CN104837865B - 衍生自髓样细胞触发受体-1(trem-1)trem-样转录物1(tlt-1)的抑制肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：2的至少6个连续氨基酸的肽以及功能保守变体。本发明还涉及用于治疗心血管病的包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的至少6个连续氨基酸的肽和功能保守变体。

Description

衍生自髓样细胞触发受体-1(TREM-1)TREM-样转录物1(TLT- 1)的抑制肽及其用途

技术领域

本发明涉及包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：2的至少6个连续氨基酸的肽以及功能保守变体。本发明还涉及用于治疗心血管病的包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的至少6个连续氨基酸的肽和功能保守变体。

背景技术

心血管病是许多疾病的标志，是全世界死亡的主要原因。

心肌梗死或脑梗死是由有害和损伤的、持久或者短暂的心肌缺血引起的复杂的临床表现的实例。这通常由冠状动脉/脑动脉闭塞引起，导致氧供求失衡。

组织损伤取决于缺血持续时间。对于短至5分钟的缺血，缺血组织在再灌注后最终会恢复，而没有梗死症状或者致命后果。然而，显著持续时间的缺血导致梗死和炎症反应。的确，梗死与炎症反应有关，而炎症反应是愈合和瘢痕形成的先决条件[Entman M.L.等，1994和Mehta J.L.等，1999]。当缺血组织被再灌注时，该反应在强度和持续时间方面被放大。

该反应是多相的：最初的缺血诱导坏死、自由基氧簇形成、补体活化、和通过TNF-α释放启动的细胞因子级联。梗死区的再灌注期与负责募集白细胞于缺血部位的增强的和加速的炎症反应有关。招募的白细胞还参与炎症介质的原位和全身释放，最终导致超活化的炎症状态，造成梗死的病理生理结果。

所有的炎症介质具有有争议的效应。的确，梗死病理生理学在它们的有益效果与有害效果之间达到平衡。例如，TNF-α在心肌缺血过程中表现出细胞保护作用以及有害作用[Harjot K Saini.等，2005]，这要取决于其表达和释放的时间、持续时间和水平。这可以解释基于阻断此类炎症介质的治疗的复杂性。

炎症介质(细胞因子、趋化因子、ROS等)的释放和大量白细胞募集在从因动脉闭塞触发的早期损伤事件至构成缺血后组织恢复基础的后期再生过程的缺血级联的所有阶段过程中起着重要的作用。靶向该炎症反应的诸多治疗策略未能证明具有任何功效。现在似乎很明显，值得去对放大环路施加作用，而不是对个别的缺血诱导炎症介质施加作用。

动脉粥样硬化通过动脉的缓慢进行性损伤形成和管腔狭窄引起脑血管病和冠状动脉病。当斑块破裂和血栓形成时，这些最常见形式的心血管病表现为急性冠状动脉综合征(ACS)、心肌梗死或者中风。对人和动物的研究已经确定，动脉粥样硬化由动脉壁内的慢性炎症过程驱动，所述的慢性炎症主要响应于内源改变的结构、特别是刺激先天性和适应性免疫反应两者的氧化脂蛋白而被启动。先天性反应由血管细胞和单核细胞/巨噬细胞两者的活化引起，随后，针对被抗原呈递细胞呈递至效应器T淋巴细胞的大量潜在抗原产生获得性免疫反应[Ait-Oufella H等，2011]。遗传修饰的小鼠模型教导我们，循环的单核细胞被趋化因子募集进入到血管壁内，然后变成巨噬细胞和荷脂泡沫细胞。内膜巨噬细胞促进通过细胞因子释放导致的斑块形成、炎症放大和通过产生蛋白酶和凋亡积累而导致的斑块去稳定化[Libby P.2002]。

单核细胞/巨噬细胞由与PRR(病原体识别受体的简称)相互作用的称作PAMP(病原体相关分子模式的简称)的多种介质刺激。数种PRR是导致动脉粥样硬化的生理病理的原因。例如，Toll样受体在人和动物动脉粥样硬化病变中表达。对TLR抑制降低了小鼠内的动脉粥样硬化的形成，表明靶向此种通路可以对抗动脉粥样硬化[Bjorkbacka H等，2004]。

最近，已经描述了一个新的在髓样细胞上表达的受体家族：髓样细胞触发受体(Triggering Receptors Expressed on Myeloid cells,TREM)。在该家族当中，TREM-1表达于单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞上。TREM-1活化导致细胞因子和趋化因子的产生(TNF-α、IL-6、IL-8、MCP-1、MCP-3、MIP-1α...)，同时伴随着快速的中性粒细胞脱粒和氧化爆发(oxidative burst)[Radsak MP等，2004和Hara H，等，2009]。

TREM-1的功能是通过与TLR协同触发旺盛的免疫反应而调整/放大炎症，而不是活化/启动炎症。TREM-1的病理生理作用首先在感染疾病中鉴定。已知TREM-1在急性(肠系膜缺血再灌注、出血性休克、胰腺炎等)和慢性(炎症性肠病、风湿性疾病等)两者的无菌炎症中起着重要的作用。

TLT-1(TREM-样转录物-1)是TREM家族的一个成员但是仅存在于巨核细胞和血小板内。首先鉴定出TLT-1通过连接血纤蛋白原和稳定血小板聚集物在血小板聚集过程中起作用。但是来自本发明人实验室的对TLT-1、可溶性TLT-1和sTLT-1衍生多肽的新发现表明，TLT-1通过特异性地抑制TREM-1而在炎症中起作用[Derive M等，2012，WO2010/124685]。

Washington等描述了TLT-1在炎症中通过促进血管损伤部位的血小板聚集起保护性作用(Washington等J Clin Invest.2009)。

由于已知血小板聚集与心血管病过程中的最坏结果(例如心肌梗死和动脉粥样硬化)有关，因此令人惊奇地发现TLT-1-衍生肽对心血管病具有治疗作用。

发明人在此描述了TREM-1：1)由来自主动脉、肠系膜动脉的内皮细胞和微血管细胞表达，2)由心肌组织表达，并且其表达在心肌缺血(持久心肌缺血和短暂心肌缺血)后的梗死区上调，3)由招募到动脉粥样化斑内的巨噬细胞表达。

他们还证明，TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽两者均能够特异性地抑制TREM-1，和降低心肌梗死和动脉粥样硬化中的TREM-1相关炎症反应。

结果，在两种不同模式的心肌缺血(持久缺血和短暂缺血)的急性期中施用这些肽有助于调节原位炎症反应和随后的白细胞运输，因此限制了缺血后心脏重构和更后阶段的疾病进展。的确，在持久缺血以及短暂缺血(缺血-再灌注)事件后6周心脏功能极大改善。这导致存活增加。

他们最终证明了TREM-1衍生肽和TLT-1-衍生肽通过特异性地抑制TREM-1在降低动脉粥样化斑块形成的程度中的作用。

因此，本发明涉及包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：2的至少6个连续氨基酸的肽和功能保守变体。

此外，本发明涉及用于治疗心血管病的包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的至少6个连续氨基酸的肽和功能保守变体，或者根据本发明的分离的核酸、表达载体、宿主细胞。

发明内容

本发明的一个目的是用于治疗心血管病的包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的至少6个连续氨基酸的肽和功能保守变体。

在一个实施方案中，用于治疗心血管病的所述肽包含选自SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的6个连续氨基酸序列。

在一个实施方案中，心血管病是心肌梗死。

在另一个实施方案中，心血管病是动脉粥样硬化。

本发明的另一个目的是包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：2的至少6个连续氨基酸的肽和功能保守变体。

在一个实施方案中，所述肽包含选自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的6个连续氨基酸序列。

在另一个实施方案中，所述肽包含如SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9所述的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，所述肽由如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQID NO：11或SEQ ID NO：12所述的氨基酸序列组成。

本发明的另一个目的是编码如上所述肽的分离的核酸序列。

本发明的另一个目的是包含如上所述核酸序列的表达载体。

本发明的另一个目的是包含如上所述表达载体的宿主细胞。

本发明的另一个目的是包含治疗有效量的至少一种如上所述肽、或者如上所述核酸、或者如上所述表达载体或者如上所述宿主细胞与至少一种可药用赋形剂的药物组合物。

具体实施方式

定义

在说明书通篇中，数个术语被采用并在下列段落中定义。

如本文所使用，术语“TREM-样转录物1”的简称“TLT-1”表示TREM家族的一个成员。来自Mcvicar小组的最初工作[Washington A.V.等，2004]证明，TLT-1是丰富的，对血小板和巨核细胞谱系具有特异性，并且被隔离在血小板α颗粒中。当血小板被凝血酶或者LPS活化时，TLT-1易位至血小板表面。TLT-1包含v-组Ig型-细胞外结构域、跨膜区和包含免疫受体酪氨酸基抑制性基序(ITIM)和聚脯氨酸丰富结构域的细胞质尾。与其他TREM家族成员不同，TLT-1不与DAP 12活化链偶联，而是已经证明它增强大鼠嗜碱粒细胞性白血病(RBL)细胞内的Ca⁺⁺信号，表明TLT-1是共活化受体。TLT-1的氨基酸序列被表述为氨基酸序列SEQ IDNO：1。

如本文所使用，术语“髓样细胞触发受体1”的简称“TREM-1”表示已经在人和鼠类多形核中性粒细胞和成熟单核细胞上鉴定出的细胞表面分子。它属于免疫球蛋白超家族并且借助于称作DAP12的衔接蛋白激活下游信号传递通路。在诸如绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细菌存在下，在细胞培养物中或者在来自感染患者的组织样品中，中性粒细胞和单核细胞上的TREM-1表达极大上调。与之鲜明对比，在来自由免疫复合物引起的非感染性炎症疾病诸如银屑病、溃疡性结肠炎或者血管炎的患者的样品中TREM-1没有上调。此外，当TREM-1与其配体结合时，观察到LPS协同效应和增强的促炎细胞因子诸如TNF-[α]的合成、连同对IL-10产生的抑制。TREM-1的氨基酸序列被描述为氨基酸序列SEQ ID NO：2。

