KR20190111253A - 탄닌산을 포함하는 심장 표적화제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 탄닌산을 포함하는 심장 표적화제에 관한 것으로, 심장으로 전달하고자 하는 심장질환 치료제를 탄닌화(TANNylation)함으로써 심장 심근에 결합하는 능력을 부여하여 치료제의 심장 표적화 및 축적을 가능하게 하며, 종래의 치료제를 심장으로 표적화시키기 위해 사용된 침습적인 방법들과 달리, 비침습적인 정맥 내 투여만으로도 치료제를 심장으로 고효율로 표적화시킬 수 있다.

Description

탄닌산을 포함하는 심장 표적화제{Agent for targeting heart comprising tannic acid}
본 발명은 탄닌산을 유효성분으로 포함하는 심장 표적화제에 관한 것이다.
현재까지 알려진 표적화된 약물을 전달하기 위한 가장 편리한 경로는 전신 주사(Systemic injection)이며, 전신 주사로 투여된 약물은 수동 확산, 증진된 투과 및 유지(EPR, enhanced permeability and retention) 및 표적 기관 수용체와의 상호 작용을 통해 다양한 암, 간 및 폐 조직으로 표적화될 수 있다. 그러나 전신 주사로 심장에 약물을 직접 표적화하는 것은 심한 체적 변화를 동반하는 심장의 끊임없는 동적 수축-이완 사이클 때문에 매우 어려운 문제이며, 또한 혈액의 교환은 빠르고 방대하기 때문에 투여된 치료제가 심장 내에서 장시간 약효를 나타내기란 쉽지 않다.
심장에 국소적으로 치료제를 전달하기 위한 대부분의 방법은 흉골 절개(sternotomy) 또는 개흉술(thoracotomy)과 같은 외과 수술을 필요로 하며, 이는 환자의 흉벽 및 뼈의 절개를 불가피하게 포함한다. 가장 대표적인 예는 '셀 시트(cell-sheet)' 방식으로, 이는 손상된 심근의 표면에 직접 적용된다. 비록 심근내(intramyocardial) 또는 심외막(epicardial) 주사가 치료를 위한 비외과적인 접근법으로 간주될 수 있지만, 심장의 동적인 움직임 때문에 약물을 정확히 표적화하기 위해서는 개방 수술이 반드시 필요하다. 직접적인 심장 조직 주사 이외에도, 아데노-관련 바이러스 벡터에 의한 심장 유전자 치료, 초음파를 이용한 미세 소포 파괴, 카테터-기반 유전자 전달 및 리포좀이 결합된 심근 경색 특이적인 표적화 펩타이드와 같이 정맥 내 주사 경로를 이용한 몇몇 연구가 보고(Scott, R. C. et al., Expert Opin. Drug Deliv. 5, 459-470(2008); Wang, Z. et al., Nat. Biotechnol. 23, 321-328(2005); Mayer, C. R. & Bekeredjian, R., Adv. Drug Deliver. Rev. 60, 1177-1192 (2008); Dvir, T. et al., Nano Lett. 11, 4411-4414(2011); Beeri, R. et al., Circulation 106, 1756-1759(2002))되어 있지만, 이러한 전신 전달 방법은 섬세하고 힘든 화학/생물학적 실험 설정이 필요하며, 정맥 내로 고농도로 투여되어야 하는 단점들이 있다.
정맥 내 주사에 의해 심장에 단백질/펩타이드 치료제를 효율적으로 전달하기 위해서는 약물 전달 비히클(vehicle)이 기관(즉, 조직)-특이적 고유한 특성을 인식할 수 있어야 한다. 즉, 정맥 내 주입된 비히클은 혈관 내피층의 당질층(glycocalyx layers)에 흡착되지 않아야 하며, 두껍고 세포외기질(ECM)이 풍부한 조직인 심근(대부분 엘라스틴과 콜라겐으로 구성)과 같은 심장 조직에 즉시 흡착할 수 있어야 한다.
탄닌산(TA, tannic acid)은 과일, 채소, 올리브, 카카오 등의 식물에서 발견되는 가장 풍부한 폴리 페놀 중 하나로서, 근래 탄닌산은 다기능 코팅 분자로 이용되고 있다. 또한 DNA 및 트롬빈, 젤라틴, 콜라겐 및 뮤신과 같은 프롤린이 풍부한 단백질을 포함한 생체거대분자(biomacromolecules)과의 친화력이 뛰어난 분자로 알려져있다. 탄닌산은 페놀성 히드록시기가 풍부한 모이어티 (5개의 갈롤 그룹(방향족 고리에 연결된 3개의 -OH기) 및 5개의 카테콜 그룹(방향족 고리에 공유결합으로 연결된 2개의 -OH기))가 표적 단백질과 다중 수소 결합 및 소수성 상호 작용을 통해 단백질과 결합한다.
본 발명의 목적은 탄닌산을 유효성분으로 포함하는 심장 표적화제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 탄닌화된 심장질환 치료제를 유효성분으로 포함하는 심장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 탄닌화된 약물 전달체를 유효성분으로 포함하는 심장 표적화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 심장질환 치료제를 탄닌화하는 단계를 포함하는 심장질환 치료제를 심장으로 고효율로 표적화시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 탄닌산 및 심장질환 치료제를 포함하는 심장질환 치료용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 탄닌산을 유효성분으로 포함하는 심장 표적화제를 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00001
.
또한, 본 발명은 탄닌화된 심장질환 치료제를 유효성분으로 포함하는 심장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 탄닌화된 약물 전달체를 유효성분으로 포함하는 심장 표적화용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 심장질환 치료제를 탄닌화하는 단계를 포함하는 심장질환 치료제를 심장으로 고효율로 표적화시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 탄닌산 및 심장질환 치료제를 포함하는 심장질환 치료용 키트를 제공한다.
본 발명은 심장으로 전달하고자 하는 심장질환 치료제를 탄닌화(TANNylation)함으로써 심장 심근에 결합하는 능력을 부여하여 치료제의 심장 표적화 및 축적을 가능하게 하며, 종래의 치료제를 심장으로 표적화시키기 위해 사용된 침습적인 방법들과 달리, 비침습적인 정맥 내 투여만으로도 치료제를 심장으로 고효율로 표적화시킬 수 있다.
도 1은 탄닌화된 GFP(TANNylated GFP) 제조 과정을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 [TA]/[GFP]의 임계 화학량론적 비율(critical stoichiometric ratio)을 결정하기 위한 탁도 시험 결과를 나타낸 것이다 (TA: 탄닌산).
도 3은 [TA]/[GFP]의 화학양론적 비율에 따른 탄닌화된 GFP의 모습을 육안으로 관찰한 것이다 ((A): [TA]/[GFP]=72; (B): [TA]/[GFP]=143; (C): [TA]/[GFP]=357).
도 4는 나노스케일의 복합체를 형성하는 [TA]/[GFP]의 화학양론적 비율 72 및 143인 탄닌화된 GFP의 형태(morphology) 및 크기(size) 특성을 분석한 결과이다 ((A) 및 (B): [TA]/[GFP] = 72인 탄닌화된 GFP의 DLS 분석 결과 및 AFM 분석 결과; (C) 및 (D): [TA]/[GFP] = 143인 탄닌화된 GFP의 DLS 분석 결과 및 AFM 분석 결과).
도 5는 마이크로 스케일의 복합체를 형성하는 [TA]/[GFP]의 화학양론적 비율 214(A), 286(B) 및 714(C)인 탄닌화된 GFP의 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 6은 탄닌화된 GFP(TANNylated GFP)를 마우스에 정맥 내 주사한 후, 3시간째 및 6시간째의 탄닌화된 GFP의 전체적인 장기 분포를 나타낸 것이다 (HTI(heart-targeting index): 심장-표적화 지수; Spleen: 비장; Kidney: 신장; Lung: 폐; Heart: 심장; Liver: 간).
도 7은 탄닌화되지 않은 GFP(un-TANNylated GFP)를 마우스에 정맥 내 주사한 후, 3시간째 및 6시간째의 탄닌화된 GFP의 전체적인 장기 분포를 나타낸 것이다 (HTI(heart-targeting index): 심장-표적화 지수; Spleen: 비장; Kidney: 신장; Lung: 폐; Heart: 심장; Liver: 간).
도 8은 탄닌화된 GFP(TANNylated GFP) 및 탄닌화되지 않은 GFP(un-TANNylated GFP)를 마우스에 정맥 내 주사한 후, 1.5, 6, 48 및 120시간째의 심장 축적 효과를 나타낸 것이다.
도 9는 탄닌화된 GFP(TANNylated GFP) 및 탄닌화되지 않은 GFP(un-TANNylated GFP)를 마우스에 정맥 내 주사한 후, 1.5, 6, 48 및 120시간째의 HTI 값을 나타낸 것이다.
도 10은 탄닌화된 GFP(TANNylated GFP) 및 탄닌화되지 않은 GFP(un-TANNylated GFP)를 마우스에 정맥 내 주사한 후, 탄닌화된 GFP 또는 탄닌화되지 않은 GFP의 분포 결과를 나타낸 것이다 ((A): 탄닌화되지 않은 GFP 투여 시 심근(위) 및 혈관(아래); (B): 탄닌화된 GFP 투여 시 심근(위) 및 혈관(아래); (C): 탄닌화된 GFP 투여 시 심장 전체 분포)
도 11은 탄닌화된 GFP(TANNylated GFP) 및 탄닌화되지 않은 GFP(un-TANNylated GFP)를 마우스에 정맥 내 주사한 후, 혈류 내 약동학(pharmacokinetics) 결과를 나타낸 것이다 (파란색 화살표: 주사 후 6시간 째에 심장 축적이 나타나는 시간을 나타낸 것이다).
도 12는 엘라스틴(Ela)/콜라겐(Col) 및 탄닌산(TA); 또는 HA(히알루론산)/HS(헤파린 설페이트) 및 탄닌산(TA) 간의 형성된 분자간(inter-molecular) 복합체로 인해 나타나는 용액의 탁도를 측정한 결과이다 (ECM: 세포외기질(extracellular matrix); Glycocalyx: 당질층).
