켜 조제한다. 멸균 주사용액의 조제를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 조제방법은 진공-건조 및 동결-건조 기술인데, 이 기술들에 의해 앞서 그의 멸균-여과된 용액으로부터 여하한 부가적인 바람직한 성분 플러스 활성 성분의 분말이 얻어진다.

조성 후, 용액을 당해 투여 포뮬레이션에 적합한 방식 및 치료적으로 유효한 양으로 투여한다. 포뮬레이션은 전술한 바와 같은 주사용액의 종류와 같은 다양한 투여 제형으로 투여되는 것이 용이하지만, 약물 방출 캡슐 등의 제형도 사용가능하다.

예를 들어 수용액 중 비경구 투여시, 당해 용액은 필요에 따라 적절히 완충시켜야 하며 충분한 염수 또는 글루코스를 이용하여 액상 희석제를 먼저 등장성으로 만든다. 이들 특수한 수용액들은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 적합하다. 이 경우, 사용가능한 멸균 수성 매질은 본 발명의 출원 당시 통상의 기술자에게 잘 알려진 것들일 수 있다. 예를 들어, 일회 투여량을 1 ml의 등장성 NaCl 용액에 용해시켜 1000 ml의 피하주입(hypodermoclysis) 유액에 첨가하거나 또는 제안된 주입 위치에서 주사할 수 있다. 치료 대상자의 상태에 따라 어느 정도의 투여량 변화는 불가피할 수 있다. 어느 경우든 투여 책임자가 당해 대상자에게 적절한 투여량을 결정할 것이다.

본 발명의 펩타이드는 치료 혼합물로서 1회 투여량 당 약 0.0001 내지 1.0 밀리그램, 또는 약 0.001 내지 0.1 밀리그램, 또는 약 0.1 내지 1.0 또는 심지어 약 10 밀리그램 등의 양으로 포함될 수 있다. 다회 투여 역시 투여가능하다.

정맥내 또는 근육내 주사와 같은 본 발명 화합물의 비경구 투여 제형 이외에도 기타 약학적으로 허용가능한 정제 또는 경구 투여에 적합한 기타 고체; 리포좀 포뮬레이션; 서방형 캡슐; 및 현재 이용되는 기타 형태도 이용가능하다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드는 심혈관 질환을 보다 효과적으로 중단시키는 것이 목적인 복합 치료법의 일부를 구성할 수 있다. 이 경우, 본 발명은 본 발명의 적어도 1종의 펩타이드를; 예컨대 스타틴 화합물, 항응집 접근법, 항-알도스테론 화합물, ACE 억제제 (안지오텐신 전환효소 억제제) 및 베타-차단제와 같은 기타 항-심혈관계 질환 화합물(들)과 함께 제공한다.

또한, 본 발명은 심혈관 질환을 앓는 포유동물에게 적어도 1종의 본 발명의 펩타이드 또는 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 적어도 1종의 DNA 서열을, 바람직하게는 이를 함유하는 의약 조성물의 형태의 치료적 유효량으로 투여하는 것으로 이루어지는, 상기 포유동물의 심혈관 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 이 특정 구체예에서, 상기 의약 조성물은 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드들에 더해 1종 이상의 (COOH) 펩타이드들 함유한다. 심근경색 및 뇌경색, 급성 심근경색, 허혈, 관상심장 질환, 급성 관상동맥 증후군, 뇌졸중, 동맥류, 안정형 또는 운동형 협심증, 심근병증, 고혈압성 심장질환, 심부전(만성 및 급성), 폐심장증, 부정맥, 염증성 심장 질환 예컨대 심장내막염, 심근염, 말초동맥 질환, SIRS-관련된 심근장애 및 맥관장애, 죽상동맥경화증을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

이하에 첨부된 도면과 실시예를 참조로 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 어떠한 방식으로든 이들 실시예와 도면으로 국한되는 것은 아니다.

