JP6873261B2 - タンニン酸を含む心臓を標的化するための薬剤 - Google Patents

タンニン酸を含む心臓を標的化するための薬剤 Download PDF

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Description

発明の分野
本発明は、活性成分としてタンニン酸を含む心臓標的化剤に関する。
関連出願の記載
これまでに知られている、標的化薬を送達するための最も便利な方法は、全身注射である。全身注射を介して投与された薬は、受動拡散、血管透過性・滞留性亢進(EPR)並びに標的器官の受容体との相互作用を通して様々な腫瘍、肝臓及び肺組織に標的化され得る。しかしながら、重篤な容量変化を伴う心臓の一定の動的収縮弛緩サイクルのため、全身注射による心臓に対する薬の直接標的化は極めて難しい。さらに、血液交換は迅速且つ広範であるため、投与された薬が心臓で長期間の効果を有することは簡単ではない。
一般的に、薬を心臓に局所的に送達するための方法の大半は、胸骨切開又は開胸などの外科手術を必要とし、これは必然的に患者の胸壁及び骨の切開を伴う。最も代表的な例は、損傷した心筋の表面に直接適用される「細胞シート」である。治療のための非外科的アプローチとして心筋内注射又は心外膜注射が考えられる場合であっても、心臓の動態的変動により、薬を正確に標的化するために開胸術が必要である。直接心臓組織注射の他にも、静脈注射経路を用いた幾つかの研究、例えばアデノ関連ウイルスベクターによる心臓遺伝子療法、超音波を用いた微小空胞破壊、カテーテルベースの遺伝子送達、及びリポソームと結合させた心筋梗塞特異的標的化ペプチドが報告されている(Scott, R. C. et al., Expert Opin. Drug Deliv.5, 459-470 (2008); Wang, Z. et al., Nat. Biotechnol.23, 321-328 (2005); Mayer, C. R. & Bekeredjian, R., Adv. Drug Deliver. Rev. 60, 1177-1192 (2008); Dvir, T. et al., Nano Lett. 11, 4411-4414 (2011); Beeri, R. et al., Circulation 106, 1756-1759 (2002))。このような全身送達法は、繊細且つ困難な化学的/生物学的実験装置を必要とし、静脈に高濃度で投与されるという不利点を有する。
タンパク質/ペプチド薬を、静脈注射を介して心臓に効率的に送達するため、薬送達ビヒクルは、器官(組織)-特異的な特徴を認識することができなければならない。すなわち、静脈注射により注射されるビヒクルは、血管内皮層のグリコカリックス層に吸着されるべきではなく、むしろ厚く且つECMリッチな心筋(大部分はエラスチン及びコラーゲンで構成される)などの心臓組織に直ぐに吸着されるべきである。
タンニン酸(TA)は、果物、野菜、オリーブ及びカカオなどの植物中に豊富なポリフェノールの1つである。近年、タンニン酸は、多機能コーティング分子として使用されている。タンニン酸は、DNA、並びにトロンビン、ゼラチン、コラーゲン及びムチンなどのプロリンリッチタンパク質を含む生体高分子と優れた親和性を有する分子としても知られている。タンニン酸は、複数の水素結合、並びに水酸基リッチ部分(5つのガロール基(1つの芳香環に結合している3つの-OH基)及び5つのカテコール基(共有結合により芳香環に結合している2つの-OH基))と標的タンパク質との間の疎水性相互作用を通してタンパク質に結合する。
Scott, R. C. et al., Expert Opin. Drug Deliv.5, 459-470 (2008) Wang, Z. et al., Nat. Biotechnol.23, 321-328 (2005) Mayer, C. R. & Bekeredjian, R., Adv. Drug Deliver. Rev. 60, 1177-1192 (2008) Dvir, T. et al., Nano Lett. 11, 4411-4414 (2011) Beeri, R. et al., Circulation 106, 1756-1759 (2002)
発明の要約
本発明の目的は、活性成分としてタンニン酸を含む心臓標的化剤を提供することである。
本発明の別の目的は、心臓病の予防又は治療のためのタンニン酸化(tannylated)心臓病治療薬の使用を提供することである。
また本発明の目的は、活性成分としてタンニン酸化薬物担体を含む心臓標的化組成物を提供することである。
本発明のさらなる目的は、心臓病治療薬を高効率で心臓に標的化する方法であって、心臓病治療薬をタンニン酸化するステップを含む、上記方法を提供することである。
同様に本発明の目的は、タンニン酸及び心臓病治療薬を含む、心臓病を治療するためのキットを提供することである。
上記の目的を達成するため、本発明は、活性成分として、以下の式1：
Figure 0006873261
 により表されるタンニン酸を含む心臓標的化剤を提供する。
本発明はまた、心臓病の予防又は治療のための、活性成分としてタンニン酸化心臓病治療薬を含む医薬組成物も提供する。
本発明はまた、活性成分としてタンニン酸化薬物担体を含む心臓標的化組成物も提供する。
本発明はまた、心臓病治療薬をタンニン酸化するステップを含む、心臓病治療薬を高効率で心臓に標的化する方法も提供する。
本発明はまた、タンニン酸及び心臓病治療薬を含む、心臓病を治療するためのキットも提供する。
本発明はまた、対象にタンニン酸化心臓病治療薬を投与するステップを含む、心臓病を予防、改善又は治療するための方法も提供する。
さらに、本発明は、心臓病の予防、改善又は治療のための薬の製造のための、タンニン酸化心臓病治療薬の使用を提供する。
有利な効果
本発明によれば、心臓に送達される心臓病治療薬は、薬のタンニン酸化(tannylation)を誘導することにより心臓の心筋に結合することが可能であり、これにより上記薬の心臓標的化及び蓄積を可能にする。伝統薬が心臓を標的化することを可能にするために用いられている従来の侵襲法とは異なり、本発明の薬剤は、非侵襲的静脈内投与を介するだけで、薬が心臓を高効率で標的化することを補助することができる。
図1は、タンニン酸化GFPの調製過程を示す模式図である。 図2は、[TA]/[GFP]の臨界化学量論比(TA：タンニン酸)を決定するために実施した濁度試験の結果を示すグラフである。 図3は、[TA]/[GFP]の化学量論比によるタンニン酸化GFPの外観の目視の観察の結果を示す((A)：[TA]/[GFP]=72)。 図3は、[TA]/[GFP]の化学量論比によるタンニン酸化GFPの外観の目視の観察の結果を示す((B)：[TA]/[GFP]=143)。 図3は、[TA]/[GFP]の化学量論比によるタンニン酸化GFPの外観の目視の観察の結果を示す((C)：[TA]/[GFP]=357)。 図4は、ナノスケール複合体を形成する、[TA]/[GFP]の化学量論比72及び143を有するタンニン酸化GFPの形態及びサイズの特徴を示す((a)及び(b)：[TA]/[GFP]=72を有するタンニン酸化GFPのDLS分析及びAFM分析の結果)。 図4は、ナノスケール複合体を形成する、[TA]/[GFP]の化学量論比72及び143を有するタンニン酸化GFPの形態及びサイズの特徴を示す((a)及び(b)：[TA]/[GFP]=72を有するタンニン酸化GFPのDLS分析及びAFM分析の結果)。 図4は、ナノスケール複合体を形成する、[TA]/[GFP]の化学量論比72及び143を有するタンニン酸化GFPの形態及びサイズの特徴を示す((c)及び(d)：[TA]/[GFP]=143を有するタンニン酸化GFPのDLS分析及びAFM分析の結果)。 図4は、ナノスケール複合体を形成する、[TA]/[GFP]の化学量論比72及び143を有するタンニン酸化GFPの形態及びサイズの特徴を示す((c)及び(d)：[TA]/[GFP]=143を有するタンニン酸化GFPのDLS分析及びAFM分析の結果)。 図5は、マイクロスケール複合体を形成する、[TA]/[GFP]の化学量論比214(a)を有するタンニン酸化GFPの蛍光画像を示す。 図5は、マイクロスケール複合体を形成する[TA]/[GFP]の化学量論比286(b)を有するタンニン酸化GFPの蛍光画像を示す。 図5は、マイクロスケール複合体を形成する[TA]/[GFP]の化学量論比714(c)を有するタンニン酸化GFPの蛍光画像を示す。 図6は、マウスに対するタンニン酸化GFPの静脈注射の直後、3時間後及び6時間後それぞれの、器官におけるタンニン酸化GFPの全体的な分布を示す(HTI：心臓標的化指数)。 図7は、マウスに対する非タンニン酸化GFPの静脈注射の直後、3時間及び6時間後それぞれの、器官における非タンニン酸化GFPの全体的な分布を示す(HTI：心臓標的化指数)。 図8は、マウスに対するタンニン酸化GFP及び非タンニン酸化GFPの静脈注射の直後、1.5時間後、6時間後、48時間後及び120時間後それぞれの、マウス心臓におけるタンニン酸化GFP及び非タンニン酸化GFPの蓄積を示す。 