本发明的肽，也称作TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽，描述于下表1中。

表1：本发明的肽

如本文所使用，术语“功能保守变体”表示衍生自本发明肽的、其中蛋白质或者酶中给定氨基酸残基已经被改变而该肽的总体构象和功能没有变化的肽，所述改变包括但不限于用具有相似特征(诸如，例如，极性、氢键合能、酸性、碱性、疏水性、芳香性等等)的氨基酸替代一种氨基酸。蛋白质中除了如所指出的保守的那些氨基酸之外的氨基酸也可以不同，以致于任何两个相似功能的蛋白质之间的蛋白质或氨基酸序列相似性百分数会不同，并且可以是如根据比对方法诸如Cluster法所确定的例如从70％至99％，其中相似性基于MEGALIGN算法。“功能保守变体”还包括如通过BLAST或FASTA算法所确定具有至少20％氨基酸同一性、优选40％、更优选60％、优选至少75％、最优选至少85％、并且甚至更优选至少90％氨基酸同一性、并且具有与相比的天然或者亲本蛋白质相同或者基本相似的特征或者功能的肽。

如本文所使用，术语“衍生物”指以其他方式修饰的本发明肽的变化形式或者其功能保守变体的变化形式，即通过共价连接任何类型的分子至所述肽，通过添加化合物到所述序列的任何氨基酸中，以改变该肽的体外或体内构象、活性、特异性、有效性或者稳定性。

如本文所使用，术语“治疗的”或“治疗”表示逆转、缓解、抑制该术语所针对的病状或病症、或者所述病状或病症的一个或者多个症状的进展，或者预防该术语所针对的病状或病症、或者所述病状或病症的一个或者多个症状。

根据本发明，术语“制药的”或“可药用”表示当根据需要向哺乳动物、尤其是向人施用时不产生有害反应、变态反应或者其他非希望的反应的实体和组成。可药用载体或者赋形剂指非毒性固体、半固体或者液体的填充剂、稀释剂、包封材料或者任何类型的制剂辅料。

根据本发明，术语待治疗的“患者”或者“个体”旨在指受或者可能受炎性病状影响的人或非人哺乳动物(诸如啮齿动物(小鼠、大鼠)、猫科、犬科或者灵长类)。优选地，受试者是人。

本发明的肽

本发明的第一个方面涉及包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：2的至少6个连续氨基酸的肽和功能保守变体。

本发明的另一个方面涉及包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：1的至少6个连续氨基酸的肽和功能保守变体。

在一个实施方案中，所述肽不是SEQ ID NO：1。

在一个实施方案中，所述肽不是SEQ ID NO：2。

在一个实施方案中，所述肽的长度小于50个氨基酸，小于40、35、30、25、20个氨基酸。

在一个优选的实施方案中，本发明的肽的长度为6至20个氨基酸、或者10至20个氨基酸、或者12至18个氨基酸或者14至16个氨基酸。

在一个优选的实施方案中，本发明的肽的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。

在另一个实施方案中，本发明的肽包含选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的6个连续氨基酸序列。

在另一个优选的实施方案中，本发明的肽包含如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：8所述的氨基酸序列。

在另一个优选的实施方案中，本发明的肽包含如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：9所述的氨基酸序列。

在另一个优选的实施方案中，本发明的肽由如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所述的氨基酸序列组成。

在另一个实施方案中，本发明的肽可具有D-构型或L-构型。

在另一个实施方案中，本发明的肽的氨基端的氨基酸具有乙酰化的末端氨基，并且羧基端的氨基酸具有酰胺化的末端羧基。所以，本发明还包括其中氨基末端被乙酰化或者其中羧基末端被酰胺化的本发明肽的衍生物。

此外，本发明的肽可经历可逆的化学修饰以增加其生物利用率(包括稳定性和脂溶性)及其穿过血脑屏障和上皮组织的能力。此类可逆化学修饰的实例包括用醇酯化谷氨酸和天门冬氨酸的羧基，由此去除所述氨基酸的负电荷并增强其疏水性。该酯化反应是可逆的，因为所形成的酯键被水解酯键的细胞内酯酶识别，恢复天门冬氨酸和谷氨酸残基的电荷。净的效应是细胞内肽的积累，因为内化的脱酯的肽不能跨过细胞膜。

此类可逆化学修饰的另一个实例包括添加可以增加膜通透性的另外的肽序列，诸如TAT肽或者Penetratin肽(参见-Charge-Dependent Translocation of the Trojan.AMolecular View on the Interaction of the Trojan Peptide Penetratin with the15Polar Interface of Lipid Bilayers.Biophysical Journal，87卷，1期，2004年7月1日，332-343页)。

本发明的肽可以通过常规的按照Fmoc和/或Boc基20方法的固相化学肽合成方法得到(参见Pennington，M.W.和Dunn，B.N.(1994).Peptide synthesis protocols.HumanaPress，Totowa)。

备选地，本发明的肽可以通过基于重组DNA技术的常规方法得到，例如通过这样的方法，简言之，包括插入编码本发明肽的核酸序列到合适的质粒或者载体中，将所述质粒或者载体转化感受态细胞，以及在允许本发明的肽表达的条件下培养所述细胞，并且根据需要通过这些领域专家已知的常规手段分离和(任选)纯化本发明的肽。编码本发明肽的核酸序列可以容易地从氨基酸与编码所述氨基酸的核苷酸密码子之间的对应关系推导出。在这种情况下，本发明的另一个目的是编码本发明肽的分离的核酸序列。在一个具体的实施方案中，所述核酸选自单链DNA、双链DNA和RNA。本发明的另外的目的是包含编码本发明肽的所述核酸系列的质粒和表达载体，以及表达本发明肽的原核或真核细胞。重组DNA技术的原理综述可参见例如名称为“Principles of Gene Manipulation：An 5 Introduction toGenetic Engineering”，R.W.Old & S.B.Primrose，由Blackwell ScientificPublications出版，第4版(1989)的教科书。

如所述，本发明还包括与本发明肽功能等效的肽或者“功能保守变体”。就本说明书中使用的意义而言，表述“功能等效的”意思是指所讨论的肽具有本发明肽的至少一个生物学活性，诸如，例如，降低炎症的能力。

通过开展简单的测试来评价因为该肽而导致心血管病中炎症的减少，本发明肽的效果对技术人员而言将变得显而易见。例如，在100ng/mL LPS和/或10μg/mL抗TREM-1mAb的存在下，存在或不存在20μg/mL多肽下，将5×10⁵个分离的人中性粒细胞或巨噬细胞或内皮细胞于37℃/5％CO₂下孵育24小时。然后收集上清液并且通过ELISA测量TNF-α、IL-6和GM-CSF浓度。如果所研究的肽抑制TREM-1，则与不含肽的情况相比，细胞因子浓度必须下降高达30％或更多。

本发明的核酸、载体和重组宿主细胞

本发明的第一个方面涉及编码本发明肽的核酸分子。

在优选的实施方案中，核酸分子编码具有序列SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的肽。

“编码序列”或者“编码”表达产物诸如RNA、肽、蛋白质或者酶的序列是当其表达时产生该RNA、肽、蛋白质或酶的核苷酸序列，即编码该肽、蛋白质或者酶的氨基酸序列的核苷酸序列。蛋白质的编码序列可以包括起始密码子(通常是ATG)和终止密码子。

这些核酸分子可以通过本领域技术人员众所周知的常规方法、特别是通过对编码天然蛋白质的基因的位点定向诱变得到。有代表性地，所述核酸是DNA或者RNA分子，其可以包含在适宜载体诸如质粒、粘粒、附加体、人工染色体、噬菌体或者病毒载体中。

因此，本发明的进一步的目的涉及其中本发明的核酸分子与控制转录的适宜元件(具体而言是启动子、增强子和任选的终止子)和任选的控制翻译的适宜元件相连的载体和表达盒，本发明还涉及本发明的核酸分子插入其中的重组载体。这些重组载体可以是例如克隆载体或者表达载体。

术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”意思是指通过其可将DNA或者RNA序列(例如外源基因)引入到宿主细胞内的媒介物，以转化宿主并且促进所引入序列的表达(例如转录和翻译)。

可以使用用于动物细胞的任何表达载体，只要编码本发明的肽或者嵌合衍生物的基因可以被插入和表达即可。适宜载体的实例包括pAGE107、pAGE103、pHSG274、pKCR、pSG1βd2-4等等。

质粒的其他实例包括包含复制起点的复制型质粒或者整合型质粒，诸如例如pUC、pcDNA、pBR等等。

病毒载体的其他实例包括腺病毒载体、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体和AAV载体。此类重组病毒可以通过本领域已知的技术产生，诸如通过感染包装细胞或者通过以辅助质粒或者30病毒瞬时转染。病毒包装细胞的典型实例包括PA317细胞、PsiCRIP细胞、GPenv+细胞、293细胞等。产生此类复制缺陷型重组病毒的详细方案可在例如WO 95/14785、WO 96/22378、US 5,882,877、US 6,013,516、US 4,861,719、US 5,278,056和WO 94/19478中找到。

在用于动物细胞的表达载体中使用的启动子和增强子实例包括SV40早期启动子和增强子(Mizukami T.等，1987)、莫洛尼小鼠白血病病毒LTR启动子和增强子(Kuwana Y等，1987)、免疫球蛋白H链启动子(Mason JO等，1985)和增强子(Gillies SD等，1983)等等。

本发明还包括包含本发明核酸分子的基因递送系统，其可以用于体内(in vivo)或者离体(ex vivo)基因治疗。这包括例如病毒转移载体，诸如衍生自的常规用于基因治疗的反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、慢病毒的那些病毒转移载体。这还包括包含本发明的核酸分子和非病毒基因递送媒介物的基因递送系统。非病毒基因递送媒介物的实例包括脂质体和聚合物诸如聚乙烯亚胺、环糊精、组氨酸/赖氨酸(HK)聚合物等。

本发明的另一个目的是以至少一种本发明的核酸分子进行遗传转化的原核或真核宿主细胞。

术语“转化”意思是“外源”(即外部的或者细胞外的)基因、DNA或者RNA序列向宿主细胞的引入，以使宿主细胞表达所引入的基因或者序列从而产生想要的物质，有代表性地是由所引入基因或者序列编码的蛋白质或者酶。接受并表达所引入DNA或者RNA的宿主细胞已经“被转化”。

优选地，为了表达和产生肽，尤其是本发明的肽，将选择真核细胞，尤其是哺乳动物细胞，更加具体的是人细胞。

有代表性地，细胞系诸如CHO、BHK-21、COS-7、C127、PER.C6或者HEK29325可以使用，因为它们具有对衍生物进行正确的翻译后修饰的能力。

可以使用常规分子生物学技术开展本发明表达载体的构建、宿主细胞的转化。本发明的V-ATP酶c-亚基衍生物可以通过例如培养本发明的遗传转化细胞并从培养基中回收由所述细胞表达的衍生物得到。必要时，它们随后可以通过本领域技术人员已知的常规方法纯化，例如通过分级沉淀尤其是硫酸铵沉淀、电泳、凝胶过滤、亲和层析等。