도 1: TREM-1 및 TLT-유도된 펩타이드에 의한 TREM-1 조절(modulation)은 αTREM-1 및 LPS에 의해 시험관내에서 유도된 혈관 장애에 대해 이로운 효과를 나타낸다. 대동맥 고리 중 페닐레프린 (A 및 B) 및 아세틸콜린 (C)에 대한 투여량-반응 곡선. 건강한 래트 및 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들 또는 LR12-스크램블된 펩타이드 존재 또는 부재 하에 시험관내에서 αTREM-1 (5㎍/mL) 및 LPS (10㎍/mL)에 의해 자극된 래트로부터 대동맥을 얻었다. B: 몇몇 대동맥으로부터 상피를 제거하였다(desendothelialized: (-E)). 데이터는 적어도 5회의 상이한 실험으로부터 얻은 것이다, p 값: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ns: 비-유의적.
도 2: TREM-1은 전도성(conductives) 내성(resistives) 동맥으로부터의 내피 세포에서 발현된다.
마우스 대동맥 (전도성 동맥)(A) 및 래트의 장간막 동맥 (내성 동맥)(B)을 지시에 따라 LPS 존재 또는 부재 하에 자극하였다. Trem-1 발현을 qRT-PCR에 의해 탐지하였다. 데이터는 적어도 5회의 상이한 실험으로부터 얻은 것이다. p 값: *** p 값 <0.001. ns (유의적이지 않음).
도 3: TREM-1은 미세혈관의 내피 세포에서 본질적으로 발현되어 유도가능하다.
마우스의 폐 및 간(LuMECs 및 LiMECs)으로부터 분리된 CD146+/VEGFR2+ 세포들을 TREM-1 발현에 대한 유세포분석에 의해 분석하였다. TREM-1은 Li/LuMECs (A) 상에서 본질적으로(constitutively) 발현된다. TREM-1 발현은 실험실 패혈증 동안 생체내에서 (A) 또는 LPS에 의한 1시간 자극 후 시험관내에서 (B) 유도가능하다. TREM-1, 및 VEGFR2 발현의 동력학을 FACS에 의해서도 분석하였다 (C). LPS는 TREM-1 및 VEGFR2 발현을 시간-의존적으로 상향조절하였으며, 이것은 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들에 의해 예방되었다. 데이터는 적어도 10회의 상이한 실험으로부터 얻은 것이다. p 값: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 4: LPS 자극 후 TREM-1 발현의 동력학
(A) 시험관내 LuMEC (CD146+, VEGFR2+)를 LPS를 이용하여 4h 및 12h 동안 자극하고 qRT-PCR에 의해 (A) Trem-1, Tnf-α(B) 및 Il-6 (C) 발현에 대해 분석하였다. 데이터는 적어도 10회의 상이한 실험으로부터 얻은 것이다.
도 5: LPS에 의해 24 시간 자극된 LuMEC의 시토카인 생산에 미치는 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들의 효과
(A) LPS에 의해 24 시간 자극된 LuMEC의 상등액 중 단백질 농도를 ELISA에 의해 분석하였다. *, P < 0.05; **, P < 0.01.***, P < 0.001.
(B) LPS에 의해 24 시간 자극된 LuMEC의 시토카인/케모카인 측정치. 데이터는 대조군과 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들 처리된 세포들 간의 비율(ratio)로서 표현된다 (비율 > 1이면 처리된 세포들에 비해 대조군에서 농도가 더 높음을 나타낸다).
데이터는 적어도 10회의 상이한 실험으로부터 얻은 것이다.
도 6: 패혈증 동안 생체내 손상된 혈관의 세포내 시그널링 경로가 TREM-1 및 TLT-1-유도된 펩타이드들에 의한 TREM-1 조절에 의해 복구됨.
TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들은 Akt 경로 및 Cox-1 발현의 손상을 복구할 수 있을 뿐만 아니라 Cox-2 및 iNOS에 의해 예시되는 유도성(inductible) 경로의 상향조절도 복구할 수 있다. 이 효과를 대동맥(A) 및 장간막 동맥(B)에서 측정하였다.
데이터는 적어도 5회의 상이한 실험으로부터 얻은 것이다, p 값: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 7: TREM-1 및 TLT-1-유도된 펩타이드들에 의한 TREM-1 조절은 패혈증-유도된 심장기능 장애에 대해 유리한 효과를 갖는다.
패혈증-유도된 심장기능 장애의 래트 모델 시험 동안 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들의 투여는 밀라 카테터(Millar catheter (FEVG, ESPVR, dpdtmax/Ved, PRSW))에 의해 측정된 내인성 심장기능의 증가와 연관되어 있다.
데이터는 적어도 10회의 상이한 실험으로부터 얻은 것이다.
도 8: TREM-1 및 TLT-1-유도된 펩타이드들에 의한 TREM-1 조절은 패혈증-유도된 저혈압 및 심장기능 장애에 대해 유리한 효과를 갖는다.
(A) 패혈증-유도된 심장기능 장애의 미니-피그 모델 시험 동안 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들의 투여는 안정한 동맥 혈압(85 mmHg)를 유지하는데 필요한 노르에피네프린의 주입량 감소와 연관이 있다. 실제로, 대조군에 있어서보다 TLT-1- 및 TREM-1-유도된 펩타이드들에 있어서 MAP는 지속적으로 더 높았고 노르에피네프린 투여량은 더 낮았다.
(B) 카디악 인덱스(cardiac index), 카디악 파워 인덱스(cardiac power index), SvO2 및 산소 전달의 전개. 이들 모든 변수들은 대조군에서보다 TLT-1- 및 TREM-1-유도된 펩타이드들에 있어서 더 높았다.
(C) 아시도시스(산증) 및 고락테이트혈증(hyperlactatemia)의 발달이 LR12에 의해 약화되었다.
LR12 그룹, n=6 // LR12-스크램블된 그룹 n=5.
도 9: TREM-1 및 TLT-1-유도된 펩타이드들에 의한 TREM-1 조절은 확장기 동맥압, 수축기 동맥압 및 평균 동맥압에 있어서 패혈증-유도된 변경에 대해 이로운 효과를 갖는다.
패혈증-유도된 심장기능 장애(내독소혈증)의 원숭이 모델 시험 동안 TLT-1- 및 TREM-1-유도된 펩타이드들의 투여는 혈압(평균(A), 수축기(B) 및 확장기(C))의 내독소-유도된 일시적 강하를 완전히 방지해준다. (p<0.001 대조군 펩타이드 vs LR12). 평균 ±SD. N=6/그룹.
도 10: TREM-1은 심근조직에서 발현되며 허혈이 진행되는 동안 상향조절된다.
(A) 심근경색으로부터 6, 12 및 24 시간 경과 후 베이스라인과 경색부의 심근에 있어서 Trem-1의 q-PCR mRNA 정량화.
(B) 심근경색으로부터 24 시간 경과 후 TREM-1 단백질의 정량화.
데이터는 적어도 5회의 상이한 실험으로부터 얻은 것이다. 결과는 평균±SD이다. p 값은 *p<0.001 [건강한 부분 대 경색부].
도 11: 경색된 심근 및 원거리 구획들로부터의 백혈구 이동에 있어서 TREM-1 조절, 대조군 백혈구 동원에 의한 TREM-1 및 TLT-1-유도된 펩타이드들.
(A) TLT-1- 및 TREM-1-유도된 펩타이드들 또는 대조군 펩타이드(LR12-scr)로 처리된 마우스에 있어서 여러가지 상이한 시점에서 경색된 심근 중의 백혈구 주입의 유세포분석에 의한 정량화; 그룹 및 시점(time point) 당 n=5 마우스; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 versus LR12-scr, ^≠p<0.05, ^≠≠p<0.01 대 허위(sham).
(B) MI 후 여러가지 상이한 시점에서 골수, 혈액 및 비장 중의 백혈구 서브타입의 유세포분석에 의한 정량화; 각 시점에서 n=6-7; ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05 대 LR12-scr 처리된 마우스 ;≠≠p<0.01, ≠p<0.05 대 모의수술된(sham operated) 마우스.
(C) MI 후 MCP-1 및 MCP-3 혈장 농도; n=5 마우스; ***p<0.001 대 LR12-scr 처리된 동물들.
도 12: TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들은 TREM-1의 억제에 의해, 마우스에 있어서 허혈이 일어나는 동안 심근의 염증반응을 조절한다.
이 실험을 위해, TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들 또는 대조군 LR12-스크램블된 펩타이드 ('대조군')에 의해 처리된 마우스로부터 심근경색을 유도한지 24 시간 후에 심근 용해물(myocardial lysate)을 얻었다. 2개의 영역, 즉: 대조군 동물에서 경색된 구역으로부터 멀리 떨어진 부분을 수확한 건강한 영역과 경색부에 대해 연구하였다. 데이터는 적어도 5회의 상이한 실험으로부터 얻은 것이다. 결과는 평균 ± SD. p 값은* p<0.001 [LR12 대 대조군].
포스포 (p)-p38, (p)-ERK1/2, iNOS, Cox2, (p)-Akt, (p)-GSK3β, Socs3에 대한 항체를 이용하여 분석된 심근 조직 용해물의 웨스턴 블롯.
도 13: 마우스에 있어서 허혈이 진행되는 동안 심근 조직에 의한 시토카인의 생산에 미치는 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들의 효과
이들 실험을 위해 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들 또는 대조군 LR12-스크램블된 펩타이드('대조군')에 의해 처리된 마우스로부터 심근경색을 유도하고 6, 24 및/또는 96 시간 경과 후 심근 용해물을 수득하였다. 경색부를 시토카인/케모카인 생성에 대해 분석하였다. 데이터는 적어도 5회의 상이한 실험으로부터 얻은 것이다. p 값은 *p<0.001 [LR12 대 대조군].
(A) 심근경색으로부터 24 시간 후 경색된 심근조직에서의 시토카인/케모카인 측정. 데이터는 대조군과 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들에 의해 처리된 동물들 간의 비율로서 표현한 것이다 (비율 > 1은 처리된 마우스에서보다 대조군에서 더 높은 농도를 나타낸다).
(B) 시토카인의 발현: 심근경색으로부터 6, 24, 및 96 시간 후 경색된 심근조직에서의 Tnf-α Il-6 및 IL-10 mRNA 수준.
도 14: TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들은 TREM-1의 억제에 의해, 심근경색부에서의 프로테아제 활성을 감소시킨다.
이들 실험을 위해 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들 또는 대조군 LR12-스크램블된 펩타이드('대조군')에 의해 처리된 마우스로부터 심근경색을 유도하고 6, 24 및/또는 96 시간 경과 후 심근 용해물을 수득하였다. 경색부를 분석하였다. 데이터는 적어도 5회의 상이한 실험으로부터 얻은 것이다.
(A) Mmp9의 Q-PCR mRNA 정량:
(B) Timp-1 및;
(C) 베이스라인, 심근경색으로부터 12, 24 및 96 시간 경과 후 Mmp-9 젤라티나제 활성을 반영하는 대표적인 인-겔(in-gel) 자이모그래피. 상부(Up): 대조군-펩타이드 처리된 동물들; 하부(down): LR12 처리된 동물들.
도 15: TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들은 TREM-1의 억제에 의해, 마우스에 있어서 심근경색 후 생존률을 향상시킨다.
성체 수컷 Balb/c 마우스 (20-23g)에서 심근성 허혈을 유발시키고 무작위 그룹화한 다음 (그룹 당 n= 10-15), i.p. 주사에 의해, 반복적으로 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들 (5일 동안 1일 1회 0.2 mL NaCl 0.9% 중 100㎍_), 스크램블된-LR12 (5일 동안 1일 1회 0.2 mL NaCl 0.9% 중 100㎍), 또는 0.2 mL NaCl 0.9% 중 10㎍ 항-TREM-1 mAb를 투여하였다. 1주일 간 생존률을 모니터링하여 Log Rank 테스트에 의해 분석하였다. (제5일 경과 후 어느 마우스도 죽지 않았다). 데이터는 적어도 15회의 상이한 실험으로부터 얻은 것이다.
도 16: TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들은 TREM-1의 억제에 의해, 래트에 있어서 심근성 허혈-재관류 후 심장 기능을 증진시킨다.
성체 수컷 위스타(Wistar) 래트에서 심근성 허혈-재관류를 유발시키고 무작위 그룹화 한 다음 (그룹 당 n= 10), 반복적으로 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들 (5일 동안 1일 1회 0.2 mL NaCl 0.9% 중 3 mg/kg) 또는 스크램블된-LR12 (5일 동안 1일 1회 0.2 mL NaCl 0.9% 중 3 mg/kg)를 투여하였다. 심근 손상으로부터 6주 후, 전도성 카테터를 이용한 마취 하에 심장 기능을 조사하였다. 대조군 래트에서보다 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들로 처리된 동물에 있어서, Emax, ESPVR, 및 PRSW가 더 높았다. 모든 p<0.02 [대조군 대 LR12]).
도 17: TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들은 TREM-1 억제에 의해, 래트에 있어서 심근경색 후 수축기 및 확장기 기능을 증진시킨다.
성체 수컷 위스타(Wistar) 래트에서 심근성 허혈을 유발시키고 무작위 그룹화 한 다음 (그룹 당 n= 10), 반복적으로 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들 (5일 동안 1일 1회 0.2 mL NaCl 0.9% 중 3 mg/kg) 또는 스크램블된-LR12 (5일 동안 1일 1회 0.2 mL NaCl 0.9% 중 3 mg/kg)를 투여하였다. 심근 손상으로부터 6주 후, 전도성 카테터를 이용한 마취 하에 심장 기능을 조사하였다. 대조군에서보다 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들로 처리된 동물에 있어서, 연구된 모든 파라미터들이 더 양호하였다 (모든 p<0.02 [대조군 대 LR12]).
도 18: 4주일 간 PBS(좌측) 또는 LR12(우측)의 매일 복강 주사에 의해 처리된 apoE-/- 마우스에서 대동맥동(aortic sinus)의 죽상경화판 형성
TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들에 의한 처리는 Red Oil 염색을 이용하여 평과된 대동맥동에 있어서 죽상동맥경화증 발달을 경감시킨다: LR12 처리시 103318 ㎛² versus 비히클 투여시 146736 ㎛², P=0.02. 데이터는 적어도 15회의 상이한 실험으로부터 얻은 것이다.
도 19: 죽상경화판에서의 대식세포 염색(항-MOMA2, 레드)
apoE-/- 마우스에 있어서의 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드 처리는, 면역형광 염색 및 면역조직화학(항-MOMA2)에 의해 정량할 경우, 죽상경화판 (p=0.004)에서의 대식세포 침윤을 대조군 동물에 비해 27%까지 감소시킨다.
도 20: TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들은 TREM-1 억제에 의해, 제7일에 비-전통적인(non-classical) 단핵구 집단의 감소를 유도한다.
죽상동맥경화성 마우스 모델에서 염색 7일 후 유세포분석에 의해 순환 CD115⁺Gr1^로우(low) 및 CD115⁺Gr1^하이(high) 단핵구를 세었다. 데이터는 적어도 5회의 상이한 실험으로부터 얻은 것이다. (P<0.05).
도 21: TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들은 TREM-1 억제에 의해, 제28일에 백혈구증가증을 감소시킨다.
죽상동맥경화성 마우스 모델에서 염색 28일 후 유세포분석에 의해 순환 CD115⁺Gr1^로우 및 CD115⁺Gr1^하이 단핵구를 세었다. 데이터는 적어도 5회의 상이한 실험으로부터 얻은 것이다. *p<0.05; **p<0.001.
도 22: TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드에 의한 처리는 병변 내 단핵구 침윤을 감소시킨다.
멸균 PBS 중에 1:4로 희석한 Fluoresbrite 녹색 형광 플레인 마이크로스피어 1 ㎛를 레트로-오비탈 IV 주사함으로서 단핵구들을 생체내 표지시켰다. 병변 중의 형광 비드 카운트는 단핵구 동원을 반영한다. 데이터는 적어도 5회의 상이한 실험으로부터 얻은 것이다.P<0.05.

