WO2023055011A1 - 항노화 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents
항노화 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a peptide having anti-aging activity and a composition for inhibiting skin aging or regenerating skin containing the peptide as an active ingredient.
- Aging of skin cells may occur due to various causes, and wrinkles may occur due to aging of skin cells. It can be divided into chronological aging (endogenous aging), which is natural aging that occurs over time according to biological processes, and photoaging (photogenic aging), in which degenerative changes that occur in areas exposed to sunlight and the chronological aging are combined. can When the expression or activity of various factors related to cell growth is inhibited, natural cell aging may occur, and photoaging of skin cells may be progressed by light with a wavelength of 280 nm to 400 nm included in sunlight.
- chronological aging endogenous aging
- photoaging photogenic aging
- UVB ultraviolet rays
- the accumulation of ROS and free radicals in skin cells is promoted, and the radicals stimulate the intracellular signal transduction system to induce oxidative stress in biomolecules such as DNA, proteins, and lipids, thereby inducing oxidative stress in skin tissues. of damage may occur.
- MMP matrix metalloproteinase
- the aging of cells caused by irradiation of ultraviolet rays included in sunlight not only causes cosmetic problems by damaging the skin, but also causes cancer due to cell DNA damage, damage to the central and peripheral nervous system, and immunity. It can cause system destruction, reproductive organ disorder, infant and toddler development disorder, and skin diseases such as goat acne, which can cause serious health problems, and a solution to them is urgently needed.
- Non-Patent Document 1 S Edgar et al., Effects of collagen-derived bioactive peptides and natural antioxidant compounds on proliferation and matrix protein synthesis by cultured normal human dermal fibroblasts, Scientific Reports, 2018; 8:10474
- One object of the present invention is to provide a peptide having anti-aging activity.
- Another object of the present invention is to provide a composition for inhibiting skin aging or regenerating skin containing the above-described peptide having the activity as an active ingredient.
- Another object of the present invention is to provide a cosmetic composition for inhibiting skin aging or regenerating skin containing the above-described peptide having the activity as an active ingredient.
- Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating photoaging comprising the above-described peptide having the activity as an active ingredient.
- one aspect of the present invention provides a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
- Another aspect of the present invention provides a composition for inhibiting skin aging or regenerating skin containing the peptide as an active ingredient.
- Another aspect of the present invention provides a cosmetic composition for inhibiting skin aging or regenerating skin containing the peptide as an active ingredient.
- Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating photoaging comprising the peptide as an active ingredient.
- the peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 according to the present invention has anti-aging activity, it can be used as a raw material for cosmetics for the purpose of suppressing skin aging or regenerating the skin or pharmaceuticals for preventing, improving or treating photoaging.
- Figure 1a is a diagram confirming the expression of collagen, fibronectin and elastin when the peptide of the present invention is treated with fibroblasts: Con is an untreated group, bFGF is a positive control group.
- Figure 1b is a graph showing the effect on the expression of collagen when the peptide of the present invention is treated with fibroblasts: Con is an untreated group, bFGF is a positive control group.
- Figure 1c is a graph showing the effect on the expression of fibronectin when the peptide of the present invention is treated with fibroblasts: Con is an untreated group, and bFGF is a positive control group.
- Figure 1d is a graph showing the effect on the expression of elastin when the peptide of the present invention is treated with fibroblasts: Con is an untreated group, bFGF is a positive control group.
- Figure 2a is a graph showing the effect on the secretion of collagen and hyaluronic acid protein when the peptide of the present invention is treated with fibroblasts: Con is an untreated group, TGF-b1 is a positive control group.
- Figure 2b is a graph showing the effect on the secretion of collagen and hyaluronic acid protein when the peptide of the present invention is treated with keratinocytes: Con is an untreated group, and TGF-b1 is a positive control group.
- Figure 3a is a diagram confirming the expression of SIRT1 and AQP3 when the peptide of the present invention is treated in keratinocytes: Con is an untreated group, EGF is a positive control group.
- Figure 3b is a graph showing the effect on the expression of SIRT1 when the peptide of the present invention is treated in keratinocytes: Con is untreated, EGF is a positive control.
- Figure 3c is a graph showing the effect on the expression of AQP3 when the peptide of the present invention is treated with keratinocytes: Con is an untreated group, EGF is a positive control group.
- Figure 4 is a graph showing the effect of the peptides of the present invention on the intracellular active oxygen (ROS) level increased by ultraviolet (UV) irradiation in keratinocytes: Con is UV non-irradiated group, NC is UV irradiated group, 10 ⁇ M , 50 ⁇ M, 100 ⁇ M group treated with UV irradiation and the peptide of the present invention by concentration, Trolox was treated with UV irradiation and Trolox positive control group.
- ROS ultraviolet
- FIG. 5a is a diagram confirming the expression of SIRT1 and AQP3 that the peptides of the present invention are reduced by ultraviolet (UV) irradiation in keratinocytes:
- Con is the UV non-irradiated group
- NC is the UV irradiated group
- 10 ⁇ M is the UV irradiated group
- 10 ⁇ M is the UV irradiated group
- 50 ⁇ M 100 ⁇ M is the UV light
- Figure 5b is a graph showing the effect of the peptide of the present invention on the expression of SIRT1 reduced by ultraviolet (UV) irradiation in keratinocytes: Con is the UV non-irradiated group, NC is the UV irradiated group, 10 ⁇ M, 50 ⁇ M, 100 ⁇ M are A positive control group treated with UV irradiation and N-acetylcysteine for NaC.