도 13은 콜라겐(collagen) 또는 엘라스틴(elastin)으로 코팅된 금 표면에 결합하는 탄닌산의 SPR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 엘라스틴과 탄닌산의 결합에 대한 ITC 결과를 나타낸 것이다 ((A): 엘라스틴과 탄닌산 사이의 발열 결합을 나타내는 미가공 데이터; (B): 엘라스틴과 탄닌산의 몰비(molar ratio)의 함수로 (A)의 미가공 데이터를 재분석한 데이터).
도 15는 탄닌화된 GFP와 세포외기질(ECM); 또는 탄닌화된 GFP와 당질층(Glycocalyx)와의 결합으로 인해 나타나는 용액의 탁도를 측정한 결과이다 (Un-TANNylated GFP: 탄닌화되지 않은 GFP; TANNylated GFP: 탄닌화된 GFP).
도 16은 탄닌화된 단백질이 심장의 당질층(glycocalyx)이 아닌 세포외기질(EM) 구성 인자와 결합함을 도식화한 것이다.
도 17의 (A)는 탄닌화된 SP(Substance P), (B)는 탄닌화된 아데노-부속 바이러스(AAV, Adeno-associated virus)를 도식화한 것이다.
도 18은 (A)는 [SP]/[TA]의 화학양론적 비율에 따른 탄닌화된 SP의 모습을 육안으로 관찰한 것이고([SP]/[TA] = 0.5, 1, 5, 10 및 20), (B) 및 (C)는 [SP]/[TA]의 화학양론적 비율 20 및 10인 탄닌화된 SP의 크기 분포를 나타낸 것이다.
도 19의 (A)는 SP 및 탄닌화된 m-Cherry-SP(TANNylated SP) 복합체의 생체 내 심장 축적을 나타낸 것이고, (B)는 SP 및 탄닌화된 m-Cherry-SP 복합체(TANNylated SP)를 마우스에 정맥 내 주사한 후 6시간 째의 HTI 값을 나타낸 것이다.
도 20은 탄닌화된 AAV9을 제조하는 데에 탄닌산의 최대 임계 농도를 결정하기 위한 탁도 실험 결과를 나타낸 것이다 (빨간색 화살표는 탄닌산(0.75 mM) 첨가에 따른 탁도 변화를 나타낸다).
도 21의 (A)는 AAV 및 탄닌화된 AAV(TANNylated AAV) 복합체의 생체 내 심장 축적을 나타낸 것이고, (B)는 AAV 및 탄닌화된 AAV 복합체(TANNylated AAV)를 마우스에 정맥 내 주사한 후 6시간 째의 HTI 값을 나타낸 것이다.
도 22는 (A)는 비처리(No treat), AAV, 탄닌화된 AAV(TANNylated AAV) 복합체를 마우스에 정맥 내 주사한 후 경색된 심장 조직 내 GFP 발현 이미지를 나타낸 것이고, (B)는 (A)의 GFP 발현을 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 23의 왼쪽 이미지는 랫트의 단산성 활동 전위(MAP,monophasic action potentials)에 대한 탄닌화된 GFP의 영향을 확인하기 위해, 심장과 연결된 Langendorff 시스템의 실험 설정을 나타낸 것이고(왼쪽), 오른쪽 위 이미지는 삽입된 자극 전극(stimulating electrodes), 오른쪽 아래 이미지는 MAP 프로브(probe)를 나타낸 것이다.
도 24 및 도 25는 비처리(No treat), 탄닌화된 GFP(TANNylated GFP)의 여과되지 않은 것(100) 또는 여과된 것(Filt-100)을 투여한 마우스 심장의 단산성 활동 전위(MAP)를 측정한 결과를 나타낸 것이다
(도 24의 (A): 진폭(Amplitude); (B): Vmax; (C): 심박수(Heart rate);
도 25의 (A): 활동전위 형태의 삼각형화(Triguation); (B): 단기 변동성(Short term variability; STV)).
도 26은 압력-부피 전도도 카테터 기법(pressure?volume conductance catheter technique)을 이용한 랫트의 심장 혈류역학 실험을 도시화한 것이다.
도 27은 GFP(Control, 6 ㎍/mL) 또는 탄닌화된 GFP(TANNylated GFP, 500 ㎕/kg)를 마우스에 정맥 내 주사한 후, 12시간 및 24시간 째의 심장 혈류역학 실험 결과를 분석한 것이다 ((A): 심박수(heart rates); (B): 심박출량(cardiac output); (C): 박출량(stroke volume); (D): 구출분획(ejection fraction); (E): 심실 수축률 지수(ventricular contractility index (최대/최소 dP/dt)); 및 (F): 타우값(Tau value), Weiss 방법(logP의 회귀)에 따라 계산된 이완(relax) 시간 상수).
도 28은 bFGF 단독 투여(5 ㎍ 또는 25 ㎍) 또는 탄닌화된 bFGF(TANNylated bFGF, 5 ㎍ 또는 25 ㎍)를 MIR(myocardial ischemia reperfusion, 심근 허혈 재관류) 마우스 모델에 정맥 내 주사한 후, 28일 째의 심장 조직의 경색 크기를 나타낸 것이다 ((A): 경색 크기를 정량화한 결과; (B): 경색 부위 이미지; Sham: 건강한 심장을 가진 그룹).
도 29는 bFGF 단독 투여(5 ㎍ 또는 25 ㎍) 또는 탄닌화된 bFGF(TANNylated bFGF, 5 ㎍ 또는 25 ㎍)를 MIR(myocardial ischemia reperfusion, 심근 허혈 재관류) 마우스 모델에 정맥 내 주사한 후, 28일 째의 혈류역학 실험 결과를 분석한 것이다 ((A): 좌심실 압력(LV pressure); (B): 박출량(stroke volume)); (C): 심박출량(cardiac output); 및 (D): dP/dt (단위당 심실 압력 변화); Sham: 건강한 심장을 가진 그룹).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 탄닌산을 유효성분으로 포함하는 심장 표적화제를 제공한다:
[화학식 1]
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.
본 발명에서 "표적화(targeting)"는 임의의 물질이 생체내의 특정 세포나 특정 조직(tissue) 또는 특정 기관(organ)과 같은 표적에 대량으로 및/또는 신속하게 이동하는 것을 의미한다. 본 발명에서 "표적화제(targeting agent)"란 직간접적인 결합을 통해 다른 임의의 물질을 상기의 특정 표적으로 표적화할 수 있는 물질을 의미한다. 상기 표적화제는 표적 조직 또는 표적 기관의 세포에 직접 결합하거나 세포간 기질(extracellular matrix)에 결합하는 것일 수 있으며 또는 세포내로 흡수되는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 표적화제는 상기 탄닌산 단독으로 구성될 수 있고, 탄닌 이외의 다른 구성성분, 예를 들면, 다른 표적화제, 담체 또는 약물과의 결합을 촉진시키거나 안정화시키는 성분, 제제 제조에 사용시 또는 제제의 저장시에 탄닌산을 보호하는 성분, 탄닌산, 담체 또는 약물을 공간적으로 떨어뜨리는 스페이서(spacer) 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 표적화제는 임의의 담체 또는 약물과 결합시켜 상기 담체 또는 약물을 심장에 표적화할 수 있다.
본 발명의 표적화제가 표적화할 수 있는 물질 또는 물체는 특별히 한정되지 않지만, 투여 부위로부터 심장 또는 심장 근처 부위까지 생물의 체내를 물리적으로 이동할 수 있는 크기인 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 표적화제는 원자, 분자, 화합물, 단백질, 핵산, 단백질/핵산 복합체 등의 물질은 물론, 벡터, 바이러스 입자, 세포 중 어느 하나 이상의 요소로 구성된 약물방출시스템, 마이크로 머신등의 물체도 전달할 수 있다. 상기 물질 또는 물체는, 예들 들면 심장 조직 내의 특정 세포를 표지하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 심장질환의 치료제일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 상기 물질 또는 물체는 탄닌화(TANNylation)되는 것이 바람직하다. 본 발명에서 "탄닌화"는 탄닌산과 수소 결합 또는 소수성 상호 작용을 형성할 수 있는 물질에 탄닌산이 부착되는 과정으로 탄닌산은 페놀성 하이드록시기가 풍부한 모이어티(갈롤(gallol) 그룹 및 카테콜(catechol) 그룹)를 가지므로, 탄닌화하고자 하는 물질과 다중 수소 결합 및 소수성 상호 작용을 형성할 수 있다. 탄닌화된 물질은 심장에 표적화되어 축적된 다음, 탄닌산의 에스터 결합이 점진적으로 분해됨에 따라 천천히 방출될 수 있다.
상기 탄닌산은 상기 화학식 1로 기재되는 플라보노이드 계열의 화합물로, 심혈관 내피층의 당질층(glycocalyx layers)에 무시할 수 있을 정도의 흡착을 나타내지만, 세포외기질(ECM)이 풍부한 심근에 강한 흡착을 나타내어, 심장, 보다 구체적으로는 심장의 심근(myocardium)으로 표적화되고 심근에 축적될 수 있다.
본 발명은 탄닌화된 심장질환 치료제를 유효성분으로 포함하는 심장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 탄닌화된 심장질환 치료제는 심장, 보다 바람직하게는 심근(myocardium)에 표적화되어 축적될 수 있다.
상기 심장질환 치료제는 탄닌화될 수 있는 치료제인 한, 당업계에 공지된 모든 심장질환 치료제일 수 있고, 상기 심장질환은 당업계에 공지된 모든 심장질환을 포함할 수 있으며 구체적으로 탄닌화된 심장질환 치료제의 치료 효과에 따라 목적으로 하는 심장질환이 달라질 수 있다. 예를 들어 상기 심장질환 치료제가 bFGF일 경우, 심장질환은 허혈성 심장질환일 수 있고, 상기 허혈성 심장질환은 심근경색, 심부전증 및 협심증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 심장질환 치료제는 화합물, 단백질, 핵산 및 단백질/핵산 복합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 bFGF(basic fibroblast growth factor), SP(substance P), EGF(Epidermal growth factor), VFGF-B(vascular endothelial growth factor B) 등일 수 있으나, 한정되지 않는다.