실시예

재료 및 방법

펩타이드

GenBank|EMBL|DDBJ의 TLT-1 및 TREM-1 서열(수탁번호AY078502, AF534822, AF241219 및 AF287008)에 기초하여, TREM-1- 및 TLT-1-펩타이드들을 그들의 세포외 도메인들의 여러 부위들을 모방하도록 설계하였다(TREM1-LP17, TREM1-LP12, TREM1-LP6-1, TREM1-LP6-2, TREM1-LP6-3, TLT1-LR17, TLT1-LR12, TLT1-LR6-1, TLT1-LR6-2 및 TLT1-LR6-3). 이들은 생체내 분석을 위해 Cter 아미드화 펩타이드로서 화학합성된 것이었다 (Pepscan Presto BV, Lelystad, The Netherland). 올바른 펩타이드들을 >99% 수율로 수득하였으며 이들은 예비 정제 후, 질량 분광분석법 및 분석용 역상 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 확인되는 바와 같이, 균질하였다. 이들 펩타이드들에는 내독소가 없었다. 대응하는 스크램블된 펩타이드들도 유사하게 합성하여 이를 대조군 펩타이드로서 사용하였다.

동물

모든 절차에 대해 실험실용 동물의 관리 및 사용을 위한 지역위원회의 승인을 득하고 동물 실험에 관한 국제 가이드라인에 따라 이를 실시하였다. 마우스와 래트들은 찰스 리버(Charles River, 프랑스 스트라스부르 소재)로부터 구득하였다.

마우스의 흉부 대동맥 및 래트의 장간막 동맥의 분리

펜토바르비탈 소듐을 복강 주사하여 동물들을 마취시켰다. 중간선 복부 절개에 의해 가슴을 열어 흉부 대동맥(마우스) 또는 장간막 동맥(래트)를 노출시켰다.

혈관으로부터 혈액을 제거하고 10% 소 태아 혈청 및 항생제가 보강된 RPMI 배지에서 20 시간 인큐베이션시켰다. 여러가지 조건들을 무작위적으로 적용하였다: 1) 대조군 혈관 2) LPS (10㎍/mL)와 함께 생체외 인큐베이션된 혈관 3) LPS 및 펩타이드 처리 4) 아고니스트 αTREM-1 (5㎍/mL) 5)LPS와 함께 인큐베이션 및 처리된 내피제거된 혈관.

몇몇 실험에서, 총 RNA 및 단백질들을 자극 후 혈관으로부터 추출하였다.

혈관 반응성( Vascular reactivity )

대동맥의 혈관 반응성을 와이어 근육운동기록기(EMKA Technologies, France)를 이용하여 조사하였다. 다음 조성을 갖는 생리식염수 용액(PSS)에서 실험을 37℃에서 수행하였다: 119 mmol/L NaCl, 4.7 mmol/L KCl, 14.9 mmol/L NaHCO3- , 1.2 mmol/L MgSO42-, 2.5 mmol/L CaCl2, 1.18 mmol/L KH2PO4- , 및 5.5 mmol/L 글루코스, 95% O2 및 5% CO2에 의해 지속적으로 기포를 발생시킴). 최적의 수동 장력(passive tension) 하에서 평형기간(적어도 20분) 경과 후, KCl 탈분극(100mM)과 10 ㎛ 페닐레프린(Phe) (Sigma- Aldrich, Saint Quentin Falavier, France)과의 조합에 대한 2회의 연속적 수축을 이용하여 혈관의 최대 수축능을 검사하였다. 20분간의 수세 기간 후, 이 혈관수축제 아고니스트를 누적 투여함으로써 (1nM 내지 100㎛) PE에 대한 농도-반응 곡선을 유도하였다. 새로운 수세 기간 경과 후, 1㎛의 페닐레프린(Phe)에 의한 예비-수축(pre-contraction) 후 아세틸콜린 (ACh) (1nM 내지 100 ㎛; Sigma, St Louis, MO, USA)의 이완 효과를 검사함으로써, 내피-의존성 이완을 평가하였다. 50% 이상 이완을 유도하는 경우 아세틸콜린(1㎛)에 의한 기능성 내피가 존재하는 것으로 확인되었다.

폐 및 간의 미세혈관 내피 세포( LuMEC 및 LiMEC )의 분리

마우스들을 깊이 마취시켜(펜토바르비탈) 희생시킨 다음 폐와 간을 얻었다. 마우스의 폐 및 간의 미세혈관 내피 세포의 분리는 이전에 설명된 프로토콜 [Daqing et al, 1998]에 약간의 변형을 가하여 실시하였다. 간단히 설명하면, 장기들을 10% FBS-DMEM으로 세척하고, 1-2 mm² 크기로 다진 다음, 37℃에서 1시간 동안 가끔씩 교반하면서 I형 콜라게나제 (2 mg/ml, Gibco)로 분해(digest)처리하였다. 세포들의 효소 분해물을 70 ㎛ 세포 스트레이터를 통해 여과한 다음 1,500 rpm에서 원심분리하고, 20% FBS, 100 ㎍/ml ECGS (BD Biosciences) 및 항생제가 보강된 DMEM/F12 배지(Gibco)를 함유하는 젤라틴-코팅된 디쉬 상에 세포들을 도말하였다. 제1일에, 부유 세포들을 제거하고 PBS로 세척한 후 신선한 배양 배지를 첨가하였다. 5일 후, CD146 MicroBead Kit를 이용하여 이들 세포들을 1차 정제하였다. 트립신화 후, 세포들을 성장 배지에 재현탁시킨 다음 신선한 젤라틴-코팅된 디쉬에 도말하였다. 15일 후 세포들을 동일 공정에 따라 2차 정제하였다. 내피 세포들의 순도(> 85 %) 및 생존능을 검정하였다. 이에 더해, FACS 분석을 이용하여, 유세포분석법에 따른 VEGFR2 및 CD146 발현 탐지를 통해 표현형을 평가하였다.

미니- 피그 준비 및 패혈증-유도된 저혈압 및 패혈증-유도된 심장기능 장애의 모니터링

성체 수컷 미니-피그들(Sus scrofadomestica, Vietnamese pot-belied mini-pigs, 30-40 kg)을 Elevage Ferry (Vosges, France)로부터 구입하였다. 수술 전, 동물들을 밤새 단식시키되 물은 자유롭게 먹게 하였다. 케타민(10 mg/kg)과 미다졸람(0.1 mg/kg)을 근육내 투여하여 사전 마취를 실시하였다. 정맥내 펜토바르비탈 (초기 볼루스: 10 mg/kg, 및 연속 투여 6-8 mg/kg/h), 간헐적 수펜타닐 (10㎍), 및 판쿠로늄(4 mg)을 필요에 따라 투여함으로써 마취를 유도하고 유지시켰다. 동물들을 기계호흡 (정상탄산상태 유지를 위해, 일호흡량 8 ml/kg, PEEP 5 cm H2O, FiO2 0.21, 호흡률 14-16 호흡/분으로 조정함)시켰다. 좌측 경정맥을 노출시키고 삼중-루멘 라인을 삽입하였다. 우측 경정맥에도 카테터화하여 Swan-Ganz 카테터를 위치시켜 심박출량, SvO2, 및 우심방(right atria) 및 폐동맥압을 연속적으로 기록하도록 하였다. 동맥압의 연속 측정을 위해 우측 경동맥 카테터를 삽입하였다. 방광내 카테터를 이용하여 뇨를 수집하였다.

기기 설치 후, 중간선 개복술을 실시하여 좌측 결장으로부터 대변을 수집하였다: 1.5 g/kg을 200 mL의 0.9% NaCl에 현탁시키고 38℃에서 2 시간 인큐베이션시켰다. 수술 후, 복막염 유도 및 복수 배출을 위해 튜브를 설치하였다.

수술 후, 동물들을 2시간 동안 회복시킨 다음 베이스라인 측정('H0'이라 정의함)하였다. 연구 내내 보통 식염수를 지속적으로 투여하였다(10 mL/kg/h). 체온을 히팅 패드 또는 냉각을 이용하여 일정하게 (±1℃) 유지시켰다.

베이스라인 데이터 수집 후(H0), 복부 튜브를 통해 자가 대변을 투여함으로써 복막염을 유도시킨 후 튜브를 클램프로 유지시켰다. 2시간 후(H2), 동물들에게 무작위적으로 LR12 (LR12 그룹, n=6) 또는 비히클(보통 식염수) 단독(대조군, n=5)을 투여하였다. 30분에 걸쳐 5 mg/kg (60 mL 중)의 볼루스를 정맥 전달한 다음, 1 mg/kg/h (15 mL/h) 주입을 개시하고 연구 기간 내내 유지시켰다.

연구 기간 내내 다음의 가이드라인을 철저히 준수하면서 숙련된 임상의가 동물들을 관리하였다:

i) 혈류역학적 표적(Hemodynamic targets): 주목적은 평균 동맥압(MAP)을 85 mmHg을 상회하도록 유지시키는 것이었다. 이 목적을 달성하기 위해 그리고 0.9% NaCl 투여 (7 mL/kg/h) 유지를 위해, 히드록시에틸 전분(연구 기간 내내 최대 20 mL/kg)(HES 130/0.4, Voluven

Fresenius)을 제공하고 중심정맥압(CVP) 및 폐동맥 폐색압(pulmonary artery occlusion pressure: PAOP)을 < 18 mmHg로 하였다. 히드록시에틸 전분 최대 용적이 달성되면, 노르에피네프린의 지속적인 주입을 최대 10㎍/kg/분으로 개시하였다.

ii) 호흡 표적(Respiratory targets): 주목적은 PaO2/FiO2 비율을 > 300으로 유지하고 동맥 PaCO2를 35-45 mmHg로 유지하는 것이었다. 따라서 흡기/호기 비율을 1:1에 가깝게 증가시키고, PEEP 최대 15 cm H2O, 및 호흡률 최대 30 호흡/분으로 하여 호흡기 세팅을 변형시킬 수 있다.

iii) 체온은 히팅 패드 또는 냉각에 의해 항상 일정하게(±1℃) 유지시켜야 한다.

iv) 혈중 당농도를 유지시키기 위해 필요에 따라 5-7 mmol/L로 정맥내 글루코스 주입을 실시하였다.