- Figure 5c is a graph showing the effect of the peptides of the present invention on the expression of AQP3 reduced by ultraviolet (UV) irradiation in keratinocytes: Con is the UV non-irradiated group, NC is the UV irradiated group, 10 ⁇ M, 50 ⁇ M, 100 ⁇ M are A positive control group treated with UV irradiation and N-acetylcysteine for NaC.
- Con is the UV non-irradiated group
- NC the UV irradiated group
- 10 ⁇ M, 50 ⁇ M, 100 ⁇ M are A positive control group treated with UV irradiation and N-acetylcysteine for NaC.
- FIG. 6a is a diagram confirming the expression of Cleaved PARP-1 and Cleaved Caspase-3, which the peptides of the present invention are increased by ultraviolet (UV) irradiation in keratinocytes:
- Con is UV non-irradiated group
- NC is UV irradiated group
- 10 ⁇ M is UV irradiated group
- 50 ⁇ M is concentration NaC positive control group treated with UV irradiation and N-acetylcysteine.
- Figure 6b is a graph showing the effect of the peptide of the present invention on the expression of cleaved PARP-1 increased by ultraviolet (UV) irradiation in keratinocytes: Con is the UV non-irradiated group, NC is the UV irradiated group, 10 ⁇ M, 50 ⁇ M , 100 ⁇ M was irradiated with ultraviolet light and treated with the peptide of the present invention at each concentration. NaC was irradiated with ultraviolet light and a positive control group treated with N-acetylcysteine.
- Figure 6c is a graph showing the effect of the peptides of the present invention on the expression of Cleaved Caspase-3, which is increased by ultraviolet (UV) irradiation in keratinocytes:
- Con is the UV irradiation group
- NC is the UV irradiation group
- 10 ⁇ M was irradiated with ultraviolet light and treated with the peptide of the present invention at each concentration.
- NaC was irradiated with ultraviolet light and a positive control group treated with N-acetylcysteine.
- One aspect of the present invention provides a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
- the term 'peptide' refers to a linear molecule composed of amino acid residues, and specifically, the peptide of the present invention may include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
- the 'peptide' may be amino acid variants or fragments having a different sequence by deletion, insertion, substitution, or combination thereof within the range that does not affect the function. Amino acid exchanges that do not entirely alter the activity of the peptide are known in the art. In some cases, the peptide may be modified by phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, and the like. Accordingly, the peptide of the present invention includes a peptide having an amino acid sequence substantially identical to that of the peptide including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and variants or active fragments thereof.
- the substantially identical protein refers to at least 75%, preferably at least 80%, such as at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It means an amino acid sequence having, but is not limited thereto, and is included in the scope of the present invention if it has 75% or more amino acid sequence homology and has the same activity.
- the peptide of the present invention may additionally include a targeting sequence, a tag (tag), a labeled residue, an amino acid sequence prepared for a specific purpose to increase half-life or peptide stability.
- enhanced pharmacological properties half-life, uptake, potency, potency, etc.
- altered specificity eg broad biological activity spectrum
- reduced antigenicity N It may be modified at the -terminus or at the C-terminus.
- the 'stability' is used to mean not only in vivo stability that protects the peptide of the present invention from attack by proteolytic enzymes in vivo , but also storage stability (eg, storage stability at room temperature).
- the N-terminal modification is an acetyl group, a fluorenylmethoxycarbonyl group, a formyl group, a palmitoyl group, a myristyl group at the N-terminus of the peptide ), a stearyl group, and polyethylene glycol (PEG), but may be bound to a protecting group selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
- the C-terminal modification may be a combination of a hydroxyl group (hydroxyl group, -OH), an amino group (amino group, -NH 2 ), azide (-NHNH 2 ), etc. to the C-terminus of the peptide, but is limited thereto It is not.
- Synthesis of the peptides of the present invention can be performed using, for example, equipment or genetic engineering techniques.
- a desired peptide can be synthesized using an Fmoc solid-phase method in an automatic peptide synthesizer.
- a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention was synthesized and identified using the Fmoc solid-phase method, and selected by verifying the efficacy of the identified peptide It became.
- the effect of increasing the expression level of ECM components and skin barrier enhancing factors, the effect of reducing the level of active oxygen increased by UV irradiation, and the skin barrier enhancing gene reduced by UV light was selected through validation of the effect of restoring the expression of and suppressing the expression of apoptosis inducing factors increased by UV light.
- the peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention has skin aging inhibitory activity or skin regeneration activity.
- compositions for inhibiting skin aging or regenerating skin comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
- the “skin aging” may be aging that occurs naturally in cells over time or may be photoaging caused by sunlight.
