WO2021221239A1 - 탄닌산을 포함하는 보툴리눔 독소 약제학적 조성물 - Google Patents

탄닌산을 포함하는 보툴리눔 독소 약제학적 조성물 Download PDF

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tannic acid
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botox
tanninized
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박순현
김기석
이재면
이재혁
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한국화학연구원
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Definitions

  • the present invention relates to a botulinum toxin pharmaceutical composition
  • a botulinum toxin pharmaceutical composition comprising tannic acid as an active ingredient.
  • Botulinum toxin Clostridium botulinum anaerobic, grown in canned and unsterilized sealed food containers, produces a potent polypeptide neurotoxin, Botulinum toxin (Botox), which is produced after ingestion of food contaminated with botulinum toxin or spores 18 After 36 hours, neuroparalytic disease is induced in humans and animals.
  • Botulinum toxin consists of a heavy chain and a light chain, and the toxin passes through the intestinal lining without reduced toxicity and exits the presynaptic terminal of peripheral motor neurons (presynaptic terminals).
  • the light chain from the cytoplasm Since the light chain from the cytoplasm has a zinc endopeptidase function, it attacks vesicle proteins. As a result, the release of acetylcholine, a neurotransmitter, is suppressed, showing symptoms of botulinum toxin poisoning.
  • the molecular weight of the botulinum toxin protein is about 150 kDa, and there are seven known botulinum toxins (A, B, C, D, E, F, G).
  • Botulinum toxin is released by Clostridial bacteria as a complex comprising a 150 kDa botulinum toxin protein molecule along with a non-toxic protein. Therefore, the botulinum toxin type A complex can be produced by Clostridial bacteria in 900, 500 and 300 kDa types.
  • Botulinum toxin types B and C appear to be produced only as 500 kDa complexes.
  • Botulinum toxin type D is produced as 300 kD and 500 kDa complexes.
  • Botulinum toxin types E and F are produced only as about 300 kD complexes.
  • the composition of the complexes is believed to include non-toxic and non-hemagglutinin protein structures and hemagglutinin proteins. These two non-toxic proteins will act to provide stability against botulinum toxin molecular denaturation and protection against digestive acids when the toxin is ingested. It is known that the larger the complex of botulinum toxin, the more slowly the botulinum toxin diffuses from the site of intramuscular injection. When the toxin complex is treated with red blood cells at pH 7.3, the complex can be separated into toxin proteins and hemagglutinin proteins. Upon removal of the hemagglutinin protein, the toxin protein becomes markedly unstable.
  • botulinum toxin BOTOX® (Allergan, Inc., 900 kDa full accessory protein complex), Jeuveau (900 kDa full accessory protein complex), Dysport (Undisclosed complex), Xeomin (150 kDa no accessory proteins) , Medytox (Korea), Botulax (Hugel), etc. are distributed in the market.
  • the composition of most BOTOX®, Jeuveau, Dysport, Medytox, and Botulax consists of purified botulinum toxin type A complex, albumin and sodium chloride, packaged in a sterile, vacuum-dried form.
  • Botulinum toxin type A is prepared from a culture of Clostridium botulinum Hall strain cultured in a medium containing N-Z amine and yeast extract.
  • the botulinum toxin type A complex is purified from the culture solution through a series of acid precipitation into a crystalline complex composed of the active high molecular weight toxin protein and the associated hemagglutinin protein.
  • the crystalline complex is re-dissolved in brine and albumin, sterile filtered (0.2 microns) and vacuum dried.
  • Botulinum toxin is being used in clinical settings for the treatment of neuromuscular disorders characterized by spasticity (hyperactive skeletal muscle) caused by cerebral palsy and stroke.
  • Botulinum toxin type A was approved by the U.S. Food and Drug Administration in 1989 for the treatment of essential blepharospasm, strabismus and hemifacial spasm in patients 12 years of age and older.
  • Clinical effects of botulinum toxin type A injected peripherally intramuscularly are usually seen within one week after injection.
  • the typical duration of symptom relief (ie, flaccid muscle paralysis) by a single intramuscular injection of botulinum toxin type A is about 3 months. Recently, it has been widely used as a wrinkle-improving treatment for improving wrinkles in women.
  • Patent Document 1 (Registration Patent No. 10-2088104) as an example of using essential oil of Erigeron annuus flower as a botox adjuvant. More specifically, Patent Document 1 aims to extend the duration of the effect of botulinum neurotoxin by further including Erigeron annuus flower essential oil in the botulinum neurotoxin composition, and this is achieved through the maintenance period of muscle paralysis. I am checking. However, Patent Document 1 does not teach at all about the necessity of reducing side effects caused by in vivo diffusion without staying at the injection site of the aforementioned Botox, and solutions for minimizing side effects.
  • the present applicant was conducting research to derive an adjuvant capable of not only improving the activity of Botox itself, but also minimizing the side effects caused by the diffusion of Botox from the injection site, and a composition containing them,
  • the botulinum toxin pharmaceutical composition comprising tannic acid provided in one aspect of the present invention not only improves the activity of botulinum neurotoxin itself, but also prevents the botulinum neurotoxin from staying in the injected place and spreading into the blood due to the property of tannic acid. , as a result, demonstrated the effect of minimizing the side effects of conventional botox due to the diffusion of botulinum neurotoxin, and completed the present invention.
  • An object of one aspect of the present invention is,
  • botulinum neurotoxin not only does the activity of botulinum neurotoxin itself improve, but also due to the properties of tannic acid, the botulinum neurotoxin stays at the injected site and is prevented from spreading into the blood. To provide a tanninized botulinum toxin complex.
  • the object of another aspect of the present invention is,
  • Botulinum toxin Botulinum toxin (Botox);
  • TA tannic acid
  • An object of another aspect of the present invention is,
  • a tanninized botulinum toxin complex comprising botulinum toxin (Botox) and tannic acid (TA), to a subject in need thereof, comprising the step of administering as much as a pharmaceutically effective amount , to provide a method for treating neuromuscular related diseases.
  • Botox botulinum toxin
  • TA tannic acid
  • the object of another aspect of the present invention is,
  • a tanninized botulinum toxin complex including botulinum toxin (Botox) and tannic acid (TA) for manufacturing a medicament for the treatment of neuromuscular-related diseases.
  • Botox botulinum toxin
  • TA tannic acid
  • An object of another aspect of the present invention is,
  • Botulinum toxin Botulinum toxin (Botox);
  • TA tannic acid
  • the object of another aspect of the present invention is,
  • a tanninized botulinum toxin complex comprising botulinum toxin (Botox) and tannic acid (TA), to a subject in need thereof, comprising the step of administering as much as a pharmaceutically effective amount , to provide a treatment method for cosmetic defects.
  • Botox botulinum toxin
  • TA tannic acid
  • An object of another aspect of the present invention is,
  • botulinum toxin complex comprising botulinum toxin (Botox) and tannic acid (TA) for manufacturing a medicament for the treatment of cosmetic defects
  • the object of another aspect of the present invention is,
  • Botox botulinum toxin
  • TA tannic acid
  • One aspect of the present invention is
  • a tanninized botulinum toxin complex comprising botulinum toxin (Botox) and tannic acid (TA).
  • Botulinum toxin Botulinum toxin (Botox);
  • TA tannic acid
  • a tanninized botulinum toxin complex comprising botulinum toxin (Botox) and tannic acid (TA), to a subject in need thereof, comprising the step of administering as much as a pharmaceutically effective amount , to provide a treatment method for a neuromuscular-related disease.
  • Botox botulinum toxin
  • TA tannic acid
  • a tanninized botulinum toxin complex comprising botulinum toxin (Botox) and tannic acid (TA) for manufacturing a medicament for the treatment of neuromuscular-related diseases.
  • Botox botulinum toxin
  • TA tannic acid
  • Botulinum toxin Botulinum toxin (Botox);
  • TA tannic acid
  • a tanninized botulinum toxin complex comprising botulinum toxin (Botox) and tannic acid (TA), to a subject in need thereof, comprising the step of administering as much as a pharmaceutically effective amount , to provide a treatment method for a cosmetic defect.
  • Botox botulinum toxin
  • TA tannic acid
  • a tanninized botulinum toxin complex comprising botulinum toxin (Botox) and tannic acid (TA) for manufacturing a medicament for the treatment of cosmetic defects do.
  • Botox botulinum toxin
  • TA tannic acid
  • Botulinum toxin Botox
  • TA tannic acid
  • the botulinum toxin pharmaceutical composition comprising tannic acid provided in one aspect of the present invention not only improves the activity of botulinum neurotoxin itself, but also prevents the botulinum neurotoxin from staying at the injected site and spreading into the blood due to the property of tannic acid. , as a result, there is an effect of minimizing the side effects of conventional botox due to the diffusion of botulinum neurotoxin.
  • FIG. 1 is a diagram showing the intracellular influx of fluorescent protein when CHO (Chinese Hamster Ovary) cells are treated with only fluorescent protein (Green Fluorescent Protein, GFP) or tannin-oxidized fluorescent protein prepared by mixing fluorescent protein and tannic acid. It is a photograph showing the result of comparative evaluation.
  • BTX botulinum toxin
  • Botulinum Toxin, BTX botulinum toxin
  • TA tannic acid
  • FIG. 3 shows a group treated with botulinum toxin (BTX) alone (corresponding to BoNT Treatment in the drawing), and botulinum toxin (Botulinum Toxin, BTX) oxidized by treatment with tannic acid (TA) It is a diagram showing the results of deriving LogIC50 values for each treatment concentration of botulinum toxin from the patch-clamp results of the treated group (corresponding to BoNT/TA treatment in the drawing).
  • BTX botulinum toxin
  • TA tannic acid
  • Figure 4 is from Axion MEA data, the group treated with tannic acid alone (corresponding to TA [250] in the drawing), the group treated with botulinum toxin (BTX) alone (B [5], B [ 10], corresponding to B[25]), the group treated with botulinum toxin (BTX), which was tannin-oxidized by treatment with tannic acid (TA, BT[5], BT[10], It is a diagram showing the results of recording the burst frequency and network burst frequency of BT[25]), in the case of TA, the concentration unit is nM, and in the case of B, the concentration unit is U(unit) In BT, the number in [ ] is the concentration of B, and the TA concentration was fixed at 250 nM.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating the case of tannin oxidation of botulinum toxin by mixing botulinum toxin (BTX) with tannic acid, and whether side effects occurring when botulinum toxin is injected into the skin can be reduced through an in vivo experiment. It is a diagram showing the experimental process.