図9は、マウスに対するタンニン酸化GFP及び非タンニン酸化GFPの静脈注射の直後、1.5時間後、6時間後、48時間後及び120時間後それぞれの、HTI値を示すグラフである。 図10は、マウスに対するタンニン酸化GFP及び非タンニン酸化GFPの静脈注射後のタンニン酸化GFP又は非タンニン酸化GFPの分布パターンを示す((a)：心筋(上)及び血管(下)における非タンニン酸化GFPの分布)。 図10は、マウスに対するタンニン酸化GFP及び非タンニン酸化GFPの静脈注射後のタンニン酸化GFP又は非タンニン酸化GFPの分布パターンを示す((b)：心筋(上)及び血管(下)におけるタンニン酸化GFPの分布)。 図10は、マウスに対するタンニン酸化GFP及び非タンニン酸化GFPの静脈注射後のタンニン酸化GFP又は非タンニン酸化GFPの分布パターンを示す((c)：心臓全体におけるタンニン酸化GFPの分布)。 図11は、マウスに対するタンニン酸化GFP及び非タンニン酸化GFPの静脈注射後の血流中の薬物動態の結果を示すグラフである(青矢印：注射の6時間後の心臓におけるGFP蓄積)。 図12は、エラスチン(Ela)/コラーゲン(Col)とタンニン酸(TA)；又はHA(ヒアルロン酸)/HS(硫酸ヘパリン)とタンニン酸(TA)との間に形成された分子間複合体により生じた溶液の濁度を示すグラフである(ECM：細胞外マトリックス)。 図13は、コラーゲン又はエラスチンでコーティングされた金の表面に結合したタンニン酸のSPR分析の結果を示すグラフである。 図14は、エラスチンとタンニン酸の結合による等温滴定型熱量測定(ITC)の結果を示す((a)：エラスチンとタンニン酸との間の発熱性結合(exothermic association)を示す生データ)。 図14は、エラスチンとタンニン酸の結合によるITCの結果を示す((b)：エラスチンとタンニン酸のモル比の関数を用いて(a)の生データを再分析することにより得られたデータ)。 図15は、ECMに対するタンニン酸化GFPの結合；又はグリコカリックスに対するタンニン酸化GFPの結合によって生じた溶液の濁度を示すグラフである。 図16は、タンニン酸化タンパク質が、心臓のグリコカリックスではなく細胞外マトリックス(EM)成分に結合することを示す模式図である。 図17(a)は、タンニン酸化SP(物質P)を示す。 図17(b)は、タンニン酸化アデノ関連ウイルス(AAV)を示す。 図18(a)は、[SP]/[TA]([SP]/[TA]=0.5、1、5、10及び20)の化学量論比によるタンニン酸化SPの目視の観察の結果を示す。 図18(b)は、[SP]/[TA]の化学量論比20を有するタンニン酸化SPのサイズ分布を示す。 図18(c)は、[SP]/[TA]の化学量論比10を有するタンニン酸化SPのサイズ分布を示す。 図19(a)は、心臓におけるSP及びタンニン酸化m-Cherry-SP(タンニン酸化SP)複合体の蓄積を示す。 図19(b)は、マウスに対する静脈注射の6時間後のSP及びタンニン酸化m-Cherry-SP(タンニン酸化SP)複合体のHTI値を示す。 図20は、タンニン酸化AAV9の調製のためのタンニン酸の最大臨界濃度を決定するために実施した濁度試験の結果を示すグラフである(赤矢印：タンニン酸の添加による濁度の変化(0.75mM))。 図21(a)は、AAV及びタンニン酸化AAV複合体のin vivo心臓蓄積を示す。 図21(b)は、マウスに対するAAV及びタンニン酸化AAV複合体の静脈注射の6時間後に得られたHTI値を示すグラフである。 図22(a)は、未処置のマウス、又は静脈注射を介してAAV及びタンニン酸化AAV複合体で処置したマウスの梗塞した心臓組織におけるGFP発現画像を示す。 図22(b)は、(a)のGFP発現の定量化の結果を示すグラフである。 図23は、タンニン酸化GFPがラットの単相活動電位(MAP)に与える影響を確認するために心臓に接続されたランゲンドルフシステムの実験設定(左)、挿入された刺激電極(上右)及びMAPプローブ(下右)を示す。 図24は、未処置のマウス、又は非濾過タンニン酸化GFP(100)若しくは濾過タンニン酸化GFP(Filt-100)で処置したマウスの心臓における単相活動電位(MAP)を示す(図24(a)：振幅)。 図24は、未処置のマウス、又は非濾過タンニン酸化GFP(100)若しくは濾過タンニン酸化GFP(Filt-100)で処置したマウスの心臓における単相活動電位(MAP)を示す(図24(b)：Vmax)。 図24は、未処置のマウス、又は非濾過タンニン酸化GFP(100)若しくは濾過タンニン酸化GFP(Filt-100)で処置したマウスの心臓における単相活動電位(MAP)を示す(図24(c)：心拍数)。 図25は、未処置のマウス、又は非濾過タンニン酸化GFP(100)若しくは濾過タンニン酸化GFP(Filt-100)で処置したマウスの心臓における単相活動電位(MAP)を示す(図25(a)：活動電位形の三角形分割)。 図25は、未処置のマウス、又は非濾過タンニン酸化GFP(100)若しくは濾過タンニン酸化GFP(Filt-100)で処置したマウスの心臓における単相活動電位(MAP)を示す(図25(b)：短期変動(STV))。 図26は、ラット心臓を用いて、圧力-容量コンダクタンスカテーテル技術を使用して実施した心臓血行動態実験を示す。 図27は、マウスによる心臓血行動態実験の、GFP(対照、6μg/mL)又はタンニン酸化GFP(500μL/kg)の静脈注射の12時間後及び24時間後の結果を示す一連のグラフである((a)：心拍数)。 図27は、マウスによる心臓血行動態実験の、GFP(対照、6μg/mL)又はタンニン酸化GFP(500μL/kg)の静脈注射の12時間後及び24時間後の結果を示す一連のグラフである((b)：心拍出量)。 図27は、マウスによる心臓血行動態実験の、GFP(対照、6μg/mL)又はタンニン酸化GFP(500μL/kg)の静脈注射の12時間後及び24時間後の結果を示す一連のグラフである((c)：1回拍出量)。 図27は、マウスによる心臓血行動態実験の、GFP(対照、6μg/mL)又はタンニン酸化GFP(500μL/kg)の静脈注射の12時間後及び24時間後の結果を示す一連のグラフである((d)：駆出率)。 図27は、マウスによる心臓血行動態実験の、GFP(対照、6μg/mL)又はタンニン酸化GFPの静脈注射の12時間後及び24時間後の、結果を示す一連のグラフである((e)：心室収縮指数(最大/最小dP/dt))。 図27は、マウスによる心臓血行動態実験の、GFP(対照、6μg/mL)又はタンニン酸化GFP(500μL/kg)の静脈注射の12時間後及び24時間後の結果を示す一連のグラフである((f)：Tau値、Weiss法に従って計算した弛緩時定数(logPの回帰))。 図27は、マウスによる心臓血行動態実験の、GFP(対照、6μg/mL)又はタンニン酸化GFP(500μL/kg)の静脈注射の12時間後及び24時間後の結果を示す一連のグラフである。 図28は、MIR(心筋虚血再灌流)マウスモデルに対するbFGF単独(5μg又は25μg)又はタンニン酸化bFGF(5μg又は25μg)の静脈注射の28日後に測定した心臓組織の梗塞サイズを示す((a)：梗塞サイズの定量化の結果)。 図28は、MIR(心筋虚血再灌流)マウスモデルに対するbFGF単独(5μg又は25μg)又はタンニン酸化bFGF(5μg又は25μg)の静脈注射の28日後に測定した心臓組織の梗塞サイズを示す((b)：梗塞部位の画像；Sham：健康な心臓を有する群)。 図29は、MIR(心筋虚血再灌流)マウスモデルに対するbFGF単独(5μg又は25μg)又はタンニン酸化bFGF(5μg又は25μg)の静脈注射の28日後に実施した血行動態実験の結果を示す((a)：LV圧；Sham：健康な心臓を有する群)。 図29は、MIR(心筋虚血再灌流)マウスモデルに対するbFGF単独(5μg又は25μg)又はタンニン酸化bFGF(5μg又は25μg)の静脈注射の28日後に実施した血行動態実験の結果を示す((b)：1回拍出量；Sham：健康な心臓を有する群)。 図29は、MIR(心筋虚血再灌流)マウスモデルに対するbFGF単独(5μg又は25μg)又はタンニン酸化bFGF(5μg又は25μg)の静脈注射の28日後に実施した血行動態実験の結果を示す((c)：心拍出量；Sham：健康な心臓を有する群)。 図29は、MIR(心筋虚血再灌流)マウスモデルに対するbFGF単独(5μg又は25μg)又はタンニン酸化bFGF(5μg又は25μg)の静脈注射の28日後に実施した血行動態実験の結果を示す((d)：dP/dt(単位当たりの心室圧変化)；Sham：健康な心臓を有する群)。
好ましい実施形態の説明
本明細書中以降、本発明は詳細に記載される。
本発明は、活性成分として、以下の式1：
Figure 0006873261
 により表されるタンニン酸を含む心臓標的化剤を提供する。
この発明において、用語「標的化する」は、任意の物質が、生体内の特定の細胞、特定の組織又は特定の器官などの標的に大量に及び/又は急速に移動することを意味する。この発明において、用語「標的化剤」は、任意の物質を、直接結合又は間接結合を通して特定の標的に標的化することができる物質を意味する。標的化剤は、標的組織又は標的器官の細胞に直接結合することができるか、又は細胞外マトリックスに結合することができるか、又は上記細胞に吸収され得るが、必ずしもそれらに限定されるわけではない。