- the aging may be induced by intracellular oxidative stress that may occur due to various causes, and thus cell growth inhibition or apoptosis may proceed, and synthesis of various fiber proteins constituting it in skin cells may be inhibited. and the expression of degrading enzymes can be increased.
- expression of genes such as Col1a1, fibronectin, and elastin are suppressed in skin cells by UV irradiation, which can cause photoaging and wrinkles in skin cells.
- the "skin regeneration” may promote the growth of skin cells and enhance viability to prevent cell damage from external and/or internal stimuli, improve skin wrinkles, enhance elasticity, and strengthen the skin barrier. Regeneration includes the meaning of preventing skin damage caused by the external environment, for example, pigmentation, or improving and/or treating skin photoaging.
- the composition for inhibiting skin aging or regenerating skin enhances resistance to cell damage caused by aging or external stimuli.
- the “external stimulus” may be a physical stimulus, a chemical stimulus by application of cosmetics or other external agents, a stimulus by ultraviolet rays, or a stimulus by infrared rays.
- the damaged cells may be skin fibroblasts or keratinocytes.
- the peptide of the present invention can induce an increase in the expression of a fiber protein synthesis gene in skin cells. Therefore, the peptide can improve wrinkles and elasticity of the skin by increasing the synthesis of fibrous proteins, increase the resistance and viability of skin cells from external stimuli by improving the skin barrier, and reduce external stimuli or aging. It can enhance the regeneration of damaged skin.
- the skin aging inhibition and skin regeneration effects of the peptides of the present invention can be confirmed. there is.
- the composition for inhibiting skin aging or regenerating skin may increase the expression of collagen, fibronectin, or elastin in skin cells.
- the composition for inhibiting skin aging or regenerating skin may increase the expression of skin barrier enhancing factors SIRT1 or AQP3.
- the composition for inhibiting skin aging or regenerating skin can inhibit the generation of active oxygen (ROS) by ultraviolet rays.
- ROS active oxygen
- the composition for inhibiting skin aging or regenerating skin may increase the expression of SIRT1 or AQP3 reduced by ultraviolet rays.
- the composition for inhibiting skin aging or regenerating skin can suppress the expression of Cleaved PART-1 or Cleaved Caspase-3 increased by ultraviolet rays.
- the peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention was shown to increase the expression of Col1a1, fibronectin and elastin in fibroblasts and keratinocytes.
- the peptide was shown to increase the expression of skin barrier enhancing genes such as SIRT1 and AQP3 in keratinocytes.
- the peptide has been shown to reduce intracellular reactive oxygen species (ROS) levels in keratinocytes damaged by ultraviolet rays.
- ROS reactive oxygen species
- the peptide was shown to increase the expression of skin barrier enhancing genes such as SIRT1 and AQP3 in keratinocytes damaged by ultraviolet rays.
- the peptide was found to reduce the expression of apoptotic-inducing factors such as Cleaved PARP-1, Bax, and Cleaved Caspase-3 in keratinocytes damaged by ultraviolet rays.
- apoptotic-inducing factors such as Cleaved PARP-1, Bax, and Cleaved Caspase-3 in keratinocytes damaged by ultraviolet rays.
- the peptide of the present invention has skin aging inhibition or skin regeneration activity by regulating the expression of genes related to the aging of skin cells, and the peptide of the present invention is a composition for inhibiting skin aging or regenerating skin. It can be usefully used as an active ingredient.
- Another aspect of the present invention provides a cosmetic composition for inhibiting skin aging or regenerating skin, comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
- the skin aging inhibition or skin regeneration may be prevention or improvement of skin wrinkles, enhancement of skin elasticity, reinforcement of skin barrier, prevention of pigmentation or improvement of skin photoaging.
- the peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is the same as the peptide described in the 'composition for inhibiting skin aging or regenerating skin', and the specific description uses the information described above, and hereinafter, inhibiting skin aging or regenerating skin Only the configuration specific to the cosmetic composition for use will be described.
- the cosmetic composition may be prepared in any formulation commonly prepared in the art, for example, a solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, powder, soap, surfactant-containing cleansing, It may be formulated as an oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation and spray, but is not limited thereto.
- the cosmetic composition includes softening lotion, nutrient lotion, nutrient cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray, powder, hair tonic, hair cream, hair lotion, hair shampoo, and hair rinse. , hair conditioners, hair sprays, hair aerosols, pomades, solutions such as gels, sol gels, emulsions, oils, waxes, aerosols, etc., but may be prepared in various forms, but are not limited thereto.
- the cosmetic composition of the present invention may include other additives such as excipients and carriers, and it is possible to apply and blend ordinary ingredients formulated in general skin cosmetics as needed.
- the formulation of the cosmetic composition is a paste, cream or gel, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracanth, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or oxide as a carrier component Zinc and the like may be used.
- lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component, especially in the case of a spray, additionally chlorofluorohydrocarbon , propellants such as, but not limited to, propane/butane or dimethyl ether.
- a solvent, solubilizing agent or emulsifying agent may be used as a carrier component, for example, water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl Benzoate, propylene glycol, 1,3-butyl glycol oil, glycerol aliphatic esters, polyethylene glycol, or sorbitan fatty acid esters may be used.