상기 bFGF는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있다.
상기 SP는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있다.
서열번호 펩타이드 아미노산 서열
1 bFGF AAGSITTLP ALPEDGGSGA FPPGHFKDPK RLYCKNGGFF LRIHPDGRVD GVREKSDPHI KLQLQAEERG VVSIKGVCAN RYLAMKEDGR LLASKCVTDE CFFFERLESN NYNTYRSRKY TSWYVALKRT GQYKLGSKTG PGQKAILFLP MSAKS
2 SP RPKPQQFFGLM
상기 심장질환 치료제는 바이러스를 전달체로 하는 것일 수 있다. 상기 바이러스는 바이러스 표면에 존재하는 단백질과 탄닌산이 수소 결합 및 소수성 상호 작용을 형성하므로 탄닌화될 수 있다. 상기 바이러스를 전달체로 하는 심장질환 치료제는 심장 내에서 발현 시 치료 또는 예방 효과를 갖는 치료용 유전자(폴리뉴클레오타이드 서열)일 수 있다.
상기 바이러스는 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus) 및 렌티바이러스(lentivirus)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는 아데노-연관 바이러스(AAV)일 수 있고, 더 바람직하게는 아데노-연관 바이러스 혈청형 9(AAV9)일 수 있다.
상기 조성물은 경구 또는 비경구 투여 모두 가능하며, 비경구 투여는 두개강 내 주입, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등을 포함하나, 바람직하게는 정맥 내로 투여될 수 있다.
상기 bFGF는 5 내지 200 ㎍/kg로 투여될 수 있고, 바람직하게는 15 내지 120 ㎍/kg로 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 탄닌화된 약물 전달체를 유효성분으로 포함하는 심장 표적화용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "탄닌화"는 탄닌산과 수소 결합 또는 소수성 상호 작용을 형성할 수 있는 물질에 탄닌산이 부착되는 과정으로, 심장으로 표적화하기 위한 약물을 탄닌화하거나 심장으로 표적화하기 위한 약물을 포함하는 약물 전달체를 탄닌화할 수 있다.
상기 약물 전달체는 탄닌산과 수소 결합 및 소수성 상호 작용을 형성할 수 있는 작용기(functional group)를 가지고 있는 한, 제한없이 사용될 수 있다. 바람직하게 상기 약물 전달체는 벡터, 바이러스 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 바이러스는 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus) 및 렌티바이러스(lentivirus)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
상기 조성물은 경구 또는 비경구 투여 모두 가능하며, 비경구 투여는 두개강 내 주입, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등을 포함하나, 바람직하게는 정맥 내로 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 심장질환 치료제를 탄닌화하는 단계를 포함하는 심장질환 치료제를 심장으로 고효율로 표적화시키는 방법을 제공한다.
상기 탄닌화는 탄닌산을 포함하는 용액 및 심장질환 치료제를 포함하는 용액을 혼합함으로써 달성될 수 있으며 혼합할 때, 탄닌화된 심장질환 치료제의 크기, 형태, 안정성 등을 고려하여 탄닌산과 심장질환 치료제를 적절한 화학량론적 비율로 혼합할 수 있다.
또한, 본 발명은 탄닌산 및 심장질환 치료제를 포함하는 심장질환 치료용 키트를 제공한다.
상기 탄닌산 및 심장질환 치료제를 혼합함으로써, 심장질환 치료제를 탄닌화할 수 있다. 상기 탄닌산 및 심장질환 치료제는 용액에 용해된 상태로 제공되거나 상기 용액이 상기 키트에 추가적으로 포함될 수 있으나, 탄닌산 및 심장질환 치료제를 혼합하여 심장질환 치료제를 탄닌화할 수 있는 한, 상기 탄닌산 및 심장질환 치료제의 형태는 제한되지 않는다. 또한 상기 심장질환 치료용 키트는 약학적 조성물에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 추가적으로 포함할 수 있고, 상기 심장질환 치료제는 1종 이상 포함될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 다양한 화학양론적 비율로 탄닌산(TA)과 GFP를 혼합하여 탄닌화된 GFP(TANNylated GFP)를 제조한 결과, 생체 내 순환을 위한 합리적인 범위 내에 해당되는 [TA]/[GFP]의 화학량론적 비율이 143인 탄닌화된 GFP를 선택하였다 (도 1 내지 도 5 참조).
또한, 본 발명자들은 탄닌화된 GFP를 마우스에 정맥 내 주사하여 장기별 표적화 능력을 평가한 결과, 탄닌화된 GFP는 비장, 신장, 폐, 간에 비해 심장에 특이적으로 표적화됨을 확인하였다 (도 6 및 도 7 참조).
또한, 본 발명자들은 탄닌화된 GFP를 마우스에 정맥 내 주사하여 시간별 심장 표적화 능력을 평가한 결과, 탄닌화된 GFP는 정맥 내 주사 6시간 후에 심장으로 표적화됨을 확인하였고 120시간까지 심장 표적화 능력을 유지하여, 탄닌화된 GFP는 심장에 축적됨을 확인하였다 (도 8 및 도 9 참조).
또한, 본 발명자들은 탄닌화된 GFP를 마우스에 정맥 내 주사하여 심장 조직 내 공간 분포를 검사한 결과, 탄닌화된 GFP는 대부분 심근에 축적됨을 확인하였다 (도 10 참조).
또한, 본 발명자들은 탄닌화된 GFP를 마우스에 정맥 내 주사하여 혈액 순환 시간을 측정한 결과, 탄닌화되지 않은 GFP(Un-TANNylated GFP)와 비교하여 혈액 순환 시간이 길고, 정맥 내 주사 후 120시간까지 혈액 내에 남아있음을 확인하였다 (도 11 참조).
또한, 본 발명자들은 당질층(glycocalyx)의 주요 구성 인자인 헤라핀 설페이트(heparin sulfate, HS) 및 히알루론산(hyaluronan, HA)에 결합하는 TA의 능력과 세포외기질의 주요 구성 인자인 엘라스틴(elastin) 및 타입 Ⅰ 콜라겐(collagen)에 결합하는 TA의 능력을 비교한 결과, 탄닌산은 세포외기질, 특히 엘라스틴에 더 강하게 결합하는 것을 확인하였다 (도 12 내지 도 16 참조).
또한, 본 발명자들은 관상 동맥 혈관 확장에 효과가 있는 것으로 알려진 펩티드 약물 SP(substance P) 또는 유전자 치료제의 전달체로 이용될 수 있는 AAV9을 탄닌화하여 마우스 정맥 내 주사한 결과, 탄닌화된 GFP와 동일하게 심장에 표적화되고 축적되므로, 심장으로 전달하고자 하는 물질을 탄닌화하여 심장 표적화할 수 있음을 확인하였다 (도 17 내지 도 22 참조).
또한, 본 발명자들은 탄닌화된 GFP는 생체 외 단산성 활동 전위 및 생체 내 심장 기능 실험을 통해 독성을 나타내지 않음을 확인하였다 (도 23 내지 도 27 참조).
또한, 본 발명자들은 심장질환 치료제인 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor, bFGF)를 탄닌화하여 MIR(myocardial ischemia reperfusion, 심근 허혈 재관류) 동물모델에 정맥 내 투여한 결과, 탄닌화되지 않은 bFGF와 비교하여 심장 경색 크기를 감소시키고, 건강한 심장(샴(sham) 그룹)과 유사한 정도로 심장 기능이 개선됨을 확인하였다 (도 28 내지 도 29 참고).
따라서, 본 발명은 심장으로 전달하고자 하는 심장질환 치료제를 탄닌화(TANNylation)함으로써 심장 심근에 결합하는 능력을 부여하여 치료제의 심장 표적화 및 축적을 가능하게 하며, 종래의 치료제를 심장으로 표적화시키기 위해 사용된 침습적인 방법들과 달리, 비침습적인 정맥 내 투여만으로도 치료제를 심장으로 고효율로 표적화시킬 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 유효 성분을 생체내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여 모두 가능하며, 비경구 투여는 두개강 내 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등을 포함한다.
본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 병용되는 약물, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 심장질환 치료제의 투여량은 1일 당 0.0001 ng/kg(체중) 내지 200 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 탄닌화된 GFP의 제조
<1-1> GFP의 발현 및 정제
GFP를 암호화하는 유전자를 변형된 pET28a_Tev 벡터에 클로닝하고, 대장균 BL21RILP 균주에 형질전환(transformation) 후, 균주를 37℃에서 OD600 값이 0.4-0.8에 도달할 때까지 12시간 이상 배양하였다. 상기 균주 배양액을 정제하여 N-말단에 히스티딘-tag(his-tag)가 융합된 GFP를 수득하였다. Ni-NTA 수지(resin)로 GFP를 정제하고, TEV 프로테아제로 his-tag를 제거하였다. 버퍼(100 mM NaCl 및 50 mM TrisHCl)로 평형화된 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 수행하여 GFP를 추가 정제하였다.
<1-2> GFP의 탄닌화
탄닌화된 GFP(TANNylated GFP)를 제조하기 위해, 탄닌산(tannic acid, TA) 용액(10 mM)과 GFP 용액(pH = 7.4, PBS(phosphate buffered saline) 238 ㎍/㎖)을 준비하였다. GFP의 탄닌화를 위해 [TA]/[GFP]의 화학양론적(stoichiometric) 비율이 14, 72, 143, 214, 286, 714 및 1428가 되도록 TA 및 GFP 용액(부피비 1:1)을 혼합하였다. 혼합할 때, GFP의 농도를 고정시키고 TA 용액의 농도를 각각 0.1 ([TA]/[GFP]=14), 0.5, 1, 1.5, 2, 5, 및 10([TA]/[GFP]=1428) mM으로 PBS(pH 7.4)에 연속 희석시킨 것을 사용하였다. 모든 샘플을 실온에서 30분 동안 정치하였다.