具体而言，用于制备和纯化重组蛋白的常规方法可以用于生产本发明的蛋白质。

治疗方法、用途和药物组合物

本发明的第三个目的涉及本发明的肽用于治疗心血管病。

本发明的一个目的是用于治疗需要治疗的受试者的心血管病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的如上所述肽。在一个实施方案中，所述方法包括施用如上所述肽，其中所述肽抑制TREM-1。

根据本发明的心血管病包括但不限于心肌和脑梗死、急性心肌梗死、缺血、冠心病、急性冠状动脉综合征、中风、动脉瘤、稳定型或者劳力型心绞痛、心肌病、高血压性心脏病、心力衰竭(慢性和急性)、肺原性心脏病、心律失常、炎症性心脏病诸如心内膜炎、心肌炎、外周动脉疾病、SIRS相关的心肌和血管功能障碍、动脉粥样硬化。

在一个实施方案中，心血管病病症是心肌梗死。

在另一个实施方案中，心血管病病症是动脉粥样硬化。

在另一个实施方案中，心血管病病症是SIRS相关的心肌和血管功能障碍。

在一个实施方案中，心血管病不是肠系膜缺血再灌注。

在另一个实施方案中，心血管病不包括多微生物脓毒病过程中的心血管保护。

在一个实施方案中，本发明的肽不用于治疗脓毒病。

在一个实施方案中，本发明的肽不用于治疗缺血和再灌注综合征。

在一个实施方案中，本发明的肽不用于治疗具有高凝病症的患者。

在一个实施方案中，本发明的肽不用于治疗炎症相关的出血。

在一个实施方案中，本发明的肽不用于治疗急性病毒性心肌炎。

在本发明的一个实施方案中，本发明的肽用于治疗选自心肌和脑梗死、心肌缺血、冠心病、中风、动脉瘤、稳定型或劳力型心绞痛、心肌病、高血压性心脏病、心力衰竭(慢性和急性)、肺原性心脏病、心律失常、炎症性心脏病诸如心内膜炎、心肌炎、外周动脉疾病、SIRS相关的心肌和血管功能障碍、和动脉粥样硬化的心血管病。

在一个具体的实施方案中，本发明涉及用于治疗心血管病的包含选自氨基酸序列SEQ ID NO 2的至少6个连续氨基酸的肽和功能保守变体，或者涉及包含选自氨基酸序列SEQ ID NO 1的至少6个连续氨基酸的肽和功能保守变体。

在一个具体的实施方案中，本发明涉及用于治疗心血管病的如SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11或者SEQ ID NO：12所述的氨基酸序列的肽。

在一个实施方案中，本发明还涉及用于治疗心血管病的本发明的分离的核酸或者本发明的质粒或者本发明的表达载体或者本发明的宿主细胞。

本发明的肽能够通过其诱饵受体的特性治疗炎症病症。

通过“诱饵受体”意思是指本发明的多肽(TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽)捕捉TREM-1配体并且阻止其对TREM-1的生理作用。

因此本发明的肽构成了联合治疗(针对数个治疗靶标)的一部分，目的是更有效地终止心血管病。

本发明的另外的目的是药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的至少一种本发明的肽与至少一种可药用赋形剂。在一个具体的实施方案中，所述药物组合物还包含一种或更多种(COOH)肽。备选地，本发明的药物组合物可包含治疗有效量的载体与至少一种佐剂和/或可药用赋形剂，所述载体包含至少一个编码本发明肽的核酸序列。所述载体可以用于基因治疗。

通过“治疗有效量”意思是指以适用于任何医学治疗的合理的收益/风险比治疗心血管病的本发明嵌合衍生物的充足量。

应当理解，本发明的化合物和组合物的总的每日剂量将由主治医生在合理医疗判断范围内决定。对于任何特定患者的特定的治疗有效剂量水平会依赖于多种因素，包括治疗的病症和病症的严重性；所采用特定化合物的活性；所采用的特定组合物；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和所采用特定化合物的排泄速率；治疗持续时间；与所采用的特定肽组合或同时使用的药物；和医疗领域众所周知的相似因素。例如，本领域已知，以低于达到所期望的治疗效果所需的水平的化合物剂量开始，并且逐渐增加剂量直到实现所期望的效果。然而，产物的每日剂量可以在从0.01至1,000mg/成人/天的宽范围里变化。优选地，组合物包含0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、250和500mg活性成分，以对待治疗的患者针对症状进行剂量的调整。药物有代表性地包含约0.01mg至约500mg活性成分，优选1mg至约100mg活性成分。药物的有效量通常以0.0002mg/kg至约20mg/kg体重/天、特别是约0.001mg/kg至7mg/kg体重/天的剂量水平提供。

可施用本发明的活性产物(肽、核酸、质粒、表达载体或者宿主细胞)用于治疗心血管病。

将施用的本发明活性产物[肽或载体(构建体)]的治疗有效量，以及使用本发明的肽和/或药物组合物用于治疗病理病症的剂量，会依赖于诸多因素，包括患者年龄和状况、障碍或病状的严重性、施用的方法和频率以及待使用的特定肽。

包含本发明肽或载体(构建体)的药物组合物可以呈适宜施用的任何形式，例如固体、液体或者半固体，诸如乳膏剂、软膏剂、凝胶或者溶液，并且这些组合物可以以任何适宜方式施用，例如经口、肠胃外、吸入或者局部表面(topically)，因此它们将包括制成所希望施用形式所需的可药用赋形剂。用于施用药物的不同药物形式以及得到这些药物形式所需的赋形剂的综述可以在例如“Tratado de Farmacia Gal nica”(Treatise on GalenicPharmacy)，C.FauliTrillo，1993，Luz n 5，S.A.Ediciones，Madrid中找到。

在用于口服、舌下、皮下、肌内、静脉内、经皮、局部、肺或者直肠施用的本发明的药物组合物中，所述活性成分可以单独地或者与另一种活性成分组合以单位施用形式作为与常规药物支持物的混合物向动物和人施用。适宜的单位施用形式包括口服途径形式诸如片剂、凝胶胶囊、散剂、颗粒剂和口服悬液或者溶液；舌下和含服施用形式、气溶胶、填埋剂、皮下、经皮、局部表面、腹膜内、肌内、静脉内、皮下、经皮、鞘内和鼻内施用形式和直肠施用形式。

优选地，药物组合物包含对于能够注射的制剂而言为可药用的媒介物。这些具体而言可以是等渗的无菌盐水溶液(磷酸二氢钠或者磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等等、或者此类盐的混合物)，或者干的、尤其是冷冻干燥的组合物，在添加无菌水或者生理盐水(视情况而定)时所述组合物可以构成可注射溶液。

适宜于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或者分散系；包含芝麻油、花生油或者水性丙二醇的制剂；和用于现场制备无菌可注射溶液或者分散系的无菌散剂。在所有情况下，所述形式必须是无菌的并且必须具有容易注射程度的流动性。它必须是在制造和储存条件下稳定的并且必须防止微生物诸如细菌和真菌的污染作用。

包含游离碱或者可药用盐形式的本发明化合物的溶液可以在与表面活性剂诸如羟丙基纤维素适当混合的水中制备。分散系也可以在甘油、液体聚乙二醇以及它们的混合物中和在油中制备。在常规的储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物生长。

本发明的肽可以制成中性或盐形式的组成。可药用盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，并且与无机酸诸如例如盐酸或磷酸、或者诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等等有机酸形成。与游离羧基形成的盐还可以自无机碱诸如例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或者氢氧化铁和诸如异丙胺、三甲基胺、组氨酸、普鲁卡因等等有机碱衍生。

载体还可以是溶剂或者分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等等)、它们的适宜混合物、和植物油。适当流动性的维持可以例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)，通过维持所需的颗粒大小(在分散系的情况下)，和通过使用表面活性剂。防止微生物作用可以通过多种抗细菌剂和抗真菌试剂，例如对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等等实现。在许多情况下，优选包括等渗试剂，例如糖或者氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延缓吸收剂例如单硬脂酸铝和明胶实现。

通过将需要量的活性肽与根据需要的数种上述其它成分一起掺入到合适溶剂中、然后过滤除菌制备无菌注射溶液。通常，通过将多种无菌活性成分掺入到含有基本分散介质和来自上面所列的所需其他成分的无菌媒介物中制备分散系。在用于制备无菌注射溶液的无菌散剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从先前的无菌过滤溶液得到活性成分加任何额外的所需成分的散剂。

一旦配制好，就将溶液以与剂量制剂相容的方式和治疗有效的量施用。制剂容易地以多种剂量形式施用，诸如上述的注射溶液类型，但是也可以采用药物释放胶囊等等。对于水溶液的肠胃外施用，例如，必要时应该对溶液进行适当的缓冲处理并且液体稀释剂首先用足够的盐水或葡萄糖进行等渗处理。这些特定的水溶液特别适宜于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这一点上，本领域技术人员根据本公开将会知晓可以采用的无菌水性介质。例如，可以将一个剂量溶解在1ml等渗NaCl溶液中并且加入到1000ml皮下灌注流体内或者在所提出的灌注部位注射。剂量上的一些改变必然会根据被治疗受试者的状况而出现。如论如何，负责施用的人会决定对于个体受试者的合适剂量。

本发明的肽可以配制成大约每剂包含约0.0001至1.0mg、或者约0.001至0.1mg、或者约0.1至1.0或者甚至约10mg的治疗混合物。

除了配制成用于肠胃外施用诸如静脉内或肌内注射的本发明的化合物之外，其它可药用形式包括例如用于口服施用的片剂或者其它固体；脂质体制剂；定时释放胶囊；和当前使用的任何其它形式。

如先前所提到，本发明的肽可以构成目的是更有效地终止心血管病的联合治疗的一部分。在这种情况下，本发明提供包含至少一种本发明的肽以及另一种或其它的抗心血管病化合物例如他汀化合物、抗凝血手段(anticoagulant approaches)、抗醛固酮化合物、ACE抑制剂(血管紧张素转换酶抑制剂)和β-阻断剂的药物组合物。

此外，本发明提供治疗哺乳动物心血管病的方法，其由以下步骤组成：向患有所述心血管病的所述哺乳动物施用治疗有效量的至少一种本发明的肽，或者包含编码本发明肽的至少一种DNA序列的载体，优选地以包含它们的药物组合物的形式。在本发明的一个具体的实施方案中，所述药物组合物除了包含本发明的一种或多种肽之外，还包含一种或更多种(COOH)肽。