- the form of the formulation of the cosmetic composition is a suspension
- a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol, an ethoxylated isostearyl alcohol, a suspending agent such as polyoxyethyl sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester , microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracanth, and the like
- a suspending agent such as polyoxyethyl sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester
- microcrystalline cellulose aluminum metahydroxide
- bentonite agar or tracanth, and the like
- the formulation of the cosmetic composition is surfactant-containing cleansing
- carrier components aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyl taurate, sarcosinate, fatty acid Amide ether sulfates, alkylamidobetaines, fatty alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives, or ethoxylated glycerol fatty acid esters may be used.
- base components for forming the shampoo such as a thickener, a surfactant, a viscosity modifier, a moisturizer, a pH modifier, a preservative, and an essential oil
- a thickener such as a thickener, a surfactant, a viscosity modifier, a moisturizer, a pH modifier, a preservative, and an essential oil
- CDE may be used as the thickener
- LES an anionic surfactant, and coco betaine
- an amphoteric surfactant may be used as the surfactant
- polyquater may be used as the viscosity modifier.
- Glycerin may be used, and citric acid and sodium hydroxide may be used as the pH adjusting agent.
- Grapefruit extract and the like may be used as the preservative, and in addition, essential oils such as cedarwood, peppermint, and rosemary, and silk amino acids, pentaol, or vitamin E may be added.
- ingredients included in the cosmetic composition are components commonly used in cosmetic compositions, for example, antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, and flavorings, in addition to the peptide and carrier component of the present invention as active ingredients. It may further include an auxiliary agent and the like, but is not limited thereto.
- Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating photoaging comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
- the peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is the same as the peptide described in the 'composition for inhibiting skin aging or regenerating skin', the specific description is the same as that described above, and hereinafter, pharmaceuticals for preventing or treating photoaging Only the configuration specific to the red composition will be described.
- the "photoaging” refers to a phenomenon in which skin damage, pigmentation, wrinkle formation, or skin elasticity is reduced upon repeated or long-term exposure to sunlight.
- prevention refers to all activities that suppress or delay the occurrence, spread, and recurrence of photoaging by the peptide of the present invention or a composition containing the same.
- improvement or treatment refers to any action that beneficially changes in relation to photoaging, such as delaying, stopping, or reversing the progress of photoaging by the peptide of the present invention or a composition containing the same.
- the peptide inhibits the generation and accumulation of active oxygen in keratinocytes damaged by ultraviolet rays, increases the expression of skin barrier enhancing factors such as SIRT1 and AQP3, Cleaved PARP-1 and Cleaved Photoaging can be prevented, ameliorated or treated by inhibiting the expression of apoptosis-inducing factors such as caspase-3.
- the pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
- a pharmaceutically acceptable carrier may further include, for example, a carrier for oral administration or a carrier for parenteral administration.
- Carriers for oral administration may include lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid and the like.
- carriers for parenteral administration may include water, suitable oil, saline, aqueous glucose and glycol, and the like.
- stabilizers and preservatives may be further included. Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium bisulfite, sodium sulfite or ascorbic acid.
- Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol.
- Suitable pharmaceutically acceptable carriers may be referenced as described in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
- the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to mammals including humans by any method.
- it can be administered orally or parenterally, and parenteral administration methods include, but are not limited to, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal , intranasal, enteral, topical, sublingual or rectal administration.
- the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated into a preparation for oral administration or parenteral administration according to the administration route as described above, and the preparation for parenteral administration is specifically formulated in the form of an injection preparation or an external preparation. can be used
- the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
- 'pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type, severity, activity of the drug, It may be determined according to factors including sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field.
- the pharmaceutical composition may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered simultaneously with conventional therapeutic agents, separately or sequentially, and may be administered single or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
- the effective amount of the pharmaceutical composition may vary depending on the patient's age, sex, condition, body weight, absorption rate, inactivity rate, excretion rate, disease type, concomitant drug of the active ingredient in the body, route of administration, severity, gender, It may increase or decrease according to body weight, age, etc., and for example, about 0.0001 ⁇ g to 500 mg, preferably 0.01 ⁇ g to 100 mg of the pharmaceutical composition per 1 kg of patient body weight per day may be administered.
- the peptides of the present invention are excellent in suppressing skin aging and regenerating the skin, they can be used as raw materials for cosmetics for the purpose of suppressing skin aging or regenerating the skin, or pharmaceuticals for preventing, improving or treating photoaging. there is.
- Another aspect of the present invention provides a method for inhibiting skin aging or regenerating skin, comprising administering a therapeutically effective amount of a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to a subject.
- Another aspect of the present invention provides a method for preventing or treating photoaging comprising administering a therapeutically effective amount of a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to a subject.
- the peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is the same as the peptide described in the 'composition for inhibiting skin aging or regenerating skin', and the detailed description is incorporated hereinbefore.
- the term “therapeutically effective amount” refers to an amount of a peptide that achieves the goal of improving the incidence of disease during treatment with the peptide, while avoiding harmful side effects usually associated with other therapies.
- Another aspect of the present invention provides use of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 for use in the manufacture of a drug for preventing or treating photoaging.