혈류역학적 파라미터들을 MAP, 평균 폐동맥압(MPAP), 우심방 혈압(right atrial pressure: RAP), 심장박출량(cardiac output: CO), 카디악 인덱스 (cardiac index: CI), 및 SvO2를 포함하여 지속적으로 모니터링하였다. 전신 산소 전달(DO2) 및 전신 산소 흡수(VO2)를 Swan-Ganz 모니터에 의해 계산하였다. 카디악 파워 인덱스 (W/m²)를 MAP x CI / 451로서 구하였다 (24).

원숭이 준비 및 패혈증-유도된 저혈압 및 패혈증-유도된 심장기능 장애의 모니터링

성체 시노몰구스 원숭이들(Macacafascicularis) (2.8 내지 3.5 kg, 24개월령, Le Tamarinier, La Route Royale, Tamarin, Mauritius)을 이용하였다. 동물들을 LPS 챌린지 전날 단식시키되 물은 자유로이 마시게 하였다. CIToxLAB 프랑스 윤리위원회 (France Ethical Committee (CEC))가 모든 연구 과정을 검토 및 승인하였다(Nr CEC: 02221).

약물 투여 및 생체내 LPS 챌린지.

LPS 챌린지 전날 바이탈 사인과 체중을 기록하였다. 다음날 아침, 베이스라인 임상실험 샘플을 수집하고, 바이탈 사인의 베이스라인 세트를 기록하였다. 테플론 카테터를 통해 요골측피부정맥 및 대복재정맥(cephalic 또는 saphenous vein) 내로 약물을 투여하였다. 대측(Contralateral) 정맥은 LPS 투여에 이용하였다.

원숭이들을 무작위화하여 LR12 또는 위약 (그룹 당 n=6)을 투여하였다. 4마리로 된 또 다른 그룹에는 비히클(NaCl 0.9%)만을 주입하고 이를 대조군으로 삼았다.

시점 0에서, 12 mL/h (5mg/kg, 10분, 2 mL)의 속도로 눈금 시린지 펌프(Harvard Apparatus)에 의해 LR12 또는 위약 용액의 15분간의 정맥내 주입을 개시하였다. 이어서 연속 주입을 추가 8시간 동안 2 mL/h (1mg/kg/h, 8 시간, 16 mL)의 속도로 투여하였다. 치료 주입 직전, LPS (10 ㎍/kg)의 정맥내 볼루스를 대측 카테터 내로 10분의 기간 동안 투여하였다. 동물을 구속 의자에 곧추선 자세로 앉혀서 깨어 있는 상태로 유지시키고 연구 기간 내내 금식시켰다.

맥박수와 혈압을 1시간 동안 매 15분마다 모니터링한 후 이어서 7시간 동안 30분마다 모니터링하였다.

심근경색의 마우스 모델

모든 과정을 6-8주령 범위의 수컷 마우스 C57BL/C에 대해 실시하였다. 마우스들에게 자일라진(60 mg/kg)을 복강내 주사하여 마취시키고 바로 누운 자세(supine position)로 고정시켰다. 기관(trachea) 삽관하고 공기를 주입하였다 (일회호흡량(tidal volume)은 200μl/25g이었고 호흡률(respiratory rate)은 120 호흡/분이었다). 좌측 개흉술 후, 좌측 관상동맥을 동정하고 좌측 귀바퀴 선단으로부터 1.0 mm 거리에 8-0 프롤렌 외과봉합사로 봉합하였다. 허혈부(좌심실)의 심근 색깔이 적색에서 백색으로 변화하는 것에 의해 LAD 폐색을 확인하였다. 흉부를 닫고 피부를 6-0 실크사로 봉합하였다. 동물들을 케이지로 돌려 보내고 완전히 회복할 때까지 관리감독하였다.

수술 후 마우스들의 사망률을 모니터링하였다. 마우스들을 무작위화하여 펩타이드를 투여하거나(5일 동안 1일 복강 주사량, 5mg/kg) 투여하지 않고 생존률을 모니터링하였다. 별법으로, 마우스들을 펜토바르비탈 소듐 과량으로 마취시키고 이로부터 6h, 24h, 96h (그룹 당 n=6) 후에 희생시켰다. 중간 흉골절개술을 실시한 후에 심장을 절제하여 허혈부와 비허혈부를 분리하였다. 이어서 RT-PCR, WB, 면역조직학, 및 ELISA 분석을 위해 ARN 추출 및 단백질 추출을 실시하였다.

유세포분석

건강한 C57BL/6 및 패혈증(CLP) 마우스로부터의 미세혈관 내피 세포(MECs)를 전술한 바와 같이 분리하고 4℃에서 20분간 FITC 및 PE와 컨쥬게이션된 항-마우스 VEGFR2 및 항-TREM-1와 함께 인큐베이션시켰다. 세포들을 PBS로 2회 세척하고 0.1% 포름알데히드로 고정한 다음 유세포분석을 실시하였다. 대조군으로는, 동일 농도의 마우스 IgG2a 이소타입을 이용하였다.

또 다른 실험에서 MECs를 LPS (0.1 ㎍/ml)를 이용하여 FACS 분석 2시간 및 6시간 전에 자극하거나 하지 않았다.

경색 조직으로부터 단일 세포 현탁액을 조제하기 위해, 심장을 수확하였다: 미세 가위로 심장을 다지고; 콜라게나제 I, 콜라게나제 XI, DNase I, 및 히알루로니다제(Sigma-Aldrich)의 칵테일에 넣고; 37℃에서 1시간 진탕시켰다. 이어서 세포들을 분쇄 및 원심분리하였다 (15분, 500g, 4℃).

비장을 제거하고, 4℃ HBSS에서 3-ml 시린지의 말단을 이용하여 분쇄한 다음 70-㎛ 나일론 필터(BD)를 통해 여과하였다. 세포 현탁액을 4℃에서 300g로 10분간 원심분리하였다. 적혈구 세포들을 용해시키고 (Red Blood Cells Lysis 용액, Miltenyi), 비장세포들을 HBSS로 세척한 다음 0.2% (wt/vol) BSA가 보강된 HBSS에 재현탁시켰다. 항응고제로서 시트레이트 용액을 이용하여 심장 천공을 통해 말초 혈액을 수집하고 적혈구 세포들을 용해시켰다. 마지막으로, 대퇴골을 1 mL HBSS를 이용하여 플러싱한 후 그로부터 골수 단세포 현탁액을 얻고, 70-㎛ 나일론 필터를 통해 여과한 다음 4℃에서 300g로 10분간 원심분리하였다. 혈구계와 트리판 블루(BioRad)를 이용하여 분주액으로부터 살아있는 총 세포수를 결정하였다.

세포 현탁액을 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포(CD4- 또는 CD8-APC, CD3ε-PE, CD45-FITC), B 세포(CD19-PE, CD45-FITC), 과립구(CD45-FITC, Ly-6G-APC), 단핵구 서브셋(CD115-PE, Ly-6C-APC, CD45-FITC)에 대한 mAbs의 칵테일에서 인큐베이션시켰으며, 상기 모든 항체들은 Miltenyi Biotech로부터 구득하였다. 보고된 세포 수는 살아있는 총 세포수(ml 당 살아있는 총 백혈구)와 선택된 게이트 내의 세포 백분율의 프로덕트로서 계산되었으며, 조직(심장) mg 당, 장기(대퇴골 및 비장) 당, 또는 mL (혈액) 당 보고하였다. 데이터를 FC500 세포계산기 (Beckman Coulter) 상에서 구하였다.

RNA 추출 및 폴리머라제 연쇄반응 분석

RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Courtaboeuf, France)를 이용하여 허혈부와 비허혈부 또는 세포로부터 총 RNA를 추출하고 iScript cDNA 합성 키트(BioRad)를 이용하여 역전사하기에 앞서 NanoDrop (ThermoScientific)으로 정량하고 mTREM-1, mTNF-α, mIL-6, mMMP-9, mTIMP-1 및 mActB에 대해 이용가능한 Qiagen 프로브(Quantitect Primers)를 이용하여 정량적 PCR을 실시하여 정량하였다. 별법으로, 총 RNAs를 PCR 어레이 (Mouse Innate ImmuneEndothelial Cells RT2 Profiler PCR Arrays, SABiosciences)를 위해 RT2 First Strand Kit (SABiosciences, Tebu-bio, LePerray-en-Yvelines, France)을 이용하여 역전사시켰다. 모든 PCRs은 MyiQ Thermal Cycler에서 실시하고 iQ5 소프트웨어(Qiagen)에 의해 정량하였다. 유전자 발현을 ActB를 이용하여 정규화하였다.

단백질 인산화 분석

허혈부 및 비허혈부로부터의 조직 또는 MECs를 PhosphoSafe Extraction Reagent (Novagen)으로 용해시키고 4℃, 16,000g에서 5분간 원심분리하여 상등액을 수집하였다. 브래드포드법(Bradford's method: Pierce)을 이용하여 단백질 농도를 구하였다. 이어서 용해물(Lysates)을 항-포스포-p38, -pERK1/2, -pAKT, -pGSK3β, -iNOS, -COX2, -SOCS3, -TREM-1 및 호스-래디쉬 퍼옥시다제(Cell Signaling)와 컨쥬게이션된 대응하는 2차 항체 및 SuperSignal West Femto Substrate (Pierce)을 이용하여 웨스턴 블롯 (Criterion XT Bis-Tris Gel, 4-12%, BioRad 및 PVDF 막, Millipore)으로 분석하였다. 정규화를 위해 항-p38, 항-ERK1/2, -AKT, -GSK3β 또는 -Tubulin을 이용하였다. 다중 인산화된 단백질들의 패널에 대해서도 임뮤노블롯(Phospho-Kinase Array; R&D Systems)을 이용하여 조사하였다. LAS-4000 조영기 및 Multi-Gauge 소프트웨어 (Fujifilm)를 이용하여 후천성 및 정량적 시그널 밀도 분석을 실시하였다

시토카인 농도 측정

심근 용해물(허혈부 및 비허혈부) 및 MECs 상등액 중의 시토카인을 제조회사의 권장지침에 따라 ELISA (Mouse Quantikine ELISA 키트, R&Dsystems) 및 시토카인 패널 어세이(Proteome Profiler Mouse Cytokine Array Kit, Panel A, R&Dsystems)를 이용하여 측정하였다.