  • BTX botulinum toxin
  • FIG. 6 shows a group injected with botulinum toxin (BTX) alone (corresponding to BoNT / A only in the diagram) and a group injected with a botulinum toxin and tannic acid mixture (corresponding to BoNT / A + TA in the diagram) ,
  • BTX botulinum toxin
  • a botulinum toxin and tannic acid mixture corresponding to BoNT / A + TA in the diagram
  • the embodiment of the present invention may be modified in various other forms, and the scope of the present invention is not limited to the embodiments described below.
  • the embodiments of the present invention are provided in order to more completely explain the present invention to those of ordinary skill in the art.
  • One aspect of the present invention is
  • a tanninized botulinum toxin complex comprising botulinum toxin (Botox) and tannic acid (TA).
  • Botox botulinum toxin
  • TA tannic acid
  • the tannic acid is characterized in that it is tanninized by binding to botulinum toxin.
  • Botulinum toxin Botulinum toxin (Botox);
  • tannic acid TA
  • the tannic acid is characterized in that it is tanninized by binding to botulinum toxin.
  • the pharmaceutical composition may be for preventing or treating neuromuscular-related diseases.
  • the molecular weight of the botulinum toxin protein is about 150 kDa, and there are seven known botulinum toxins (A, B, C, D, E, F, G).
  • Botulinum toxin is released by Clostridial bacteria as a complex comprising a 150 kDa botulinum toxin protein molecule along with a non-toxic protein. Therefore, the botulinum toxin type A complex can be produced by Clostridial bacteria in 900, 500 and 300 kDa types.
  • Botulinum toxin types B and C appear to be produced only as 500 kDa complexes.
  • Botulinum toxin type D is produced as 300 kD and 500 kDa complexes.
  • botulinum toxin types E and F are produced only as about 300 kD complexes.
  • the composition of the complexes includes a non-toxic and non-hemagglutinin protein structure and a hemagglutinin protein.
  • Botulinum Neurotoxin type A (BoNT/A) may be used as the botulinum toxin (Botox).
  • the botulinum toxin may be included in the composition in a concentration range of 5 to 10,000 U/ml, but is not particularly limited to the corresponding concentration range, and the concentration range may be appropriately adjusted depending on the intended use of the composition.
  • concentration ranges include a concentration range of 5 to 8,000 U/ml, a concentration range of 5 to 6,000 U/ml, a concentration range of 5 to 4,000 U/ml, and a concentration range of 5 to 2,000 U/ml.
  • Tannic acid is one of the most abundant polyphenols found in plants such as fruits, vegetables, olives, and cacao. Recently, tannic acid has been used as a multifunctional coating molecule. It is also known as a molecule with excellent affinity for DNA and biomacromolecules including proline-rich proteins such as thrombin, gelatin, collagen and mucin. Tannic acid contains moieties rich in phenolic hydroxyl groups (5 gallol groups (3 -OH groups connected to the aromatic ring) and 5 catechol groups (two -OH groups covalently linked to the aromatic ring)) with the target protein. It can bind to proteins through multiple hydrogen bonds and hydrophobic interactions.
  • the tannic acid (TA) may be used in an appropriate amount depending on the amount of botulinum toxin in the composition and/or to maximize the activity of botulinum toxin itself or minimize side effects, and in one embodiment, several For example, the concentration range may be included in the composition at a concentration of 10 nM to 500 ⁇ M.
  • the tannic acid has a concentration range of 10 nM to 480 ⁇ M, a concentration range of 10 nM to 460 ⁇ M, a concentration range of 10 nM to 440 ⁇ M, a concentration range of 10 nM to 420 ⁇ M, a concentration range of 10 nM to 400 ⁇ M, a concentration range of 10 nM to 380 ⁇ M, 10 nM to concentration range of 360 ⁇ M, concentration range of 10 nM to 340 ⁇ M, concentration range of 10 nM to 320 ⁇ M, concentration range of 10 nM to 300 ⁇ M, concentration range of 10 nM to 280 ⁇ M, concentration range of 10 nM to 260 ⁇ M, concentration range of 10 nM to 240 ⁇ M, 10 nM to 220 ⁇ M a concentration range of 10 nM to 200 ⁇ M, a concentration range of 10 nM to 180 ⁇ M, a concentration range of 10 nM to 160 ⁇ M
  • the neuromuscular disease is a chronic obstructive pulmonary disease.
  • Myoclonus hemifacial spasm, spasmodic torticollis, anal fissure, blepharospasm, facial spasm, cerebral palsy, drugs Medication overuse headache, chronic migraine, myalgia, strabismus, temporomandibular disorder, neuralgia, overactive bladder, urge incontinence It may be selected from the group consisting of urinary incontinence, rhinitis, acne, dystonia, hyperhidrosis, and vocal fold granuloma.
  • the tannic acid (TA) improves the activity of botulinum toxin (Botox) by 1.5 to 10 times, and prevents the botulinum toxin (Botox) from spreading from the injection site, resulting in botulinum toxin diffusion It plays a role in reducing side effects.
  • Another aspect of the present invention is
  • Botulinum toxin botulinum toxin
  • TA tannic acid
  • the botulinum toxin in the first component may be included in a concentration range of 5 to 10,000 U/ml, but is not particularly limited to the corresponding concentration range, and the concentration range may be appropriately adjusted depending on the intended use of the kit.
  • concentration ranges include a concentration range of 5 to 8,000 U/ml, a concentration range of 5 to 6,000 U/ml, a concentration range of 5 to 4,000 U/ml, and a concentration range of 5 to 2,000 U/ml.
  • Tannic acid (TA) in the second component may be used in an appropriate amount depending on the amount of botulinum toxin in the kit and/or to maximize the activity of botulinum toxin itself or minimize side effects, in one embodiment As such, it may be included in the second component at a concentration of 10 nM to 500 ⁇ M.
  • the tannic acid has a concentration range of 10 nM to 480 ⁇ M, a concentration range of 10 nM to 460 ⁇ M, a concentration range of 10 nM to 440 ⁇ M, a concentration range of 10 nM to 420 ⁇ M, a concentration range of 10 nM to 400 ⁇ M, a concentration range of 10 nM to 380 ⁇ M, 10 nM to concentration range of 360 ⁇ M, concentration range of 10 nM to 340 ⁇ M, concentration range of 10 nM to 320 ⁇ M, concentration range of 10 nM to 300 ⁇ M, concentration range of 10 nM to 280 ⁇ M, concentration range of 10 nM to 260 ⁇ M, concentration range of 10 nM to 240 ⁇ M, 10 nM to 220 ⁇ M a concentration range of 10 nM to 200 ⁇ M, a concentration range of 10 nM to 180 ⁇ M, a concentration range of 10 nM to 160 ⁇ M
  • Another aspect of the present invention is
  • a method for improving the activity of botulinum toxin comprising the step of tannin-oxidizing botulinum toxin by treating botulinum toxin (Botox) with tannic acid (TA).
  • Botox botulinum toxin
  • TA tannic acid
  • Another aspect of the present invention is
  • a method for reducing side effects due to in vivo diffusion of botulinum toxin comprising the step of tannic-oxidizing botulinum toxin by treating tannic acid (TA) with botulinum toxin (Botox).
  • TA tannic acid
  • Botox botulinum toxin
  • Another aspect of the present invention is
  • a tanninized botulinum toxin complex comprising botulinum toxin (Botox) and tannic acid (TA), to a subject in need thereof, comprising the step of administering as much as a pharmaceutically effective amount , to provide a treatment method for a neuromuscular-related disease.
  • the administration method is not particularly limited oral / parenteral, but is preferably administered by injection.
  • Another aspect of the present invention is
  • a tanninized botulinum toxin complex comprising botulinum toxin (Botox) and tannic acid (TA) for manufacturing a medicament for the treatment of neuromuscular-related diseases.
  • Botox botulinum toxin
  • TA tannic acid
  • Another aspect of the present invention is
  • Botulinum toxin Botulinum toxin (Botox);
  • TA tannic acid
  • Reduction of the appearance of fine lines reduction of the appearance of wrinkles, widening of eyes, lifting the corner of the mouth, reduction of muscle mass and flattening of lines developed from the upper lip It may be one selected from the group consisting of, or one or more.
  • the botulinum toxin may be included in the composition in a concentration range of 5 to 10,000 U/ml, but is not particularly limited to the concentration range, and the concentration range may be appropriately adjusted according to the intended use of the cosmetic composition.
  • concentration ranges include a concentration range of 5 to 8,000 U/ml, a concentration range of 5 to 6,000 U/ml, a concentration range of 5 to 4,000 U/ml, and a concentration range of 5 to 2,000 U/ml.
  • TA tannic acid
  • the tannic acid (TA) may be used in an appropriate amount depending on the amount of botulinum toxin in the composition and/or to maximize the activity of botulinum toxin itself or minimize side effects, in one embodiment, For example, several concentration ranges may be included in the composition at a concentration of 10 nM to 500 ⁇ M.
  • the tannic acid has a concentration range of 10 nM to 480 ⁇ M, a concentration range of 10 nM to 460 ⁇ M, a concentration range of 10 nM to 440 ⁇ M, a concentration range of 10 nM to 420 ⁇ M, a concentration range of 10 nM to 400 ⁇ M, a concentration range of 10 nM to 380 ⁇ M, 10 nM to concentration range of 360 ⁇ M, concentration range of 10 nM to 340 ⁇ M, concentration range of 10 nM to 320 ⁇ M, concentration range of 10 nM to 300 ⁇ M, concentration range of 10 nM to 280 ⁇ M, concentration range of 10 nM to 260 ⁇ M, concentration range of 10 nM to 240 ⁇ M, 10 nM to 220 ⁇ M a concentration range of 10 nM to 200 ⁇ M, a concentration range of 10 nM to 180 ⁇ M, a concentration range of 10 nM to 160 ⁇ M
  • Another aspect of the present invention is
  • a tanninized botulinum toxin complex comprising botulinum toxin (Botox) and tannic acid (TA), comprising the step of administering to a subject in need thereof as much as a pharmaceutically effective amount , to provide a treatment method for a cosmetic defect.