- a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 shown in [Table 1] was synthesized using an automatic peptide synthesizer (Liberty, CEM Corporation, USA), and C18 reverse phase high performance liquid chromatography (HPLC) (U-3000, Thermo Fisher Scientific, USA) was used to separate pure peptides from these synthesized peptides.
- the column used was Pursuit XRs C18 (250 * 4.65 mm 100 ⁇ , Agilent, USA).
- ECM extracellular matrix
- the expression level of genes related to natural aging was confirmed.
- NIH3T3 cells (mouse fibroblast cell line) were seeded in a 6-well plate at a cell density of 5 ⁇ 10 5 cells/well, and then cultured in DMEM medium containing 10% Fetal bovine serum (FBS) for 24 hours.
- the cultured cells were washed once with serum-free DMEM media, and the peptides of the present invention were mixed with 1 mL of the serum-free DMEM media at concentrations of 10, 50, and 100 ⁇ M, respectively, and dispensed into the cells.
- PC positive control
- Cells were cultured in a CO 2 incubator at 37° C. for 24 hours.
- the extracted RNA was subjected to RT-PCR using an RNA kit (enzynomics, Cat. No.: P581T, Korea).
- [Table 2] shows the sequences of the primers for collagen (Col1a1), fibronectin, and elastin used in RT-PCR and the GAPDH primers used for comparison of the amount of total RNA in each treatment group.
- ECM extracellular matrix
- the peptides of the present invention can suppress the cellular aging phenomenon that naturally proceeds in cells targeting fibroblasts and keratinocytes.
- the amount of proteins related to natural aging was confirmed. .
- NIH3T3 cells and HaCaT cells (Human keratinocyte cell line) were seeded in a 24-well plate at a cell density of 1 ⁇ 10 4 cell/well, and then cultured in DMEM medium containing 10% Fetal bovine serum (FBS) for 24 hours. .
- the cultured cells were washed once with serum free DMEM media, and the peptides of the present invention were mixed with 2 mL of the serum free DMEM media at concentrations of 50 ⁇ M, 100 ⁇ M and 5 ng/ml, respectively, per condition. 500 ⁇ L each was dispensed into 3 wells.
- NIH3T3 cells were treated with 5 ng/ml of TGF- ⁇ 1 instead of the peptide.
- those treated with 100 nM of IGF-1 instead of the peptide were used as PC.
- Cells were cultured in a CO 2 incubator at 37° C. for 72 hours.
- the medium of the cultured NIH3T3 and HaCaT cells was centrifuged to settle the suspended matter, and then the supernatant was transferred to an e-tube, and using this, collagen ELISA (abcam, Cat No.: ab210579, UK) and hyaluronic acid (Hyaluronic acid) were used, respectively. acid, HA) ELISA (ECHELON biosciences, Cat No.: K-1200, USA) was performed.
- the expression level of genes related to natural aging was confirmed.
- HaCaT cells were seeded in a 6-well plate at a cell density of 3 ⁇ 10 5 cells/well and cultured in DMEM medium containing 10% Fetal bovine serum (FBS) for 24 hours. After washing the cultured cells once with serum free DMEM media, the peptides of the present invention were mixed with 1 mL of the serum free DMEM media at concentrations of 10, 50, and 100 ⁇ M, respectively, and then dispensed into the cells. . PC (positive control) was treated with 100 nM of EGF instead of the peptide. Cells were cultured in a CO 2 incubator at 37° C. for 24 hours.
- FBS Fetal bovine serum
- [Table 3] shows the sequences of SIRT1 and AQP3 primers used in RT-PCR. The sequence of the GAPDH primer used for comparison of the total RNA amount of each treatment group is shown in [Table 2].
- HaCaT cells were seeded in a 6-well plate at a cell density of 5 ⁇ 10 5 cells/well and cultured in DMEM medium containing 10% Fetal bovine serum (FBS) for 24 hours. After washing the cultured cells once with serum free DMEM media, the peptides of the present invention were mixed with 1 mL of the serum free DMEM media at concentrations of 10, 50, and 100 ⁇ M, respectively, and then dispensed into the cells. .
- PC Personal Control
- HaCaT cells were seeded in a 6-well plate at a cell density of 3 ⁇ 10 5 cells/well and cultured in DMEM medium containing 10% Fetal bovine serum (FBS) for 24 hours. After washing the cultured cells once with serum free DMEM media, the peptides of the present invention were mixed with 1 mL of the serum free DMEM media at concentrations of 10, 50, and 100 ⁇ M, respectively, and then dispensed into the cells. .
- PC positive control
- Cells were cultured in a CO 2 incubator at 37° C. for 1 hour.
- RT-PCR was performed using a PCR kit (enzynomics, Cat. No.: R581T, Korea).
- the sequences of SIRT1 and AQP3 primers used in RT-PCR and the sequences of GAPDH primers used for comparison of the total amount of RNA in each treatment group are shown in [Table 2] and [Table 3].
- the peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 has the effect of suppressing photoaging of cells as the expression levels of skin barrier-related factors, which were reduced by UV irradiation, are restored in keratinocytes. there is.