생체 내(in vivo) 또는 생체 외(ex vivo) 연구를 위해, 탄닌화된 GFP는 Amicon 필터(3 kDa, 0.5 mL 용량, Millipore, Billerica, MA, USA)를 사용하여 5회 이상 원심분리하였고, 유리(free) TA를 완전히 제거했다.
< 실험예 1> 탄닌화된 GFP의 특성 분석
<1-1> 탄닌화된 GFP의 콜로이드 안전성(colloidal stability)
[TA]/[GFP]의 화학양론적 비율에 따른 GFP/TA 용액의 콜로이드 안정성(즉, 안정 또는 응집)을 확인하기 위해, 실시예 1에서 제조한 화학량론적 비율 14, 72, 143, 214, 286, 714 및 1428인 GFP/TA 용액의 탁도 시험을 수행하였다.
GFP/TA 복합체(complex)가 마이크로 스케일의 응집을 형성하면, 용액의 탁도(광산란)로 인해 흡광도(A600)가 증가한다. 각 용액의 흡광도를 측정한 결과, 임계 화학양론적 [TA]/[GFP]의 비율은 143이고 (도 2에서 검은 점선), 그 이하에서는 명확한 응집이 관찰되지 않았으며 A600 값이 거의 0임을 확인하였다. 대조적으로, GFP/TA 용액의 탁도는 143을 초과한 비율에서 점진적으로 증가하였고, 1430 비율에서는 1.4 ± 0.1로 증가하였다.
[TA]/[GFP]의 비율이 72, 143 및 357인 경우의 용액의 사진을 살펴보면, [TA]/[GFP]의 비율이 72 또는 143인 경우의 GFP/TA 용액에서는 응집이 관찰되지 않았으며 이는 나노스케일의 복합체를 형성함을 나타낸다 (도 3의 (A) 및 (B)). 그러나 임계 화학량론적 비율 143보다 높은 비율로 결합된 [TA]/[GFP]의 비율 357에서는 GFP/TA 복합체의 응집이 나타남을 확인하였다 (도 3의 (C)).
<1-2> 탄닌화된 GFP의 크기와 형태
[TA]/[GFP]의 화학량론적 비율이 72 또는 143인 용액으로부터 얻은 탄닌화된 나노복합체(TANNylated nanocomplexes)의 크기와 형태를 분석하기 위해, 원자 현미경(AFM, atomic force microscopy) (Nanoman, Veeco, USA)과 동적 광산란법(DLS, dynamic light scattering)을 이용하였다.
[TA]/[GFP]의 화학량론적 비율이 143 이하인 용액 (50 ㎕)을 운모(mica) 표면 상에 로딩하고, 탈이온수로 3회 세척하였다. 2시간 동안 공기 건조시킨 후, 탄닌화된 나노복합체의 크기를 측정하였다. 입자 크기 분석기(particle size analyzer) (Zetasizer nano-ZS, Malvern instrument, UK)도 사용하였으며 샘플 용액(1 mL, [TA]/[GFP]=72 또는 143)을 일회용 큐벳에 넣고, 120초의 평형 시간 후에 탄닌화된 나노 복합체의 크기 분포를 측정했다.
분석 결과, [TA]/[GFP]의 화학량론적 비율 72로 제조된 탄닌화된 GFP의 DLS 유체역학 지름(hydrodynamic diameter)은 14.8 ± 2.9 nm (도 4의 (A))이었고, AFM으로 측정한 건조된 복합체의 평균 높이(dry height)는 약 10 nm (도 4의 (B))이었다. [TA]/[GFP]의 화학량론적 비율이 143인 경우에는 유체역학 지름이 52.7 ± 21.7 nm로 증가하고 (도 4의 (C)), 건조된 복합체의 평균 높이 값은 ~ 35 nm (도 4의 (D))이었다.
또한, 형광 현미경(Eclipse 80i, Nikon, Japan)을 사용하여 마이크로 스케일에서 탄닌화된 GFP의 형성을 확인하였다. 탄닌화된 GFP의 마이크로 응집체는 214보다 큰 화학량론적 비율에서 관찰되었다 (도 5). 비율이 714에 가까워짐에 따라 복합체 크기는 ~ 100 ㎛까지 점차적으로 증가하여 형광 현미경으로 분명하게 감지할 수 있었으며 (도 5의 (C)), 286 비율에서는 평균 크기가 ~ 5 ㎛인 마이크로-복합체가 관찰되었다 (도 5의 (B)).
본 발명자들은 생체내(in vivo) 실험을 위해 [TA]/[GFP]의 화학량론적 비율 143인 탄닌화된 GFP를 선택하였다. 이는 비율 143의 탄닌화된 GFP의 크기 분포가 생체 내 순환을 위한 통상적인 미셀 나노 캐리어(micellar nanocarriers)의 합리적인 범위 내에 있기 때문이다.
< 실험예 2> 탄닌화된 GFP의 생체 내 혈액 순환 및 분포
<2-1> 탄닌화된 GFP의 장기별 표적화 평가
탄닌화된 단백질의 생체 내 순환을 조사하기 위해, 동물 실험을 수행하였다. 동물 실험 절차는 카이스트의 동물관리위원회 (KA2016-34)의 승인을 받아 수행되었고, 연구자들은 보건 복지부가 권장하는 윤리 규범을 따라 실험을 수행하였다.
먼저 탄닌화된 GFP의 생체 내 독성을 확인하기 위해, 마우스의 체중 변화를 측정하였다. 국립 암 연구소(National Cancer Institute)의 마우스의 독성 표준 측정에 따르면, 마우스에 20% 이상의 체중 감량이 있을 시 독성이 있는 것으로 간주한다. 탄닌화된 GFP의 생체 내 독성을 확인한 결과, 탄닌화된 GFP가 주입된 마우스는 2일에 걸쳐 6% 정도의 체중 감소가 있었으나, 이는 무시할 수 있는 수준으로 판단하였으며 하기의 실험을 수행하였다.
[TA]/[GFP]의 화학양론적 비율 143인 탄닌화된 GFP(TANNylated GFP) 또는 탄닌화되지 않은 GFP(Un-TANNylated GFP)를 마우스(BALBc, 8 주령, 수컷, 24-26 g)의 꼬리 정맥 정맥 내로 주사(240 ㎍/kg)하였다. 주입한 마우스를 정해진 시간 간격(3시간 및 6시간)으로 희생시킨 후 간, 심장, 비장, 신장 및 폐의 GFP 형광 강도를 IVIS 영상 시스템(IVIS 200, Xenogen, 미국)으로 측정하였다. 면역 조직 화학 (IHC, immunohistochemistry) 분석을 위해, 조직(심장 및 대정맥)을 실온에서 48시간 동안 4% 포름알데히드에 고정, 드라이 아이스 상의 OCT(optimal cutting temperature) 화합물로 조직을 포매하였다. 냉동된 조직 블록은 냉동 마이크로톰 절편기 (cryo-microtome, Leica CM3050s, GMI Inc., USA)를 사용하여 10 ㎛의 두께로 절단하였다. 절단된 절편은 1% BSA(bovine serum albumin)으로 블로킹한 후, 1차 항체로 항-GFP 항체(ab6556; 1:500 희석 배수, Abcam, Cambridge, UK, 12시간, 4℃)와 2차 항체로 염소-항토끼 IgG flamma 488 (RSA1241, 1:200 희석 배수, BioActs, South Korea, 1시간, 25℃)를 처리하였고, 형광 현미경(Eclipse 80i, Nikon, Japan)을 이용하여 관찰하였다.
마우스 각 기관(organ)의 형광 강도 분석에서 탄닌화된 GFP를 주사하고, 3시간 째에는 대부분의 기관에서 형광 방출이 관찰되지 않았으나 (도 6), 6시간 째에는 심장에서 주로 GFP 유래 형광이 관찰되어, 탄닌화된 GFP가 심장에 고효율로 축적됨을 알 수 있었다 : ~ 1.0 × 107 내지 4.9 × 108 광자 s-1 (도 6, 흰색 점선으로 표시된 원). 대조군인 탄닌화되지 않은 GFP(un-TANnylated GFP)를 주사한 경우, GFP 대부분이 간에서 축적되었으며, 주입 후 3시간 또는 6시간 후에도 심장에서 GFP 유래 형광은 관찰되지 않았다 (도 7).
또한, 탄닌화의 심장 표적화 능력에 대해 HTI(heart targeting index) = [심장 형광 방출]/[간 방출]를 이용하여 정량적 분석을 수행한 결과, 탄닌화된 GFP를 주입 후 6시간인 경우를 제외한 모든 시료는 매우 낮은 HTI 값을 보였다. 구체적으로 탄닌화되지 않은 GFP(un-TANNylated GFP) 3시간의 경우 0.007, 탄닌화되지 않은 GFP 6시간의 경우 0.0025이었고, 탄닌화된 GFP(TANNylated GFP) 3시간의 경우 0.0014). 6시간에서 HTI 값은 0.135으로, 이 결과는 탄닌화된 GFP가 심장에 높은 효율로 전달됨을 나타낸다.
<2-2> 시간별 탄닌화된 GFP의 심장 표적화 평가
주입 6시간 이후에도 심장에서 탄닌화된 GFP가 검출되는지 확인하고자, 실험예 2-1과 동일한 방법으로 GFP 또는 탄닌화된 GFP를 마우스에 정맥 주사(240 ㎍/kg)하고 정해진 시간 간격(1.5, 5, 48 및 120시간)으로 희생시킨 후, 심장의 GFP 형광 강도를 IVIS 영상 시스템 (IVIS 200, Xenogen, 미국)으로 측정하고, HTI 값을 산출하였다.