本発明の標的化剤は、前記タンニン酸単独で構成され得るか、又はタンニンに加えて、他の標的化剤、担体、薬に対する結合を促進又は安定化させる成分、薬の調製のための使用において又は調製薬の保存の場合にタンニン酸を保護する成分、又は薬を空間的に分離するスペーサなどの他の構成成分を含み得る。本発明の標的化剤を任意の担体又は薬にコンジュゲートさせて、上記担体又は薬を心臓に標的化することができる。
本発明の標的化剤により標的化される物質又は物は特に限定されないが、好ましくは、投与点から心臓又は心臓近くへの物理的移動に適した適切なサイズである。従って、本発明の標的化剤は、ベクター、ウイルス粒子及び細胞並びにマイクロマシン、また原子、分子、化合物、タンパク質、核酸及びタンパク質/核酸複合体などの物質の少なくとも1つで構成される薬放出系などの物体を送達することができる。上記の物質又は物は、心臓組織における特定の細胞を標識することができると考えられ、これは、好ましくは心臓病治療薬であるが、必ずしもそれに限定されるわけではない。上記の物質又は物は、好ましくはタンニン酸化されている。本発明において、用語「タンニン酸化(tannylation)」は、タンニン酸が、タンニン酸と水素結合又は疎水性相互作用を形成することができる物質に結合する過程を示す。特に、タンニン酸はフェノール性水酸基リッチ部分(ガロール基及びカテコール基)を有するため、タンニン酸化される物質と、複数の水素結合及び疎水性相互作用を通じて相互作用することができる。タンニン酸化された物質は心臓中に蓄積され、その後、タンニン酸のエステル結合が緩やかに分解するに従ってゆっくりと放出される。
前記タンニン酸は、式1により表されるフラボノイド-ベースの化合物の1つであり、これは、心臓血管内皮層のグリコカリックス層に対しては有意でない付着を示すが、細胞外マトリックス(ECM)リッチ心筋に対しては強い付着を示す。従って、タンニン酸は、心臓、より具体的には心臓の心筋に標的化され、心筋中に蓄積され得ることが示唆される。
本発明はまた、心臓病の予防又は治療のための、活性成分としてタンニン酸化心臓病治療薬を含む医薬組成物も提供する。
タンニン酸化心臓病治療薬は、心臓、より好ましくは心臓の心筋に標的化され得、心筋中に蓄積され得る。
前記心臓病治療薬は、それがタンニン酸化され得る治療薬である限り、当技術分野で公知の任意の心臓病治療薬であってよい。前記心臓病は、当技術分野で公知の全ての心臓病を包含し得る。特に、標的心臓病は、タンニン酸化心臓病治療薬の治療効果により異なり得る。例えば、上記の心臓病治療薬がbFGFである場合、心臓病は、心筋梗塞、心不全及び狭心症からなる群から選択することができる虚血性心臓病であり得る。
上記の心臓病治療薬は、化合物、タンパク質、核酸及びタンパク質/核酸複合体からなる群から選択される1種以上の物質であってよく、これは、好ましくはbFGF(塩基性線維芽細胞成長因子)、SP(物質P)、EGF(上皮細胞成長因子)又はVFGF-B(血管内皮成長因子B)であるが、必ずしもそれに限定されるわけではない。
前記bFGFは、配列番号１により表されるアミノ酸配列で構成され得る。
前記SPは、配列番号２により表されるアミノ酸配列で構成され得る。
Figure 0006873261
上記の心臓病治療薬は、担体としてウイルスを用いることができる。このウイルスは、ウイルスの表面上に存在するタンパク質とタンニン酸との間の水素結合及び疎水性相互作用によりタンニン酸化され得る。このウイルスを担体として用いる治療剤は、心臓において発現すると治療効果又は予防効果を有する治療遺伝子(ポリヌクレオチド配列)であり得る。前記ウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス及びレンチウイルスからなる群から選択することができる。より好ましくは、ウイルスは、アデノ関連ウイルス血清型9(AAV9)であり得る。
上記の組成物は、経口的に又は非経口的に投与することが可能であり、非経口投与としては、例えば、頭蓋内注射、静脈注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、経皮投与などが挙げられ、静脈注射がより好ましい。
前記bFGFは、5〜200μg/kgの用量で、好ましくは15〜120μg/kgの用量で投与することができる。
また本発明は、活性成分としてタンニン酸化薬物担体を含む心臓標的化組成物も提供する。
この発明において、用語「タンニン酸化」は、タンニン酸が、タンニン酸と水素結合又は疎水性相互作用を形成することができる物質に結合する過程を示す。上記の過程により、心臓を標的とする薬がタンニン酸化され得るか、又は心臓を標的とする薬を運ぶ薬物担体がタンニン酸化され得る。
前記薬物担体は、それがタンニン酸と水素結合及び疎水性相互作用を形成し得る官能基を有する限り、限定なく用いることができる。上記の薬物担体は、好ましくはベクター、ウイルス及び細胞からなる群から選択され得るが、必ずしもそれらに限定されるわけではない。
前記ウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス及びレンチウイルスからなる群から選択することができる。
上記の組成物は、経口的に又は非経口的に投与することが可能であり、非経口投与としては、例えば、頭蓋内注射、静脈注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、経皮投与などが挙げられ、静脈注射がより好ましい。
また本発明は、心臓病治療薬を高効率で心臓に標的化する方法であって、心臓病治療薬をタンニン酸化するステップを含む、上記方法も提供する。
上記のタンニン酸化は、タンニン酸を含む溶液と心臓病治療薬を含む溶液とを混合することにより達成することができる。混合時、心臓病治療薬とタンニン酸とは、心臓病治療薬のサイズ、形及び安定性に従って、適切な化学量論比で混合することができる。
また本発明は、タンニン酸及び心臓病治療薬を含む、心臓病を治療するためのキットも提供する。
心臓病治療薬は、タンニン酸と心臓病治療薬とを混合することによりタンニン酸化することができる。タンニン酸と心臓病治療薬は、それぞれ溶液に溶解させて提供することもできるし、又は複数溶液としてキットに含まれていてもよい。しかしながら、タンニン酸及び心臓病治療薬の形態は、タンニン酸と心臓病治療薬とを混合することにより心臓病治療薬がタンニン酸化され得る限り、限定されない。上記の心臓病を治療するためのキットは、医薬組成物中で一般的に用いられる担体、希釈剤、賦形剤又はそれらの少なくとも2つの組み合わせを付加的に含み得、このキットには、1つ以上の心臓病治療薬を含めることができる。
本発明の好ましい実施形態において、本発明者らは、タンニン酸(TA)とGFPとを様々な化学量論比で混合することによりタンニン酸化GFPを調製した。その後、143の[TA]/[GFP]の化学量論比を有するタンニン酸化GFP(これは、in vivo循環のための合理的な範囲に対応する)を選択した(図1〜5参照)。
本発明者らは、タンニン酸化GFPを、静脈注射を介してマウスに投与し、その腸標的化能を評価した。結果として、タンニン酸化GFPが、脾臓、腎臓、肺、及び肝臓と比較して心臓に特異的に標的化されたことが確認された(図6及び7参照)。
本発明者らは、タンニン酸化GFPを、静脈注射を介してマウスに投与し、その心臓標的化能を経時的に評価した。結果として、タンニン酸化GFPは、静脈注射の6時間後に心臓に標的化され、120時間まで心臓標的化能を維持したことが見出され、タンニン酸化GFPが心臓に蓄積されたことが確認された(図8及び9を参照)。
本発明者らは、タンニン酸化GFPを、静脈注射を介してマウスに投与し、心臓組織中でのタンニン酸化GFPの空間分布を検証した。その結果、タンニン酸化GFPが主として心筋中に蓄積されたことが確認された(図10参照)。
また本発明者らは、タンニン酸化GFPを、静脈注射を介してマウスに投与し、タンニン酸化GFPの血液循環時間を測定した。結果として、タンニン酸化GFPの血液循環時間が、非タンニン酸化GFPの血液循環時間より相対的に長く、静脈注射の120時間後まで血中に残留していたことが確認された(図11参照)。
本発明者らは、TAが硫酸ヘパリン(HS)及びヒアルロン酸(HA)(グリコカリックスの主成分)に結合する能力、及びTAがエラスチン及びI型コラーゲン(細胞外マトリックスの主成分)に結合する能力も比較した。結果として、TAは、細胞外マトリックス、特にエラスチンにより強く結合することが確認された(図12〜16参照)。
本発明者らは、冠動脈血管の拡張において有効であることが知られているペプチド薬SP(物質P)、又は治療遺伝子用の送達ビヒクルとして用いられることが知られているAAV9をタンニン酸化し、その後、これらを、静脈注射を介してマウスに投与した。その結果、これらがタンニン酸化GFPとして心臓に標的化され且つ心臓に蓄積されたことが確認され、心臓に送達される物質が、タンニン酸化されて心臓に標的化され得ることを示していた(図17〜22参照)。