  • the administration method is not particularly limited oral / parenteral, but is preferably administered by injection.
  • the cosmetic defect may be a wrinkle.
  • Another aspect of the present invention is
  • a tanninized botulinum toxin complex comprising botulinum toxin (Botox) and tannic acid (TA) for manufacturing a medicament for the treatment of cosmetic defects do.
  • Botox botulinum toxin
  • TA tannic acid
  • Another aspect of the present invention is
  • Botulinum toxin Botox
  • TA tannic acid
  • botulinum toxin (Botox) adjuvant The botulinum toxin (Botox) adjuvant,
  • Myoclonus hemifacial spasm, spasmodic torticollis, anal fissure, blepharospasm, facial spasm, cerebral palsy, drugs Medication overuse headache, chronic migraine, myalgia, strabismus, temporomandibular disorder, neuralgia, overactive bladder, urge incontinence It may be for preventing or treating a neuromuscular-related disease selected from the group consisting of urinary incontinence, rhinitis, acne, dystonia, hyperhidrosis and vocal fold granuloma.
  • botulinum toxin (Botox) adjuvant may be for cosmetic purposes.
  • the botulinum toxin (Botox) adjuvant may be administered simultaneously with the botulinum toxin.
  • the botulinum toxin pharmaceutical composition comprising tannic acid provided in one aspect of the present invention not only improves the activity of botulinum neurotoxin itself, but also prevents the botulinum neurotoxin from staying at the injected site and spreading into the blood due to the property of tannic acid. , as a result, there is an effect of minimizing the side effects of conventional botox due to the diffusion of botulinum neurotoxin.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention contains botulinum toxin as an active ingredient, thereby reducing the spread of botulinum toxin from the site of high-efficiency targeted treatment and intramuscular injection, thereby minimizing side effects. This is directly supported by the experimental examples described below.
  • tannic acid could deliver the protein into the cell by taking advantage of the high binding force with the protein.
  • proteins since they are hydrophilic, there must be a receptor or a tunnel for the protein to be delivered into the cell.
  • tannic acid it is possible to bind to all proteins, so the free OH groups remaining after binding of tannic acid to proteins can also bind to various proteins in the cell membrane. Cells continue to undergo repeated endocytosis and exocytosis. If the protein bound to tannic acid binds to the cell membrane, it can be introduced into the cell through endocytosis. The present applicant confirmed whether the mixture of tannic acid and protein was introduced into the cell.
  • CHO (Chinese Hamster Ovary) cells were treated with tannin-oxidized protein, and after 4 hours, the cells were treated with a fluorescent protein (Green Fluorescent Protein, GFP) and in a group in which tannic acid was bound to a fluorescent protein (Green Fluorescent Protein, GFP). The difference in the degree of inflow was compared.
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • FIG. 1 is a diagram showing the intracellular influx of fluorescent protein when CHO (Chinese Hamster Ovary) cells are treated with only fluorescent protein (Green Fluorescent Protein, GFP) or tannin-oxidized fluorescent protein prepared by mixing fluorescent protein and tannic acid. It is a photograph showing the result of comparative evaluation.
  • the tannic acid binds to the protein, and thus the protein can be easily delivered into the cell.
  • botulinum toxin In order to evaluate whether the activity of botulinum toxin itself increases when botulinum toxin is tannin-oxidized by mixing botulinum toxin (BTX) and tannic acid, the following electrophysiological measurement method (patch-clamp CMAP) was performed.
  • Electrophysiological measurement methods and results are as follows.
  • the isolated brain-cerebral tissue is reacted with 5 mL digestion solution, specifically papain, Dnase I and Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) at 37°C for 35 minutes.
  • 5 mL digestion solution specifically papain, Dnase I and Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) at 37°C for 35 minutes.
  • EBSS Earle's Balanced Salt Solution
  • Feeding solution (B-27 + Glutamax + Neurobasal media) was exchanged every 2-3 days.
  • Tannic acid (TA, tannic acid) was prepared by dissolving it in PBS solution at a concentration of 25 ⁇ M.
  • Solution conditions (mM) in glass pipette 135 CsCl, 10 HEPES, 1 EGTA, 1 Na-GTP, 4 and 10 QX-314 (pH 7.4, adjusted to CsOH).
  • the resistance of the tip of the glass pipette can be measured as 4 to 5 ⁇ .
  • the solution composition for storing neurons when performing electrophysiological recordings is (mM): 140 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 glucose (pH 7.4, adjusted with NaOH).
  • spontaneous AMPA and NMDA receptor inhibitors CNQX and APV are added to the neuron storage solution.
  • Axion MEA records the burst frequency and network burst frequency before botulinum toxin (BTX) treatment in the neuron culture medium. Frequency) and network burst frequency are recorded to compare before and after processing.
  • BTX botulinum toxin
  • BTX botulinum toxin
  • Botulinum Toxin, BTX botulinum toxin
  • TA tannic acid
  • FIG. 3 shows a group treated with botulinum toxin (BTX) alone (corresponding to BoNT Treatment in the drawing), and botulinum toxin (Botulinum Toxin, BTX) oxidized by treatment with tannic acid (TA) It is a diagram showing the results of deriving LogIC50 values for each treatment concentration of botulinum toxin from the patch-clamp results of the treated group (corresponding to BoNT/TA treatment in the drawing).
  • BTX botulinum toxin
  • TA tannic acid
  • botulinum toxin itself was higher in the experimental group treated with botulinum toxin (BTX), which was tanninized by treatment with tannic acid (TA), than in the experimental group treated with botulinum toxin (BTX) alone. It can be seen that the output is about 1.8 times higher. The smaller the LogIC50 value, the greater the effect of the toxin. In addition, 0.5, 1.0, and 1.5 on the x-axis in FIG. 3 mean the concentration of botulinum toxin U/ml.
  • Figure 4 is from Axion MEA data, the group treated with tannic acid alone (corresponding to TA [250] in the drawing), the group treated with botulinum toxin (BTX) alone (B [5], B [ 10], corresponding to B[25]), the group treated with botulinum toxin (BTX), which was tannin-oxidized by treatment with tannic acid (TA, BT[5], BT[10], It is a diagram showing the results of recording the burst frequency and network burst frequency of BT [25]).
  • TA the concentration unit is nM
  • B the concentration unit is U (unit).
  • B-T the number in [ ] is the concentration of B, and the TA concentration was fixed at 250 nM.
  • B[5] indicates that the concentration of botulinum toxin is used as much as 5 U/ml
  • B[10] indicates that the concentration of botulinum toxin is used as much as 10 U/ml
  • B[25] indicates that the concentration of botulinum toxin is used as much as 10 U/ml. It means that the concentration of 25 U/ml was used.
  • botulinum toxin BTX
  • BTX botulinum toxin
  • botulinum toxin When botulinum toxin is tanninized by mixing botulinum toxin (BTX) and tannic acid, it is evaluated whether the activity of botulinum toxin itself can be increased and side effects that have occurred when botulinum toxin is injected into the skin can be reduced. In order to do this, the following experiment was performed.
  • BTX botulinum toxin
  • FIG. 5 is a diagram illustrating the case of tannin oxidation of botulinum toxin by mixing botulinum toxin (BTX) with tannic acid, and whether side effects occurring when botulinum toxin is injected into the skin can be reduced through an in vivo experiment. It is a diagram showing the experimental process.
  • BTX botulinum toxin
  • BoNT/A [100 unit/mL], TA [100 nM] were prepared at a concentration, and then mixed in a 1:1 volume ratio and reacted to a final BoNT/A [50 unit/mL], TA [50 nM] concentration.
  • FIG. 6 shows a group injected with botulinum toxin (BTX) alone (corresponding to BoNT / A only in the diagram) and a group injected with a botulinum toxin and tannic acid mixture (corresponding to BoNT / A + TA in the diagram) ,
  • BTX botulinum toxin
  • tannic acid mixture corresponding to BoNT / A + TA in the diagram
  • botulinum neurotoxin diffuses through the blood vessels from the injection site, and the botulinum neurotoxin has an effect even in an unintended place, which can cause side effects.
  • the content of the above ingredients per ampoule (2 ml) is prepared.
  • Each component is added and dissolved in purified water according to a conventional liquid preparation method, an appropriate amount of lemon flavor is added, the above components are mixed, purified water is added, the whole is adjusted to 100 ml by adding purified water, and then filled in a brown bottle. Sterilize to prepare a solution.
  • the botulinum toxin pharmaceutical composition comprising tannic acid provided in one aspect of the present invention not only improves the activity of botulinum neurotoxin itself, but also prevents the botulinum neurotoxin from staying at the injected site and spreading into the blood due to the property of tannic acid. , and consequently is useful for minimizing the side effects of conventional botox due to botulinum neurotoxin diffusion.

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Abstract

본 발명은 탄닌산을 유효성분으로 포함하는 보툴리눔 독소 약제학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 일 측면에서 제공하는 탄닌산을 포함하는 보툴리눔 독소 약제학적 조성물은 보툴리눔 신경 독소 자체의 활성이 개선될 뿐만 아니라, 탄닌산의 특성에 의해 주사된 곳에 보툴리눔 신경 독소가 머물고 혈액으로 확산되는 것이 방지되어, 결과적으로 보툴리눔 신경 독소 확산에 의한 종래 보톡스의 부작용을 최소화할 수 있는 효과가 있다.

Description

탄닌산을 포함하는 보툴리눔 독소 약제학적 조성물
본 발명은 탄닌산을 유효성분으로 포함하는 보툴리눔 독소 약제학적 조성물에 관한 것이다.