- HaCaT cells were seeded in a 6-well plate at a cell density of 5 ⁇ 10 5 cells/well and cultured in DMEM medium containing 10% Fetal bovine serum (FBS) for 24 hours.
- FBS Fetal bovine serum
- the peptide of the present invention was mixed with 1 mL of the serum free DMEM media at a concentration of 10, 50, and 100 ⁇ M, respectively, and dispensed into the cells did PC (positive control) was treated with 2.5 mM of N-Acetylcysteine (NaC) instead of the peptide.
- the cells were cultured for 1 hour at 37°C in a CO 2 incubator, the medium of the cultured cells was transferred to a tube, 1 mL of PBS was added, and the cells were irradiated with a UV irradiator (VILBER LOURMAT, Cat No.: 3102-BSU, France). 15 J/cm 2 of UVB was irradiated. After removing the PBS, 900 ⁇ l of the medium transferred to the tube was added again and cultured for 24 hours at 37° C. in a CO 2 incubator. Thereafter, the cells were washed twice with PBS, and then the cells were lysed with a cell lysis buffer.
- VILBER LOURMAT UV irradiator
- the peptides of the present invention suppress the expression of apoptosis-inducing factor, whose expression is increased in cells damaged by UV irradiation.
- the peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 reduces the expression of apoptosis inducer, which had been increased by UV irradiation, and suppresses photoaging of cells, thereby promoting skin regeneration.
Landscapes
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Abstract
본 발명은 항노화 활성을 갖는 펩타이드 및 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 재생용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 항노화 활성을 가지므로 이를 피부 노화 억제 또는 피부 재생을 목적으로 하는 화장품 또는 광노화의 예방, 개선 또는 치료를 목적으로 하는 의약품의 원료로 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 항노화 활성을 갖는 펩타이드 및 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 재생용 조성물에 관한 것이다.
피부 세포는 각종 원인에 의하여 노화 현상이 일어날 수 있고, 피부 세포의 노화에 의하여 주름이 발생할 수 있다. 생물학적 과정에 따라 시간이 경과하며 나타나는 자연적인 노화인 연대학적 노화(내인적 노화)와 햇빛에 노출되는 부위에서 발생하는 퇴행성 변화와 상기 연대학적 노화가 복합적으로 나타나는 광노화(광인성 노화)로 구분될 수 있다. 세포의 성장과 관련된 각종 인자들의 발현 또는 활성이 저해되는 경우 자연적인 세포의 노화가 발생할 수 있으며, 햇빛에 포함된 280 nm 내지 400 nm 파장의 빛에 의하여 피부 세포의 광노화가 진행될 수 있다. 그 중에서도 특히 280 nm 내지 320 nm 범위의 파장을 갖는 UVB와 같은 자외선의 조사에 의하여 피부나 섬유의 손상이 발생할 수 있으며 피부가 까맣게 타는 그을음 현상이 발생할 수 있다. UVB가 조사되면 피부 세포 내의 ROS 및 자유 라디칼의 축적이 촉진되며, 라디칼에 의해 세포 내 신호전달 체계를 자극하여 DNA, 단백질, 지질과 같은 생체 분자에 산화적 스트레스를 유발할 수 있고, 이로 인하여 피부 조직의 손상이 발생될 수 있다.
피부 세포의 산화적 스트레스가 증가하면, 표피의 각질세포나 진피의 섬유아세포에 자극이 발생하고 일련의 세포 내 신호 전달 과정을 거쳐 콜라겐 분해효소인 MMP(matrix metalloproteinase)와 같은 유전자의 발현이 증가될 수 있고, 피부의 주요 구성성분으로 진피의 90%를 차지하며 피부에 강도, 장력을 부여해 외부 자극이나 힘으로부터 피부를 보호하는 역할을 하는 콜라겐(collagen)의 감소가 유발되어, 이에 따라 피부의 노화나 주름이 형성될 수 있다. 따라서, 상기 콜라겐과 같은 섬유 단백질들의 합성이나 분해에 관련된 유전자의 발현 조절을 통해 피부 세포의 노화를 방지하고 주름의 개선 효과를 기대할 수 있다.
햇빛에 포함된 자외선의 조사에 따른 세포의 노화 작용은 단지 피부의 손상에 의하여 미용적인 측면에서 문제를 발생시키는 것뿐만 아니라, 세포의 DNA 손상으로 인하여 암을 유발하거나 중추 및 말초 신경계의 손상, 면역 시스템 파괴, 생식기관 장애, 영아 및 유아 발달 장애, 그리고 염소좌창 등의 피부 질환을 일으킬 수 있어 심각한 건강 상의 문제도 발생할 수 있는바, 그에 대한 해결책이 시급한 실정이다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 여러 종류의 물질들이 개발되어 왔으며 다양한 종류의 식물이나 미생물들로부터 얻은 추출물을 이용하여 상기와 같은 문제점을 극복하고자 하는 시도들이 있어 왔다. 그러나 많은 경우, 자연물로부터 얻은 추출물 내에서 구체적으로 어떤 물질이 피부 세포의 보호나 노화 현상으로부터의 회복 효과를 이끌어낼 수 있는지 확인하지 못하여, 정확한 구성을 알 수 없어 미지의 물질들도 함께 함유하고 있는 추출물 조성물을 이용하고 있는 실정이다. 인체에 직접 접촉시키거나 적용하여 사용되어야 하는 특성상, 부작용을 최소화하고 인체에 대한 안전성이 담보되어야 하는바, 상기와 같은 문제점을 해결할 수 있는 효과를 갖는 단일 물질을 정확하게 규명하여 인체의 피부 세포 등에 적용해야 할 필요성이 있다.