그 결과, 탄닌화된 GFP 주입 후 1.5 시간 째에 약한 형광 방출(1.7 × 108 ± 5.5 × 106 광자 s- 1)이 확인되었고, 주입 후 6시간 째에 1.9 × 108 ± 7.8 × 106 광자 s- 1 로 형광 방출이 증가하였다 (도 8). 이 형광 강도는 120시간 째에서 (2.2 × 108 ± 4.4 × 107 광자 s- 1)에도 유사한 수준으로 유지되었는데 (도 8), 상기의 결과들은 탄닌화된 단백질의 심장 표적화 및 심장 축적을 나타낸다. 또한, 시간에 따른 HTI 값은 6시간 째에서 0.124 ± 0.015이고, 120시간 째에서 0.062 ± 0.020 (도 9, 빨간색 막대)으로, 탄닌화되지 않은 GFP(un-TANNylated GFP) (도 9, 검은색 막대)를 주입한 경우와 유의한 차이가 있었다. 심장의 형광 신호는 144시간 째(7일)에 1.2 × 108 ± 1.7 × 107로 감소했다.
<2-3> 탄닌화된 GFP의 심장 조직 내 분포
탄닌화된 GFP의 심장 조직 내 공간 분포를 분석하기 위해, 실험예 2-1에 기재한 바와 같이 면역 조직 화학 분석을 수행하였다.
흥미롭게도, 탄닌화되지 않은 GFPs를 투여한 경우 심장의 어떤 구역에서도 형광 신호가 관찰되지 않은 반면, 탄닌화된 GFP의 투여 시, 대부분의 형광 신호는 점선과 화살표에 의해 표시된 왼쪽 심근으로부터 방출되었다 (도 10의 (B)의 위 이미지). 혈관 내벽(즉, 대정맥)에서도 형광 방출이 관찰되지 않았다 (도 10의 (A)와 (B)의 아래 이미지). 특히, 횡단면 전체 심장 이미지에서 볼 수 있듯이, GFP 신호는 좌심실에 가까운 심근에서 관찰되었다 (도 10의 (C), 흰색 별표). 이러한 결과는 탄닌화된 단백질이 심근에 활발하게 축적됨을 나타낸다.
<2-4> 탄닌화된 GFP의 혈액 순환 시간
탄닌화된 GFP의 혈액 순환 시간을 확인하고자, [TA]/[GFP]의 화학양론적 비율 143인 탄닌화된 GFP를 마우스의 꼬리 정맥 내로 주사(240 ㎍/kg)한 후 시간 간격(1.5, 5, 48 및 120시간)에 따라 혈액(30-50 ㎕)을 각 마우스의 꼬리에서 채취하였다. 채취한 혈액은 응고를 방지하기 위해 0.2 중량% 헤파린 용액(10 ㎕)과 혼합한 후, 13,500 rpm에서 5분간 원심 분리하여 혈장을 분리하고 -20℃에서 보관하였다. GFP ELISA 키트(Cell Biolabs, USA)를 사용하여 혈장 내 GFP 양을 47.5에서 380 pg/mL까지의 GFP 표준 곡선을 이용하여 측정하였다.
탄닌화된 GFP(TANNylated GFP)의 혈액 순환 시간(도 11, 빨간색)은 탄닌화되지 않은 GFP(un-TANNylated GFP)의 혈액 순환 시간(도 11, 검은색)보다 긴 것으로 나타났다. 주입 후 8시간 째(파란색 화살표)에, 혈류의 GFP 농도는 탄닌화된 GFP의 경우 8.3 ± 0.8 ng/mL이었지만 탄닌화되지 않은 GFP의 경우 0.8 ± 4.1 ng/mL이었다. 탄닌화되지 않은 GFP는 대부분 배출되거나 주사 30분 후에 간에 의해 여과되었다. 대조적으로, 탄닌화된 GFP는 주사 후 120시간 동안 혈액 내에 남아있었으며, 이것은 도 8에 도시된 심장에서의 탄닌화된 GFP의 시간 경과에 따른 축적 결과와 일치한다. 탄닌화된 GFP 주사 420시간 후, 혈액 내 GFP 수준은 약 0.3 ng/mL의 검출 가능한 수준으로 유지되었으나, 탄닌화되지 않은 GFP는 검출할 수 없었다.
< 실험예 3> 탄닌산 ( TA ) 및 세포외기질 (ECM) 구성 인자 간의 상호작용 분석
TA와 세포외기질 구성 인자 간의 상호작용을 확인하기 위해, 탁도 측정법, SPR(surface plasmon resonance, 표면 플라즈몬 공명) 및 ITC(isothermal titration calorimetry, 등온적정형열량계)를 사용하여, 당질층(glycocalyx)의 주요 구성 인자인 헤파린 설페이트(heparin sulfate, HS) 및 히알루론산(hyaluronan, HA)에 결합하는 TA의 능력과 세포외기질의 주요 구성 인자인 엘라스틴 및 타입 I 콜라겐에 결합하는 TA의 능력을 분석하였다. 상기 실험 방법들은 생체 분자와 생체 물질 간의 상호작용을 증명하기 위해 널리 이용되어 온 방법들이다.
<3-1> 탁도 측정법을 이용한 TA 및 세포외기질 (ECM), TA 및 당질층(Glycocalyx)의 결합
탁도 분석을 위해 엘라스틴, 타입 I 콜라겐, HS 및 HA 용액을 0.24 mg/mL의 농도로 PBS에 희석하여 제조하였다. 각각의 용액에 1:1의 부피비로 TA(17 mg/mL)를 첨가하고 샘플을 강하게 혼합시켰다. 탁도는 UV/vis 분광기(HP8453, Hewlett-Packard, USA)로 600 nm에서 측정하였다.
일반적으로 두 개의 거대 분자가 분자간 강한 친화성을 나타낼 때, 마이크로 복합체가 신속하게 생성되며, 이는 일반적으로 가시광선을 산란시켜 탁한 용액을 형성하게 된다. 예상대로, 콜라겐/엘라스틴 용액의 탁도(A600)는 TA를 첨가함에 따라 극적으로 증가했으며, 엘라스틴의 경우 1.219 ± 0.022이고 (도 12, 첫 번째 흰색 바), 콜라겐의 경우 0.173 ± 0.022였다 (도 12, 첫 번째 회색 바). 그러나 HS 또는 HA 용액에서도 탁도 변화가 관찰되지 않았다.
<3-2> SPR 분석을 이용한 TA 및 엘라스틴/타입 I 콜라겐의 결합
SPR 분석을 위해, 엘라스틴 및 타입 I 콜라겐 (10 ㎍/mL), TA 용액(2 mg/mL)을 PBS(pH 7.3)에 희석하여 제조하였다. 모든 용액은 0.2-㎛ 마이크로필터(Millipore, USA)로 여과하여 사용하였다. 비아코어(Biacore) 금 (Au) 센서 칩 위에 각 단백질(엘라스틴 또는 타입 I 콜라겐)을 600초 동안 흡착시키고, 칩을 10분 동안 세척하여 약하게 흡착된 샘플을 제거하였다. 유동 버퍼로 PBS를 사용하여 10 ㎕/min의 유속으로 SPR 분석을 수행하였다.
SPR의 변화된 반응값(RU)은 엘라스틴 및 타입 I 콜라겐 단백질 둘 모두에 대해 TA가 친화력을 가짐을 나타낸다 (도 13). TA가 콜라겐이 흡착된 표면에 노출되었을 때 ΔRU 값은 793이었고, 엘라스틴 층에 대한 ΔRU 값은 1319 (도 13, 빨간색)으로, 이는 특히 TA가 엘라스틴과 강력하게 상호작용한다는 것을 나타낸다.
<3-3> ITC 분석을 이용한 TA 및 엘라스틴의 결합
ITC 측정에는 엘라스틴(210 ㎍/mL)과 TA 용액(2.5 mg/mL)을 사용했다. 엘라스틴을 샘플 셀에 위치시키고 TA 용액을 주사기에 넣은 후, TA 용액(250 ㎕)을 샘플 셀에 있는 엘라스틴으로 5 ㎕ 분량을 50번의 순차적인 주사로 적정하였다(350 rpm 교반과 함께). 시간 간격은 후속 주입을 위해 180초로 설정하였고, 미가공 데이터(raw data)는 Microcal Origin (Microcal Software, Northampton, USA)을 사용하여 처리되었다.
ITC 실험 결과, 엘라스틴에 대한 TA 결합은 열역학적 변화를 가져왔다 (도 14). 미가공 데이터에 나타난 전반적인 음의 값은 TA와 엘라스틴 사이의 결합에 대한 발열 상호 작용을 나타낸다(도 14의 (A)). TA-엘라스틴 결합은 다른 일반적인 항원-항체 상호 작용의 열역학 플롯과 차이를 나타내며, 여기서 적정(titration)은 전반적으로 S 자형 곡선을 나타낸다. TA와 엘라스틴 사이의 결합은 특이적이지 않으나 두 단계(two-phase) 결합을 나타낸다. [TA]/[엘라스틴] 비율이 ~20 까지인(도 14의 (B), 검은색 화살표로 표시) 첫 번째 단계에서는 TA가 엘라스틴과 분자 간(inter-molecularly)으로 결합한다. [TA]/[엘라스틴] 비율 ~30부터인 두 번째 결합 단계에서는 inter-TA/엘라스틴 복합체가 서로 결합한다. 즉, TA가 결합된 엘라스틴은 다른 TA가 결합된 엘라스틴과의 상호 작용을 촉진시키는 핵 형성 씨드(nucleating seeds)의 역할을 할 수 있으며, 이는 검정색 화살표부터 시작하는 열역학 전이점으로 확인된다. 이 단계에서, 결합 친화력은 TA와 엘라스틴의 결합 친화력보다 낮으므로, 기울기는 첫 번째 단계에 비해 가파르지 않다 (도 14의 (B)).