통조림 및 살균되지 않은 밀봉된 식품 용기에서 배양되는 혐기성 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)은 강력한 폴리펩티드 신경독인, 보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox)를 생성하며, 보툴리눔 독소 또는 포자에 감염된 음식물을 먹은 후 18에서 36시간이 지나면 사람 및 동물에서 신경마비 질환이 유발된다. 보툴리눔 독소 구조는 중연쇄(Heavy chain)와 경쇄(Light chain)으로 구성되어 있고, 이 독소는 독성이 감소되지 않은 채로 장 내막을 통과하여 말초 운동 뉴런의 시냅스 이전(Presynaptic terminal)의 세포 외 유출(Exocytosis) 과정에서 노출되는 소포체 단백질(Synaptic vesicle protein)과 결합하여, 클라트린(clathrin)에 의한 세포흡수 소포체(Endocytotic vesicles)를 통하여 말초 운동 뉴런으로 유입된다. 세포흡수 소포체(Endocytotic vesicles)들의 높은 내부 산도로 인해, 보툴리눔 독소 중 경쇄(Light chain)가 세포질(cytoplasm)로 나오게 된다.
세포질로 나온 경쇄(Light chain)는 아연 엔도펩티다아제(endopeptidase) 기능을 가지므로, 소포 관련 단백질들(vesicle proteins)을 공격한다. 이 결과, 신경전달 물질인 아세틸콜린의 방출이 억제되어 보툴리눔 독소 중독의 증상을 보이는데, 해당 증상으로는 보행장애, 연하장애 및 언어장애로부터 호흡근육의 마비 등이 있고, 죽음까지 유발할 수 있다.
보툴리눔 독소 단백질의 분자량은 약 150 kDa이고, 현재까지 알려진 보툴리눔 독소는 7가지(A, B, C, D, E, F, G)이다. 보툴리눔 독소는 클로스트리디움계 박테리아에 의해서, 비독성 단백질과 함께 150 kDa 보툴리눔 독소 단백질 분자를 포함하는 복합체(complex)로서 방출된다. 그러므로, 보툴리눔 독소 타입 A 복합체는 클로스트리디움계 박테리아에 의해서, 900, 500 및 300 kDa형으로 생성될 수 있다. 보툴리눔 독소 타입 B 및 C는 500 kDa 복합체로서만 생성되는 것으로 보인다. 보툴리눔 독소 타입 D는 300kD 및 500 kDa 복합체로서 생성된다. 보툴리눔 독소 타입 E 및 F는 약 300kD 복합체로서만 생성된다. 복합체들의 구성은 비독성 및 비 적혈구응집소 단백질 구조와 적혈구 응집소 단백질을 포함하는 것으로 여겨진다. 이러한 두 가지 비독성 단백질은 보툴리눔 독소 분자 변성에 대한 안정성 및 독소가 섭취될 때 소화성 산에 대한 보호를 제공하는 데에 작용할 것이다. 보툴리눔 독소의 복합체가 클수록 근육 주사된 부위로부터 보툴리눔 독소가 더 천천히 확산되는 것으로 알려져 있다. 독소 복합체는 pH 7.3에서 적혈구 세포로 처리하면 복합체가 독소 단백질과 적혈구응집소 단백질로 분리될 수 있다. 적혈구응집소 단백질의 제거 시, 독소 단백질은 현저한 불안정해진다.
상업적으로 입수 가능한 보툴리눔 독소로 BOTOX®(Allergan, Inc., 900 kDa의 full accessory protein complex), Jeuveau(900 kDa의 full accessory protein complex), Dysport(Undisclosed complex), Xeomin(150 kDa의 no accessory proteins), Medytox(Korea), Botulax(Hugel)등이 시중에 유통되고 있다. 대부분의 BOTOX®, Jeuveau, Dysport, Medytox, Botulax의 조성은 정제 보툴리눔 독소 타입 A 복합체, 알부민 및 염화나트륨으로 구성되며, 살균, 진공건조 형태로 포장된다. 보툴리눔 독소 타입 A는, N-Z 아민 및 효모 추출물을 함유하는 배지에서 배양된 클로스트리디움 보툴리눔 홀 종(Hall strain)의 배양물로부터 제조한다. 보툴리눔 독소 타입 A 복합체를 배양물 용액으로부터 일련의 산 침전을 통하여, 활성 고분자량 독소 단백질 및 관련 적혈구응집소 단백질로 구성되는 결정형 복합체로 정제한다. 결정형 복합체를 염수 및 알부민에 재-용해하고, 살균 여과(0.2미크론)한 후, 진공 건조한다.
보툴리눔 독소는 뇌성마비, 뇌졸증 등에 의한 경련성(활동항진성 골격근)을 특징으로 하는 신경근 장애 치료를 위해 임상 세팅에 사용되고 있다. 보툴리눔 독소 타입 A는 1989년 미국 식품의약청에 의해서, 12세 이상 환자에서의 본태성 안검경련, 사시 및 반측안면 경련의 치료에 사용되는 것이 허가되었다. 말초 근육 내 주사된 보툴리눔 독소 타입 A의 임상 효과는 보통 주사 후 1주 내에 나타난다. 일 회 보툴리눔 독소 타입 A의 근육 내 주사에 의한 증상 구제(즉, 이완 근육 마비)의 전형적인 지속시간은 약 3개월이다. 최근에는 여성의 주름을 개선하기 위한 주름 개선 치료제로도 많이 활용되고 있다.
한편, 보툴리눔 독소 제품을 의료용도나 미용용도로 사용한 후, 의도하지 않은 부작용이 발생하는 심각한 문제가 있다. 구체적으로, 독소는 주사 부위에서 신체의 다른 부위로 퍼져 근육 마비를 일으킬 수 있다. 또한, 호흡 곤란과 음식을 삼키기 어려울 수도 있다. 전 세계적으로 600건이 넘는 원치 않는 부작용과 28명이 사망한 것으로 보고되었다. 2008년 2월 미국 식품의 약국(FDA)은 더 심각한 부작용을 보고했는데, 치료 후 사지 경련이 있는 여러 어린이가 사망하였다. 최근 제약회사, 환자, 그리고 미용을 위한 사용자들로부터, 보톡스 약효는 증가시키되, 의도하지 않은 보톡스의 생체 내 확산에 의한 부작용은 최소화할 수 있는 제품의 요구가 증가하고 있는 추세이다.
보톡스 약효를 증가시키기 위한 목적으로 개망초(Erigeron annuus) 꽃 에센셜 오일(essential oil)을 보톡스 보조제로 사용한 일 사례로는 특허문헌 1(등록특허 10-2088104)이 있다. 보다 구체적으로, 특허문헌 1은 보툴리눔 신경 독소 조성물에 개망초(Erigeron annuus) 꽃 에센셜 오일(essential oil)을 더 포함시켜 보툴리눔 신경 독소의 효과 유지 기간을 연장시키는데 목적이 있으며, 이를 근육 마비 유지 기간을 통해 확인하고 있다. 하지만, 특허문헌 1은 앞서 언급한 보톡스가 주사한 부위에 머물지 않고 생체 내 확산에 의해 발생하는 부작용 저감 필요성과, 부작용 최소화를 위한 해결수단에 대하여는 전혀 교시하고 있지 않다.
본 출원인은 보톡스 자체의 활성개선뿐만 아니라, 보톡스가 주사 부위로부터 확산됨에 따라 발생하는 부작용도 최소화할 수 있는 보조제와, 이들을 포함하는 조성물을 도출하기 위해 연구를 수행하던 중,
본 발명의 일 측면에서 제공하는 탄닌산을 포함하는 보툴리눔 독소 약제학적 조성물이 보툴리눔 신경 독소 자체의 활성이 개선될 뿐만 아니라, 탄닌산의 특성에 의해 주사된 곳에 보툴리눔 신경 독소가 머물고 혈액으로 확산되는 것이 방지되어, 결과적으로 보툴리눔 신경 독소 확산에 의한 종래 보톡스의 부작용을 최소화할 수 있는 효과를 입증하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 측면에서의 목적은,
보툴리눔 신경 독소 자체의 활성이 개선될 뿐만 아니라, 탄닌산의 특성에 의해 주사된 곳에 보툴리눔 신경 독소가 머물고 혈액으로 확산되는 것이 방지되어, 결과적으로 보툴리눔 신경 독소 확산에 의한 종래 보톡스의 부작용을 최소화할 수 있는 탄닌화된 보툴리눔 독소 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 측면에서의 목적은,
보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox); 및
탄닌산(Tannic acid, TA)을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일 측면에서의 목적은,
보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox)와 탄닌산(Tannic acid, TA)을 포함하는 탄닌화된 보툴리눔 독소 복합체를, 이를 필요로 하는 대상(subject)에게 약학적 유효량(effective amount)만큼 투여하는 단계를 포함하는, 신경근육 관련 질환의 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 측면에서의 목적은,
신경근육 관련 질환 치료용 약제(medicament)를 제조하기 위한, 보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox)와 탄닌산(Tannic acid, TA)을 포함하는 탄닌화된 보툴리눔 독소 복합체의 용도(Use)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일 측면에서의 목적은,
보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox); 및
탄닌산(Tannic acid, TA)을 유효성분으로 포함하는 미용적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 측면에서의 목적은,
보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox)와 탄닌산(Tannic acid, TA)을 포함하는 탄닌화된 보툴리눔 독소 복합체를, 이를 필요로 하는 대상(subject)에게 약학적 유효량(effective amount)만큼 투여하는 단계를 포함하는, 미용적 결함(cosmetic defect)의 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일 측면에서의 목적은,
미용적 결함(cosmetic defect) 치료용 약제(medicament)를 제조하기 위한, 보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox)와 탄닌산(Tannic acid, TA)을 포함하는 탄닌화된 보툴리눔 독소 복합체의 용도(Use)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 측면에서의 목적은,
탄닌산(Tannic acid, TA)을 유효성분으로 포함하는 보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox) 보조제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명의 일 측면은,
보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox)와 탄닌산(Tannic acid, TA)을 포함하는, 탄닌화된 보툴리눔 독소 복합체를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 측면은,
보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox); 및
탄닌산(Tannic acid, TA)을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명의 또 다른 일 측면은,
보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox)와 탄닌산(Tannic acid, TA)을 포함하는 탄닌화된 보툴리눔 독소 복합체를, 이를 필요로 하는 대상(subject)에게 약학적 유효량(effective amount)만큼 투여하는 단계를 포함하는, 신경근육 관련 질환의 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 측면은,
신경근육 관련 질환 치료용 약제(medicament)를 제조하기 위한, 보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox)와 탄닌산(Tannic acid, TA)을 포함하는 탄닌화된 보툴리눔 독소 복합체의 용도(Use)를 제공한다.