[선행기술문헌]
[비특허문헌]
(비특허문헌 1)S Edgar et al., Effects of collagen-derived bioactive peptides and natural antioxidant compounds on proliferation and matrix protein synthesis by cultured normal human dermal fibroblasts, Scientific Reports, 2018; 8:10474
본 발명의 일 목적은 항노화 활성을 보유한 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 목적은 상술한 활성을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 재생용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일 목적은 상술한 활성을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일 목적은 상술한 활성을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 광노화 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 재생용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 광노화 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 항노화 활성을 가지므로 이를 피부 노화 억제 또는 피부 재생을 목적으로 하는 화장품 또는 광노화의 예방, 개선 또는 치료를 목적으로 하는 의약품의 원료로 사용할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1a는 본 발명의 펩타이드를 섬유아세포에 처리하였을 때 콜라겐, 피브로넥틴 및 엘라스틴의 발현을 확인한 도이다: Con은 무처리군, bFGF는 양성대조군.
도 1b는 본 발명의 펩타이드를 섬유아세포에 처리하였을 때 콜라겐의 발현에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다: Con은 무처리군, bFGF는 양성대조군.
도 1c는 본 발명의 펩타이드를 섬유아세포에 처리하였을 때 피브로넥틴의 발현에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다: Con은 무처리군, bFGF는 양성대조군.
도 1d는 본 발명의 펩타이드를 섬유아세포에 처리하였을 때 엘라스틴의 발현에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다: Con은 무처리군, bFGF는 양성대조군.
도 2a는 본 발명의 펩타이드를 섬유아세포에 처리하였을 때 콜라겐 및 히알루론산 단백질의 분비에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다: Con은 무처리군, TGF-b1은 양성대조군.
도 2b는 본 발명의 펩타이드를 각질형성세포에 처리하였을 때 콜라겐 및 히알루론산 단백질의 분비에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다: Con은 무처리군, TGF-b1은 양성대조군.
도 3a는 본 발명의 펩타이드를 각질형성세포에 처리하였을 때 SIRT1 및 AQP3의 발현을 확인한 도이다: Con은 무처리군, EGF는 양성대조군.
도 3b는 본 발명의 펩타이드를 각질형성세포에 처리하였을 때 SIRT1의 발현에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다: Con은 무처리군, EGF는 양성대조군.
도 3c는 본 발명의 펩타이드를 각질형성세포에 처리하였을 때 AQP3의 발현에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다: Con은 무처리군, EGF는 양성대조군.
도 4는 본 발명의 펩타이드가 각질형성세포에서 자외선(UV) 조사에 의해 증가된 세포 내 활성산소(ROS) 레벨에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다: Con은 자외선 비조사군, NC는 자외선 조사군, 10μM, 50μM, 100μM 는 자외선 조사 및 본 발명의 펩타이드를 농도별로 처리한 군, Trolox는 자외선 조사 및 Trolox를 처리한 양성대조군.
도 5a는 본 발명의 펩타이드가 각질형성세포에서 자외선(UV) 조사에 의해 감소된 SIRT1 및 AQP3의 발현을 확인한 도이다: Con은 자외선 비조사군, NC는 자외선 조사군, 10μM, 50μM, 100μM 는 자외선 조사 및 본 발명의 펩타이드를 농도별로 처리한 군 NaC는 자외선 조사 및 N-아세틸시스테인을 처리한 양성대조군.
도 5b는 본 발명의 펩타이드가 각질형성세포에서 자외선(UV) 조사에 의해 감소된 SIRT1의 발현에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다: Con은 자외선 비조사군, NC는 자외선 조사군, 10μM, 50μM, 100μM 는 자외선 조사 및 본 발명의 펩타이드를 농도별로 처리한 군 NaC는 자외선 조사 및 N-아세틸시스테인을 처리한 양성대조군.
도 5c는 본 발명의 펩타이드가 각질형성세포에서 자외선(UV) 조사에 의해 감소된 AQP3의 발현에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다: Con은 자외선 비조사군, NC는 자외선 조사군, 10μM, 50μM, 100μM 는 자외선 조사 및 본 발명의 펩타이드를 농도별로 처리한 군 NaC는 자외선 조사 및 N-아세틸시스테인을 처리한 양성대조군.
도 6a는 본 발명의 펩타이드가 각질형성세포에서 자외선(UV) 조사에 의해 증가된 Cleaved PARP-1 및 Cleaved Caspase-3의 발현을 확인한 도이다: Con은 자외선 비조사군, NC는 자외선 조사군, 10μM, 50μM, 100μM 는 자외선 조사 및 본 발명의 펩타이드를 농도별로 처리한 군 NaC는 자외선 조사 및 N-아세틸시스테인을 처리한 양성대조군.