<3-4> 탁도 측정법을 이용한 탄닌화된 GFP 및 ECM의 결합
탄닌화된 GFP를 ECM 유사 용액인 엘라스틴/콜라겐 또는 당질층(glycocalyx) 유사 용액인 HS/HA 혼합물에 직접 첨가하여 탁도 변화를 시험하였다. 실험예 3-1에서 수행한 방법과 같은 방식으로, TA 대신 탄닌화된 GFP(화학량론적 비율 = 143, 100 ㎕)를 첨가한 후, 600 nm의 파장에서 ECM 또는 당질층 구성 인자(모든 구성 인자의 최종 농도 = 0.5 mg/mL, 100 ㎕)의 탁도를 측정하였다 (도 15).
탄닌화된 GFP의 첨가 시, ECM 용액에서는 A600 값 0 내지 0.2 (도 15, 빨간색 화살표)까지 관찰 가능한 탁도 변화를 나타내었다. 도 12에 나타낸 혼탁도 결과와 유사하게, 당질층(glycocalyx) 유사 용액에서는 탁도 변화가 관찰되지 않았다. 도 16은 엘라스틴/콜라겐에 대한 TA의 높은 친화성으로 인해 탄닌화된 단백질이 당질층이 아닌 심장의 세포외기질에 축적되는 것을 나타낸 도이다.
< 실시예 2> 탄닌화된 SP (substance P) 및 탄닌화된 mCherry - SP의 제조
관상 동맥 혈관을 확장시킬 수 있다고 보고되어 있는 펩티드 약물인 SP(substance P, 서열번호 2)를 전신투여하는 경우 손상된 조직으로 내인성 줄기세포(endogenous stem cells)의 이동을 촉진함으로써, 상처 치유 과정을 개선할 수 있다고 보고된 바 있다. 따라서 SP 투여는 내인성 줄기세포의 손상된 심근으로의 이동을 유도, 조직 재생 및 혈관 신생을 촉진하여 심근 경색(myocardial infarction)에 치료 및 재생 효과를 나타낼 것으로 생각된다. 이에 탄닌화된 GFP와 마찬가지로 탄닌화된 SP가 심장으로 표적화되는지를 확인하고자 하였다.
실시예 1의 탄닌화된 GFP의 제조 방법과 동일한 방법으로 탄닌화된 SP를 제조하였다. 구체적으로 탄닌산(TA) 용액(10 mM)과 SP 용액(pH = 7.4, PBS(phosphate buffered saline)에서 0.6 mM)을 준비하고, TA 용액의 농도를 0.05, 0.1, 0.5 및 1 mM로 희석하였다. 희석된 TA 용액과 SP 용액을 [SP]/[TA]의 화학양론적(stoichiometric) 비율이 10(TA 용액의 농도 = 0.05 mM), 5, 1 및 0.5(TA 용액의 농도 = 1 mM)가 되도록 부피비 1:1로 강하게 혼합하여 탄닌화된 SP를 제조하였다.
또한, 탄닌화된 SP의 생체내 심장 표적화 특성을 분석하기 위해, mCherry가 태그된 융합 단백질(mCherry-SP)을 만든 후 mCherry-SP 용액(mCherry-SP, 0.5 mM, λexc = 587 nm, λemi = 610 nm)을 제조, [TA]/[mCherry-SP]의 화학양론적 비율이 2가 되도록 TA 용액과 혼합하여 탄닌화된 mCherry-SP를 제조하였다.
< 실험예 4> 탄닌화된 SP 및 탄닌화된 mCherry - SP의 특성 분석
<4-1> 탄닌화된 SP의 크기와 형태
실시예 2에서 탄닌화된 SP를 제조하기 위해 혼합한 [SP]/[TA]의 비율이 20, 10, 5, 1 및 0.5 인 경우의 용액을 육안으로 관찰한 후, 입자 크기 분석기(Zetasizer nano-ZS, Malvern instrument, UK)를 사용하여 탄닌화된 SP([SP]/[TA]의 비율 = 20 및 10, 용액 용량 = 1 mL)의 크기를 분석했다.
탄닌화된 SP는 [SP]/[TA]의 비율 20 또는 10에서 ~ 1 ㎛ 크기의 복합체를 형성함을 확인하였다 (도 18).
<4-2> 탄닌화된 mCherry - SP의 심장 축적 효과
탄닌화된 SP의 생체내 심장 표적화 특성을 평가하기 위해, 마우스 꼬리 정맥 (BALBc, 8 주령, 24-26 g)에 탄닌화되지 않은 mCherry-SP (10 ㎍, 0.0031 mM, 200 ㎕) 또는 실시예 2에서 제조한 탄닌화된 mCherry-SP (200 ㎕)을 주사하고, 주사 후 6시간 째에 마우스를 희생시켰다. 간 및 심장의 mCherry 형광 강도는 IVIS 영상 시스템 (IVIS 200, Xenogen, USA)을 이용하여 측정하였다.
GFP의 실험 결과와 유사하게, 탄닌화된 mCherry-SP 도 주사 후 6시간 째에 심장에 축적되었다 (도 19의 (A)). HTI 값은 0.062 ± 0.008에서 0.111 ± 0.008 (도 19의 (B))로 극적으로 증가하였다.
< 실시예 3> 탄닌화된 AAV9 ( Adeno -associated virus serotype 9)의 제조
<3-1> GFP를 암호화하는 AAV9의 제조 및 정제
유전자 치료제 전달에 사용될 수 있는 AAV9를 탄닌화하여, 탄닌화된 AAV9가 심장으로 표적화되는지 확인하고자 하였다. AAV9는 임상 시험에 현재 사용되고 있는 FDA 승인 바이러스 벡터이고, AAV9 외피 단백질(coat protein)의 탄닌화가 심장에 대한 축적을 향상시킬 수 있다고 판단하여 선택하였다.
CMV(cytomegalovirus) 프로모터에 의해 발현되는 GFP를 암호화하는 AAV(혈청형 9; AAV9)를 Jang, J.-H. et al., Mol.Ther. 19, 667-675(2011)에 기재된 방법대로 생산하였다. 간략하게, 세 종류의 동량 (17 ㎍) 플라스미드 즉, 아데노 헬퍼 플라스미드(pHelper; Stratagene, La Jolla, CA, 미국), 캡시드 9 조립체를 암호화하는 플라스미드(pAAV9), 및 ITRs(inverted terminal repears)에 의해 둘러싸인 CMV GFP의 폴리뉴클레오타디르르 포함하는 플라스미드를 인산칼슘과 복합체화시키고, AAV293 세포(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, 미국)로 형질감염(transfection)시켰다. 형질감염 2일 후, GFP 발현 서열이 도입된 AAV9 벡터를 수확하고 18℃에서 2시간 동안 이오딕사놀(iodixanol, OptiPrep, Alere Technologies AS, Oslo, 노르웨이) 밀도 구배 초원심분리 (360,000 g; Optima L-90K, Beckman Coulter, Brea, CA, 미국) 를 수행하여 정제하였다. AAV9-GFP 벡터의 게놈 역가(genomic titer, 3.6 ×109 vg/㎕)는 SYBR Green master mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)을 이용하여 정량적 PCR (QPCR; Mini Opticon, Bio-rad. Hercules, CA, 미국)로 결정하였다.
<3-2> AAV9의 탄닌화
탄닌화된 AAV9를 제조하기 위해, 실시예 1의 탄닌화된 GFP의 제조 방법과 동일한 방법으로 탄닌화된 AAV를 제조하였다. 탄닌산(TA) 용액(10 mM)과 실시예 3-1에서 제조한 AAV9 용액을 준비하고, TA 용액의 농도를 0.1, 0.25, 0.5, 0.75 및 1 mM로 희석하였다. 희석된 TA 용액과 AAV9 용액을 부피비 1:1로 강하게 혼합하여 탄닌화된 AAV9를 제조하였다.
< 실험예 5> 탄닌화된 AAV9의 콜로이드 안전성(colloidal stability) 평가
실시예 <3-2>에서 제조한 탄닌화된 AAV9 용액의 흡광도(A600)를 UV/vis spectrometry (HP8453, Hewlett Packard)를 사용하여 측정하였다.
0.75 mM 농도의 TA (도 20, 녹색) 용액과 혼합되었을 때, AAV9 응집체 형성이 관찰되었으므로, 0.5 mM의 TA 농도를 AAV9 (1.1 x 1010 vg) (도 20, 분홍색)에 대한 최대 임계 농도로 결정하였다.
< 실험예 6> 탄닌화된 AAV9의 심장 표적화 평가
<6-1> 비질환 모델에서의 탄닌화된 AAV9의 심장 표적화 평가
탄닌화된 AAV9의 생체내(in vivo)에서의 심장 표적화 정도를 확인하기 위해, 탄닌화되지 않은 AAV9 (1 x 1011 vg, 60 ㎕) 또는 탄닌화된 AAV9 (1 x 1011 vg, 60 ㎕)를 마우스 꼬리 정맥으로 주사(BALBc, 8주령, 수컷, 24-26g)한 후, 21일째에 마우스를 희생시켜 심장, 비장, 폐, 신장 및 간의 GFP 발현 강도를 IVIS 영상 시스템 (IVIS 200, Xenogen, USA)으로 측정하였다.
면역 조직 화학 (IHC, immunohistochemistry) 분석을 위해, 심장을 실온에서 48시간 동안 4% 포름알데히드에 고정시킨 후, 드라이 아이스 상의 OCT(optimal cutting temperature) 화합물로 조직을 포매하였다. 냉동된 조직 블록은 cryo-microtome (Leica CM3050s, GMI Inc., USA)을 사용하여 10 ㎛의 두께로 절단하여 절편으로 만든 후, 항체의 투과 효율을 높이기 위해 Triton 0.2%로 처리하였다. 1% BSA(bovine serum albumin)으로 블로킹한 후, 1차 항체로 항-GFP 항체(ab6556; 1 : 500 희석 배수, Abcam, Cambridge, UK, 12시간, 4℃)와 2차 항체로 염소-항토끼 IgG flamma 488 (RSA1241, 1 : 200 희석 배수, BioActs, South Korea, 1시간, 25℃)를 처리한 후, 형광 현미경(Eclipse 80i, Nikon, Japan)을 이용하여 관찰하였다.