나아가, 본 발명의 또 다른 일 측면은,
보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox); 및
탄닌산(Tannic acid, TA)을 유효성분으로 포함하는 미용적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 측면은,
보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox)와 탄닌산(Tannic acid, TA)을 포함하는 탄닌화된 보툴리눔 독소 복합체를, 이를 필요로 하는 대상(subject)에게 약학적 유효량(effective amount)만큼 투여하는 단계를 포함하는, 미용적 결함(cosmetic defect)의 치료방법을 제공한다.
나아가, 본 발명의 또 다른 일 측면은,
미용적 결함(cosmetic defect) 치료용 약제(medicament)를 제조하기 위한, 보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox)와 탄닌산(Tannic acid, TA)을 포함하는 탄닌화된 보툴리눔 독소 복합체의 용도(Use)를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 측면은,
탄닌산(Tannic acid, TA)을 유효성분으로 포함하는 보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox) 보조제를 제공한다.
본 발명의 일 측면에서 제공하는 탄닌산을 포함하는 보툴리눔 독소 약제학적 조성물은 보툴리눔 신경 독소 자체의 활성이 개선될 뿐만 아니라, 탄닌산의 특성에 의해 주사된 곳에 보툴리눔 신경 독소가 머물고 혈액으로 확산되는 것이 방지되어, 결과적으로 보툴리눔 신경 독소 확산에 의한 종래 보톡스의 부작용을 최소화할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포에 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)만 처리하거나, 형광 단백질 및 탄닌산을 혼합하여 제조되는 탄닌산화된 형광 단백질을 처리할 경우, 형광 단백질의 세포내 유입 정도를 비교 평가한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BTX)를 단독으로 처리한 군(도면에서 BoNT 50U에 해당함)과, 탄닌산(TA, tannic acid)을 처리함에 따라 탄닌산화된 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BTX)를 처리한 군(도면에서 BoNT 50U / TA 250 nM에 해당함)의 patch-clamp 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BTX)를 단독으로 처리한 군(도면에서 BoNT Treatment에 해당함)과, 탄닌산(TA, tannic acid)을 처리함에 따라 탄닌산화된 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BTX)를 처리한 군(도면에서 BoNT/TA Treatment에 해당함)의 상기 patch-clamp 결과로부터, 보툴리눔 독소의 처리 농도별 LogIC50 값을 도출한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 Axion MEA 데이터로부터, 탄닌산을 단독으로 처리한 군(도면에서 TA[250]에 해당함), 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BTX)를 단독으로 처리한 군(도면에서 B[5], B[10], B[25]에 해당함), 탄닌산(TA, tannic acid)을 처리함에 따라 탄닌산화된 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BTX)를 처리한 군(도면에서 B-T[5], B-T[10], B-T[25]에 해당함)의 버스트 주파수(Burst Frequency)와 네트워크 버스트 주파수(Network Burst Frequency)를 기록한 결과를 나타내는 도면이고, TA의 경우 농도 단위가 nM이고, B의 경우 농도 단위가 U(unit)이며, B-T에서 [ ] 안의 수치는 B의 농도이고, TA 농도는 250 nM로 고정하였다.
도 5는 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BTX)와 탄닌산을 혼합하여 보툴리눔 독소를 탄닌산화할 경우, 종래 보툴리눔 독소를 피부 내 주사할 경우 발생하던 부작용도 저감될 수 있는지에 대해 in vivo 실험을 통해 평가할 때의 실험과정을 나타내는 도면이다.
도 6은 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BTX)를 단독으로 주사한 군(도면에서 BoNT/A only에 해당함)과, 보툴리눔 독소 및 탄닌산 혼합액(도면에서 BoNT/A + TA에 해당함)을 주사한 군에서, 주사한 위치와 주사하지 않은 위치(Vehicle)에서의 CMAP 전기적 파형을 측정하여, 보툴리눔 독소가 주사한 위치로부터 혈관을 통해 확장하여 부작용을 유발할 가능성이 있는지 비교한 결과를 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
한편, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함"한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 일 측면은,
보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox)와 탄닌산(Tannic acid, TA)을 포함하는, 탄닌화된 보툴리눔 독소 복합체를 제공한다. 이때, 상기 탄닌산은 보툴리눔 독소에 결합하여 탄닌화된 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일 측면은,
보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox); 및
탄닌산(Tannic acid, TA)을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 이때, 상기 탄닌산은 보툴리눔 독소에 결합하여 탄닌화된 것을 특징으로 한다.
상기 약학적 조성물은 신경근육 관련 질환의 예방 또는 치료용일 수 있다.
상기 보툴리눔 독소 단백질의 분자량은 약 150 kDa이고, 현재까지 알려진 보툴리눔 독소는 7가지(A, B, C, D, E, F, G)이다. 보툴리눔 독소는 클로스트리디움계 박테리아에 의해서, 비독성 단백질과 함께 150 kDa 보툴리눔 독소 단백질 분자를 포함하는 복합체(complex)로서 방출된다. 그러므로, 보툴리눔 독소 타입 A 복합체는 클로스트리디움계 박테리아에 의해서, 900, 500 및 300 kDa형으로 생성될 수 있다. 보툴리눔 독소 타입 B 및 C는 500 kDa 복합체로서만 생성되는 것으로 보인다. 보툴리눔 독소 타입 D는 300kD 및 500 kDa 복합체로서 생성된다. 마지막으로, 보툴리눔 독소 타입 E 및 F는 약 300kD 복합체로서만 생성된다. 복합체들의 구성은 비독성 및 비 적혈구응집소 단백질 구조와 적혈구 응집소 단백질을 포함한다. 본 발명에서 상기 보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox)는, 보툴리눔 신경독소 A형 (Botulinum Neurotoxin type A, BoNT/A)을 사용할 수 있다.
상기 보툴리눔 독소는 조성물에 5 내지 10,000 U/ml 농도 범위로 포함될 수 있으나, 특별히 해당 농도 범위에 제한되는 것은 아니고, 조성물의 사용처에 따라 농도 범위를 적절히 조절할 수 있다. 일 구체예로, 몇 가지 농도범위를 들면 5 내지 8,000 U/ml의 농도 범위, 5 내지 6,000 U/ml의 농도 범위, 5 내지 4,000 U/ml의 농도 범위, 5 내지 2,000 U/ml의 농도 범위, 5 내지 1,000 U/ml의 농도 범위, 5 내지 900 U/ml의 농도 범위, 5 내지 800 U/ml의 농도 범위, 5 내지 700 U/ml의 농도 범위, 5 내지 600 U/ml의 농도 범위, 5 내지 500 U/ml의 농도 범위, 5 내지 400 U/ml의 농도 범위, 5 내지 300 U/ml의 농도 범위, 5 내지 200 U/ml의 농도 범위, 5 내지 100 U/ml의 농도 범위, 5 내지 90 U/ml의 농도 범위, 5 내지 80 U/ml의 농도 범위, 5 내지 70 U/ml의 농도 범위, 5 내지 60 U/ml의 농도 범위, 5 내지 50 U/ml의 농도 범위일 수 있다.
탄닌산(Tannic acid, TA)은 과일, 채소, 올리브, 카카오 등의 식물에서 발견되는 가장 풍부한 폴리페놀 중 하나로서, 근래 탄닌산은 다기능 코팅 분자로 이용되고 있다. 또한 DNA 및 트롬빈, 젤라틴, 콜라겐 및 뮤신과 같은 프롤린이 풍부한 단백질을 포함한 생체거대분자(biomacromolecules)과의 친화력이 뛰어난 분자로 알려져 있다. 탄닌산은 페놀성 히드록시기가 풍부한 모이어티 (5개의 갈롤 그룹(방향족 고리에 연결된 3개의 -OH기) 및 5개의 카테콜 그룹(방향족 고리에 공유결합으로 연결된 2개의 -OH기))가 표적 단백질과 다중 수소결합 및 소수성 상호작용을 통해 단백질과 결합할 수 있다.
상기 탄닌산(Tannic acid, TA)은 조성물에서 보툴리눔 독소의 양에 따라, 및/또는 보툴리눔 독소 자체의 활성을 최대화하거나 부작용을 최소화하기 위한 적절한 양을 채택하여 사용할 수 있으며, 일 구체예로, 몇 가지 농도범위를 들면 10nM 내지 500μM 농도로 조성물에 포함될 수 있다. 또 다른 측면에서 탄닌산은 10nM 내지 480μM의 농도 범위, 10nM 내지 460μM의 농도 범위, 10nM 내지 440μM의 농도 범위, 10nM 내지 420μM의 농도 범위, 10nM 내지 400μM의 농도 범위, 10nM 내지 380μM의 농도 범위, 10nM 내지 360μM의 농도 범위, 10nM 내지 340μM의 농도 범위, 10nM 내지 320μM의 농도 범위, 10nM 내지 300μM의 농도 범위, 10nM 내지 280μM의 농도 범위, 10nM 내지 260μM의 농도 범위, 10nM 내지 240μM의 농도 범위, 10nM 내지 220μM의 농도 범위, 10nM 내지 200μM의 농도 범위, 10nM 내지 180μM의 농도 범위, 10nM 내지 160μM의 농도 범위, 10nM 내지 140μM의 농도 범위, 10nM 내지 120μM의 농도 범위, 10nM 내지 100μM의 농도 범위, 30nM 내지 500μM의 농도 범위, 50nM 내지 500μM의 농도 범위, 70nM 내지 500μM의 농도 범위, 90nM 내지 500μM의 농도 범위, 110nM 내지 500μM의 농도 범위, 130nM 내지 500μM의 농도 범위, 150nM 내지 500μM의 농도 범위, 170nM 내지 500μM의 농도 범위, 190nM 내지 500μM의 농도 범위, 210nM 내지 500μM의 농도 범위, 230nM 내지 500μM의 농도 범위 등일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 신경근육 관련 질환은,
근육간대경련(myoclonus), 반측성 안면경련(hemifacial spasm), 경련성 사경(spasmodic torticollis), 열항(anal fissure), 안검경련(blepharospasm), 안면 경련(facial spasm), 뇌성마비(cerebral palsy), 약물과용 두통(medication overuse headache), 만성 편두통(chronic migraine), 근육통(myalgia), 사시(strabismus), 측두하악장애(temporomandibular disorder), 신경 통증(neuralgia), 과민성 방광(overactive bladder), 절박성 요실금(urge urinary incontinence), 비염(rhinitis), 여드름(acne), 근긴장 이상증(dystonia), 다한증(hyperhidrosis) 및 성대 육아종(vocal fold granuloma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 탄닌산(Tannic acid, TA)은 보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox)의 활성을 1.5 내지 10배 개선시키며, 보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox)가 주사된 위치로부터 확산되는 것을 방지하여 보툴리눔 독소 확산에 의한 부작용을 저감시키는 역할을 수행한다.