在一个实施方案中，根据本发明的心血管病包括但不限于心肌和脑梗死、急性心肌梗死、缺血、冠心病、急性冠状动脉综合征、中风、动脉瘤、稳定型或劳力型心绞痛、心肌病、高血压性心脏病、心力衰竭(慢性和急性)、肺原性心脏病、心律失常、炎症性心脏病诸如心内膜炎、心肌炎、外周动脉疾病、SIRS相关的心肌和血管功能障碍、动脉粥样硬化。

本发明将通过下列附图和实施例进一步说明。然而，这些实施例和附图无论如何都不能解释为限制本发明的范围。

附图说明

图1：通过TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽对TREM-1的调节具有对抗被αTREM-1和LPS体外(in vitro)诱导的血管功能障碍的益处。

主动脉环中去氧肾上腺素(A和B)和乙酰胆碱(C)的浓度响应曲线。自健康大鼠收集主动脉并且用αTREM-1(5μg/mL)和LPS(10μg/mL)与或不与TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽或LR12-乱序肽体外刺激。B：一些主动脉被去内皮化(-E)。数据是至少5次不同实验的代表性数据，p值：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns：无显著性。

图2：TREM-1在来自传导性和阻力性动脉的内皮细胞内的表达。

如所指示用或者不用LPS刺激小鼠主动脉(传导性动脉)(A)和大鼠肠系膜动脉(阻力性动脉)(B)。通过qRT-PCR测定Trem-1的表达。数据是至少5次不同实验的代表数据，p值：***p值<0.001.ns(无显著性)。

图3：TREM-1在微血管内皮细胞内组成型表达并且是可诱导的。

通过流式细胞术分析从小鼠肺和肝脏分离的CD146+/VEGFR2+细胞(LuMEC和LiMEC)的TREM-1表达。TREM-1在Li/LuMEC上组成型表达(A)。在体内的实验性脓毒病期间(A)或者体外使用LPS进行1小时刺激时(B)可诱导TREM-1的表达。通过FACS还分析了TREM-1和VEGFR2表达动力学(C)。LPS诱导TREM-1和VEGFR2时间依赖性表达上调，这种上调被TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽阻止。数据是至少10次不同实验的代表性数据，p值：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图4：LPS刺激时的TREM-1表达动力学。

(A)用LPS体外刺激LuMEC(CD146+，VEGFR2+)4小时和12小时，并且通过qRT-PCR分析Trem-1(A)、Tnf-α(B)和Il-6(C)表达。数据是至少10次不同实验的代表性数据。

图5：TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽对使用LPS刺激24小时的LuMEC的细胞因子产生的作用。

(A)通过ELISA分析使用LPS刺激24小时的LuMEC的上清液中的蛋白质浓度。*，P<0.05；**，P<0.01.***，P<0.001。

(B)使用LPS刺激24小时的LUMEC中的细胞因子/趋化因子测量。数据表示为对照与使用TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽处理细胞之间的比值(比值>1表示对照中的浓度比处理细胞中的浓度更高)。

数据是至少10次不同实验的代表性数据。

图6：脓毒病期间体内损坏的血管细胞内信号传导途径被TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽对TREM-1的调节恢复。

TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽能够恢复Akt途径损伤和Cox-1表达以及能够恢复可诱导通路例如Cox-2和iNOS的上调。在主动脉(A)和肠系膜动脉(B)中测量了该作用。

数据是至少5次不同实验的代表性数据，p值：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图7：通过TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽对TREM-1的调节有益于对抗脓毒病诱导的心脏功能障碍。

在脓毒病诱导的心脏功能障碍的大鼠模型期间施用TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽与固有的心脏功能的增强有关，这经Millar导管所测量(FEVG，ESPVR，dpdtmax/Ved，PRSW)。

数据是至少10次不同实验的代表性数据。

图8：通过TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽对TREM-1的调节有益于对抗脓毒病诱导的低血压和心脏功能障碍。

(A)在脓毒病诱导的心脏功能障碍的迷你猪模型期间施用TLT-1-衍生肽和TREM-1-衍生肽与维持稳定的平均动脉血压(85mmHg)所需的去甲肾上腺素灌注的降低有关。的确，与对照相比，TLT-1-衍生肽和TREM-1-衍生肽处理的动物中MAP一直更高并且去甲肾上腺素剂量更低。

(B)心指数、心力指数(cardiac power index)、SvO2和氧递送的演变。所有这些参数在TLT-1-衍生肽和TREM-1-衍生肽处理动物中比在对照中更高。

(C)酸中毒和高乳酸血症的发展被LR12减弱。

LR12组，n＝6//LR12-乱序肽组n＝5。

图9：通过TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽对TREM-1的调节有益于对抗脓毒病诱导的舒张压、收缩压和平均动脉血压的改变。

在脓毒病诱导的心脏功能障碍(内毒素血症)的猴模型期间施用TLT-1-衍生肽和TREM-1-衍生肽完全阻止内毒素诱导的血压暂时下降(平均动脉血压(A)，收缩压(B)和舒张压(C))(p<0.001对照肽相对于LR12)。平均值±SD。N＝6/组。

图10：TREM-1在心肌组织中表达并且在缺血期间上调。

(A)基线心肌内和心肌梗死后6、12和24小时的梗死区内Trem-1的q-PCR mRNA定量。

(B)心肌梗死后24小时的TREM-1蛋白质定量。

数据是至少5次不同实验的代表性数据。结果是平均值±SD。p值为*p<0.001[健康区相对于梗死区]。

图11：TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽通过调节TREM-1控制梗塞心肌内的白细胞募集以及白细胞从远距离区室的动员。

(A)对用TLT-1-衍生肽和TREM-1-衍生肽或者对照肽(LR12-scr)处理的小鼠中不同时间点的梗塞心肌内的白细胞浸润的流式细胞术定量；n＝5只小鼠/组/时间点；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001对LR12-scr，^≠p<0.05，^≠≠p<0.01对假处理(sham)。

(B)对在MI后不同时间点的骨髓、血液和脾脏中的白细胞亚型的流式细胞术定量；每一时间点n＝6-7；***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05相对于LR12-scr处理小鼠；≠≠p<0.01，≠p<0.05相对于假处理小鼠。

(C)MI后的MCP-1和MCP-3血浆浓度；n＝5小鼠；***p<0.001相对于LR12-scr处理动物。

图12：TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽通过抑制TREM-1调节小鼠缺血期间的心肌炎症反应。

对于这些实验，在诱导心肌梗死后24小时从用TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽或对照LR12-乱序肽(“对照”)处理的小鼠得到心肌裂解物。研究了两个区域：在对照动物中远离梗死区采集的健康区、和梗死区。数据是至少5次不同实验的代表性数据。结果为平均值±SD。p值为*p<0.001[LR12相对于对照]。

使用抗磷酸化(p)-p38、(p)-ERK1/2、iNOS、Cox2、(p)-Akt、(p)-GSK3β、Socs3的抗体分析心肌组织裂解物的Western印迹。

图13：TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽对小鼠缺血期间心肌组织产生细胞因子的作用。

对于这些实验，在诱导心肌梗死后6、24和/或96小时从用TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽或对照LR12-乱序肽(“对照”)处理的小鼠得到心肌裂解物。分析梗死区的细胞因子/趋化因子产生。数据是至少5次不同实验的代表性数据。p值为*p<0.001[LR12相对于对照]。

(A)心肌梗死后24小时的梗死心肌组织内的细胞因子/趋化因子测量。数据表示为对照与TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽处理动物之间的比值(比值>1表示对照中的浓度比处理小鼠中的浓度高)。

(B)细胞因子的表达：心肌梗死后6、24和96小时梗死心肌组织内的Tnf-α、Il-6和IL-10mRNA水平。

图14：TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽通过抑制TREM-1降低心肌梗死区的蛋白酶活性。

对于这些实验，在诱导心肌梗死后6、24和/或96小时从用TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽或对照LR12-乱序肽(“对照”)处理的小鼠得到心肌裂解物。分析梗死区。数据是至少5次不同实验的代表性数据。

(A)Q-PCR mRNA定量Mmp9；

(B)Timp-1和；

(C)凝胶内酶谱的代表性结果，该结果反映基线、心肌梗死后12、24和96小时的Mmp-9明胶酶活性。上图：对照肽处理的动物；下图：LR12处理的动物。

图15：TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽通过抑制TREM-1促进小鼠心肌梗死后的存活。

成年雄性Balb/c小鼠(20-23g)经受心肌缺血，并且随机分组(n＝10-15/组)以接受重复的TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽(100μg于0.2mL NaCl0.9％中，每天一次，持续5天)、乱序的-LR12(100μg于0.2mL NaCl 0.9％中，每天一次，持续5天)、或者于0.2mL NaCl0.9％中的10μg抗TREM-1mAb，腹膜内注射。监测在1周里的存活情况并通过对数秩检验(LogRank test)对存活情况进行分析(在第5天之后没有死亡)。数据是至少15次不同实验的代表性数据。

图16：TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽通过抑制TREM-1改善大鼠内心肌缺血再灌注后的心脏功能。

成年雄性Wistar大鼠经受心肌缺血再灌注并且随机分组(n＝10)以接受重复的TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽(3mg/kg于0.2mL NaCl 0.9％中，每天一次，持续5天)或者乱序的-LR12(3mg/kg于0.2mL NaCl 0.9％中，每天一次，持续5天)。心肌损伤后6周，在麻醉下通过使用电导导管检查心脏功能。Emax、ESPVR和PRSW在以TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽处理的动物中比在对照大鼠中更高。所有的p<0.02[对照相对于LR12])。

图17：TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽通过抑制TREM-1改善大鼠心肌梗死后的收缩和舒张功能。

成年雄性Wistar大鼠经受心肌缺血并随机分组(n＝20)以接受重复的TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽(3mg/kg于0.2mL NaCl 0.9％中，每天一次，持续5天)或者乱序的-LR12(3mg/kg于0.2mL NaCl 0.9％中，每天一次，持续5天)。心肌损伤后6周，在麻醉下通过使用电导导管检查心脏功能。在以TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽处理的动物中所有的所研究参数均比在对照大鼠中好(所有的p<0.01[对照相对于LR12])。