심장에 전달된 AAV9는 GFP 발현을 유도한 바, 이는 AAV9 벡터에 클로닝된 유전자가 심장 세포에서 성공적으로 세포 전사 및 번역을 통해 발현되었음을 나타낸다 (도 21). 또한 탄닌화된 AAV9 복합체에 대한 HTI 값(~ 0.15)은 탄닌화되지 않은 AAV9의 HTI 값(~ 0.06)보다 2.5 배 높았다. 이러한 결과는 탄닌화는 AAV9 벡터의 내재적 유전자 전달 능력에 영향을 미치지 않음을 제시한다.
<6-2> MIR 동물 모델에서의 탄닌화된 AAV의 심장 표적화 평가
MIR(myocardial ischemia reperfusion, 심근 허혈 재관류) 동물모델에서 탄닌화된 AAV의 심장 표적화를 조사하였다.
구체적으로 유도 챔버 내에서 이소플루레인(isoflurane, 3 cc min-1) + 럼푼(Rompun, 자알라진(xylazine), 1 mg kg-1) 및 산소 혼합물로 랫트(SD 랫트, 8주령, 수컷, 230-270 g)의 마취를 수행하였다. 이어서, 랫트에게 삽관을 하고, 이소플루레인 및 산소의 혼합물을 1cc min-1의 속도로 통기시켰다. 랫트 심장을 왼쪽 개흉술(thoracotomy)을 통해 노출시킨 다음, 10분간의 폐색(occlusion) 후, 좌전하행지(LAD)를 통한 혈류 재개를 위해 봉합선을 빠르게 풀었다. 봉합선를 제거한 직후 실시예 3에서 얻은 탄닌화된 AAV9 또는 탄닌화되지 않은 AAV9 (2 × 1011 vg, 400 ㎕)를 주입했다. 실험예 6-1의 정상 심장에서의 발현 테스트와 유사하게, 주사 후 21일째에 모든 랫트를 희생시키고, IVIS 시스템을 이용하여 GFP 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 22의 (A)에서 볼 수 있듯이, 탄닌화된 AAV9는 AAV9 단독 또는 처리하지 않은 것에 비해 경색된 심장 조직(흰색 점선)에서 유전자 발현이 향상되었다. 탄닌화된 AAV9 (도 22의 (B), 녹색 막대) 주입 후 GFP 발현 효율은 AAV9 단독 (빨간색 막대) 또는 비처리 대조군 (검정 막대)의 것보다 거의 2배 더 높았다.
< 실험예 7> 탄닌화된 GFP의 심장 독성( cardiocytotoxicity ) 평가
탄닌화된 GFP의 심장 독성(cardiocytotoxicity)을 확인하기 위해, 생체외(ex vivo) 단산성 활동 전위(MAP, monophasic action potentials) (도 23 내지 도 25)를 측정하고 생체내(in vivo) 심장 기능 실험 (도 26 내지 도 27)을 수행하였다.
<7-1> 랫트 심장의 MAP 기록
랫트의 심장을 절개(excise)하기 위해, 1000 IU/kg 헤파린을 복강내 주사(ip)한 다음 50mg/kg 펜토바르비탈(pentobarbital)을 복강내 주사하여 마취시켰다. 랫트가 진정되고 페달 반사(pedal reflex) 활동을 상실한 후에, 심장을 빠르게 절개하고 Langendorff 장치에 있는 대동맥을 통해 카보젠(95 % O2 및 5 % CO2)으로 포화된 변형된 Krebs-Henseleit(K-H) 버퍼(112 mM NaCl, 5 mM KCl, 11.5 mM 글루코스, 25 mM NaHCO3, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM KH2PO4, 2 mM 피루브산(pyruvic acid), 및 1.25 mM CaCl2)를 일정한 압력(75-85 cmH2O) 및 온도(37.5℃) 하에서 관류시켰다.
테프론(Teflon)이 코팅된 은 선(0.25 mm 직경)으로부터 제작된 변형된 Franz MAP 전극을 이용하여 좌심실 심내막(endocardium)의 MAPs를 기록하였다. 초기 평형 기간(15-30분) 후, 뇌전도(electroencephalogram, EEG) 증폭기 (Module 73-1770, EEGA, Germany)를 이용하여 MAPs를 연속적으로 기록하였다. 차등 AC 증폭기 1700 (A-M System, WA) 및 분리된 펄스 자극기 2100 (A-M System, WA)을 이용하여 심장을 전기 자극하였고, Ponemah 소프트웨어를 사용하여 심박수, 최대 속도(Vmax), 진폭 및 최대 재분극의 30%, 60% 또는 100% 에서의 MAP 지속 시간(APD30, APD60 또는 APD100)을 측정하고 지속적으로 모니터링하였다. 이러한 파라미터들이 안정화된 이후, 비히클(vehicle) 대조군 (K-H 용액만) 또는 탄닌화된 GFP (여과되지 않은 또는 원심분리로 여과된 100μM TA + GFP)를 함유하는 K-H 용액을 15-20 분간 관류시켰다.
탄닌화된 GFP 용액은 진폭과 Vmax 파라미터에 영향을 미치지 않은 것으로 나타났다 (도 24의 (A), (B))). 심박수(heart rate)의 경우, 100 μM의 여과되지 않은 탄닌화된 GFP는 분당 180 박동의 정상 심박수에서 161 ± 16까지 심박수를 감소시켰지만, 여과 후에는 심박수에 미치는 효과에 유의한 차이가 없었다(도 24의 (C)). 이는 독성이 있다고 알려진 유리(free) 탄닌산이 여과에 의해 제거되었기 때문인 것으로 판단된다.
또한 랫트의 심장 APDs의 불안정성(instability)과 활동전위 형태의 삼각형화(triangulation)에 탄닌화된 GFP가 미치는 영향을 분석했다. 불안정성(instability)은 단기 변동성(STV, Short-term variability)으로 정량화되었고, 단기 변동성(STV)은 푸엥카레 플롯 상의 식별선(identity line)까지의 평균 직교거리로 결정되며, 구체적으로 STV = Σ|Dn +1-Dn|/[30√2] 공식에 따라 계산되었다 (여기서 D는 APD100). 활동전위 형태의 삼각형화(triangulation)은 APD30에서 APD100까지의 재분극 시간으로 정의된다(즉, 활동전위 형태의 삼각형화 = APD100 - APD30). APD100에서 관찰된 활동전위 기간의 연장(prolongation)이 APD30에서 관찰된 활동전위 기간의 연장보다 크거나 APD30에서 관찰된 시간 감소가 APD100에서 관찰된 시간 감소보다 더 클 때, 활동 전위의 전체 모양은 삼각형이 된다. 도 25의 (A)에서, 여과되지 않은 탄닌화된 GFP로 처리한 것은 활동전위 형태의 삼각형화(triangulation)의 한계를 나타내지만, 여과된 탄닌화된 GFP를 사용함으로써 활동전위 형태의 삼각형화(triangulation) 현상은 정상 수준으로 되돌아갔다(도 25 (A), 빨간색 박스). STV의 경우, 100 μM 탄닌화된 GFP는 STV에 유의한 영향을 미치지 않았으며, 이는 비처리 대조군과 유사하다 (도 25의 (B)).
<7-2> 압력-부피 전도도 카테터 기법을 이용한 랫트의 심장 기능 측정
여과된 탄닌화된 GFP의 심장 안전성(cardiosafety)를 확인하기 위해, 생체내 심장 혈류역학 분석(도 26)을 수행하였다.
연속 체온 모니터링과 함께 가열 패드에서 3% 이소플루레인(isoflurane) (기화기, Vet equip. USA, 2-3 cc/min)로 랫트를 마취시켰다. 압력-부피 변환기 (2.0Fr, Millar instruments, TX)를 우측 경동맥을 통해 좌심실로 도입하고, 신호를 공지된 방법에 따라 기록하였다(Hondeghem, L. M. et al., Circulation 103, 2004-2013 (2001)). 압력 및 부피 신호는 LabScribe 데이터 수집 소프트웨어(iWorx / CB Sciences, USA)로 출력하는 Scisense ADV500 (Transonic, USA)을 사용하여 기록하였다.
기록될 파라미터 값들이 안정화된 후에, 랫트를 3그룹으로 무작위로 분리하여 GFP (대조군) 또는 탄닌화된 GFP(12시간 및 24시간 군)를 꼬리 정맥으로 주사하였다. 탄닌화된 GFP를 주사한 후 12시간 및 24시간 째에 데이터를 수집하여 분석하였다.
심박수(HR, heart rate), 심박출량(CO, cardiac output), 박출량(SV, stroke volume) 및 구출분획(EF, ejection fraction), 좌심실(LV, left ventricle) 압력, 최대 압력 상승률에 대한 최대 dP/dt (dP/dtmax), 최대 압력 감소율에 대한 최소 dP/dt (dP/dtmin), 수축말기용량(ESV, end systolic volume), 확장말기용량(EDV, end diastolic volume), 박출작업량(SW, stroke work), 동맥 탄성(Ea, arterial elastance) 및 이완 시간 상수에 대한 타우값(tau values)을 분석용 소프트웨어를 이용하여 하기의 알고리즘으로 분석하였다:
HR: 60/평균주기(average cycle period)
ESP: 수축 말기에서 심실 압력(Ventricular pressure at end-systole)
EDP: 확장 말기에서 심실 압력(Ventricular pressure at end-diastole)
LV(좌심실) 압력: 선택된 주기에 걸친 압력 채널의 평균 최대값(Average maximum value of pressure channel over selected cycles)
dP/dtmax: 선택된 주기에 걸친 평활화된 미분의 평균 최대값(Average maximum value of smoothed derivative over selected cycles)
dP/dtmin: 선택된 주기에 걸친 평활화된 미분의 평균 최소값(Average minimum value of smoothed derivative over selected cycles)
SV = EDV(선택된 주기에 걸친 확장 말기 용량의 평균값, average value at end-diastole volume over selected cycles) - ESV(선택된 주기에 걸친 수축 말기 용량의 평균값, average value at end-systole volume over selected cycles)
CO = SV * HR
EF = 100 * (SV/EDV)
SW: 선택된 심장 주기에 걸친 평균화된 PV 루프 내의 면적(Area within the PV Loop averaged over selected cardiac cycles)
Ea: ESP/SV
Weiss의 방법을 이용한 타우(Tau): logP의 회귀 (regression of logP).