本発明者らは、ex vivo単相活動電位及びin vivo心臓機能実験を通して、タンニン酸化GFPが毒性を示さないことを確認した(図23〜27参照)。
本発明者らは、心臓病治療薬として用いられることが知られている塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)のタンニン酸化を誘導し、タンニン酸化bFGFを、静脈注射を介してMIR(心筋虚血再灌流)動物モデルに投与した。結果として、タンニン酸化bFGFが、非タンニン酸化bFGFと比較して心筋梗塞サイズを低下させ、心臓機能を健康な心臓(sham群)のレベルと同様に改善したことが確認された(図28及び29参照)。
本発明によれば、心臓に送達される心臓病治療薬は、薬の心臓標的化及び蓄積を可能とするように薬のタンニン酸化を誘導することにより、心臓の心筋に結合することができる。伝統薬が心臓を標的化することを可能にするために用いられる従来の侵襲法とは異なり、本発明の薬剤は、非侵襲的な静脈内投与を介するだけで、薬が心臓を高効率で標的化することを補助することができる。
本発明の医薬組成物は、任意の一般的に用いられる担体、希釈剤、賦形剤、又はこれらの少なくとも2つの組み合わせを含み得る。製薬上許容可能な担体は、Merck Index, 第13版, Merck & Co. Inc.に記載される化合物により例示される、限定することなく生体内の活性成分を送達することができる任意の担体、例えば、生理食塩水、滅菌水、リンガー溶液、緩衝生理食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分の1種以上を含む混合物であり得る。必要であれば、抗酸化剤、緩衝剤、及び静菌剤などの一般的な添加剤を付加的に添加することができる。本発明の組成物は、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑沢剤と混合することにより、例えば、注射用の水溶液、懸濁液及びエマルション、丸剤、カプセル剤、粒剤又は錠剤などの異なる形態で製剤化することができる。本組成物はさらに、各疾患に適した剤形に、又はRemington’s Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA, 第18版, 1990)に示される方法に従った成分により、調製することができる。
本発明の組成物は、本活性成分と同一又は類似の機能を有する1種以上の有効成分を含み得る。
本発明の組成物は、単位用量形態の又は複数用量容器中の製薬上許容可能な担体及び/又は賦形剤を用いることによって、当業者により実施され得る方法により製剤化することができる。製剤は、油溶性又は水溶性媒体中の溶液、懸濁液又はエマルション、抽出物、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であり得る。この時点で、分散剤又は安定剤を付加的に含めることができる。
また本発明は、対象にタンニン酸化心臓病治療薬を投与するステップを含む、心臓病を予防、改善又は治療するための方法も提供する。
本発明によるタンニン酸化心臓病治療薬は、上記の特徴を有し得る。本明細書中における「対象」は、哺乳動物、特にヒトであり得る。
本発明の組成物は、経口的に又は非経口的に投与することが可能であり、非経口投与としては、例えば、頭蓋内注射、静脈注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、経皮投与などが挙げられる。
本発明の組成物の有効投与量は、製剤法、投与法、年齢、体重、患者の病態、食事、投与時間、投与経路、体内での活性成分の吸収速度、不活性化速度、一緒に適用される他の薬、排出速度及び応答感度等の因子によって変動し得る。特に、本発明の心臓病治療薬の好ましい用量は、1日当たり0.0001ng/kg(体重)〜200mg/kg(体重)である。
さらに、本発明は、心臓病の予防、改善又は治療のための薬の製造のための、タンニン酸化心臓病治療薬の使用を提供する。
本発明によるタンニン酸化心臓病治療薬は、上記の特徴を有し得る。
本発明の実際的且つ現在好ましい実施形態は、以下の実施例に示されるとおり、例示である。
しかしながら、当業者であれば、この開示を考慮すれば本発明の精神及び範囲内で改変及び改善を行い得ることが理解されるだろう。
実施例1：タンニン酸化GFPの調製
＜1-1＞ GFPの発現及び精製
GFPをコードする遺伝子を改変pET28a_Tevベクターにクローン化し、これをE. coli BL21RILP株に形質転換した。この株を、OD600が0.4〜0.8に達するまで37℃で12時間超培養した。この株の培養培地を精製し、ここから、N末端に融合したHisタグを有するGFPを得た。得られたGFPを、Ni-NTA樹脂を用いて精製し、TEVプロテアーゼを用いて前記Hisタグを除去した。緩衝剤(100mM NaCl及び50mM Tris-HCl)で平衡化したサイズ排除クロマトグラフィーを実施し、GFPをさらに精製した。
＜1-2＞ GFPのタンニン酸化
タンニン酸化GFPを調製するため、タンニン酸(TA)溶液(10mM)及びGFP溶液(pH=7.4、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)238μg/mL)を調製した。GFPのタンニン酸化のため、TA及びGFP溶液を(1：1の体積比で)混合し、14、72、143、214、286、714及び1428の[TA]/[GFP]化学量論比を作成した。混合時、GFPの濃度を固定し、TAの濃度は、濃度を0.1([TA]/[GFP]=14)から、0.5、1、1.5、2、5及び10([TA]/[GFP]=1428)mMへと連続的に上昇させながらPBS(pH7.4)中で希釈した。全サンプルを室温で30分間静置した。
In vivo又はex vivo研究のため、タンニン酸化GFPを、Amiconフィルター(3kDa、0.5mL、Millipore、Billerica社、マサチューセッツ州、米国)を用いて5回超の遠心分離をして、遊離TAを完全に除去した。
実験的実施例1：タンニン酸化GFPの特徴の分析
＜1-1＞ タンニン酸化GFPのコロイド安定性
[TA]/[GFP]の化学量論比によるGFP/TA溶液のコロイド安定性(すなわち、安定性又は凝集)を研究するため、実施例1で調製した14、72、143、214、286、714及び1428の化学量論比を有するGFP/TA溶液を用いて濁度試験を実施した。
GFP/TA複合体がマイクロスケールの凝集を形成する場合、吸光度(A600)は、溶液の濁度(光散乱)に起因して増加する。各溶液の吸光度を測定した。その結果、[TA]/[GFP]の臨界化学量論比は143(図2の黒色点線)であり、これより下では明らかな凝集は観察されず、従ってA600値がほぼゼロであることが見出された。他方、GFP/TA溶液の濁度は、143より高い化学量論比で徐々に増加し、1430の化学量論比で1.4±0.1であった。
72、143及び357の[TA]/[GFP]比を有する溶液の写真に示されるとおり、72又は143の比を有するGFP/TA溶液中では凝集が観察されず、ナノスケール複合体が形成されたことを示していた(図3(A)及び(b))。しかしながら、357の[TA]/[GFP]比ではGFP/TA複合体凝固が観察され、これは143の臨界化学量論比より高かった(図3(C))。
＜1-2＞ タンニン酸化GFPのサイズ及び形
72又は143の[TA]/[GFP]化学量論比を有する溶液から得られたタンニン酸化ナノ複合体のサイズ及び形を、AFM(原子間力顕微鏡、Nanoman、Veeco社、米国)及びDLS(動的光散乱)を用いることにより分析した。
143未満の[TA]/[GFP]化学量論比を有する溶液(50μL)を、マイカの表面上にロードし、その後、脱イオン水で3回洗浄した。2時間空気乾燥した後、タンニン酸化ナノ複合体のサイズを測定した。粒径分析器(Zetasizer nano-ZS、Malvern instrument社、英国)も使用した。サンプル溶液(1mL、[TA]/[GFP]=72又は143)を使い捨てキュベットに入れ、その後120秒間平衡した。その後、タンニン酸化ナノ複合体のサイズ分布を測定した。その結果、72の[TA]/[GFP]化学量論比で調製したタンニン酸化GFPのDLS水力学的直径は14.8±2.9nm(図4(A))であり、AFMにより測定した乾燥複合体の平均乾燥高さは約10nm(図4(B)であった。143の[TA]/[GFP]化学量論比で調製したサンプルの場合、DLS水力学的直径は52.7±21.7nm(図(C))に増加し、乾燥複合体の平均乾燥高さは35nm以下であった(図4(D))。
ミクロスケールでのタンニン酸化GFPの形成もまた、蛍光顕微鏡(Eclipse 80i、Nikon、日本)を用いることにより確認された。タンニン酸化GFPのマイクロ凝集体は、214より高い化学量論比で観察された(図5)。化学量論比が714に近づくにつれて、複合体のサイズは100μmまで徐々に増加し、これは蛍光顕微鏡により明確に検出することができた(図5(C))。286の比で、5μm以下の平均サイズのマイクロ複合体が観察された(図5(B))。