图18：经4周每日腹膜内注射PBS(左)或LR12(右)处理的apoE-/-小鼠主动脉窦内的粥样硬化斑块。

以TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽处理减少了主动脉窦内动脉粥样硬化的发展，使用油红(Red Oil)染色进行评价的：LR12处理的103318μm²相对于媒介物施用的146736μm²，P＝0.02。数据是至少15个不同实验的代表性数据。

图19：粥样硬化斑块中的巨噬细胞染色(抗-MOMA2，红色)。

相对于对照动物，以TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽处理apoE-/-小鼠使粥样硬化斑块中的巨噬细胞浸润减少27％(p＝0.004)，如通过免疫荧光染色和免疫组织化学(抗-MOMA2)定量。

图20：TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽通过抑制TREM-1诱导在第7天减少了循环的非典型单核细胞群。

在染色后通过流式细胞术对动脉粥样硬化小鼠模型中循环的CD115⁺Gr1^低和CD115⁺Gr1^高单核细胞计数7天。数据是至少5次不同实验的代表性数据(P<0.05)。

图21：TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽通过抑制TREM-1在第28天减少了白细胞增多。

在染色后通过流式细胞术对动脉粥样硬化小鼠模型中循环的CD115⁺Gr1^低和CD115⁺Gr1^高单核细胞计数28天。单核细胞数据是至少5次不同实验的代表性数据。*p<0.05；**p<0.001。

图22：以TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽处理减少损害内的单核细胞浸润。

通过眶后静脉内注射在无菌PBS中以1:4稀释的1μm Fluoresbrite绿色荧光微球(Fluoresbrite green fluorescent plain microsphere)体内标记单核细胞。损害处的荧光珠计数反映了单核细胞的募集。数据是至少5次不同实验的代表性数据。P<0.05。

实施例

材料与方法

肽

基于GenBank|EMBL|DDBJ中的TLT-1和TREM-1序列(登录号AY078502、AF534822、AF241219和AF287008)，设计模拟它们胞外域的不同部分的TREM-1-肽和TLT-1-肽(TREM1-LP17、TREM1-LP12、TREM1-LP6-1、TREM1-LP6-2、TREM1-LP6-3、TLT1-LR17、TLT1-LR12、TLT1-LR6-1、TLT1-LR6-2和TLT1-LR6-3)。将它们化学合成(Pepscan Presto BV，Lelystad，荷兰)为C末端酰胺化肽用于体内分析。获得了正确的肽，得率>99％，并且在制备型纯化后为均质的，如通过质谱分析和分析型反相高效液相色谱所证实。这些肽不含内毒素。同样地合成相应的乱序肽并用作对照肽。

动物

所有操作规程均获得当地实验室动物护理和使用委员会的批准并且按照动物实验国际准则开展。小鼠和大鼠从Charles River(拉特拉斯堡，法国)得到。

小鼠胸主动脉和大鼠肠系膜动脉的分离

腹膜内注射戊巴比妥钠将动物麻醉。自腹部中线切开，并打开胸腔暴露胸主动脉(小鼠)或者肠系膜动脉(大鼠)。

将血管排空血液并在补充10％胎牛血清和抗生素的RPMI培养基中孵育20小时。随机应用不同的条件：1)对照血管，2)与LPS(10μg/mL)离体孵育的血管，3)LPS和肽处理，4)激动性αTREM-1(5μg/mL)，5)用LPS孵育并进行处理的去内皮化血管。

在一些实验中，从刺激后血管提取总RNA和蛋白质。

血管反应性

在微血管张力测定仪(wire myogrph,EMKA Technologies，法国)上研究主动脉血管反应性。实验于37℃下在含下列成分的生理盐溶液(PSS)中开展并连续地以95％O2和5％CO2鼓泡：119mmol/L NaCl，4.7mmol/L KCl，14.9mmol/L NaHCO3-，1.2mmol/L MgSO42-，2.5mmol/L CaCl2，1.18mmol/L KH2PO4-，和5.5mmol/L葡萄糖。在最佳被动张力下的平衡阶段(至少20分钟)之后，响应于KCl去极化(100mM)和10μM去氧肾上腺素(Phe)(Sigma-Aldrich，Saint Quentin Falavier，法国)的组合的两次连续收缩用于测试血管的最大收缩能力。在20分钟的清洗阶段之后，通过累积施用该血管收缩激动剂(1nM至100μM)得到对PE的浓度响应曲线。在新一次的清洗阶段之后，通过测试在通过1μM去氧肾上腺素(Phe)预收缩之后乙酰胆碱(ACh)(1nM至100μM；Sigma，St Louis，MO，美国)的舒张效果评价内皮依赖性舒张。使用乙酰胆碱(1μM)证实了功能性内皮的存在，所述乙酰胆碱引起舒张超过50％。

肺和肝脏微血管内皮细胞(LuMEC和LiMEC)的分离

深度麻醉下(戊巴比妥)处死小鼠收集肺和肝脏。按照先前所述的方法[Daqing等，1998]稍加修改进行小鼠肺和肝脏微血管内皮细胞的分离。简言之，将器官在10％FBS-DMEM中洗涤，切成1-2mm方块，并且用I型胶原酶(2mg/ml，Gibco)于37℃消化1小时，间或搅拌。细胞消化物经70μm细胞过滤器过滤，于1,500rpm离心并且将细胞铺板于明胶包被皿中，所述皿中装有补充20％FBS、100μg/ml ECGS(BD Biosciences)和抗生素的DMEM/F12培养基。在第1天，去除漂浮细胞并用PBS洗涤并加入新鲜培养基。5天后，使用CD146 MicroBead试剂盒首次纯化这些细胞。胰蛋白酶消化之后，将细胞重悬于生长培养基中，然后铺板于新的明胶包被皿中。15天后，按照相同的方法对细胞进行第二次纯化。证实了内皮细胞的纯度(>85％)和生存力。此外，通过FACS分析，通过流式细胞术确定VEGFR2和CD146表达来评价细胞表型。

迷你猪制备和监测脓毒病诱导低血压和脓毒病诱导心脏功能障碍

成年雄性迷你猪(Sus scrofadomestica，越南大肚迷你猪，30-40kg)购自ElevageFerry(Vosges，法国)。在手术之前，动物禁食过夜，自由取水。通过肌内施用氯胺酮(10mg/kg)和咪达唑仑(0.1mg/kg)开展麻醉准备。通过静脉内施用戊巴比妥(最初推注：10mg/kg，和连续施用6-8mg/kg/h)、间歇施用舒芬太尼(10μg)以及必要时施用潘可龙(pancuronium,4mg)引起并维持麻醉。将动物机械通气(潮气量8ml/kg，PEEP 5cm H2O，FiO2 0.21，呼吸频率14-16次呼吸/分钟，调整以维持正常二氧化碳血)。暴露左颈静脉并且插入三腔线(threelumen line)。右颈静脉也插入导管并放置Swan-Ganz导管使得可以连续记录心排血量、SvO2、和右心房及肺动脉压。插入右颈动脉导管用于连续测量动脉压。在膀胱内插入导管使得可以收集尿。

在仪器操作之后，行中线剖腹术从左结肠收集粪便：将1.5g/kg悬于200mL 0.9％NaCl中并于38℃孵育2小时。手术之后，在合适的位置放置一个管用于腹膜炎诱导和腹水流出。

手术之后，允许动物恢复2小时，然后进行基线测量(定义为‘H0’)。在整个研究过程中连续施用生理盐水(10mL/kg/h)。使用加热垫或者降温保持身体温度恒定(±1℃)。

在基线数据收集(H0)之后，通过采用腹部管施用自体粪便诱导腹膜炎，随后维持腹部管呈夹紧状态。2小时后(H2)，将动物随机接受LR12(LR12组，n＝6)或者仅媒介物(生理盐水)(对照组，n＝5)。在30分钟里静脉递送5mg/kg(于60mL中)的推注剂量，然后开始1mg/kg/h(15mL/h)灌注并持续整个研究期间。

在整个研究期间，动物护理由富有经验的重点护理医生严格遵守规则提供:

i)血液动力学靶标：主要的目标是维持高于85mmHg的平均动脉压(MAP)。为了实现该目标并且除了维持施用0.9％NaCl(7mL/kg/h)之外，可以使用羟乙基淀粉(最高达20mL/kg，在整个研究期间)(HES 130/0.4，费森尤斯)以提供中心静脉压(CVP)和肺动脉闭塞压(PAOP)为<18mmHg。当达到羟乙基淀粉最大容量时，开始连续灌注去甲肾上腺素，最高达10μg/kg/min。

ii)呼吸靶标：主要的目标是维持PaO2/FiO2比率>300和动脉PaCO2为35-45mmHg。因此，通过增加吸气/呼气比率接近于1:1，使PEEP最高达15cm H2O，和使呼吸频率最高达30次呼吸/min，可修改通气机设置。

iii)使用加热垫或者降温维持身体温度恒定(±1℃)。

iv)必要时，实施静脉内葡萄糖灌注以维持5-7mmol/L的血糖。

连续监测血液动力学参数，包括MAP、平均肺动脉血压(MPAP)、右心房压(RAP)、心排血量(CO)、心指数(CI)和SvO2。通过Swan-Ganz监测仪计算全身氧递送(DO2)和全身氧摄取(VO2)。心力指数(W/m²)计算为MAP×CI/451(24)。

准备猴和检测脓毒病诱导低血压和脓毒病诱导心脏功能障碍

使用雄性食蟹猴(Macacafascicularis)(2.8至3.5kg，24个月龄，Lemarinier，LaRoute Royale，绢毛猴，毛里求斯)。在LPS攻击前的那天将动物禁食，但完全自由饮水。CIToxLAB法国伦理文员会(CEC)审阅并批准了全部研究计划(Nr CEC：02221)。

药物施用和体内LPS攻击。

在LPS攻击前的那天记录生命体征和体重。第二天早上，收集基线临床实验室样本，并且记录一组基线生命体征。通过Teflon导管将药物施用到头静脉或者隐静脉内。对侧静脉用于LPS施用。

猴子随机接受LR12或者安慰剂(n＝6，每组)。另外一组4只猴子仅接受媒介物(NaCl 0.9％)灌注并作为对照组。

在时间点0时，开始15分钟的静脉内灌注LR12或者安慰剂溶液，通过校准的注射器泵(Harvard Apparatus)以12mL/h(5mg/kg，10分钟，2mL)的速度递送。然后以2mL/h的速度再连续灌注8小时(1mg/kg/h，8小时，16mL)。在10分钟期间施用静脉内推注LPS(10μg/kg)到对侧导管内，然后立即进行处理灌注。动物在束缚椅上以直立位保持清醒并且在整个研究期间持续禁食。