본 발명의 다른 일 측면은,
보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox)를 포함하는 제1성분; 및
탄닌산(Tannic acid, TA)을 포함하는 제2성분;을 포함하는 신경근육 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 키트를 제공한다.
상기 제1성분에서 보툴리눔 독소는 5 내지 10,000 U/ml 농도 범위로 포함될 수 있으나, 특별히 해당 농도 범위에 제한되는 것은 아니고, 키트의 사용처에 따라 농도 범위를 적절히 조절할 수 있다. 일 구체예로, 몇 가지 농도범위를 들면 5 내지 8,000 U/ml의 농도 범위, 5 내지 6,000 U/ml의 농도 범위, 5 내지 4,000 U/ml의 농도 범위, 5 내지 2,000 U/ml의 농도 범위, 5 내지 1,000 U/ml의 농도 범위, 5 내지 900 U/ml의 농도 범위, 5 내지 800 U/ml의 농도 범위, 5 내지 700 U/ml의 농도 범위, 5 내지 600 U/ml의 농도 범위, 5 내지 500 U/ml의 농도 범위, 5 내지 400 U/ml의 농도 범위, 5 내지 300 U/ml의 농도 범위, 5 내지 200 U/ml의 농도 범위, 5 내지 100 U/ml의 농도 범위, 5 내지 90 U/ml의 농도 범위, 5 내지 80 U/ml의 농도 범위, 5 내지 70 U/ml의 농도 범위, 5 내지 60 U/ml의 농도 범위, 5 내지 50 U/ml의 농도 범위일 수 있다.
상기 제2성분에서 탄닌산(Tannic acid, TA)은 키트에서 보툴리눔 독소의 양에 따라, 및/또는 보툴리눔 독소 자체의 활성을 최대화하거나 부작용을 최소화하기 위한 적절한 양을 채택하여 사용할 수 있으며, 일 구체예로, 10nM 내지 500μM 농도로 제2성분에 포함될 수 있다. 또 다른 측면에서 탄닌산은 10nM 내지 480μM의 농도 범위, 10nM 내지 460μM의 농도 범위, 10nM 내지 440μM의 농도 범위, 10nM 내지 420μM의 농도 범위, 10nM 내지 400μM의 농도 범위, 10nM 내지 380μM의 농도 범위, 10nM 내지 360μM의 농도 범위, 10nM 내지 340μM의 농도 범위, 10nM 내지 320μM의 농도 범위, 10nM 내지 300μM의 농도 범위, 10nM 내지 280μM의 농도 범위, 10nM 내지 260μM의 농도 범위, 10nM 내지 240μM의 농도 범위, 10nM 내지 220μM의 농도 범위, 10nM 내지 200μM의 농도 범위, 10nM 내지 180μM의 농도 범위, 10nM 내지 160μM의 농도 범위, 10nM 내지 140μM의 농도 범위, 10nM 내지 120μM의 농도 범위, 10nM 내지 100μM의 농도 범위, 30nM 내지 500μM의 농도 범위, 50nM 내지 500μM의 농도 범위, 70nM 내지 500μM의 농도 범위, 90nM 내지 500μM의 농도 범위, 110nM 내지 500μM의 농도 범위, 130nM 내지 500μM의 농도 범위, 150nM 내지 500μM의 농도 범위, 170nM 내지 500μM의 농도 범위, 190nM 내지 500μM의 농도 범위, 210nM 내지 500μM의 농도 범위, 230nM 내지 500μM의 농도 범위 등일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 측면은,
보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox)에 탄닌산(Tannic acid, TA)을 처리하여 보툴리눔 독소를 탄닌산화하는 단계를 포함하는, 보툴리눔 독소의 활성을 개선시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일 측면은,
보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox)에 탄닌산(Tannic acid, TA)을 처리하여 보툴리눔 독소를 탄닌산화하는 단계를 포함하는, 보툴리눔 독소의 생체 내 확산에 따른 부작용을 저감시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은,
보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox)와 탄닌산(Tannic acid, TA)을 포함하는 탄닌화된 보툴리눔 독소 복합체를, 이를 필요로 하는 대상(subject)에게 약학적 유효량(effective amount)만큼 투여하는 단계를 포함하는, 신경근육 관련 질환의 치료방법을 제공한다. 이때, 상기 투여 방법은 경구/비경구 특별히 제한되는 것은 아니지만, 주사로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 일 측면은,
신경근육 관련 질환 치료용 약제(medicament)를 제조하기 위한, 보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox)와 탄닌산(Tannic acid, TA)을 포함하는 탄닌화된 보툴리눔 독소 복합체의 용도(Use)를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은,
보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox); 및
탄닌산(Tannic acid, TA)을 포함하는, 미용적 조성물을 제공한다.
이때, 상기 미용적 조성물의 미용 효과는,
미세 라인(fine line)의 외형(appearance) 감소, 주름의 외형 감소, 눈의 확장(widening), 구각 리프팅(lifting the corner of the mouth), 근육양의 감소 및 윗 입술로부터 전개되는 라인의 평탄화로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종, 또는 1종 이상일 수 있다.
마찬가지로, 상기 보툴리눔 독소는 5 내지 10,000 U/ml 농도 범위로 조성물에 포함될 수 있으나, 특별히 해당 농도 범위에 제한되는 것은 아니고, 미용적 조성물의 사용처에 따라 농도 범위를 적절히 조절할 수 있다. 일 구체예로, 몇 가지 농도범위를 들면 5 내지 8,000 U/ml의 농도 범위, 5 내지 6,000 U/ml의 농도 범위, 5 내지 4,000 U/ml의 농도 범위, 5 내지 2,000 U/ml의 농도 범위, 5 내지 1,000 U/ml의 농도 범위, 5 내지 900 U/ml의 농도 범위, 5 내지 800 U/ml의 농도 범위, 5 내지 700 U/ml의 농도 범위, 5 내지 600 U/ml의 농도 범위, 5 내지 500 U/ml의 농도 범위, 5 내지 400 U/ml의 농도 범위, 5 내지 300 U/ml의 농도 범위, 5 내지 200 U/ml의 농도 범위, 5 내지 100 U/ml의 농도 범위, 5 내지 90 U/ml의 농도 범위, 5 내지 80 U/ml의 농도 범위, 5 내지 70 U/ml의 농도 범위, 5 내지 60 U/ml의 농도 범위, 5 내지 50 U/ml의 농도 범위일 수 있다.
또한, 상기 탄닌산(Tannic acid, TA)은 조성물에서 보툴리눔 독소의 양에 따라, 및/또는 보툴리눔 독소 자체의 활성을 최대화하거나 부작용을 최소화하기 위한 적절한 양을 채택하여 사용할 수 있으며, 일 구체예로, 몇 가지 농도범위를 들면 10nM 내지 500μM 농도로 조성물에 포함될 수 있다. 또 다른 측면에서 탄닌산은 10nM 내지 480μM의 농도 범위, 10nM 내지 460μM의 농도 범위, 10nM 내지 440μM의 농도 범위, 10nM 내지 420μM의 농도 범위, 10nM 내지 400μM의 농도 범위, 10nM 내지 380μM의 농도 범위, 10nM 내지 360μM의 농도 범위, 10nM 내지 340μM의 농도 범위, 10nM 내지 320μM의 농도 범위, 10nM 내지 300μM의 농도 범위, 10nM 내지 280μM의 농도 범위, 10nM 내지 260μM의 농도 범위, 10nM 내지 240μM의 농도 범위, 10nM 내지 220μM의 농도 범위, 10nM 내지 200μM의 농도 범위, 10nM 내지 180μM의 농도 범위, 10nM 내지 160μM의 농도 범위, 10nM 내지 140μM의 농도 범위, 10nM 내지 120μM의 농도 범위, 10nM 내지 100μM의 농도 범위, 30nM 내지 500μM의 농도 범위, 50nM 내지 500μM의 농도 범위, 70nM 내지 500μM의 농도 범위, 90nM 내지 500μM의 농도 범위, 110nM 내지 500μM의 농도 범위, 130nM 내지 500μM의 농도 범위, 150nM 내지 500μM의 농도 범위, 170nM 내지 500μM의 농도 범위, 190nM 내지 500μM의 농도 범위, 210nM 내지 500μM의 농도 범위, 230nM 내지 500μM의 농도 범위 등일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 측면은,
보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox)와 탄닌산(Tannic acid, TA)을 포함하는 탄닌화된 보툴리눔 독소 복합체를, 이를 필요로 하는 대상(subject)에게 약학적 유효량(effective amount)만큼 투여하는 단계를 포함하는, 미용적 결함(cosmetic defect)의 치료방법을 제공한다. 이때, 상기 투여 방법은 경구/비경구 특별히 제한되는 것은 아니지만, 주사로 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 미관 결함(cosmetic defect)은 주름(wrinkle)일 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면은,
미용적 결함(cosmetic defect) 치료용 약제(medicament)를 제조하기 위한, 보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox)와 탄닌산(Tannic acid, TA)을 포함하는 탄닌화된 보툴리눔 독소 복합체의 용도(Use)를 제공한다.