本発明者らは、143の比を有するタンニン酸化GFPのサイズ分布が、in vivo循環用の従来のミセルナノ担体の合理的範囲内にあったため、in vivo 実験用に143の[TA]/[GFP]化学量論比を有するGFPを選択した。
実験的実施例2：In vivo血液循環及びタンニン酸化GFPの分布
＜2-1＞ タンニン酸化GFPの器官特異的標的化の評価
タンニン酸化タンパク質のin vivo循環を研究するため、以下の動物試験を実施した。動物試験手順は、動物実験委員会(Animal Care Committee)、KAIST(KA2016-34)の承認を得て実施し、研究者らは、保健福祉部(Ministry of Health and Welfare)により推奨される倫理規定に従って実験を行った。
最初に、タンニン酸化GFPのin vivo毒性を確認するため、マウスの体重変化を観察した。米国国立癌研究所(National Cancer Institute)により提案されるマウスでの毒性標準測定によれば、試験マウスが20％又はそれ以上も体重を減少させた場合、毒性が確認されたと考えられた。タンニン酸化GFPのin vivo毒性が研究された。結果として、タンニン酸化GFPで処置したマウスは、2日間で体重を約6％減少させ、これは有意ではないと考えられ、その後以下の実験を実施した。
143の[TA]/[GFP]化学量論比を有するタンニン酸化GFP又は非タンニン酸化GFPを、マウス(BALBc、8週齢、雄、24〜26g)の尾静脈に静脈注射した(240μg/kg)。処置したマウスを一定間隔(3時間及び6時間)で屠殺し、その後、IVIS画像システム(IVIS 200、Xenogen社、米国)で肝臓、心臓、脾臓、腎臓及び肺のGFP蛍光強度を測定した。IHC(免疫組織化学的検査)のため、組織(心臓及び大静脈)を4％ホルムアルデヒド中で室温にて48時間固定し、組織をOCT(最適切断温度)化合物と共にドライアイスに埋め込んだ。凍結組織塊を、凍結ミクロトーム(Leica CM3050s, GMI Inc.、米国)を用いて10μmの厚さを有する薄片に切断した。スライスされた切片を1％BSA(ウシ血清アルブミン)でブロックし、その後、一次抗体としての抗GFP抗体(ab6556；1：500、Abcam社(ケンブリッジ、英国)、12時間、4℃)及び二次抗体としてのヤギ-抗-ウサギIgG flamma 488(RSA1241、1：200、BioActs、韓国、1時間、25℃)で処理した。蛍光顕微鏡(Eclipse 80i, Nikon社、日本)を用いて観察を実施した。
各マウス器官の蛍光強度分析において、タンニン酸化GFP注射から3時間、大部分の器官において蛍光発光は検出されなかった(図6)。しかしながら、注射の6時間後、GFP由来の蛍光は主に心臓において観察され、タンニン酸化GFPが高効率(：〜1.0×107〜4.9×108フォトンs-1)で心臓に蓄積されたことを示していた(図6、白い点線で示される円)。非タンニン酸化GFPを注射した対照の場合、大部分のGFPは肝臓に蓄積され、注射の3時間後又は6時間後のいずれにおいても、GFP由来の蛍光は心臓において観察されなかった(図7)。
タンニン酸化の心臓標的化能を、HTI(心臓標的化指数)=[心臓の蛍光発光]/[肝臓の発光]を用いて定量的に分析した。その結果、全てのサンプルが、タンニン酸化GFPの注射の6時間後の観察の場合を除いて、極めて低いHTI値を示した。特に、注射の3時間後に観察された非タンニン酸化GFPのHTIは0.007であり、注射の6時間後に観察された非タンニン酸化GFPのHTIは0.0025であった。注射の3時間後に観察されたタンニン酸化GFPのHTIは0.0014であり、注射の6時間後に観察されたタンニン酸化GFPのHTIは0.135であった。これらの結果は、タンニン酸化GFPが高効率で心臓に送達されたことを示す。
＜2-2＞ タンニン酸化GFPの心臓標的化の経時的評価
注射の6時間後にタンニン酸化GFPが心臓において検出されたか否かを研究するため、GFP又はタンニン酸化GFPを、実験的実施例＜2-1＞に記載されているのと同じ方法により、静脈注射(240μg/kg)を介してマウスに投与した。マウスを一定間隔(1.5、5、48及び120時間)で屠殺した。IVIS画像システム(IVIS 200、Xenogen社、米国)により心臓のGFP蛍光強度を測定し、HTI値を計算した。
その結果、弱い蛍光発光(1.7×108±5.5×106フォトンs-1)が、タンニン酸化GFPの注射の1.5時間後に検出された。蛍光発光は、注射の6時間後に1.9×108±7.8×106フォトンs-1まで増加した(図8)。蛍光強度は、注射の120時間後まで同様のレベル(2.2×108±4.4×107フォトンs-1)に維持された(図8)。上記の結果は、タンニン酸化タンパク質の心臓標的化及び心臓蓄積を示す。時間依存性HTI値は、タンニン酸化GFPの注射の6時間後に0.124±0.015であり、注射の120時間後に0.062±0.020(図9、赤色棒)であり、これは非タンニン酸化GFPの注射の結果と有意に異なっていた(図9、黒色棒)。心臓の蛍光シグナルは、注射後144時間(7日間)で1.2×108±1.7×107に低下した。
＜2-3＞ 心臓組織におけるタンニン酸化GFPの分布
心臓組織におけるタンニン酸化GFPの空間分布を分析するため、実験的実施例＜2-1＞に記載されるとおりに免疫組織化学的分析を実施した。
興味深いことに、非タンニン酸化GFPを心臓に投与した場合、心臓のいずれの部分においても蛍光シグナルは観察されなかった。タンニン酸化GFPを投与した場合、大部分の蛍光シグナルは、点線及び矢印により示される左心筋から発光した(図10(B)、上の画像)。血管(すなわち、大静脈)の内壁に蛍光発光は観察されなかった(図10(A)及び(B)、下の画像)。GFPシグナルは、心臓断面画像に示されるとおり、左心室に近い心筋において観察された(図10(C)、白星)。これらの結果は、タンニン酸化タンパク質が心筋中で活発に蓄積されたことを示す。
＜2-4＞ タンニン酸化GFPの血液循環時間
タンニン酸化GFPの血液循環時間を研究するため、143の[TA]/[GFP]化学量論比を有するタンニン酸化GFPをマウスの尾静脈に注射し(240μg/kg)、各マウスの尾から一定の時間間隔(1.5、5、48及び120時間)で血液を採取した(30〜50μL)。血液凝固を予防するため、採取した血液を0.2重量％のヘパリン溶液(10μL)と混合し、その後13,500rpmで5分間遠心分離して血漿を分離した。得られた血漿を-20℃で保存した。血漿GFPの量を、GFP ELISAキット(Cell Biolabs社、米国)により、47.5〜380pg/mLのGFP標準曲線を用いて測定した。
タンニン酸化GFPの血液循環時間(図11、赤色)は、非タンニン酸化GFPの血液循環時間より長かった(図11、黒色)。血流中のタンニン酸化GFPの濃度は注射の8時間後に8.3±0.8ng/mL(青色矢印)であったが、血流中の非タンニン酸化GFPの濃度は0.8±4.1ng/mLであった。大部分の非タンニン酸化GFPは、注射後30分間で肝臓により排出又は濾過された。対照的に、タンニン酸化GFPは、注射後120時間血液中に残留していた。上記の結果は、図8に示される、心臓における時間依存性のタンニン酸化GFPの蓄積の研究結果と一致していた。タンニン酸化GFPの注射の420時間後、血液GFPの濃度は約0.3ng/mLの検出可能なレベルに維持されたが、非タンニン酸化GFPは検出されなかった。
実験的実施例3：タンニン酸(TA)と細胞外マトリックス(ECM)成分との間の相互作用の分析
TAとECM成分との間の相互作用を研究するため、TAが硫酸ヘパリン(HS)及びヒアルロン酸(ヒアルロナン、HA)(グリコカリックスの主要構成成分)に結合する能力、及びTAがエラスチン及びI型コラーゲン(細胞外マトリックスの主要構成成分)に結合する能力を、比濁法、SPR(表面プラズモン共鳴)及びITC(等温滴定型熱量測定)を用いることにより分析した。これらの実験的方法は、生体分子と生体材料との間の相互作用を証明するために広く用いられている。
＜3-1＞ 比濁法を用いたTAと細胞外マトリックス(ECM)、及びTAとグリコカリックスの結合分析
濁度分析のため、エラスチン、I型コラーゲン、HS及びHAの各溶液を、これらを0.24mg/mLの濃度でPBSに希釈することにより調製した。各溶液にTA(17mg/mL)を1：1の体積比で添加し、その後勢いよく混合した。UV/vis分光分析器(HP8453、Hewlett-Packard社、米国)を用いて、600nmで濁度を測定した。
一般的に、2つの巨大分子が強い分子間親和性を示す場合、マイクロ複合体が急速に形成される。これは一般的に、可視光を散乱させることにより混濁溶液の形成をもたらす。予想したとおり、コラーゲン/エラスチン溶液の濁度(A600)は、TAの添加により劇的に増加した。正確には、エラスチン溶液の濁度は1.219±0.022(図12、第1の白色バー)であり、コラーゲン溶液の濁度は0.173±0.022(図12、第1の灰色バー)であった。しかしながら、HS溶液又はHA溶液における濁度変化は観察されなかった。