每15分钟监测一次脉搏和血压，持续1小时，然后每30分钟监测一次，持续7小时。

心肌梗死小鼠模型

所有操作在6-8周龄的雄性C57BL/C小鼠上开展。通过腹膜内注射甲苯噻嗪(60mg/kg)将小鼠麻醉并以仰卧位固定。气管插管并通气(潮气量为200μl/25g并且呼吸频率为120次呼吸/min)。在左侧胸廓切开之后，鉴别出左侧冠状动脉并且用8-0聚丙烯外科缝线在距离左心房尖1.0mm处结扎。通过缺血区(左心室)的心肌颜色从红色变成白色的改变证实了LAD闭塞。闭合胸部并且用6-0丝线缝合。将动物放回到笼中，监视动物直到完全痊愈。

在术后监测小鼠的死亡率。小鼠随机接受肽或者不接受肽(每天腹膜内注射，持续5天，5mg/kg)并且监测小鼠的存活情况。备选地，在6h、24h、96h(n＝6，每组)后通过过量戊巴比妥钠麻醉处死小鼠。行正中胸骨切开术，然后切除心脏并且剥离缺血和非缺血区。然后进行ARN提取和蛋白质提取用于RT-PCR、WB、免疫组织学和ELISA分析。

流式细胞术

如所述从健康C57BL/6和脓毒性(CLP)小鼠分离微血管内皮细胞(MEC)并与缀合FITC和PE的抗小鼠VEGFR2和抗TREM-1于4℃孵育20分钟。用PBS洗涤细胞两次并且在0.1％甲醛中固定，然后在流式细胞仪中分析。作为对照，使用相同浓度的小鼠IgG2a同种型。

在另外的实验中，在FACS分析之前MEC用LPS(0.1μg/ml)刺激2小时和6小时或者不刺激。

为了从梗死组织制备单细胞悬液，采集心脏；用精细剪剪碎；置于胶原酶I、胶原酶XI、DNA酶I和透明质酸酶混合物(Sigma-Aldrich)中；并且于37℃摇动1小时。然后将细胞充分研磨并离心(15min，500g，4℃)。

取出脾脏，使用3-ml注射器末端在HBSS中于4℃研磨，并且经70-μm尼龙过滤器(BD)过滤。细胞悬液于4℃下以300g离心10分钟。将红细胞裂解(红细胞裂解溶液，Miltenyi)，并将脾细胞用HBSS洗涤并重悬于补充有0.2％(wt/vol)BSA的HBSS中。使用柠檬酸盐溶液作为抗凝剂通过心脏穿刺抽取外周血，并且将红细胞裂解。最后，在用1mL HBSS冲洗，经70-μm尼龙过滤器过滤并于4℃下以300g离心10分钟之后，从股骨得到骨髓单细胞悬液。使用血球计数器用台盼蓝(BioRad)确定等分试样的活细胞总数。

细胞悬液在抗CD4⁺或CD8⁺T细胞(CD4-APC或CD8-APC、CD3ε-PE、CD45-FITC)、B细胞(CD19-PE、CD45-FITC)、粒细胞(CD45-FITC、Ly-6G-APC)、单核细胞亚组(CD115-PE、Ly-6C-APC、CD45-FITC)的mAb混合物中孵育，所有抗体来自Miltenyi Biotech。报告的细胞数量计算为总的活细胞(总活白细胞/ml)与所选择门内细胞百分数的乘积，并且报告为每mg组织(心脏)、每一器官(股骨和脾脏)或者每mL(血液)。数据在FC500细胞计数器(BeckmanCoulter)上获得。

RNA提取和聚合酶链式反应分析

使用RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen，Courtaboeuf，法国)从细胞或者缺血和非缺血区提取总RNA，并且用NanoDrop(ThermoScientific)定量，之后使用iScriptcDNA合成试剂盒(BioRad)进行逆转录并通过定量PCR使用针对mTREM-1、mTNF-α、mIL-6、mMMP-9、mTIMP-1和mActB的Qiagen可用探针(Quantitect Primers)定量。备选地，总RNA使用RT²第一链试剂盒(SABiosciences，Tebu-bio，LePerray-en-Yvelines，法国)逆转录用于PCR阵列(小鼠先天免疫/内皮细胞RT² Profiler PCR阵列，SABiosciences)。所有PCR均在MyiQ热循环仪上开展并且通过iQ5软件(Qiagen)定量。基因表达经ActB归一化。

蛋白质磷酸化分析

来自缺血和非缺血区的组织或者MEC用PhosphoSafe提取试剂(Novagen)裂解并于4℃以16,000g离心5分钟以收集上清液。蛋白质浓度根据Bradford法(Pierce)确定。然后，裂解物通过Western印迹(标准XT Bis-Tris凝胶，4-12％，BioRad以及PVDF膜，Millipore)分析，使用抗磷酸化-p38、抗-磷酸化–pERK1/2、抗-磷酸化-pAKT、抗-磷酸化-pGSK3β、抗-磷酸化-iNOS、抗-磷酸化-COX2、抗-磷酸化-SOCS3、抗-磷酸化-TREM-1和对应的缀合辣根过氧化物酶的二级抗体(Cell Signaling)以及SuperSignal West Femto底物(Pierce)显色。抗-p38、抗–ERK1/2、抗-AKT、抗-GSK3β或抗-微管蛋白用于归一化。还通过免疫印迹(磷酸化-激酶阵列；R&D Systems)研究了一组多磷酸化的蛋白质。通过LAS-4000成像仪和Multi-Gauge软件(Fujifilm)获得并开展定量信号密度分析。

细胞因子浓度测量

通过ELISA(小鼠Quantikine ELISA试剂盒，R&Dsystems)和细胞因子成组测定(Proteome Profiler小鼠细胞因子阵列试剂盒，板A，R&Dsystems)并根据制造商的推荐测量心肌裂解物(缺血和非缺血区)和MEC上清液中的细胞因子。

酶谱法

通过SDS-PAGE明胶酶谱法测定组织提取物中的MMP-9酶活性。组织提取物中存在的MMP-9降解明胶基质，在对凝胶进行蛋白质染色后留下清晰条带。简言之，将匀浆的和标准化的组织样品在无还原剂下变性并且通过在含明胶的7.5％SDS-PAGE凝胶中的电泳分离。然后将凝胶在Triton x-100(为了使蛋白质复性)存在下室温孵育2小时，然后在含10mMCaCl2、0.15M NaCl和50mM Tris(pH 7.5)的缓冲液中于37℃孵育过夜。之后，将凝胶用0.25％考马斯蓝染色。通过密度测量仪进行条带分析和定量。

心肌持久缺血大鼠模型

使用成年雄性Wistar大鼠(360-380g)。所有大鼠均用氯胺酮(100mg/kg，肌内施用)麻醉并机械通气。在左胸廓切开术之后，鉴别出左冠状动脉并用6-0聚丙烯外科缝线结扎。通过缺血区(左心室)内心肌由红色至白色的改变证实了LAD闭塞。闭合胸部并用6-0丝线缝合皮肤。将动物放回笼中，并监视它们直到它们完全愈合。所有大鼠的术后死亡率为20％。

在外科LAD闭合之后，通过微TEP成像评价缺血区的重要性。然后使动物随机接受肽(5mg/kg，每24小时一次，持续5天)或者安慰剂(媒介物)。

在6周时通过微TEP成像和电导导管(Millar)进一步评价以研究对心肌重建和心肌功能的治疗效应。

心肌缺血再灌注大鼠模型

动物接受与持久缺血中相同的手术，但是在缺血60分钟后通过释放LAD结扎使缺血区再灌注。然后采用如上所述相同的方案。

微PET成像

在所有动物中，在开始PET记录之前60分钟，将约70MBq的¹⁸F-FDG(体积为0.3–0.5ml)在短暂麻醉(1.5–2.5％异氟烷吸入)下静脉内注射。使用专门的小动物PET系统(Inveon，Siemens，Knoxville，TN，美国)在连续的异氟烷麻醉下获得列表模式的记录。将动物仰卧位放置并置于加热垫上以维持身体温度在正常范围内。通过置于四肢内表面的三个电极将动物与标准ECG监测器连接。18F发射的记录时间为20分钟，57Co透射的记录时间为6分钟。符合时间窗设定为3.4ns并且能量窗在350keV和650keV之间。重建了16个心脏间隔(cardiac interval)的图像，提供了对于普通心率值11–15ms的时间分辨率(temporalresolution)。在这些条件下，轴向空间分辨率(axial spatial resolution)小于1.5mm。此外，对于在通过立体造型方法得到的LV大鼠模体(phantom)，通过FDG PET成像精确地确定了实际的腔容积，其高于100μl的水平，所述100μl的水平对应于成年动物的LV收缩末期容积的下限。

电导导管研究

大鼠用异氟烷麻醉并且将2F高保真微压计导管(SPR-407，Millar Institute，Houston，TX，美国)通过右颈动脉插入到LV内。Millar导管与哈佛数据采集系统(HarvardData Acquisition System)相连，该采集系统与带有AcqKnowledge III软件的(ACQ 3.2)PC对接。

小鼠中的动脉粥样硬化

对12周龄雄性ApoE-/-小鼠安排脂肪饮食(脂质15％，胆固醇1.25％，无胆酸盐)并且通过每日腹膜内注射肽(100μg/天)或者PBS进行处理。脂肪饮食4周后，处死小鼠用于分析。

主动脉窦内的粥样硬化斑块用油红染色并定量。使用免疫荧光染色和免疫组织化学，我们分析了斑块组成。最终，我们使用Potteaux等人开发的脉冲染色技术探究了肽处理对粥样硬化斑块中单核细胞募集的影响。简言之，通过眶后静脉内注射在无菌PBS中以1:4稀释的1μm Fluoresbrite绿色荧光微球体内标记单核细胞[Potteaux等，2011]。损害内荧光珠计数反映了单核细胞募集。

结果

1.TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽改善大动脉内LPS-诱导的收缩和内皮功能障碍：

为了研究对TREM-1的调节是否能直接影响内皮血管运动力(endothelialvascomotricity)，我们使用LPS、αTREM-1(TREM-1激动剂)、TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽以及对照肽LR12-乱序肽间接体内刺激了从正常大鼠剥离的血管或者去内皮化血管。首先，LPS以及αTREM-1诱导了血管运动力损伤(图1A和C)。然后，TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽恢复了与LPS相关的血管运动力损伤(图1B和C)。最后，当内皮被去除时，所有的TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽均丧失它们的有益作用(图1B)。