자이모그래피( Zymography )

조직 추출물 중의 MMP-9 효소 활성을 SDS-PAGE 젤라틴 자이모그래피를 이용하여 탐지하였다. 조직 추출물에 존재하는 MMP-9은 젤라틴 매트릭스를 분해하여, 단백질에 대한 겔 염색 후 투명한 밴드가 남는다. 간단히 설명하면, 균질화되어 정규화된 조직 샘플들을 환원제 없이 변성시키고 젤라틴을 함유하는 7.5% SDS-PAGE 겔에서 전기영동으로 분리시킨다. 이어서 Triton x-100 (단백질을 재생시키기 위함)의 존재하에 겔을 10mM CaCl2, 0.15 M NaCl, 및 50mM Tris (pH 7.5)를 함유하는 완충액 중에서 실온에서 2 시간 및 이어서 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 그 후, 겔을 0.25% 쿠마씨 블루로 염색하였다. 밀도측정법에 의해 밴드를 분석 및 정량하였다.

심근성 영구 허혈의 래트 모델

성체 수컷 위스타 래트(360-380g)를 이용하였다. 모든 래트들을 케타민(100 mg/kg, 근육내)으로 마취시키고 기계 호흡시켰다. 좌측 개흉술을 실시한 후, 좌측 관상동맥을 동정하고 6-0 프롤렌 외과용 봉합사로 봉합하였다. 허혈부(좌심실) 내의 심근 색상이 적색에서 백색으로 변화하는 것에 의해 LAD 폐색을 확인하였다. 가슴을 닫고 피부를 6-0 실크사로 봉합하였다. 동물들을 케이지로 되돌려 보내고 완전히 회복될 때까지 관리감독하였다. 모든 래트들의 수술후 사망률은 20%였다.

외과적 LAD 폐색 후, 허혈부의 중요성을 마이크로-TEP 조영에 의해 평가하였다. 이어서 동물들을 무작위화하여 5일 동안 24 시간 마다 펩타이드(5mg/kg) 또는 위약(비히클)을 투여하였다.

심근 재형성 및 심근 기능에 대한 치료 효과를 연구하기 위해 제6주에 마이크로-TEP 조영 및 전도성 카테터(Millar)를 이용하여 추가 평가를 실시하였다.

심근성 허혈 재관류의 래트 모델

영구 허혈의 경우와 동일한 수술을 동물에 대해 실시하되, 단 허혈 60분 후에 LAD 봉합을 풀어 허혈부를 재관류시켰다. 이후에는 전술한 것과 동일한 프로토콜을 실시하였다.

마이크로 PET 조영

모든 동물에 있어서, 약 70 MBq의 ¹⁸F-FDG (0.3-0.5 ml 용적)를 정맥내 주사하고 PET 기록 개시 60분 전에 단기 마취(1.5-2.5%의 이소플루란 흡입)시켰다. 전용의(dedicated) 소규모 동물 PET 시스템(Inveon, Siemens, Knoxville, TN, USA)을 이용하여, 이소플루란에 의해 연속 마취시키면서 리스트 모드로 기록하였다. 동물들을 엎드린 자세로 위치시키고 히팅 패드 위에 놓아 체온을 정상 범위로 유지시켰다. 동물들의 사지 말단의 내측 표면에 전극을 3개 꽂아 표준 ECG 모니터에 동물들을 연결시켰다. 기록 시간은 18F 방출의 경우 20분, 57Co 투과의 경우 6분이었다. 동시 타이밍 윈도우(coincidence timing window)는 3.4 ns로 설정되었고 에너지 윈도우는 350 keV와 650 keV 사이에 설정되었다. 16 심장 인터벌로 영상을 재구성하여, 보통의 심박수 값에 대해 11-15 ms의 시간 해상도(temporal resolution)를 제공하였다. 이들 조건 하에서, 축공간 해상도(axial spatial resolution)는 1.5 mm 미만이었다. 이에 더해, 스테레오리소그래피 공정으로 얻은 LV 래트 모형에 대해, 성체의 경우 LV 수축말기 볼륨의 하한치에 대응하는 100 μl를 상회하는 수준의 FDG PET 이미지에 의해 실제 캐비티 볼륨을 정밀하게 측정하였다.

전도 카테터( conductance catheter ) 연구

이소플루란으로 래트들을 마취시키고 2 F 고충실도(high-fidelity) 마이크로-마노미터 카테터(SPR-407, Millar Institute, Houston, TX, USA)를 우측 경동맥을 통해 LV 내로 삽입하였다. 이 Millar 카테터를 AcqKnowledge III 소프트웨어(ACQ 3.2)가 장착된 PC 인터페이스를 갖는 Harvard Data Acquisition System에 연결시켰다.

마우스에 있어서 죽상동맥경화증

12-주령의 수컷 ApoE-/- 마우스들을 지방 다이어트(지질 15%, 콜레스테롤 1.25%, 콜레이트 없음(no cholate))시키고 펩타이드 (100㎍/일) 또는 PBS를 매일 복강 주사하여 처리하였다. 지방 다이어트 실시 4주일 후, 분석을 위해 마우스들을 희생시켰다.

Red Oil을 이용하여 죽상경화판을 염색하고 대동맥동에서 정량하였다. 면역형광 염색 및 면역조직화학을 이용하여, 본 발명자들은 죽상경화판의 조성을 분석하였다. 마지막으로, 본 발명자들은 Potteaux 등이 개발한 펄스 염색 기술을 이용하여 죽상경화판에서의 단핵구 동원에 대한 펩타이드 처리 효과를 탐구하였다. 간단히 설명하면, 멸균 PBS에 1:4로 희석한 1 ㎛ Fluoresbrite 녹색 형광 플레인 마이크로스피어를 레트로-오비탈 정맥 주사함으로써 단핵구들을 생체내 표지하였다 [Potteaux 등, 2011]. 병변 내의 형광 비드 갯수(count)는 단핵구 동원을 반영하는 것이다.

결과

1. TREM -1- 및 TLT -1-유도된 펩타이드들은 대동맥에서 LPS -유도된 수축 및 내피 장애를 개선시킨다 .:

TREM-1 조절이 내피 혈관운동성(vasomotricity)에 직접 영향을 미치는지를 조사하기 위해, 본 발명자들은 정상 래트로부터 절제한 혈관을 LPS, αTREM-1 (TREM-1의 아고니스트), TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들 및 LR12-스크램블된 대조군 펩타이드를 이용하여 생체외 자극하거나 내피를 제거하였다. 우선, LPS 및 αTREM-1은 혈관운동성 손상을 유도하였다(도 1A 및 C). 이어서, TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들은 LPS-연관된 운동성 손상을 복구하였다(도 1B 및 C). 마지막으로, 모든 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들은 내피가 제거되자 그들의 이로운 효과를 상실하였다 (도 1B).

2. TREM -1은 대동맥 및 장간막 동맥으로부터의 내피 세포에서 발현된다:

TREM-1이 마우스의 대동맥 및 래트의 장간막 동맥으로부터의 내피 세포에서 발현하는지를 알아보기 위해, 본 발명자들은 혈관(내피가 있거나 없음)을 LPS로 6 시간 자극하였다(100ng/ml). Trem-1 발현은 마우스 대동맥 (도 2A) 및 래트 장간막 동맥 (도 2B) 양자 모두에서 내피가 존재할 경우에만 LPS 자극시 상향조절되었다.

본 발명자들은 따라서 TREM-1이 마우스의 대동맥 및 래트의 장간막 동맥으로부터의 내피 세포에서 발현한다는 것을 최초로 밝혀낸 것이다.

3. TREM -1은 폐 및 간의 미세혈관 내피 세포( LuMEC 및 LiMEC )에서 발현된다:

TREM-1은 폐와 간의 내피 세포에서 본질적으로(constitutively) 발현된다; 그의 발현은 패혈증 동안 LPS 자극에 의해 상향조절된다(도 3). 이러한 결과들은 실시간 RT-PCR에 의해 추가로 확인되었다 (도 3C).

Trem-1의 발현은 LPS에 의한 4시간의 자극 후 강하게 증가되었으며 그 후에는 감소하였다. 마찬가지로, Tnf-α 및 Il-6은 동일한 동력학을 나타내었다 (도 4).

예상대로, 세포를 LPS로 24 시간 자극시키자 다양한 시토카인들이 왕성하게 생산되었으며 그 농도는 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들에 의해 감소되었다 (도 5).

따라서, TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들에 의한 처리에 의해 내피 세포에 의한 전염증성 시토카인의 생산을 약화시킬 수 있었다.

4. TREM -1 조절은 패혈증-유도된 심장혈관 장애를 개선시킨다 :

마우스 모델: 본 발명자들은 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들의 투여가 마우스의 패혈증 쇼크 동안 평균 동맥압을 유지시키고 젖산 산증을 경감시킨다는 것을 관찰하였다. 혈관 시그널링 조사 결과 패혈증 동안 Akt 경로 뿐만 아니라 Cox-1 발현은 Cox-2 및 iNOS의 상향조절과 함께 손상되었다. 이러한 요소들은 혈관 장애가 TREM-1 조절에 의해 복구됨을 입증하는 것이다 (도 6).

래트 모델: 본 발명자들은 또한 고유한 심장 기능에도 초점을 맞춰 (도 7; 표 2) TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들에 의한 TREM-1 조절이 심장의 몇몇 파라미터들, 즉: ESPVR (수축말기압-체적 관계: End-Systolic Pressure-Volume Relationship), PRSW (Preload Recruitable Stroke Work), (dP/dt)max/Ved (좌심실압 마커) 및 LVEF (좌심실 박출계수: Left Ventricular Ejection Fraction)의 개선과 연관이 있음을 밝혀내었다.