TA는 다른 분자(즉, 금속-배위된 TA 복합체)와 함께 제제화될 때 비독성이 되기 때문에, 분자 수준에서 고정되어 있는 단백질 탄닌화에 사용된 TA는 해로운 영향을 미치지 않을 것이라고 가정했다. 실제로, 탄닌화되지 않은 GFP(un-TANNylated GFP)를 주사한 경우와 비교했을 때, 탄닌화된 GFP(TANNylated GFP)는 주사 후 12시간 또는 24시간째에 상기 파라미터에 영향을 미치지 않았다 (도 27). 따라서 이러한 생체외 및 생체내 분석을 통해 탄닌화된 GFP는 심독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다.
< 실시예 4> 탄닌화된 bFGF의 제조
먼저 bFGF(basic fibroblast growth factor, 서열번호 1)를 1mg/mL의 농도로 PBS(phosphate buffered saline)에 용해시키고, 탄닌산(tannic acid, 이하 TA로 표기)은 0.14 mM 또는 0.7 mM의 농도로 제조하였다. TA 용액 (100 ㎕)을 각 bFGF 용액에 첨가하여(5㎍ 용량의 경우 0.14 mM, 그리고 25㎍ 의 경우 0.7 mM), 화학량론적 몰비([TA]/[bFGF]) 143인 탄닌화된 bFGF(TANNylated bFGF)를 제조하였다.
< 실험예 8> 탄닌화된 bFGF 치료능 확인
bFGF는 심장 기능 회복을 위한 신생 혈관(neovasculature) 형성에 결정적인 역할을 하지만 정맥 내 주사로는 치료 효과가 없어 다른 제형(즉, 하이드로 겔)을 이용한 심근 주사가 필요하다. 따라서, 심장질환 모델인 MIR(myocardial ischemia reperfusion) 모델에서 정맥 주사를 통한 탄닌화된 bFGF의 치료 효과를 확인하고자 하였다.
구체적으로 유도 챔버 내에서 이소플루레인(isoflurane, 3 cc min-1) + 럼푼(Rompun, 자알라진(xylazine), 1 mg kg-1) 및 산소 혼합물로 랫트(SD 랫트, 8주령, 수컷 230~270 g)의 마취를 수행하였다. 이어서, 랫트에게 삽관을 하고, 이소플루레인 및 산소의 혼합물을 1cc min-1의 속도로 통기시켰다. 랫트 심장을 왼쪽 개흉술(thoracotomy)을 통해 노출시킨 다음, 10분간의 폐색(occlusion) 후, 좌전하행지(LAD)를 통한 혈류 재개를 위해 봉합선을 빠르게 풀었다. 봉합선를 제거한 직후 실시예 4에서 얻은 탄닌화된 bFGF(TANNylated bFGF) 또는 비탄닌화된 bFGF (non-TANNylated bFGF) (5 ㎍ 또는 25 ㎍, 주사 용량 200 ㎕)를 주입하였다 (n = 7, 각 그룹).
주사 후 28일째에 LabScribe 데이터 수집 소프트웨어(iWorx / CB Sciences, 미국)로 데이터를 출력하는 ScScense ADV500 (Transonic, 미국)을 사용하여 좌심실 기능에 대한 생체 내(in vivo) 혈류역학(hemodynamic) 평가를 수행하였다.
혈류역학 평가가 끝나면 심장을 분리하고 혈액 잔류물을 제거하기 위해 따뜻한(~ 37℃) PBS에 침지하였다. 그런 다음 심장을 즉시 -20℃에서 동결시키고, 동결된 심장을 심첩(apex)으로부터 약 2mm의 횡단 슬라이스로 절단하였다. 슬라이스를 세포 배양 접시에 넣은 다음 37℃에서 15분간 PBS에 녹인 1% TTC(triphenyltetrazolium chloride)를 처리하였다. 염색 후, 심장 슬라이스를 스캐너로 촬영하여 적색으로 염색된 살아있는 조직과 백색의 염색되지 않은 괴사 조직을 구별하였다. 경색 크기의 영역은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 디지털 방식으로 측정하였으며 백분율로 표시하였다.
그 결과, 도 28의 (A)에 나타낸 바와 같이, 5 ㎍의 탄닌화된 bFGF(TANNylated bFGF) 주사 후 28일째에 경색 크기는 전체 심장의 약 16%였으나(검정색 바), 대조적으로 무처리군의 경색 크기는 51% (흰색 바), bFGF 단독 주사의 경우 경색 크기는 31%였다 (회색 바). 25 ㎍의 bFGF의 투여 시, 5 ㎍의 bFGF를 투여했을 때와 경색 크기 결과에 큰 차이가 없었다.
조직학적 이미지도 탄닌화된 bFGF(TANNylated bFGF)의 주사 후 경색 크기의 감소를 보여주었다 (도 28의 (B)). 특히, 탄닌화된 bFGF(TANNylated bFGF)의 주입은 건강한 심장(샴(sham) 그룹)과 유사한 정도로 모든 혈류역학 기능적 값(즉, 좌심실 압력(left ventricular pressure), 박출량(stroke volume), 심박출량(cardiac output), 심실 수축력 지수(ventricular contractility index))을 회복시켰다. (도 29, 표 2). 이러한 결과는 심장을 표적으로 하는 약물의 탄닌화(TANNylation)가 심장질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 나타낸다.
Sham MIR MIR + bFGF 5 ㎍ MIR + TANNylated bFGF 5 ㎍
n 6 7 7 7
심박수(HR), bpm 310.0 ± 17.7 329.8 ± 15.2 316.5 ± 12.9 322.7 ± 18.0
수축 말기에서 심실 압력(ESP), mmHg 99.7 ± 1.4 74.3 ± 4.7** 85.3 ± 1.7* 103.8 ± 4.6##
확장 말기에서 심실 압력(EDP), mmHg 8.7 ± 1.5 5.7 ± 1.2 8.5 ± 0.9 9.8 ± 1.6
수축말기용량(ESV), ㎕ 48.6 ± 11.0 280.2 ± 13.5** 254.5 ± 13.8** 133.9 ± 19.5**,##
확장말기용량(EDV), ㎕ 255.2 ± 39.8 396.2 ± 13.4** 365.3 ± 27.5* 295.9 ± 23.3#
박출작업량(SW), mmHg·mL·kg 3.23 ± 0.54 1.39 ± 0.18** 1.51 ± 0.14* 3.00 ± 0.53#
동맥 탄성(Ea), mmHg/μL 0.57 ± 0.18 0.77 ± 0.21 0.86± 0.12 0.77 ± 0.14
타우값(Tau), ms 11.2 ± 1.1 10.2 ± 0.3 11.7 ± 0.5 11.7 ± 1.1
(샴 그룹과 비교하여 *P < 0.05, **P < 0.01; MIR 그룹과 비교하여 #P < 0.05, ##P < 0.01)
본 발명의 탄닌화는 적절한 화학양론적 비로 탄닌화하고자 하는 물질 및 탄닌산(TA)을 혼합함으로써 간단하게 수행될 수 있다. 탄닌화(TANNylation)는 페길화(PEGylation)와 유사하게 생체내 혈액 순환 시간을 증가시켰다. 그러나 탄닌화는 페길화와 달리 심장의 심근에 결합하는 능력을 부여할 수 있으며, 이는 탄닌화된 물질의 심장에의 표적화 및 축적에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명에서는 GFP, 심장질환 치료제인 SP 및 bFGF, 및 바이러스 AAV9를 탄닌화하여 심장의 심근에 표적화되고 축적됨을 확인하였으며, 탄닌화는 심장질환 치료제의 심장 표적화를 위한 일반적인 방법으로 사용될 수 있음을 보여주었다. 특히 MIR 질환 모델에 탄닌화된 bFGF를 정맥 내 투여하여 치료 효과를 확인하여, 이는 탄닌화된 심장질환 치료제는 심장에 국소적으로 치료제를 전달하기 위해 침습적인 방법을 이용하는 종래의 문제점을 해결할 수 있음을 보여준다.
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Claims (11)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 탄닌산을 유효성분으로 포함하는 심장 표적화제:
    [화학식 1]
    Figure pat00003
    .
  2. 제1항에 있어서, 상기 탄닌산은 심장의 심근(myocardium)에 표적화 및 축적되는 것인, 심장 표적화제.
  3. 탄닌화된 심장질환 치료제를 유효성분으로 포함하는 심장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 심장질환 치료제는 화합물, 단백질, 핵산 및 단백질/핵산 복합체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 심장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 단백질은 bFGF(basic fibroblast growth factor) 또는 SP(substance P)인, 심장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 탄닌화된 약물 전달체를 유효성분으로 포함하는 심장 표적화용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 약물 전달체는 벡터, 바이러스 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 심장 표적화용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 바이러스는 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus) 및 렌티바이러스(lentivirus)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 심장 표적화용 조성물.
  9. 제3항 또는 제6항에 있어서, 상기 조성물은 정맥 내로 투여되는 것인, 심장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 심장질환 치료제를 탄닌화하는 단계를 포함하는 심장질환 치료제를 심장으로 고효율로 표적화시키는 방법.
  11. 탄닌산 및 심장질환 치료제를 포함하는 심장질환 치료용 키트.
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