본 발명의 다른 일 측면은,
탄닌산(Tannic acid, TA)을 유효성분으로 포함하는 보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox) 보조제를 제공한다.
상기 보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox) 보조제는,
근육간대경련(myoclonus), 반측성 안면경련(hemifacial spasm), 경련성 사경(spasmodic torticollis), 열항(anal fissure), 안검경련(blepharospasm), 안면 경련(facial spasm), 뇌성마비(cerebral palsy), 약물과용 두통(medication overuse headache), 만성 편두통(chronic migraine), 근육통(myalgia), 사시(strabismus), 측두하악장애(temporomandibular disorder), 신경 통증(neuralgia), 과민성 방광(overactive bladder), 절박성 요실금(urge urinary incontinence), 비염(rhinitis), 여드름(acne), 근긴장 이상증(dystonia), 다한증(hyperhidrosis) 및 성대 육아종(vocal fold granuloma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경근육 관련 질환의 예방 또는 치료용일 수 있다.
또한, 상기 보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox) 보조제는 미용을 위한 것일 수 있다. 상기 보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox) 보조제는, 보툴리눔 독소와 동시에 투여할 수 있다.
본 발명의 일 측면에서 제공하는 탄닌산을 포함하는 보툴리눔 독소 약제학적 조성물은 보툴리눔 신경 독소 자체의 활성이 개선될 뿐만 아니라, 탄닌산의 특성에 의해 주사된 곳에 보툴리눔 신경 독소가 머물고 혈액으로 확산되는 것이 방지되어, 결과적으로 보툴리눔 신경 독소 확산에 의한 종래 보톡스의 부작용을 최소화할 수 있는 효과가 있다. 특히, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 보툴리눔 독소를 유효성분으로 포함하여 고효율 표적화 치료 및 근육 주사된 부위로부터 보툴리눔 독소의 확산을 감소시켜, 부작용을 최소화할 수 있다. 이는 후술하는 실험예에 의해 직접적으로 뒷받침된다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실험예 1> 탄닌산(TA, tannic acid)과 단백질 결합을 통한, 탄닌화된 단백질의 세포내 유입(Tannylated protein endocytosis) 정도 평가
탄닌산이 단백질과 결합력이 높은 장점을 활용하여, 세포 내로 단백질을 전달할 수 있는지 확인하였다. 단백질의 경우 친수성이기 때문에 단백질이 세포 내로 전달되려면 수용체나 혹은 터널(channel)이 있어야 한다. 탄닌산의 경우 모든 단백질과 결합이 가능하기 때문에 탄닌산과 단백질의 결합하고 남은 free OH 그룹들이 세포막에 있는 다양한 단백질과도 결합이 가능하다. 세포는 계속해서 세포내 이입(Endocytosis)과 세포외 유출(Exocytosis)이 반복적으로 일어난다. 만약, 탄닌산과 결합된 단백질이 세포막에 결합하면 세포내 이입(Endocytosis)을 통해 세포 내로 유입이 가능하다. 본 출원인은 탄닌산과 단백질의 혼합물이 세포 내로 유입되는지를 확인하였다. 실험은 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포에 탄닌산화된 단백질을 처리하고 4시간 뒤에 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)을 처리한 군과 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)에 탄닌산을 결합한 군에서 세포 내 유입 정도의 차이를 비교하였다.
그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1은 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포에 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)만 처리하거나, 형광 단백질 및 탄닌산을 혼합하여 제조되는 탄닌산화된 형광 단백질을 처리할 경우, 형광 단백질의 세포내 유입 정도를 비교 평가한 결과를 나타내는 사진이다.
도 1에 나타난 바와 같이,
CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포에 형광 단백질만 처리한 경우 형광 단백질이 세포 내로 전혀 유입되지 않고 세포막 밖에 분포하고 있음이 확인되었다(도 1의 위 그림). 반면, 형광 단백질 및 탄닌산을 혼합하여 제조되는 탄닌산화된 형광 단백질을 처리할 경우 형광 단백질이 세포 내로 유입되어 세포 핵과 결합되어 있음이 확인되었다(도 1의 아래 그림).
이로부터, 탄닌산이 단백질과 결합하여, 단백질을 세포 내로 용이하게 전달할 수 있음을 알 수 있다.
<실험예 2> 탄닌산이 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BTX) 자체의 활성을 현저히 증가시킬 수 있는지에 대한 평가 (보톡스 약효 개선효과 확인)
보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BTX)와 탄닌산을 혼합하여 보툴리눔 독소를 탄닌산화할 경우, 보툴리눔 독소 자체의 활성이 증가하는지 평가하기 위하여 하기와 같은 전기생리학적 측정방법(patch-clamp CMAP)을 수행하였다.
전기생리학적 측정방법 및 결과는 다음과 같다.
(1) 랫 대뇌피질 뉴런 배양
A. SD rat 임신 18일 째 CO2 gas로 안락사 후, 태반에서 18일 배아의 뇌에서 대뇌 영역을 분리한다.
B. 분리한 뇌-대뇌 조직을 5 mL 소화 용액(digestion solution), 구체적으로, 파파인(papain), Dnase I 및 EBSS(Earle's Balanced Salt Solution)으로 37 에서 35분 동안 반응시킨다.
C. 반응시킨 소화된 세포 용액(digested cell solution)의 상층액에, 5 mL blocking solution (FBS + Ovomucoid protease inhibitor + Dnase I + EBSS)을 추가하여 300g 3분 동안 원심분리를 수행한다.
D. 상기 상층액을 버리고, 세포 펠렛(pellet)을 5 mL blocking solution으로 suspend 한 후 300g 3분 동안 원심분리를 수행한다.
E. 상층액을 버리고, 세포 펠릿(pellet)을 5 mL seeding solution (FBS + B-27 + Glutamax + penicillin/streptomycin + Neurobasal media)으로 suspending 하였다.
F. Poly-D-lysine 코팅된 12 mm 커버슬립(coverslip) 위에 2.0Х105 세포 / 100 ㎕로 시딩(seeding) 하였다.
(Poly-D-lysine 코팅된 Axion MEA 플레이트에 1.5Х105 세포 / 100 ㎕ 시딩)
G. 2시간 후, 500 ㎕ seeding solution을 추가하였다.
H. 2 내지 3일마다 feeding solution (B-27 + Glutamax + Neurobasal media) 배양액으로 교환하였다.
(2) 처리조건
A. 보툴리눔 신경독소 A형 (Botulinum Neurotoxin type A, BoNT/A, 휴젤사의 보툴렉스) 50 units을 용해시킨 100 ㎕ PBS 용액 [500 U/mL]을 준비하였다.
B. 탄닌산(TA, tannic acid)을 PBS 용액에 25 μM 농도로 녹여 준비하였다.
C. 50 ㎕ BoNT/A와 5 ㎕ TA를 섞고 상온에서 5분 동안 반응하였다.
D. 최종 배양액이 500 ㎕이 되도록, 반응시킨 BoNT/A와 TA 용액을 처리한다.
(3) 전기생리학적 측정방법(patch-clamp CMAP)을 활용한 mIPSC (mini inhibitory post synaptic current) 기록
유리 파이펫의 용액조건 (mM): 135 CsCl, 10 HEPES, 1 EGTA, 1 Na-GTP, 4 및 10 QX-314 (pH 7.4, CsOH로 조정). 유리 파이펫 끝의 저항은 4 에서 5 Ω정도가 측정되게 만든다. 전기생리학적 기록을 수행할 때 뉴런을 보관하는 용액조성은 (mM): 140 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 글루코스 (pH 7.4, NaOH로 조정)이다. 자발적인 억제성을 기록하기 위해서는 자발적인(Spontaneous) AMPA와 NMDA 수용체 억제제인 CNQX 및 APV을 뉴런을 보관하는 용액에 넣어준다. 전기적 기록은 Axon Patch-Clamp (Molecular Devices) 장비를 사용하고, 뉴런의 막전압을 -70mV로 고정하여 mIPSC 기록한다. 분석은 Clampfit 10 (Molecular Devices), Origin8 software (Mocrocal Inc)를 사용한다. 통계분석은 Student's t-test (*P□<□0.01)로 한다.
(4) Axion MEA 측정방법
Axion MEA는 뉴런 배양액에 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BTX)를 처리하기 전에 버스트 주파수(Burst Frequency)와 네트워크 버스트 주파수(Network Burst Frequency)를 기록하며, 보툴리눔 독소를 처리하고 24시간 후에 다시 버스트 주파수(Burst Frequency)와 네트워크 버스트 주파수(Network Burst Frequency)를 기록하여 처리 전과 처리 후를 비교한다.
(5) 실험결과
실험결과를 도 2 내지 도 4에 나타내었다.
도 2는 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BTX)를 단독으로 처리한 군(도면에서 BoNT 50U에 해당함)과, 탄닌산(TA, tannic acid)을 처리함에 따라 탄닌산화된 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BTX)를 처리한 군(도면에서 BoNT 50U / TA 250 nM에 해당함)의 patch-clamp 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BTX)를 단독으로 처리한 군(도면에서 BoNT Treatment에 해당함)과, 탄닌산(TA, tannic acid)을 처리함에 따라 탄닌산화된 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BTX)를 처리한 군(도면에서 BoNT/TA Treatment에 해당함)의 상기 patch-clamp 결과로부터, 보툴리눔 독소의 처리 농도별 LogIC50 값을 도출한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2 및 도 3에 나타난 바와 같이,
보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BTX)를 단독으로 처리한 실험군보다, 탄닌산(TA, tannic acid)을 처리함에 따라 탄닌산화된 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BTX)를 처리한 실험군에서, 보툴리눔 독소 자체의 효과가 약 1.8배 더욱 높게 나오는 것을 알 수 있다. LogIC50 값이 작을수록 톡신의 효과가 큰 것이다. 또한, 도 3에서 x축의 0.5, 1.0, 1.5는, 보툴리눔 독소의 농도 U/ml를 의미한다.