＜3-2＞ SPRを用いたTAとエラスチン/I型コラーゲンの結合分析
SPR分析のため、エラスチン、I型コラーゲン(10μg/mL)及びTA(2mg/mL)の各溶液を、これらをPBS(pH7.3)に希釈することにより調製した。全ての溶液を、0.2μmマイクロフィルター(Millipore社、米国)で濾過した。各タンパク質(エラスチン又はI型コラーゲン)を、Biacore金(Au)センサーチップ上に600秒間付着させた。このチップを10分間洗浄し、それらの上に弱く付着していたかかるサンプルを除去した。SPR分析は、PBSをフローバッファーとして用いて10μL/分の流速で実施した。
改変されたSPRの応答値(RU)は、TAが、エラスチン及びI型コラーゲンの両方に対して親和性を有していたことを示す(図13)。TAが、コラーゲンを吸着させた表面上に曝露された場合、ΔRU値は793であった。TAが、エラスチンを吸着させた表面上に曝露された場合、ΔRU値は1319であった(図13、赤色)。これらの結果は、TAが、エラスチンとより強く相互作用することを示す。
＜3-3＞ ITCを用いたTAとエラスチンの結合分析
エラスチン(210μg/mL)溶液及びTA(2.5mg/mL)溶液をITC分析のために用いた。エラスチンをサンプル細胞に入れた。TA溶液を注射器に入れ、これを力価測定のため(350rpmで撹拌しながら)サンプル細胞(250μL)中のエラスチンに注射した(50回連続注射、1注射当たり5μL)。後続の注射のための時間間隔を180秒に設定し、Microcal Origin(Microcal Software社、ノーサンプトン、米国)を用いて生データを処理した。
ITCの結果は、TAとエラスチンとの間の相互作用が、熱力学的変化を生じさせたことを確認した(図14)。生データ中に示される全体的なマイナスの値は、TAとエラスチンとの間の結合の発熱相互作用を示す(図14(A))。TA-エラスチンの結合は、他の一般的な抗原-抗体相互作用の熱力学的プロットとは異なっていた。本明細書において、力価測定は一般的にS型曲線を示した。TAとエラスチンとの間の結合は特異的ではなかったが、2相コンジュゲーションを示した。[TA]/[エラスチン]比が20以下であった第1ステップにおいて(図14(B)、黒色矢印)、TAは、エラスチンと分子間的にコンジュゲートしていた。[TA]/[エラスチン]比が30以上の第2ステップにおいて、TA/エラスチン間複合体は、相互にコンジュゲートしていた。すなわち、TA-コンジュゲートしたエラスチンは別のTA-コンジュゲートしたエラスチンとの相互作用を促進し得る核形成種の役割を果たすことが可能であり、これは黒色矢印から開始する熱力学的転移点により確認された。このステップにおいて、結合親和性は、TAとエラスチンとの間の結合親和性より低く、このため傾きは第1ステップと比較して急ではなかった(図14(B))。
＜3-4＞ 比濁法を用いたタンニン酸化GFPとECMの結合分析
タンニン酸化GFPを、エラスチン/コラーゲン、ECM様溶液、又はHS/HA混合物、グリコカリックス様溶液に直接添加し、その後比濁法を行った。これらの溶液に、TAの代わりに、タンニン酸化GFP(化学量論比=143、100μL)を、実験的実施例＜3-1＞に記載されているのと同じ方法により添加し、その後、ECM又はグリコカリックス成分(全成分の最終濃度=0.5mg/mL、100μL)の濁度を600nmの周波数で測定した(図15)。
タンニン酸化GFPをECM溶液に添加した場合、濁度変化は、0〜0.2のA600値範囲内で検出可能であった(図15、赤色矢印)。図12に示される濁度試験の結果と同様に、グリコカリックス様溶液中では濁度変化は検出されなかった。図16は、タンニン酸化タンパク質が、エラスチン/コラーゲンに対するTAの高い親和性により、グリコカリックスではなく心臓の細胞外マトリックス中に蓄積されたことを示す図である。
実施例2：タンニン酸化SP(物質P)及びタンニン酸化mCherry-SPの調製
冠動脈を拡げることが知られているペプチド薬であるSP(物質P、配列番号2)の全身投与は、損傷組織への内在性幹細胞の遊走を促進することにより創傷治癒過程を改善し得ることが報告されている。従って、SP投与は、損傷した心筋に対する内在性幹細胞の遊走を誘導し、組織再生及び血管新生を促進することにより、心筋梗塞に対して治療効果及び再生効果を有すると考えられる。これに基づいて、本発明者らは、タンニン酸化SPが、タンニン酸化GFPのように心臓を標的化することができるか否かについて研究した。
タンニン酸化SPを、実施例1においてタンニン酸化GFPの調製のために用いたのと同様の方法により調製した。特に、タンニン酸(TA)溶液(10mM)及びSP溶液(pH=7.4、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)中0.6mM)を調製し、TA溶液の濃度を0.05、0.1、0.5及び1mMに希釈した。希釈したTA溶液及びSP溶液を1：1の体積比で勢いよく混合し、[SP]/[TA]化学量論比を10(TA溶液の濃度=0.05mM)、5、1及び0.5(TA溶液の濃度=1mM)に調整し、タンニン酸化SPの調製をもたらした。
タンニン酸化SPのin vivo心臓標的化特性を分析するため、mCherryタグ化融合タンパク質(mCherry-SP)を調製し、mCherry-SP溶液(mCherry-SP、0.5mM、λexc=587nm、λemi=610nm)の調製を導き、これをTA溶液とさらに混合し、[TA]/[mCherry-SP]化学量論比を2とした。その結果、タンニン酸化mCherry-SPが調製された。
実験的実施例4：タンニン酸化SP及びタンニン酸化mCherry-SPの特徴の分析
＜4-1＞ タンニン酸化SPのサイズ及び形
実施例2におけるタンニン酸化SPを生成するために調製した20、10、5、1及び0.5の[SP]/[TA]比を有する混合溶液を、裸眼で観察した。次いで、タンニン酸化SP([SP]/[TA]比=20及び10、体積=1mL)のサイズを、粒径分析器(Zetasizer nano-ZS、Malvern instrument社、英国)を用いて分析した。
その結果、タンニン酸化SPが、20又は10の[SP]/[TA]比で1μm以下のサイズの複合体を形成したことが確認された(図18)。
＜4-2＞ タンニン酸化mCherry-SPの心臓蓄積効果
タンニン酸化SPのin vivo心臓標的化特性を評価するため、実施例2で調製した非タンニン酸化mCherry-SP(10μg、0.0031mM、200μL)又はタンニン酸化mCherry-SP(200μL)のいずれかを、マウスの尾静脈(BALBc、8週齢、24〜26g)に注射した。注射の6時間後にマウスを屠殺した。肝臓及び心臓におけるmCherryの蛍光強度を、IVIS画像システム(IVIS 200、Xenogen社、米国)を用いて測定した。
GFPの結果と同様に、タンニン酸化mCherry-SPもまた、注射の6時間後に心臓に蓄積された(図19(A))。HTI値は、0.062±0.008から0.111±0.008へと劇的に増加した(図19(B))。
実施例3：タンニン酸化AAV9(アデノ関連ウイルス血清型9)の調製
＜3-1＞ GFPをコードするAAV9の調製及び精製
治療遺伝子を送達するために使用し得るAAV9を、タンニン酸化AAV9が心臓に標的化されたことを確認するためにタンニン酸化した。AAV9は、臨床試験において現在用いられているFDA認可のウイルスベクターである。AAV9コートタンパク質のタンニン酸化が心臓におけるそれらの蓄積を増加させると考えられたため、AAV9が選択された。
CMV(サイトメガロウイルス)プロモーターにより発現されるGFPをコードするAAV(血清型9；AAV9)を、Jang, J.-H. et al., Mol. Ther. 19, 667-675 (2011)に記載される方法に従って調製した。手短に言えば、アデノヘルパープラスミド(pHelper；Stratagene社、ラホヤ、カリフォルニア州、米国)、キャプシド9アセンブリ(pAAV9)をコードするプラスミド、及びITR(末端逆位配列)により囲まれたCMV FGPポリヌクレオチドを含むプラスミドである3種類のプラスミド(等容量、17μg)を、リン酸カルシウムと合わせて複合体を生成し、その後AAV293細胞にトランスフェクトした(Agilent Technologies社、パロアルト、カリフォルニア州、米国)。トランスフェクションの2日後、GFP発現配列と共に導入されたAAV9ベクターを回収し、イオジキサノール(OptiPrep、Alere Technologies AS社、オスロ、ノルウェー)密度勾配超遠心(360,000g；Optima L-90K、Beckman Coulter社、ブレア、カリフォルニア州、米国)により、18℃で2時間精製した。AAV9-GFPベクター(3.6×109vg/μL)のゲノム力価を、SYBR緑色マスターミックス(Thermo Fisher Scientific社、ウォルサム、マサチューセッツ州)を用いた定量PCR(QPCR；Mini Opticon、Bio-rad社、ヘラクレス、カリフォルニア州、米国)により決定した。