표 2: TREM -1 조절은 패혈증-유도된 심장기능 장애에 대해 이롭다.

미니-피그 모델: 패혈증의 미니-피그 모델에서, 본 발명자들은 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들의 투여가 심혈관 부전을 경감시킨다는 것을 관찰하였다. 체적 레스큐시테이션(volume rescucitation)에도 불구하고, 복막염은 MAP(도 8A)의 급속한 저하를 유도하였다(대조군의 경우 7750 ± 540 mL vs. LR12 그룹의 경우 6500 ± 800 mL, p=0.137). 따라서, MAP > 85 mmHg로 유지하기 위해서, 각각 4/5 및 1/6 대조군 및 및 LR12-처리 동물에서 H12까지 노르에피네프린을 개시하였다. 혈압을 유지하는데 필요한 노르에피네프린 주입속도는 대조군에서보다 LR12-처리된 동물에서 유의적으로 더 낮았다(도 8A).

카디악 인덱스와 카디악 파워 인덱스(심장 성능을 더 잘 설명하는 것으로 믿어짐) 두 가지 모두는 저혈압과 관련하여 대조군에서 저감되었다. 이것은 SvO2 및 DO2의 점진적인 저하로 나타내진다 (도 8B). 다시금, LR12는심부전을 감소시키는데 있어서 유의적으로 이로운 효과를 나타내었다. 두 가지 그룹 모두에서 LR12에 의해 대폭 감소되기는 하였으나 점진적인 젖산 산증이 일어났다(도 8C)(p=0.0005).

원숭이 모델: 원숭이의 내독소 주입 모델에서, 본 발명자들은 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들의 투여에 의한 심혈관 부전의 감소를 관찰하였다. LPS 주사 후 심박수는 일시적으로 증가하였으며 LR12 주입 효과는 없었다(나타내지 않음). LPS 챌린지는 체온을 특히 H1과 H2 사이에서 약간 상승시켰지만, 위약(LR12scr) 및 LR12-처리된 동물 간의 차이는 유의적이지 않았다 (나타내지 않음).

사용된 LPS 투여량이 소량임에도 불구하고, 위약-처리군에서는 일시적으로 저혈압이 나타났다; 수축기 동맥압은 180분에서 25%까지 감소하였고 확장기 동맥압은 40%까지 감소하였다(p<0.001 vs. LR12 또는 대조군). 극명히 대조되는 바와 같이, LR12 처리된 원숭이들은 전혀 저혈압이 나타나지 않았으며 이들의 동맥압은 대조군 동물과 다르지 않았다 (도 9).

5. TREM -1은 심근 조직에서 발현하며 허혈이 일어나는 동안 상향조절된다:

TREM-1이 심장 조직에서 발현되는지 알아보기 위해, 심장동맥 결찰 전 그리고 심근경색(MI)으로부터 6, 24 및 96 시간 후 마우스의 건강한 부분과 경색부 두 가지 모두로부터 심근을 수확하였다. trem-1의 베이스라인 발현은 매우 낮은 반면 허혈은 점진적으로 발현을 상향조절하였으며 MI로부터 24 시간 후에 최대 수준에 도달하였다 (도 10A). 웨스턴 블롯에 의해서도 동일한 동력학이 단백질 수준에서 관찰되었다 (도 10B). 이와 대조적으로, 비경색부('건강한 부분')에서는 모든 시간을 통털어 TREM-1 발현이 낮게 유지되었다 (데이터 나타내지 않음).

6. TREM -1- 및 TLT -1-유도된 펩타이드들은 마우스에서 MI 동안 백혈구 동원을 조절하고 원격부로부터의 백혈구 이동을 제어한다:

마우스에서, 그리고 인간에서도 마찬가지로, 2가지 서로 다른 단핵구 서브타입이 존재한다, 즉: Ly-6C^하이 단핵구는 강력한 염증 매개자인 반면, Ly-6C^로우 단핵구는 반대 효과를 나타낸다 [NAHRENDORF et al, 2007]. TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들에 의한 Trem-1 조절은 Ly-6C^하이 단핵구에 의한 경색된 심근의 침윤을 완전히 없애는 반면, Ly-6C^로우 단핵구 동원을 일시적으로 증가시켰다. PMN 침윤은 LR12 처리에 의해서도 차단되었다(도 11A). 비록 TREM-1은 림프구에 의해 발현되지 않지만, Trem-1 조절은 B-세포 및 T-세포 이동성에 영향을 미쳤다: B- 및 CD8⁺-림프구 침윤은 감소된 반면, CD4⁺-세포 동원은 LR12-처리된 마우스에서 증가하였다.

경색된 심근으로의 백혈구 동원을 제어하는데 Trem-1이 중요한 것으로 여겨짐에 따라, 본 발명자들은 원격 영역들로부터의 세포 이동에 미치는 그의 영향을 조사하였다. 심근경색 후, 단핵구들은 24시간 이내에 비장으로부터 나와 심장을 침윤시킨다 (SWIRSKI, 외). 이 현상은 MI 후 최대 1주일 동안 비장 단핵구 함량을 급속히 감소시키면서 지속되는 것으로 관찰되었다. 이와 동시에, 순환 단백구의 숫자의 현저한 상승이 제72시간에 관찰된 한편, 골수(BM)에서는 점진적인 축적이 일어났다(도 11B). Trem-1 결실 또는 조절은 혈액 단핵구증가증 뿐만 아니라 비장의 단핵구 고갈을 거의 완전히 없앴다.

말초혈액 호중구 갯수는 제72시간에 증가하였으며 7일까지 베이스라인으로 회귀하였다. 이 호중구증가증은 Trem -1-녹아웃 또는 LR12 처리된 마우스에서는 관찰되지 않았다. 비장은 그들의 비장 함량이 거의 변화되지 않은 것으로 미루어 볼 때 호중구 생산/방출에 지대한 기여를 하는 것으로 보이지 않았다. BM에서는 점진적이고도 가장 완만한 축적이 관찰되었으며 그룹들 간에 이렇다할 차이는 없었다(도 11B).

B-, CD4⁺-, CD8⁺-림프구 수는 MI로부터 24시간 후 비장에서 극적으로 감소되었으며 이와 동시에 CD4⁺ 및 CD8⁺ 림프구감소증도 일어났다. 이어서, 제72시간에 증가된 수의 순환 림프구가 존재하였으며 이는 MI로부터 7일 후까지는 베이스라인으로 회귀하였다. Trem-1 차단에 의해 이 림프구 동력학 패턴은 방지되었다(도 11B).

단핵구 화학유인물질 단백질 1 (MCP-1 또는 CCL2), CX3CL1 (또는 프락탈카인: Fractalkine), 및 MCP-3 (또는 CCL7)은 각각 Ly-6C^하이, Ly-6C^로우 단핵구, 및 림프구를 염증성 부위로 동원시키는 것과 관련된 중요한 케모카인들이다. MCP-1, CX3CL1, 및 MCP-3의 혈장 농도는 MI로부터 24시간 증가하였다. MCP-1 및 MCP-3 수준은 처리된 마우스에서 현저히 감소되었다 (도 11C).

7. TREM -1- 및 TLT -1-유도된 펩타이드들은 마우스에 있어서 MI 동안 심근의 염증성 반응을 조절한다:

이어서 본 발명자들은 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들에 의한 TREM-1 조절이 침윤성 염증 세포의 활성화를 조절할 수 있는지를 연구조사하였다. MI에 이어 심근에 급속히 침습하는 염증 세포들은 iNOS 및 COX2 발현의 상향조절과 함께 p38 MAPK, 및 ERK ½의 인산화를 활성화시킨다. 이 활성화는 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들에 의해 부분적으로 무위로 돌아갔다 (도 12). 본 발명자들이 이들 단벡질들의 인산화/발현 동력학을 분석하는 내내, 펩타이드의 수준은 계속 감소하였다 (나타내지 않음). 이와 대조적으로, 생존(AKT)과 관련되거나 팽창을 감소시키는(SOCS3) 것으로 알려진 몇몇 단백질들은 모든 펩타이드들에 의해 상향조절되었다. 예를 들어, 글리코겐 합성효소 키나아제 3 (GSK3β)는 전염증성(pro-inflammatory) 및 소염성 시토카인의 생산을 제어하는데 중추적인 역할을 한다. 선천성 면역 세포에서, GSK3β 불활성화(인산화를 경유)는 시토카인의 생산을 억제하여 심근세포의 생존을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 여기서 본 발명자들은 GSK3β의 인산화가 대조군에 비해 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들에 의해 증가됨을 관찰하였다.

세포의 전염증 활성이 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들에 의해 조절되는 것으로 보임에 따라, 본 발명자들은 이것이 시토카인/케모카인 생산을 감소시키는 것으로 해석될 수 있을지 조사하였다.

본 발명자들이 다음에 시험한 선천성 면역 또는 내피 기능에 관련된 168종의 유전자들 가운데, 156종의 발현은 MI 후 24시간에서 대부분 관상동맥 결찰 후 심근 내에서 변경되었다. LR12 투여는 심근경색-유도된 유전자의 활성화에 반하였다.

예상된 바와 같이, MI는 다양한 시토카인 (IL6, IL13, IL17, IL27, IFNγ) 및 케모카인 (MIP2, JE)의 왕성한 생산을 유도하였다. 이들 단백질의 농도는 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들에 의해 감소되었다(도 13A). 정량적 PCR이 이러한 결과를 유전자 수준에서, 특히 MI로부터 6시간 후 확인해주었다 (도 13B).

따라서, TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들의 투여에 의해 경색부에서 MI-염증 반응을 조절할 수 있었다.