2.TREM-1在来自主动脉和肠系膜动脉的内皮细胞上表达:

为了确定TREM-1是否在来自小鼠主动脉和大鼠肠系膜动脉的内皮细胞中表达，我们使用LPS刺激血管(具有或者不具有内皮)6小时(100ng/ml)。仅当小鼠主动脉(图2A)和大鼠肠系膜动脉(图2B)中的内皮存在时，在LPS刺激时Trem-1表达才上调。

因此我们首次证明，TREM-1表达于来自小鼠主动脉和大鼠肠系膜动脉内皮细胞上。

3.TREM-1在肺和肝脏微血管内皮细胞(LuMEC和LiMEC)上表达:

TREM-1组成型表达于肺和肝脏微血管内皮细胞上；在脓毒病期间和通过LPS刺激其表达上调(图3)。通过实时RT-PCR进一步证实了这些结果(图3C)。

Trem-1表达在用LPS刺激4小时后强烈地增加，然后降低。类似地，Tnf-α和Il-6表现出相同的动力学(图4)。

如所预期，用LPS刺激细胞24小时导致强力产生多种细胞因子，它们的浓度被TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽降低(图5)。

因此，用TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽出来能够减弱内皮细胞产生促炎细胞因子。

4.对TREM-1调节改善脓毒病诱导的心脏血管功能障碍:

小鼠模型：我们观察到，施用TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽保持了小鼠脓毒性休克期间的平均动脉压并缓冲了乳酸酸中毒。对血管信号传导的探究表明，脓毒病期间Akt通路以及Cox-1表达受损，并伴有Cox-2和iNOS上调。证明血管功能障碍的这些要素通过对TREM-1的调节而恢复(图6)。

大鼠模型：我们还集中于固有的心脏功能(图7；表2)，并且证明通过TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽调节TREM-1与若干心脏参数改善有关：ESPVR(收缩末期压力-容量关系)、PRSW(前负荷充盈性搏功)、(dP/dt)max/Ved(左心室压指标)和LVEF(左心室射血分数)。

表2：对TREM-1调节有益于抗脓毒病诱导的心脏功能障碍。

	FEVG	ESPVR	Dpdtmax/Ved	PRSW
					媒介物	4.21±7.2	1.5±0.2	55±20	79±11
TLT1-LR17	75.6±7.2	2.5±0.3	150±12	145±6*
					TLT1-LR12	77.2±9.2	2.7±0.1	158±18	143±7
TLT1-LR6-1	79.6±7.4	2.9±0.3	160±15	142±8
					TLT1-LR6-2	75±5.9	2.3±0.2	155±12	139±10
TLT1-LR6-3	78±8.7	2.2±0.2	157±10	149±6
					TREM1-LR17	75.9±8.9	2.7±0.3	156±11	150±8

TREM1-LR12	72±9.4	2.8±0.2	158±18	139±6
					TREM1-LR6-1	76±5.9	2.5±0.3	150±20	145±6
TREM1-LR6-2	79.4±9.9	2.7±0.1	155±15	144±6
					TREM1-LR6-3	78.6±7.4	2.9±0.4	163±10	139±8
TLT1-LR12scr	39.9±4.9	1.6±0.3	61±12	88±8

迷你猪模型：在脓毒病的迷你猪模型中，我们观察到，施用TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽减弱了心血管衰竭。腹膜炎诱导了MAP的快速降低(图8A)，但是容积复苏(对照为7750±540mL，而LR12组为6500±800mL，p＝0.137)。因此，为了维持MAP>85mmHg，分别在4/5和1/6的对照和LR12处理动物中在H12开始去甲肾上腺素。为维持血压所需的去甲肾上腺素灌注速率在LR12处理动物中显著低于在对照动物中(图8A)。

在对照组中，由于低血压，心指数和心力指数(据信更好地描述心脏性能)两者变得低于正常水平。这造成SvO2和DO2的进行性降低(图8B)。同样，LR12表现出在减弱心力衰竭方面具有显著的有益效果。两组均发生进行性乳酸酸中毒(图8C)，虽然被LR12极大地减弱(p＝0.0005)。

猴模型：在内毒素灌注猴模型中，我们观察到，施用TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽减弱了心血管衰竭。在LPS注射之后心率短暂升高，LR12灌注无作用(未显示)。LPS攻击诱导了体温的稍微增加，特别是H1和H2之间，但是在安慰剂(LR12scr)和LR12处理的动物之间的差异无显著性(未显示)。

即使所使用的LPS剂量小，但在安慰剂处理组中也出现了短暂的低血压：动脉收缩压在180分钟时的降低高达25％，动脉舒张压的降低高达40％(p<0.001相对于LR12或者对照组)。与之截然不同的是，LR12处理的猴一直没出现过低血压，并且它们的动脉压与对照动物的无区别(图9)。

5.TREM-1在心肌组织中表达并且在缺血过程中上调:

为了测定TREM-1是否在心脏组织中表达，从冠状结扎前的小鼠以及心肌梗死(MI)后6、24和96小时的小鼠健康区和梗死区收集心肌。trem-1的基线表达极低，而缺血诱导了进行性的表达上调，在MI后24小时达到最高水平(图10A)。通过western印迹在蛋白质水平观察到相同的动力学(图10B)。与之相比，在所有时间时在非梗死(“健康”)区TREM-1表达维持在低水平(数据未显示)。

6.TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽调节小鼠MI期间的白细胞募集并且调节白细胞从远距离区室的动员:

在小鼠中，也可能在人中，存在2种不同的单核细胞亚型：Ly-6C^高单核细胞是强力的炎症介质，而Ly-6C^低单核细胞具有相反的作用[NAHRENDORF等，2007]。通过TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽调节Trem-1完全消除了梗死心肌被Ly-6C^高单核细胞浸润，同时暂时增加Ly-6C^低单核细胞的募集。PMN浸润还可通过LR12处理阻断(图11A)。虽然淋巴细胞不表达TREM-1，但是对Trem-1进行调节影响了B-细胞和T-细胞动员：在LR12处理小鼠中，B-淋巴细胞和CD8⁺-淋巴细胞浸润被降低，同时CD4⁺-细胞募集增加。

由于Trem-1在调节白细胞募集至梗死心肌中似乎是重要的，所以我们研究了它对从远距离区室的细胞动员的影响。在心肌梗死之后，单核细胞在24小时内从脾脏出来浸润到心脏中(SWIRSKI，等)。在这里在MI后也观察到了该现象，同时脾脏单核细胞含量的快速下降持续长达1周。同时，在72小时时出现循环单核细胞数量的显著增加，而在骨髓(BM)中出现进行性累积(图11B)。Trem-1缺失或者调节几乎完全消除了脾脏单核细胞损耗以及血液单核细胞增多症。

外周血中性粒细胞计数在72小时时增加并且经过7天恢复至基线。在Trem-1-敲除或者LR12处理的小鼠中没有观察到这种中性粒细胞增多症。脾脏似乎不是中性粒细胞生产/释放的主要贡献者，因为脾脏的中性粒细胞含量几乎没有变化。在BM中还观察到进行性和中度积累，但是各组间没有差异(图11B)。

脾脏中B-淋巴细胞、CD4⁺-淋巴细胞、CD8⁺-淋巴细胞的数量在MI后24小时急剧减少，伴有CD4⁺和CD8⁺淋巴细胞减少症。因此，循环淋巴细胞数量增加出现在72小时时，之后在MI后7天恢复至基线。阻断Trem-1阻止了这种淋巴细胞动力学模式(图11B)。

单核细胞趋化蛋白1(MCP-1或者CCL2)、CX3CL1(或者Fractalkine)和MCP-3(或者CCL7)是参与分别将Ly-6C^高单核细胞、Ly-6C^第单核细胞和淋巴细胞募集至炎症部位中的重要趋化因子。MCP-1、CX3CL1和MCP-3的血浆浓度在MI后24小时增加。MCP-1和MCP-3水平在处理小鼠中显著降低(图11C)。

7.TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽调节小鼠MI期间的心肌炎症反应:

我们接着研究了通过TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽对TREM-1进行调节是否调节浸润炎症细胞活化。在MI后快速侵入心肌的炎症细胞通过p38 MAPK和ERK 1/2的磷酸化而活化，伴有iNOS和COX2表达上调。这种活化部分地被TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽消除(图12)。当我们这些蛋白质的磷酸化/表达的动力学时，在所有时间点肽均降低它们的水平(未显示)。与之相比，参与存活(AKT)或者已知抑制炎症(SOCS3)的数种蛋白质被所有肽上调。例如，糖原合成酶激酶3(GSK3β)在调节促炎细胞因子和抗炎细胞因子产生中起着至关重要的作用。在先天免疫细胞中，GSK3β失活(通过磷酸化)抑制细胞因子的产生，并且已知改善心肌细胞存活。在此我们观察到与对照相比，GSK3β磷酸化被TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽增加。

由于细胞促炎活性似乎被TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽调节，所以我们接着研究了它是否会引起细胞因子/趋化因子产生的下降。

在我们接着检测的参与先天免疫或者内皮功能的168个基因当中，在冠状动脉结扎后的心肌中，几乎是在MI后24小时，156个基因的表达改变了。施用LR12阻碍了心肌梗死诱导的基因活化。

如所预期，MI导致强力产生多种细胞因子(IL6、IL13、IL17、IL27、IFNγ)和趋化因子(MIP2、JE)。这些蛋白质的浓度被TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽降低(图13A)。定量PCR在基因水平证实了这些结果(图13B)，尤其是在MI 6小时后。

因此，施用TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽能够调节梗死区内的MI炎症反应。

8.TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽降低心肌梗死组织内的蛋白酶活性:

浸润中性粒细胞和巨噬细胞在梗死心肌中表达基质金属蛋白酶9(Mmp-9)。Mmp-9活性可以被金属蛋白酶组织抑制剂-1(Timp-1)抵消。这两种蛋白质之间的精确平衡的维持在防止会导致心功能不全的心室重构中起着至关重要的作用。在此我们观察到，在对照小鼠的梗死区中Mmp-9和Timp-1mRNA表达均增加了。与之相比，在用TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽处理的动物中，Mmp-9表达维持低水平，而Timp-1被极大上调(图14A，B)。因此，Mmp-9/Timp-1比值在对照小鼠中总是较高。Mmp-9明胶酶活性在对照中梗死区中总是比在用TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽处理的小鼠中更高(图14C)。