＜3-2＞ AAV9のタンニン酸化
タンニン酸化AAV9を調製するため、実施例1においてタンニン酸化GFPの調製に用いたのと同様の方法によりタンニン酸化AAVを調製した。特に、タンニン酸(TA)溶液(10mM)及び実施例＜3-1＞において調製したAAV9溶液を調製し、TA溶液の濃度を0.1、0.25、0.5、0.75及び1mMに希釈した。希釈したTA溶液及びAAV9溶液を1：1の体積比で勢いよく混合し、タンニン酸化AAV9の調製をもたらした。
実験的実施例5：タンニン酸化AAV9のコロイド安定性の評価
実施例＜3-2＞で調製したタンニン酸化AAV9の吸光度(A600)を、UV/vis分光分析(HP8453、Hewlett Packard社)を用いて測定した。
0.75mM TA溶液と混合した場合(図20、緑色)、AAV9凝集体形成が観察され、このためAAV9(1.1x1010vg)に対するTAの最大臨界濃度(図20、ピンク色)は0.5mMであると決定された。
実験的実施例6：タンニン酸化AAV9の心臓標的化の評価
＜6-1＞ 非疾患モデルにおけるタンニン酸化AAV9の心臓標的化の評価
タンニン酸化AAV9のin vivo心臓標的化特性を評価するため、非タンニン酸化AAV9(1x1011vg、60μL)又はタンニン酸化AAV9(1x1011vg、60μL)のいずれかをマウス(BALBc、8週齢、24〜26g)の尾静脈に注射した。注射の21日後にマウスを屠殺した。心臓、脾臓、肺、腎臓及び肝臓の蛍光強度を、IVIS画像システム(IVIS 200、Xenogen社、米国)を用いて測定した。
IHC(免疫組織化学的検査)のため、4％ホルムアルデヒド中で室温にて48時間心臓を固定し、組織をOCT(最適切断温度)化合物と共にドライアイスに埋め込んだ。凍結組織塊を、凍結ミクロトーム(Leica CM3050、GMI Inc.社、米国)を用いて10μmの厚さを有する薄片に切断した。抗体の浸透効率を増加させるため、Triton(0.2％)をこの薄片に処理した。この切片を、1％BSA(ウシ血清アルブミン)でブロックし、その後、一次抗体としての抗GFP抗体(ab6556；1：500、Abcam社、ケンブリッジ、英国、12時間、4℃)及び二次抗体としてのヤギ-抗-ウサギIgG flamma 488(RSA1241、1：200、BioActs, 韓国、1時間、25℃)で処理した。蛍光顕微鏡を用いて観察を実施した(Eclipse 80i、Nikon社、日本)。
心臓に送達されたAAV9はGFP発現を誘導し、AAV9ベクターにクローン化された遺伝子が、心臓細胞中で、細胞転写及び翻訳を介して首尾よく発現したことを示していた(図21)。タンニン酸化AAV9複合体のHTI値(〜0.15)は、非タンニン酸化AAV9のHTI値(〜0.06)より2.5倍高かった。これらの結果は、タンニン酸化が、AAV9ベクターの内在性遺伝子導入能に影響を与えなかったことを示唆する。
＜6-2＞ MIR動物モデルにおけるタンニン酸化AAVの心臓標的化の評価
MIR(心筋虚血再灌流)動物モデルにおけるタンニン酸化AAVの心臓標的化を研究した。
特に、誘導チャンバ内で、ラット(SDラット、8週齢、雄、230〜270g)を、イソフルラン(3cc 分-1)、ロムプン、キシラジン(1mg kg-1)及び酸素の混合物で麻酔した。次いで、ラットに挿管し、イソフルラン及び酸素の混合物を1cc 分-1の速度で流した。ラットの心臓を、左開胸を通して曝露し、その後10分間閉鎖した。縫合線を迅速にゆるめ、左前下行枝(LAD)を通して血流を再開した。縫合線を除去した直後、実施例3で得られたタンニン酸化AAV9又は非タンニン酸化AAV9(2×1011vg、400μL)を注射した。実施例＜6-1＞で実施した正常心臓における発現試験と同様に、注射の21日目に全ラットを屠殺し、IVISシステムを用いてGFP発現を確認した。
その結果、図22(A)に示されるとおり、タンニン酸化AAV9は、AAV9単独又は未処置と比較して、梗塞した心臓組織(白色点線)において遺伝子発現を改善した。タンニン酸化AAV9の注射後(図22(B)、緑色棒)、GFP発現効率は、AAV9単独で処置した群(赤色棒)又は未処置対照(黒色棒)のGFP発現のほぼ2倍高かった。
実験的実施例7：タンニン酸化GFPの心臓細胞毒性の評価
タンニン酸化GFPの心臓細胞毒性を確認するため、ex vivo単相活動電位(MAP)を測定し(図23〜25)、in vivo心臓機能実験を実施した(図26及び27)。
＜7-1＞ ラット心臓のMAPの記録
ラットの心臓を切除するため、腹腔内注射(ip)を介してラットにヘパリン(1000 IU/kg)を投与し、ペントバルビタールの腹腔内注射(50mg/kg)により麻酔した。ラットが安定し、足の反射活動を喪失したら、心臓を迅速に切開し、カルボゲン(95％O2及び5％CO2)で飽和させた改変型クレブス-ヘンゼライト(K-H)緩衝液(112mM NaCl、5mM KCl、11.5mMグルコース、25mM NaHCO3、1.2mM MgSO4、1.2mM KH2PO4、2mMピルビン酸、及び1.25mM CaCl2)を、ランゲンドルフ装置に接続された大動脈を通して37.5℃にて75〜85cmH2Oの圧力下で灌流させた。
左心室心内膜のMAPを、Teflonでコーティングされた銀線(直径0.25mm)で作製した改変型Franz MAP電極を用いて記録した。MAPは、初期平衡期間(15〜30分間)後、脳波(EEG)増幅器(Module 73-1770、EEGA、ドイツ)を用いて連続的に記録した。心臓を、示差AC増幅器1700(A-M System社、ワシントン州)及び別個のパルス刺激器2100(A-M System社、ワシントン州)を用いて電気的に刺激した。最大再分極(APD30、APD60又はAPD100)の30％、60％又は100％での心拍、最大速度(Vmax)、振幅及びMAP期間を測定し、Ponemahソフトウェアを用いて連続的にモニターした。これらのパラメータの全てが安定した後、ビヒクル対照(K-H溶液単独)又はタンニン酸化GFP(100μm TA+GFP、非濾過又は遠心分離により濾過)を含むK-H溶液を、15〜20分間灌流させた。
タンニン酸化GFP溶液は、振幅及びVmaxパラメータに影響を与えなかった(図24(A)及び(B))。心拍の場合、100μmの非濾過タンニン酸化GFPは、心拍を正常な180拍/分から161±16へと低下させた。しかしながら、濾過タンニン酸化GFPは、心拍に有意に影響を与えなかった(図24(C))。これは、毒性を有することが知られている遊離タンニン酸が濾過により除去されたためであった。
本発明者らは、ラットにおいてタンニン酸化GFPが心臓APDの不安定性及び活動電位形の三角形分割に与える影響についても研究した。この不安定性を短期変動(STV)により定量化し、短期変動(STV)は、ポアンカレプロット上のアイデンティティライン（identitiy line）に対する平均直交距離により決定された。特に、以下の式に従って短期変動(STV)を計算した：STV=Σ|Dn+1-Dn|/[30√2](D：APD100)。活動電位形の三角形分割は、APD30からAPD100への再分極時間(すなわち、活動電位形の三角形分割=APD100-APD30)により定義される。APD100で観察される活動電位期間の延長が、APD30で観察される活動電位期間の延長より大きい場合、又はAPD30で観察される時間低下がAPD100で観察される時間低下より大きい場合、活動電位の全体的な形は三角形になる。図25(A)に示されるとおり、非濾過タンニン酸化GFPを処置した場合、活動電位形の三角形分割は制限された。他方、濾過タンニン酸化GFPを処置した場合、活動電位形の三角形分割は正常レベルに戻った(図25(A)、赤色箱)。STVの場合、100μMのタンニン酸化GFPは、未処置対照群と同様にSTVに有意には影響を与えなかった(図25(B))。
＜7-2＞ 圧力-容量コンダクタンスカテーテル技術を用いたラットの心臓機能の測定
濾過タンニン酸化GFPの心安全性を確認するため、in vivo心臓血行動態分析(図26)を実施した。
ラットを、連続的に体温をモニタリングしながらヒーティングパッド上で3％イソフルラン(気化器、Vet equip社、米国、2〜3cc/分)で麻酔した。圧力-容量変換器(2.0Fr、Millar instruments社、テキサス州)を、右頸動脈を通して左心室に導入し、通知された方法に従ってシグナルを記録した(Hondeghem, L. M. et al., Circulation 103, 2004-2013(2001))。圧力及び体積シグナルを、LabScribeデータ収集ソフト(iWorx/CB Sciences社、米国)に対するScScense ADV500(Transonic社、米国)出力データを用いて記録した。
記録されるパラメータ値が安定した後、ラットを3つの群に無作為に分割し、これらの群に対して、GFP(対照)又はタンニン酸化GFP(12時間群及び24時間群)を尾静脈に注射した。タンニン酸化GFPの注射の12時間後及び24時間後、データを回収して分析した。