8. TREM -1- 및 TLT -1-유도된 펩타이드들은 심근경색 조직에서 프로테아제 활성을 감소시킨다.

침윤성 호중구 및 대식세포들은 경색된 심근에서 매트릭스 금속단백분해효소 9(metalloproteinase 9) (Mmp-9)를 발현한다. Mmp-9 활성은 금속단백분해효소-1 (Timp-1)의 조직 억제제에 의해 맞균형될 수 있다(counterbalanced). 이들 2종의 단백질들의 미묘한 밸런스는 심장부진(cardiac insufficienty)로 이끄는 심실재형성을 예방하는데 있어 중요한 역할을 한다. 여기서 본 발명자들은 Mmp-9 및 Timp-1 mRNA 발현이 대조군 마우스의 경색부에서 증가함을 관찰하였다. 이와 대조적으로, Mmp-9 발현은 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들로 처리된 동물에서는 낮게 유지된 반면 Timp-1은 매우 높게 상향조절되었다(도 14A, B). 따라서, Mmp-9 / Timp-1 비율은 대조군 마우스에서 항상 더 높았다. 경색부에 있어서 Mmp-9 젤라티나제 활성은 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들로 처리된 마우스 보다 대조군에서 항상 더 컸다 (도 14C).

이러한 결과는 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들이 MI 후 심장 구조를 보존하고 심장 재형성에 반대되는데 있어 이로운 역할을 한다는 가정을 뒷받침하는 것이다.

9. TREM -1- 및 TLT -1-유도된 펩타이드들은 마우스에 있어서 MI 후 생존능을 개선시킨다.:

이어서 본 발명자들은 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들이 MI 동안 어떠한 보호 효과를 갖는지 알아보고자 하였다. 성체 수컷 Balb/c 마우스에게 영구적인 관상동맥 결찰로부터 60분 후부터 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들, 또는 스크램블된 LR12를 반복 투여하였다 (5일 동안 매일 100㎍). LR12-처리된 동물들은 1 마리를 제외하고 전원 생존한 반면(도 15) 대조군 마우스의 40%는 죽었다 (Log-Rank 테스트; p<0.01). 유사한 결과가 다른 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들의 경우에도 얻어졌다.

지속적인 TREM-1 관여가 더더욱 해로운지를 조사하기 위해, 본 발명자들은 마우스들에게 아고니스트 항-TREM-1 mAb를 투여하였다. 이 처리는 사망률을 극적으로 증가시켜 겨우 20%만 생존하였다.

10. TREM -1- 및 TLT -1-유도된 펩타이드들은 래트에 있어서 심근성 허혈- 재관 류 후 심장 기능을 개선시킨다 :

MI의 보다 타당한 모델에서 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들의 역할을 알아보기 위해, 본 발명자들은 래트에 있어서 일시적인 관상동맥 결찰을 실시하였다 (허혈-재관류 모델: IR). 무작위화 후, 동물들을 마취(마이크로-TEP) 하에 조영하고 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들 (5일 동안 매일 3 mg/kg 씩 복강투여). 이어서 전도성 카테터(Millar)를 이용하여 심장 기능을 연구하기 6주일 전에 반복 조영하였다.

IR 직후 제1일에, 두 그룹 모두는 서로 필적하였다. 경색무는 약간 중요하였고 심장 기능은 약간만 변경되었다. 제6주째, 모든 래트들은 거의 완전히 경색으로부터 치유되는 개선을 보였고 심실재형성(ventricular remodelling)도 일어나지 않았다 (표 3). 따라서, TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들은 마이크로-TEP에 의해 평가된 여러 파라미터들에는 영향을 미치지 않았다. 이와 대조적으로, 전도 카테터에 의해 심장 기능을 조사한 경우, 본 발명자들은 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들이 Emax 또는 PRSW와 같은 중요한 수축 파라미터들을 극적으로 개선시키는 것을 관찰하였다 (도 16; 표 4).

따라서, 심근성 허혈의 상대적으로 마일드한 이 모델의 기간 동안에조차 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들의 투여에 의해 수축기 심장 기능을 복구할 수 있었다.

11. TREM -1- 및 TLT -1-유도된 펩타이드들은 래트에 있어서 심근경색 후 수축기 및 확장기 기능을 개선시킨다 :

본 발명자들은 마지막으로 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들에 의해 부여된 염증 반응의 조절이 심각한 MI 후 심장 기능 개선으로 이어지는 것으로 해석될 수 있는지 조사하였다. 본 발명자들은 무작위화에 앞서 래트들에 대해 영구적 관상동맥 결찰을 실시하고 전술한 바와 같이 조영하였다.

이번에도 제1일에는, 두 그룹 모두 완벽히 비슷하였다. 제6주차에, 중요한 심실확장의 존재에 의해 가늠되는 바와 같이 중요한 심장리모델링(cardiac remodelling)이 일어났다. 이 심장재형성은 적어도 부분적으로는 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들에 의해 변경되었다 (표 5). 심장부전(cardiac insufficienty)의 간접 마커로서, 대조군 동물들은 모든 펩타이드로 처리된 동물들에 비해 체중이 더 증가하였다.

전도성 카테터에 의해 심장 기능을 조사한 결과, 본 발명자들은 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들이 Emax, ESPVR, PRSW, dP/dTmin, dP/dTmax, 및 Ved와 같은 중요한 수축기 및 확장기 파라미터들을 극적으로 개선시켰음을 관찰하였다 (도 17).

이를 종합하면, 이들 데이터는 심근경색 후의 심장재형성 심부전을 방지하는데 있어서의 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들의 보호 효과를 뒷받침해주는 것이다.

12. TREM -1- 및 TLT -1-유도된 펩타이드들은 마우스에 있어서 죽상동맥경화증 발병을 방지한다:

Red Oil을 이용하여 죽상경화판을 염색하고 대동맥동에서 정량하였다. 흥미롭게도, TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들에 의한 처리에 의해 대동맥동 내의 병변 크기의 유의적인 30% 감소가 유도되었다 (103318 ㎛2 대 146736 ㎛2, P=0.02) (도 18). 이 결과는 두 번째 실험 세트에 의해 확인되었다.

13. TREM -1- 및 TLT -1-유도된 펩타이드들은 죽상판의 세포 조성을 변화시킨다:

면역형광 염색법 및 면역조직화학 기술을 이용하여, 본 발명자들은 플라크 조성을 분석하였다. 본 발명자들은 그룹들 간에 립프구 침윤(항-CD3 항체) 및 콜라겐 축적(Sirius Red)과 관련하여서는 어떠한 차이점도 관찰하지 못하였다. 그러나, 본 발명자들은 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들에 의해 처리된 마우스들로부터의 죽상동맥경화성 병변들에서는 대식세포 침윤이 유의적으로 27% 감소되었음을 발견하였다 (도 19).

14. TREM -1- 및 TLT -1-유도된 펩타이드들은 죽상동맥경화성 마우스에 있어서 혈액 백혈구 집단을 변형시킨다:

유세포분석을 이용하여, 본 발명자들은 혈액의 백혈구 집단을 분석하였다. 전통적 단핵구는 CD115+Gr1high였고 비-전통적 단핵구는 CD115+Gr1low였다. chow 다이어트 하의 apoE-/- 마우스들에 있어서, 오직 비-전통적 단핵구들만이 TREM을 발현하였다. 흥미롭게도, 고지방 다이어트는 비-전통적 단핵구에서 TREM-1의 발현을 증가시켰다(데이터 나타내지 않음).

이어서, 본 발명자들은 처리가 행해지는 동안 혈액 백혈구 집단에 대해 분석하였다. 제7일에, 본 발명자들은 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들로 처리된 마우스의 혈액에서 비-전통적 단핵구들이 유의적으로 감소함을 관찰하였다(도 20). 제28일에, 본 발명자들은 혈액 중 전통적 및 비-전통적 단핵구가 유의적으로 감소하는 것을 관찰하였다 (도 21).

15. TREM -1- 및 TLT -1-유도된 펩타이드들은 죽상경화판으로의 단핵구 동원을 감소시킨다:

마지막으로, 본 발명자들은 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들에 의한 처리가 죽상경화판에서 단핵구 동원에 미치는 효과를 알아보았다. 본 발명자들은 Potteaux 등이 개발한 펄스 염색 기술을 이용하였다. 간단히 설명하면, 멸균 PBS에 1:4로 희석한 1 ㎛ Fluoresbrite 녹색 형광 플레인 마이크로스피어를 레트로-오비탈 정맥 주사함으로써 단핵구들을 생체내 표지하였다 [Ait-Oufella H. 외, 2011]. 병변 내의 형광 비드 갯수(count)는 단핵구 동원을 반영하는 것이다. 처리된 apoE-/- 마우스들을 희생시키기 24 시간 전에 비드를 주사하였다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 대조군에 비해 TREM-1- 및 TLT-1-유도된 펩타이드들에 의해 처리된 그룹에서 단핵구 침윤이 유의적으로 감소하였음을 발견하였다(도 22).

참고문헌

본 명세서 전반에 걸쳐, 다양한 참고문헌들이 본 발명이 속한 기술분야의 기술 수준을 설명한다. 이들 참고문헌의 개시내용은 본 명세서에 참조 통합되었다.

Ait-Oufella H, Taleb S, Mallat Z, Tedgui A. Recent advances on the role of cytokines in atherosclerosis. ArteriosclerThrombVascBiol 31 (5):969-979 (2011).

Bjorkbacka H, Kunjathoor VV, Moore KJ, Koehn S, Ordija CM, Lee MA, Means T, Halmen K., Luster AD., Golenbock DT., Freeman MW. Reduced atherosclerosis in MyD88-null mice links elevated serum cholesterol levels to activation of innate immunity signaling pathways. Nat Med 10 (4):416-421(2004).

Daqing W. Hartwell., Tanya N. Mayadas., Gaetan Berger., Paul S. Frenette., Helen Rayburn., Richard O. Hynes., Denisa D. Wagner. Role of P-selectin cytoplasmic domain in granular targeting in vivo and in early inflammatory responses.Journal of Cell Biology; 143 4:1129 1141 (1998).