这些结果支持TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽在保持心脏结构和对抗MI后心脏重构中起着有益作用的假设。

9.TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽改善大鼠MI后的存活:

接着我们想阐释施用TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽是否在MI期间具有一些保护性作用。在持久冠状动脉结扎后60分钟开始，随机地用重复剂量(100μg/天，持续5天)的TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽或LR12-乱序肽向成年雄性Balb/c小鼠腹膜内施用。除一只以外，所有LR12-处理的动物均存活(图15)，而40％的对照小鼠死亡(对数秩检验；p<0.01)。使用另外的TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽得到相似结果。

为了研究持续的TREM-1参与是否会更加有害，我们向小鼠施用了激动性抗TREM-1mAb。该处理极大地增加了死亡率，仅20％存活。

10.TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽改善大鼠心肌缺血再灌注后的心脏功能:

为了研究TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽在更相关的MI模型中的作用，我们在大鼠中进行了暂时冠状动脉结扎(缺血-再灌注模型：IR)。在随机分组之后，将动物在麻醉条件下成像(微TEP)并施用TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽(3mg/kg/天，持续5天，腹膜内施用)或者LR12-乱序肽。在6周时重复成像，之后我们通过电导导管(Millar)研究心脏功能。

在第1天，即刚在IR之后两组不相上下。梗死区中度重要并且心脏功能轻微改变。6周时，所有大鼠均改善，梗死几乎完全治愈并且没有心室重构(表3)。因此，TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽对通过微TEP评价的参数没有影响。与之相比，当通过电导导管研究心脏功能时，我们观察到TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽极大改善了决定性的收缩参数，诸如Emax或者PRSW(图16；表4)。

表3：大鼠心肌缺血-再灌注期间生理参数总结。

表4：TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽改善大鼠心肌缺血-再灌注后的心脏功能。

	Emax	ESPVR	PRSW
				媒介物	2.8±0.3	1±0.2	68±11
TLT1-LR17	5.1±0.6	2±0.2	105±6
				TLT1-LR12	4.8±0.5	2.2±0.1	103±5
TLT1-LR6-1	4.5±0.6	2.4±0.4	102±6
				TLT1-LR6-2	6.5±0.9	1.8±0.1	99±8
TLT1-LR6-3	5.2±0.4	1.7±0.3	109±6
				TREM1-LR17	5.9±0.8	2.2±0.3	110±5
TREM1-LR12	4.5±0.4	2.3±0.4	99±4
				TREM1-LR6-1	5.5±0.4	2±0.3	105±6
TREM1-LR6-2	6±0.6	2.2±0.1	104±5
				TREM1-LR6-3	5.8±0.5	2.3±0.4	99±8
TLT1-LR12scr	2.7±0.3	1.1±0.3	65±8

因此，甚至在该相对温和的心肌缺血模型期间，施用TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽也能够恢复心脏收缩功能。

11.TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽改善大鼠心肌梗死后的收缩和舒张功能:

我们最后研究了通过TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽所提供的对炎症反应的调节是否能够在严重MI后引起心脏功能的改善。我们在大鼠中开展了持久冠状动脉结扎，之后随机分组并如上所述进行成像。

再次地，在第1天，两组完全相似。6周时，重大的心脏重构发生了，如通过出现重大的心室扩张所评价。该心脏重构至少部分地被TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽改变(表5)。作为心功能不全的间接指标，对照动物的体重增加比用所有肽处理的大鼠的更多。

表5：所选择的大鼠心肌梗死后的生理参数。

当通过电导导管研究心脏功能时，我们观察到，TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽极大改善了决定性的收缩和舒张参数诸如Emax、ESPVR、PRSW、dP/dTmin、dP/dTmax和Ved(图17)。

这些数据加在一起支持TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽在防止心肌梗死后的心脏重构和心功能不全中起着保护性作用。

12.TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽防止小鼠动脉粥样硬化发展:

主动脉窦中的粥样硬化斑块使用油红染色并定量。有趣的是，用TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽处理导致主动脉窦内损害大小显著减少30％(103318μm2相对于146736μm2，P＝0.02)(图18)。该结果在第二组实验中得到确认。

13.TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽改变动脉粥样化斑块的细胞组成:

我们使用免疫荧光染色和免疫组织化学分析了斑块组成。关于淋巴细胞浸润(抗CD3抗体)和胶原积累(天狼星红)，我们没有观察到任何组间差异。然而，我们发现在通过TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽处理的小鼠中动脉粥样硬化病变内的巨噬细胞浸润显著减少27％(图19)。

14.TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽改变动脉粥样硬化小鼠内的血液白细胞群:

我们使用流式细胞术分析了血液白细胞群。典型的单核细胞是CD115+Gr1^高而非典型的单核细胞是CD115+Gr1^低。在普通饮食(chow diet)下的apoE-/-小鼠中，仅非典型的单核细胞表达TREM。有趣的是，高脂肪饮食增加了TREM-1在非典型单核细胞上的表达(数据未显示)。

因此，我们分析了处理期间血液的白细胞群。在第7天，我们观察到用TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽处理的小鼠血液中非典型单核细胞的显著减少(图20)。在第28天，我们观察到血液中典型和非典型单核细胞的显著减少(图21)。

15.TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽降低单核细胞向粥样硬化斑块的募集:

最后，我们探究了使用TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽处理对粥样硬化斑块内单核细胞募集的作用。我们使用Potteaux等开发的脉冲染色技术。简言之，通过眶后静脉内注射在无菌PBS中以1:4稀释的1μm Fluoresbrite绿色荧光微球体内标记单核细胞[Ait-Oufella H.等，2011]。损害内荧光珠计数反映出单核细胞募集。在apoE-/-小鼠处死处理前24小时注射荧光珠。有趣的是，我们发现与对照组相比，在用TREM-1-衍生肽和TLT-1-衍生肽处理的组中单核细胞浸润显著减少(图22)。

参考文献

在本申请的通篇中，许多参考文献描述了本发明所属领域的现有技术。这些文献的公开在此通过参考并入到本公开中。

Ait-Oufella H,Taleb S,Mallat Z,Tedgui A.Recent advances on the roleof cytokines in atherosclerosis.ArteriosclerThrombVascBiol 31(5):969-979(2011).

Bjorkbacka H,Kunjathoor VV,Moore KJ,Koehn S,Ordija CM,Lee MA,Means T,Halmen K.,Luster AD.,Golenbock DT.,Freeman MW.Reduced atherosclerosis inMyD88-null mice links elevated serum cholesterol levels to activation ofinnate immunity signaling pathways.Nat Med 10(4):416-421(2004).

Daqing W.Hartwell.,Tanya N.Mayadas.,Berger.,Paul S.Frenette.,Helen Rayburn.,Richard O.Hynes.,Denisa D.Wagner.Role of P-selectincytoplasmic domain in granular targeting in vivo and in early inflammatoryresponses.Journal of Cell Biology；1434:11291141(1998).

Derive M,Bouazza Y,Sennoun N,Marchionni S,Quigley L,Washington V,Massin F,Max JP,Ford J,Alauzet C,Levy B,McVicar DW,Gibot S.Soluble TREM-liketranscript-1 regulates leukocyte activation and controls microbial sepsis.JImmunol.2012 Jun 1；188(11):5585-92.Epub 2012 May 2.

Entman M.L.,Smith C.W.Postreperfusion inflammation.A model forreaction to injury in cardiovascular disease.Cardiovasc Res 9:1301-1311(1994).

Hara H,Saito T.CARD9 versus CARMA1 in innate and adaptiveimmunity.Trends in Immunology；30:234-242(2009).

Harjot K Saini.,Yan-Jun Xu.,Ming Zhang.,Peter P Liu.,Lorrie AKirshenbaum.,NaranjanSDhalla.Role of tumour necrosis factor-alpha and othercytokines in ischemia-reperfusion-induced injury in theheart.ExpClinCardiol.2005 Winter；10(4):213–222.

Libby P.Inflammation in atherosclerosis.Nature 420(6917):868-874(2002).

Mehta J.L.,Li D.Y.Inflammation in ischemic heart disease:response totissue injury or a pathogenetic villain.Cardiovasc Res；2:291-299(1999).

Nahrendorf M,Swirski FK,Aikawa E,Stangenberg L,Wurdinger T,FigueiredoJL,Libby P,Weissleder R,Pittet MJ.The healing myocardium sequentiallymobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.JExp Med 204,3037–3047(2007).

Potteaux S,Gautier EL,Hutchison SB,van Rooijen N,Rader DJ,Thomas MJ,Sorci-Thomas MG,Randolph GJ Suppressed monocyte recruitment drives macrophageremoval from atherosclerotic plaques of Apoe-/-mice during diseaseregression.J Clin Invest 121(5):2025-2036(2011).doi:43802[pii]10.1172/JCI43802.

Radsak MP,Salih HR,Rammensee H,Schild H.Triggering receptor expressedon myeloid cells-1 in neutrophil inflammatory responses:differentialregulation of activation and survival.J.Immunol；172:4956-4963(2004).

Swirski FK,Nahrendorf M,Etzrodt M,Wildgruber M,Cortez-Retamozo V,Panizzi P,Figueiredo JL,Kohler RH,Chudnovskiy A,Waterman P,Aikawa E,MempelTR,Libby P,Weissleder R,Pittet MJ.Identification of splenic reservoirmonocytes and their deployment to inflammatory sites.Science 325,612–616(2009).

Washington AV,Gibot S,Acevedo I,Gattis J,Quigley L,Feltz R,De La MotaA,Schubert RL,Gomez-Rodriguez J,Cheng J,Dutra A,Pak E,Chertov O,Rivera L,Morales J,Lubkowski J,Hunter R,Schwartzberg PL,McVicar DW.TREM-liketranscript-1 protects against inflammation-associated hemorrhage byfacilitating platelet aggregation in mice and humans.J Clin Invest.2009 Jun；119(6):1489-501.

Claims (6)

1.由来自氨基酸序列SEQ ID NO：4的至少6个连续氨基酸组成的肽在制备用于治疗心血管病的药物中的用途，所述心血管病选自急性心肌梗死、急性冠状动脉综合征、中风和急性心力衰竭。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述肽由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列组成。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的用途，其中所述心血管病是急性心肌梗死。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述药物被配制成用于向需要其的受试者注射。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的用途，其中所述药物包含一种或多种其他抗心血管病化合物。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述一种或多种其他抗心血管病化合物选自他汀化合物、抗凝血手段、抗醛固酮化合物、ACE抑制剂和β-阻断剂。