HR(心拍)、CO(心拍出量)、SV(1回拍出量)及びEF(駆出率)、LV(左心室)圧、dP/dtmax(最大圧力上昇速度の最大dP/dt)、dP/dtmin(最大圧力低下速度の最小dP/dt)、ESV(収縮末期容量)、EDV(拡張末期容量)、SW(1回仕事量)、Ea(大動脈弾性率)、及び弛緩時定数のTau値を、以下の分析ソフトウェアを用いるアルゴリズムにより分析した。
HR：60/平均循環期間
ESP：収縮末期の心室圧
EDP：拡張末期の心室圧
LV(左心室)圧：選択されたサイクルにわたる圧力チャネルの平均_最大値
dP/dtmax：選択されたサイクルにわたる平滑化微分係数の平均最大値
dP/dtmin：選択されたサイクルにわたる平滑化微分係数の平均最小値
SV=EDV(選択されたサイクルにわたる拡張末期容量の平均値)-ESV(選択されたサイクルにわたる収縮末期容量の平均値)
CO=SV * HR
EF=100 * (SV/EDV)
SW：選択された心臓サイクルにわたり平均したPV Loop内の面積
Ea：ESP/SV
Weiss’s法を用いたTau：logPの回帰。
TAは、他の分子と共に製剤化された場合に非毒性となる(すなわち、金属配位TA複合体)。このため、分子レベルで固定されたタンパク質のタンニン酸化に用いられたTAは悪影響を及ぼさなかったと考えられた。実際、非タンニン酸化GFPが注射された場合と比較して、タンニン酸化GFP注射は、注射の12時間後又は24時間後に上記のパラメータに悪影響を及ぼさなかった(図27)。従って、上記のex vivo及びin vivo分析から、タンニン酸化GFPは心臓毒性を有していなかったことが確認された。
実施例4：タンニン酸化bFGFの調製
最初に、bFGF(塩基性線維芽細胞成長因子、配列番号1)を、1mg/mLの濃度でPBS(リン酸緩衝生理食塩水)に溶解し、タンニン酸(本明細書中以降TAと呼ばれる)溶液を0.14mM又は0.7mMの濃度で調製した。TA溶液(100μL)をbFGF溶液(5μgには0.14mM、25μgには0.7mM)に添加し、143の化学量論モル比([TA]/[bFGF])を有するタンニン酸化bFGFの調製をもたらした。
実験的実施例8：タンニン酸化bFGFの治療効果の確認
bFGFは、心臓機能の回復のための血管新生の形成において重要な役割を果たす。しかしながら、bFGFの静脈注射は治療上有効ではなく、このため他の製剤(例えば、ハイドロゲル)を心筋に注射する必要性がある。従って、静脈注射を介して投与されたタンニン酸化bFGFが、MIR(心筋虚血再灌流)動物モデルにおいて治療効果を示したか否かについて研究した。
特に、ラット(SDラット、8週齢、雄、230〜270g)を、誘導チャンバ内で、イソフルラン(3cc 分-1)、ロムプン、キシラジン(1mg kg-1)及び酸素の混合物を用いて麻酔した。その後、ラットに挿管し、イソフルラン及び酸素の混合物を1cc 分-1の速度で流した。ラットの心臓を、左開胸を通して曝露し、その後10分間閉鎖した。縫合線を急速にゆるめ、左前下行枝(LAD)を通して血流を再開させた。縫合線を除去した直後、実施例4において得られたタンニン酸化bFGF又は非タンニン酸化bFGF(5μg又は25μg、注射体積200μL)を注射した(n=7、各群)。
注射の28日後、LabScribeデータ収集ソフト(iWorx/CB Sciences社、米国)に対するScScense ADV500(Transonic社、米国)出力データを用いて左心室機能を研究するため、in vivo血行動態評価を実施した。
血行動態評価が完了した後、心臓を分離し、温PBS(〜37℃)に浸漬して血液残留物を除去した。次いで、心臓を-20℃で急速に凍結し、凍結した心臓を、尖部から約2mm離れて縦方向に薄切りにした。この切片を細胞培養皿上に置き、これをPBSに溶解した1％TTC(塩化トリフェニルテトラゾリウム)で、37℃にて15分間処理した。染色後、心臓切片をスキャナーで撮影した。その後、赤色で染色した生組織、及び染色されなかったため白色として示される壊死組織を識別した。梗塞領域のサイズを、ImageJソフトウェアを用いてデジタル的に測定し、結果は％として示される。
その結果、図28(A)に示されるとおり、5μgのタンニン酸化bFGFの注射の28日後、梗塞サイズは全心臓(黒色バー)の約16％であり、未処置対照群の梗塞サイズは51％であった(白色バー)。bFGF単独を注射した場合、梗塞サイズは31％であった(灰色バー)。25μgのbFGFを投与した場合、梗塞サイズは5μgのbFGFを投与した場合とそれほど変わらなかった。
また組織学的画像は、タンニン酸化bFGFの注射後の梗塞のサイズ低下も裏付けた(図28(B))。特に、タンニン酸化bFGFの注射は、全ての血行動態機能値(左心室圧、1回拍出量、心拍出量、及び心室収縮指数)を、健康な心臓(sham群)と同様のレベルに回復させた(図29及び表2)。これらの結果は、心臓標的化剤のタンニン酸化が、心臓病の治療において効率的であることを示す。
Figure 0006873261
本発明のタンニン酸化は、単に、タンニン酸化される物質とタンニン酸(TA)とを適切な化学量論比で混合するだけで達成することができる。タンニン酸化は、ペグ化と同様にin vivo血液循環時間を増加させた。しかしながら、ペグ化と異なり、タンニン酸化は心臓の心筋に結合する能力を与えることが可能であり、このためタンニン酸化は、タンニン酸化物質の心臓標的化及びこれらの物質の心臓における蓄積のために使用することができる。
この発明において、GFP、SP及びbFGF、心臓病治療薬、及びウイルスAAV9がタンニン酸化され、これらが心筋に標的化されて蓄積されたことが確認された。従って、タンニン酸化は、心臓病治療薬の心臓標的化のための一般的な方法として有用であることが確認された。特に、MIR動物モデルにおいてタンニン酸化bFGFが静脈的に注射された場合、タンニン酸化bFGFの治療効果が確認された。上記の結果は、タンニン酸化心臓病治療薬が、治療薬を心臓に局所的に送達するために侵襲法を用いる従来の方法の不利点を克服し得ることを示す。
本発明は、以下の実施形態を包含する。
（実施形態１）
活性成分として、以下の式1：
Figure 0006873261
 により表されるタンニン酸を含む心臓標的化剤。
（実施形態２）
タンニン酸が、心臓の心筋に標的化されて心筋中に蓄積される、実施形態１に記載の心臓標的化剤。
（実施形態３）
心臓病の予防又は治療のための、活性成分としてのタンニン酸化心臓病治療薬を含む医薬組成物。
（実施形態４）
心臓病治療薬が、化合物、タンパク質、核酸及びタンパク質/核酸複合体からなる群から選択される1種以上の物質である、実施形態３に記載の心臓病の予防又は治療のための医薬組成物。
（実施形態５）
タンパク質が、bFGF(塩基性線維芽細胞成長因子)又はSP(物質P)である、実施形態４に記載の心臓病の予防又は治療のための医薬組成物。
（実施形態６）
活性成分としてタンニン酸化薬物担体を含む心臓標的化組成物。
（実施形態７）
薬物担体が、ベクター、ウイルス及び細胞からなる群から選択される、実施形態６に記載の心臓標的化組成物。
（実施形態８）
ウイルスが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス及びレンチウイルスからなる群から選択される、実施形態７に記載の心臓標的化組成物。
（実施形態９）
実施形態３又は実施形態６に記載の心臓病の予防又は治療のための医薬組成物であって、該組成物が静脈注射を介して投与される、前記医薬組成物。
（実施形態１０）
心臓病治療薬を高効率で心臓に標的化する方法であって、心臓病治療薬をタンニン酸化するステップを含む、前記方法。
（実施形態１１）
タンニン酸及び心臓病治療薬を含む、心臓病を治療するためのキット。
（実施形態１２）
心臓病を予防、改善又は治療するための方法であって、対象にタンニン酸化心臓病治療薬を投与するステップを含む、前記方法。
（実施形態１３）
心臓病の予防、改善又は治療のための薬の製造のための、タンニン酸化心臓病治療薬の使用。

Claims (4)

  1. タンパク質と、以下の式：
    Figure 0006873261
     により表されるタンニン酸とを含み、タンニン酸がタンパク質に結合している、タンパク質及びタンニン酸を心臓へ標的化するためのタンニン酸化されたタンパク質複合体。
  2. タンパク質が、bFGF(塩基性線維芽細胞成長因子)、SP(物質P)、EGF(上皮細胞成長因子)及びVFGF-B(血管内皮成長因子B)からなる群から選択される一種以上の物質である、請求項１に記載のタンニン酸化されたタンパク質複合体。
  3. ウイルスと、以下の式：
    Figure 0006873261
     により表されるタンニン酸とを含み、タンニン酸がウイルスに結合している、ウイルス及びタンニン酸を心臓へ標的化するためのタンニン酸化されたウイルス複合体。
  4. ウイルスが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス及びレンチウイルスからなる群から選択される、請求項３に記載のタンニン酸化されたウイルス複合体。
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