도 4는 Axion MEA 데이터로부터, 탄닌산을 단독으로 처리한 군(도면에서 TA[250]에 해당함), 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BTX)를 단독으로 처리한 군(도면에서 B[5], B[10], B[25]에 해당함), 탄닌산(TA, tannic acid)을 처리함에 따라 탄닌산화된 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BTX)를 처리한 군(도면에서 B-T[5], B-T[10], B-T[25]에 해당함)의 버스트 주파수(Burst Frequency)와 네트워크 버스트 주파수(Network Burst Frequency)를 기록한 결과를 나타내는 도면이다. TA의 경우 농도 단위가 nM이고, B의 경우 농도 단위가 U(unit)이다. B-T에서 [ ] 안의 수치는 B의 농도이며, TA 농도는 250 nM로 고정하였다.
도 4에 나타난 바와 같이,
Axion MEA를 활용하여 기록한 결과인 버스트 주파수(Burst Frequency)와 네트워크 버스트 주파수(Network Burst Frequency)의 발생 빈도가,
탄닌산 또는 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BTX)만 처리한 군보다, 탄닌산화된 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BTX)를 처리한 군에서 상대적으로 현저하게 감소하는 것을 알 수 있다.
참고로, 도 4에서, B[5]는 보툴리눔 독소의 농도를 5 U/ml만큼 사용한 것이고, B[10]는 보툴리눔 독소의 농도를 10 U/ml만큼 사용한 것이고, B[25]는 보툴리눔 독소의 농도를 25 U/ml만큼 사용한 것을 의미한다.
상기 전기생리학적 결과를 정리하면,
보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BTX)에 의한 신경전달물질(즉, 아세틸콜린)의 분비가, 탄닌산화된 보툴리눔 독소를 처리한 실험군에서 현저하게 감소한 것을 의미하며, 이는 결과적으로 탄닌산에 의해 보툴리눔 독소 자체의 활성이 현저히 상승하였음을 의미한다.
<실험예 3> 탄닌산화된 보툴리눔 독소를 피부 내 주사할 경우 부작용 저감효과 평가 (보톡스 부작용 저감효과 확인)
보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BTX)와 탄닌산을 혼합하여 보툴리눔 독소를 탄닌산화할 경우 보툴리눔 독소 자체의 활성이 증가할 뿐만 아니라, 종래 보툴리눔 독소를 피부 내 주사할 경우 발생하던 부작용도 저감될 수 있는지에 대해 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적인 실험방법 및 결과는 다음과 같다.
(1) 랫 대뇌피질 뉴런 배양
사용한 장비, 처리농도, 자극조건, 마우스 자료는 다음과 같으며, 실험과정을 도 5에 나타내었다. 도 5는 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BTX)와 탄닌산을 혼합하여 보툴리눔 독소를 탄닌산화할 경우, 종래 보툴리눔 독소를 피부 내 주사할 경우 발생하던 부작용도 저감될 수 있는지에 대해 in vivo 실험을 통해 평가할 때의 실험과정을 나타내는 도면이다.
A. 장비: PowerLab 26T, needle electrode, LabChart software
B. BoNT/A [100 unit/mL], TA [100 nM] 농도로 준비 후 1:1 부피비로 섞어 최종 BoNT/A [50 unit/mL], TA [50nM] 농도로 반응시켰다.
C. ICR 마우스 7주령 (35±3g)을 호흡 마취시킨 후, 꼬리 root로부터 2 ㎝, 5 ㎝ 부위에 70V / 4mA / 0.1ms에 해당하는 전기 자극을 주고, 좌/우 뒷다리의 비복근(gastrocnemius) 상/하단에 전극을 꽂아 10회 가량 반응을 측정하였다. 이때 tail root에 ground reference 전극을 위치시켰다.
D. 측정 후 비복근(gastrocnemius)에 BoNT/A 또는 BoNT/A + TA 혼합액을 10 ㎕ 만큼 주사하였다.
(2) 실험결과
실험결과를 도 6에 나타내었다.
도 6은 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BTX)를 단독으로 주사한 군(도면에서 BoNT/A only에 해당함)과, 보툴리눔 독소 및 탄닌산 혼합액(도면에서 BoNT/A + TA에 해당함)을 주사한 군에서,
주사한 위치와 주사하지 않은 위치(Vehicle)에서의 CMAP 전기적 파형을 측정하여, 보툴리눔 독소가 주사한 위치로부터 혈관을 통해 확장하여 부작용을 유발할 가능성이 있는지 비교한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6에 나타난 바와 같이,
보툴리눔 신경 독소만 마우스에 주사한 경우(좌측 그래프), 주사한 위치와 주사하지 않은 위치(Vehicle)에서의 CMAP 전기적 파형이 모두 감소하여,
이로부터 보툴리눔 신경 독소가 주사한 위치로부터 혈관을 통해 확산하여 의도치 않은 곳에서도 보툴리눔 신경 독소가 효과를 내어 부작용을 유발할 수 있음을 알 수 있다.
반면, 보툴리눔 신경 독소와 탄닌산을 포함하는 혼합액(조성물)을 마우스에 주사한 경우(우측 그래프), 주사한 위치에서는 CMAP 전기적 파형이 감소하나, 주사하지 않은 위치(Vehicle)에서는 CMAP 전기적 파형이 감소하지 않으며, 이로부터 탄닌화된 보툴리눔 신경 독소는, 단백질과 결합력이 높은 탄닌산의 특성에 의해 주사된 곳에 잘 머물고 혈액으로 확산되는 것이 방지되어, 결과적으로 보툴리눔 신경 독소 확산에 의한 종래 보톡스의 부작용을 최소화할 수 있는 효과가 나타남을 알 수 있다.
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.
제제예 1. 약학적 조성물
1.1 주사제의 제조
탄닌화된 보툴리눔 독소 복합체 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4·2H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
1.2 액제의 제조
탄닌화된 보툴리눔 독소 복합체 10 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
본 발명의 일 측면에서 제공하는 탄닌산을 포함하는 보툴리눔 독소 약제학적 조성물은 보툴리눔 신경 독소 자체의 활성이 개선될 뿐만 아니라, 탄닌산의 특성에 의해 주사된 곳에 보툴리눔 신경 독소가 머물고 혈액으로 확산되는 것이 방지되어, 결과적으로 보툴리눔 신경 독소 확산에 의한 종래 보톡스의 부작용을 최소화하는데 유용하다.

Claims (15)

  1. 보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox)와 탄닌산(Tannic acid, TA)을 포함하는, 탄닌화된 보툴리눔 독소 복합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 탄닌산은 보툴리눔 독소에 결합하여 탄닌화된 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소 복합체.
  3. 보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox); 및
    탄닌산(Tannic acid, TA)을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 탄닌산은 보툴리눔 독소에 결합하여 탄닌화된 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 신경근육 관련 질환의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 신경근육 관련 질환은,
    근육간대경련(myoclonus), 반측성 안면경련(hemifacial spasm), 경련성 사경(spasmodic torticollis), 열항(anal fissure), 안검경련(blepharospasm), 안면 경련(facial spasm), 뇌성마비(cerebral palsy), 약물과용 두통(medication overuse headache), 만성 편두통(chronic migraine), 근육통(myalgia), 사시(strabismus), 측두하악장애(temporomandibular disorder), 신경 통증(neuralgia), 과민성 방광(overactive bladder), 절박성 요실금(urge urinary incontinence), 비염(rhinitis), 여드름(acne), 근긴장 이상증(dystonia), 다한증(hyperhidrosis) 및 성대 육아종(vocal fold granuloma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  7. 보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox)와 탄닌산(Tannic acid, TA)을 포함하는 탄닌화된 보툴리눔 독소 복합체를, 이를 필요로 하는 대상(subject)에게 약학적 유효량(effective amount)만큼 투여하는 단계를 포함하는, 신경근육 관련 질환의 치료방법.
  8. 신경근육 관련 질환 치료용 약제(medicament)를 제조하기 위한, 보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox)와 탄닌산(Tannic acid, TA)을 포함하는 탄닌화된 보툴리눔 독소 복합체의 용도(Use).
  9. 보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox); 및
    탄닌산(Tannic acid, TA)을 유효성분으로 포함하는 미용적 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 미용적 조성물의 미용 효과는,
    미세 라인(fine line)의 외형(appearance) 감소, 주름의 외형 감소, 눈의 확장(widening), 구각 리프팅(lifting the corner of the mouth), 근육양의 감소 및 윗 입술로부터 전개되는 라인의 평탄화로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 미용적 조성물.
  11. 보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox)와 탄닌산(Tannic acid, TA)을 포함하는 탄닌화된 보툴리눔 독소 복합체를, 이를 필요로 하는 대상(subject)에게 약학적 유효량(effective amount)만큼 투여하는 단계를 포함하는, 미용적 결함(cosmetic defect)의 치료방법.
  12. 미용적 결함(cosmetic defect) 치료용 약제(medicament)를 제조하기 위한, 보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox)와 탄닌산(Tannic acid, TA)을 포함하는 탄닌화된 보툴리눔 독소 복합체의 용도(Use).
  13. 탄닌산(Tannic acid, TA)을 유효성분으로 포함하는 보툴리눔 독소(Botulinum toxin, Botox) 보조제.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 보툴리눔 독소 보조제는,
    근육간대경련(myoclonus), 반측성 안면경련(hemifacial spasm), 경련성 사경(spasmodic torticollis), 열항(anal fissure), 안검경련(blepharospasm), 안면 경련(facial spasm), 뇌성마비(cerebral palsy), 약물과용 두통(medication overuse headache), 만성 편두통(chronic migraine), 근육통(myalgia), 사시(strabismus), 측두하악장애(temporomandibular disorder), 신경 통증(neuralgia), 과민성 방광(overactive bladder), 절박성 요실금(urge urinary incontinence), 비염(rhinitis), 여드름(acne), 근긴장 이상증(dystonia), 다한증(hyperhidrosis) 및 성대 육아종(vocal fold granuloma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소 보조제.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 보툴리눔 독소 보조제는 미용을 위한 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소 보조제.
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