Derive M, Bouazza Y, Sennoun N, Marchionni S, Quigley L, Washington V, Massin F, Max JP, Ford J, Alauzet C, Levy B, McVicar DW, Gibot S. Soluble TREM-like transcript-1 regulates leukocyte activation and controls microbial sepsis. J Immunol. 2012 Jun 1;188(11):5585-92. Epub 2012 May 2.

Entman M.L., Smith C.W.Postreperfusion inflammation. A model for reaction to injury in cardiovascular disease. Cardiovasc Res 9:1301-1311 (1994).

Hara H, Saito T. CARD9 versus CARMA1 in innate and adaptive immunity. Trends in Immunology ;30:234-242 (2009).

Harjot K Saini., Yan-Jun Xu., Ming Zhang., Peter P Liu., Lorrie A Kirshenbaum., NaranjanSDhalla. Role of tumour necrosis factor-alpha and other cytokines in ischemia-reperfusion-induced injury in the heart. ExpClinCardiol. 2005 Winter; 10(4): 213-222.

Libby P. Inflammation in atherosclerosis. Nature 420 (6917):868-874 (2002).

Mehta J.L., Li D.Y. Inflammation in ischemic heart disease: response to tissue injury or a pathogenetic villain. Cardiovasc Res;2:291-299 (1999).

Nahrendorf M, Swirski FK, Aikawa E, Stangenberg L, Wurdinger T, Figueiredo JL, Libby P, Weissleder R, Pittet MJ. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. J Exp Med 204, 3037-3047 (2007).

Potteaux S, Gautier EL, Hutchison SB, van Rooijen N, Rader DJ, Thomas MJ, Sorci-Thomas MG, Randolph GJ Suppressed monocyte recruitment drives macrophage removal from atherosclerosis of Apoe-/- mice during disease regression. J Clin Invest 121 (5):2025-2036 (2011). doi:43802 [pii] 10.1172/JCI43802.

Radsak MP, Salih HR, Rammensee H, Schild H. Triggering receptor expressed on myeloid cells-1 in neutrophil inflammatory responses: differential regulation of activation and survival. J. Immunol;172:4956-4963 (2004).

Swirski FK, Nahrendorf M, Etzrodt M, Wildgruber M, Cortez-Retamozo V, Panizzi P, Figueiredo JL, Kohler RH, Chudnovskiy A, Waterman P, Aikawa E, Mempel TR, Libby P, Weissleder R, Pittet MJ. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites.Science 325, 612-616 (2009).

Washington AV, Gibot S, Acevedo I, Gattis J, Quigley L, Feltz R, De La Mota A, Schubert RL, Gomez-Rodriguez J, Cheng J, Dutra A, Pak E, Chertov O, Rivera L, Morales J, Lubkowski J, Hunter R, Schwartzberg PL, McVicar DW. TREM-like transcript-1 protects against inflammation-associated hemorrhage by facilitating platelet aggregation in mice and humans. J Clin Invest. 2009 Jun;119(6):1489-501.

SEQUENCE LISTING <110> INSERM ; Universit?de Lorraine <120> INHIBITING PEPTIDES DERIVED FROM TRIGGERING RECEPTOR EXPRESSED ON MYELOID CELLS-1 (TREM-1) TREM-LIKE TRANSCRIPT 1 (TLT-1) AND USES THEREOF <130> 303/PCT <160> 13 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 311 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Glu Gly Gln 1 5 10 15 Gly Ile Val Gly Ser Leu Pro Glu Val Leu Gln Ala Pro Val Gly Ser 20 25 30 Ser Ile Leu Val Gln Cys His Tyr Arg Leu Gln Asp Val Lys Ala Gln 35 40 45 Lys Val Trp Cys Arg Phe Leu Pro Glu Gly Cys Gln Pro Leu Val Ser 50 55 60 Ser Ala Val Asp Arg Arg Ala Pro Ala Gly Arg Arg Thr Phe Leu Thr 65 70 75 80 Asp Leu Gly Gly Gly Leu Leu Gln Val Glu Met Val Thr Leu Gln Glu 85 90 95 Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Gly Cys Met Val Asp Gly Ala Arg Gly Pro 100 105 110 Gln Ile Leu His Arg Val Ser Leu Asn Ile Leu Pro Pro Glu Glu Glu 115 120 125 Glu Glu Thr His Lys Ile Gly Ser Leu Ala Glu Asn Ala Phe Ser Asp 130 135 140 Pro Ala Gly Ser Ala Asn Pro Leu Glu Pro Ser Gln Asp Glu Lys Ser 145 150 155 160 Ile Pro Leu Ile Trp Gly Ala Val Leu Leu Val Gly Leu Leu Val Ala 165 170 175 Ala Val Val Leu Phe Ala Val Met Ala Lys Arg Lys Gln Gly Asn Arg 180 185 190 Leu Gly Val Cys Gly Arg Phe Leu Ser Ser Arg Val Ser Gly Met Asn 195 200 205 Pro Ser Ser Val Val His His Val Ser Asp Ser Gly Pro Ala Ala Glu 210 215 220 Leu Pro Leu Asp Val Pro His Ile Arg Leu Asp Ser Pro Pro Ser Phe 225 230 235 240 Asp Asn Thr Thr Tyr Thr Ser Leu Pro Leu Asp Ser Pro Ser Gly Lys 245 250 255 Pro Ser Leu Pro Ala Pro Ser Ser Leu Pro Pro Leu Pro Pro Lys Val 260 265 270 Leu Val Cys Ser Lys Pro Val Thr Tyr Ala Thr Val Ile Phe Pro Gly 275 280 285 Gly Asn Lys Gly Gly Gly Thr Ser Cys Gly Pro Ala Gln Asn Pro Pro 290 295 300 Asn Asn Gln Thr Pro Ser Ser 305 310 <210> 2 <211> 234 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Lys Thr Arg Leu Trp Gly Leu Leu Trp Met Leu Phe Val Ser 1 5 10 15 Glu Leu Arg Ala Ala Thr Lys Leu Thr Glu Glu Lys Tyr Glu Leu Lys 20 25 30 Glu Gly Gln Thr Leu Asp Val Lys Cys Asp Tyr Thr Leu Glu Lys Phe 35 40 45 Ala Ser Ser Gln Lys Ala Trp Gln Ile Ile Arg Asp Gly Glu Met Pro 50 55 60 Lys Thr Leu Ala Cys Thr Glu Arg Pro Ser Lys Asn Ser His Pro Val 65 70 75 80 Gln Val Gly Arg Ile Ile Leu Glu Asp Tyr His Asp His Gly Leu Leu 85 90 95 Arg Val Arg Met Val Asn Leu Gln Val Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Gln 100 105 110 Cys Val Ile Tyr Gln Pro Pro Lys Glu Pro His Met Leu Phe Asp Arg 115 120 125 Ile Arg Leu Val Val Thr Lys Gly Phe Ser Gly Thr Pro Gly Ser Asn 130 135 140 Glu Asn Ser Thr Gln Asn Val Tyr Lys Ile Pro Pro Thr Thr Thr Lys 145 150 155 160 Ala Leu Cys Pro Leu Tyr Thr Ser Pro Arg Thr Val Thr Gln Ala Pro 165 170 175 Pro Lys Ser Thr Ala Asp Val Ser Thr Pro Asp Ser Glu Ile Asn Leu 180 185 190 Thr Asn Val Thr Asp Ile Ile Arg Val Pro Val Phe Asn Ile Val Ile 195 200 205 Leu Leu Ala Gly Gly Phe Leu Ser Lys Ser Leu Val Phe Ser Val Leu 210 215 220 Phe Ala Val Thr Leu Arg Ser Phe Val Pro 225 230 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Leu Gln Glu Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Gly Cys Met Val Asp Gly Ala 1 5 10 15 Arg <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Leu Gln Glu Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Gly Cys Met 1 5 10 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Leu Gln Glu Glu Asp Ala 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Glu Asp Ala Gly Glu Tyr 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gly Glu Tyr Gly Cys Met 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Leu Gln Val Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Gln Cys Val Ile Tyr Gln Pro 1 5 10 15 Pro <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Leu Gln Val Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Gln Cys Val 1 5 10 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Leu Gln Val Glu Asp Ser 1 5 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Glu Asp Ser Gly Leu Tyr 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Gly Leu Tyr Gln Cys Val 1 5 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide scramble <400> 13 Glu Leu Met Glu Gly Gly Gln Glu Cys Ala Asp Tyr 1 5 10

Claims (12)

1. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 3으로부터의 적어도 6개의 연속 아미노산을 포함하고 6 내지 20개의 아미노산 길이를 갖는 펩타이드를 포함하는, 심혈관 질환의 치료에 사용되기 위한 의약 조성물.
2. 제1항에 있어서, 펩타이드는 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, 및 SEQ ID NO: 7로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 의약 조성물.
3. 제1항에 있어서, 펩타이드는 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, 및 SEQ ID NO: 7로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것인 의약 조성물.
4. 제1항에 있어서, 펩타이드는 SEQ ID NO: 4에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 것인 의약 조성물.
5. 제1항에 있어서, 심혈관 질환은 급성 심근경색, 급성 관상동맥 증후군, 뇌졸중, 급성 심부전으로부터 선택되는 것인 의약 조성물.
6. 제1항에 있어서, 심혈관 질환은 심근경색인 의약 조성물.
7. 제1항에 있어서, 심혈관질환은 죽상동맥경화증인 의약 조성물.
8. 제1항에 있어서, 펩타이드는 이를 필요로 하는 대상자에게 주사되기 위한 것인 의약 조성물.
9. 제1항에 있어서, 펩타이드는 1종 이상의 다른 항-심혈관계 질환 화합물과 조합하여 투여되는 것인 의약 조성물.
10. 제9항에 있어서, 상기 1종 이상의 다른 항-심혈관계 질환 화합물은 스타틴 화합물, 항응집 접근법, 항-알도스테론 화합물, ACE 억제제 및 베타-차단제로부터 선택되는 것인 의약 조성물.
11. 삭제
12. 삭제

Images