도 6b는 본 발명의 펩타이드가 각질형성세포에서 자외선(UV) 조사에 의해 증가된 Cleaved PARP-1의 발현에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다: Con은 자외선 비조사군, NC는 자외선 조사군, 10μM, 50μM, 100μM 는 자외선 조사 및 본 발명의 펩타이드를 농도별로 처리한 군 NaC는 자외선 조사 및 N-아세틸시스테인을 처리한 양성대조군.
도 6c는 본 발명의 펩타이드가 각질형성세포에서 자외선(UV) 조사에 의해 증가된 Cleaved Caspase-3의 발현에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다: Con은 자외선 비조사군, NC는 자외선 조사군, 10μM, 50μM, 100μM 는 자외선 조사 및 본 발명의 펩타이드를 농도별로 처리한 군 NaC는 자외선 조사 및 N-아세틸시스테인을 처리한 양성대조군.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다.
본 명세서에서, 용어 '펩타이드'란 아미노산 잔기로 이루어진 선형의 분자를 의미하며, 구체적으로 본 발명의 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 '펩타이드'는 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들, 또는 단편들일 수 있다. 상기 펩타이드의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서, 펩타이드는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 이에, 본 발명의 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다.
상기 실질적으로 동일한 단백질이란 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 예컨대, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 의미하나 이에 한정되지 않으며, 75% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 활성을 가진다면 본 발명의 범위에 포함된다.
또한, 본 발명의 펩타이드는 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 보다 나은 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 본 발명의 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단이 변형된 것일 수 있다. 상기 '안정성'은 생체 내 단백질 절단 효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 생체내(in vivo)에서의 안정성뿐만 아니라, 저장안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 포함하는 의미로 사용된다.
상기 N-말단 변형은 펩타이드의 N-말단에 아세틸기(acetyl group), 플루오레닐메톡시카르보닐기(fluoreonylmethoxycarbonyl group), 포르밀기(formyl group), 팔미토일기(palmitoyl group), 미리스틸기(myristyl group), 스테아릴기(stearyl group) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)로 이루어진 군으로부터 선택된 보호기가 결합한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 C-말단 변형은 펩타이드의 C-말단에 히드록시기(hydroxyl group, -OH), 아미노기(amino group, -NH2), 아자이드(azide, -NHNH2) 등이 결합한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 펩타이드의 합성은 예를 들어 기기를 이용하거나 유전공학 기법을 이용하여 수행할 수 있다. 기기를 이용하여 합성하는 경우, 자동 펩타이드 합성기에서 원하는 펩타이드를 Fmoc 고체상(Fmoc solid-phase) 방법으로 합성할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 Fmoc 고체상(Fmoc solid-phase) 방법을 이용하여 합성 및 동정하였고, 동정된 펩타이드의 효능을 검증하는 것에 의해 선별되었다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 동정된 펩타이드의 효능을 검증하기 위해 ECM 구성 성분과 피부 장벽 강화 인자의 발현 수준 증가 효과 및 자외선 조사에 의해 증가한 활성산소 레벨 감소 효능, 자외선에 의해 감소한 피부 장벽 강화 유전자의 발현 회복, 자외선에 의해 증가한 세포사멸 유도 인자의 발현 억제 효과에 대한 유효성 검증을 통해 본 발명의 펩타이드를 선별하였다.
이에 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 피부 노화 억제 활성 또는 피부 재생 활성을 갖는다.
본 발명의 다른 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 재생용 조성물을 제공한다.
상기 “피부노화”는 시간의 흐름에 따라 세포에서 자연적으로 발생하는 노화일 수 있고, 햇빛에 의해 발생하는 광노화일 수 있다. 또한, 상기 노화는 다양한 원인에 의해 발생할 수 있는 세포 내 산화적 스트레스 현상에 의해 유도될 수 있으며, 이에 따라 세포 성장 억제나 세포사멸이 진행될 수 있고 피부세포에서 이를 구성하는 각종 섬유 단백질의 합성이 저해되고 분해 효소의 발현이 증가될 수 있다. 특히, 자외선 조사에 따라 피부 세포에서는 Col1a1, 피브로넥틴, 엘라스틴과 같은 유전자의 발현이 억제되어 피부 세포의 광노화 및 주름 발생을 유발할 수 있다.
상기 “피부재생”은 피부세포의 성장을 촉진시키고 생존력을 강화하여 외부 및/또는 내부의 자극으로부터 세포손상을 방지하고 피부의 주름 개선, 탄력의 증진 및 피부 장벽을 강화시키는 것일 수 있으며, 상기 피부재생에는 외부 환경으로부터 유발되는 피부손상, 예를 들어 색소침착의 예방 또는 피부 광노화의 개선 및 또는 치료의 의미를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 피부 노화 억제 또는 피부 재생용 조성물은 노화 또는 외부 자극에 의한 세포 손상에 대한 저항성을 증진시킨다.
상기 “외부 자극”은 물리적 자극, 화장품 또는 기타 외용제 적용에 의한 화학적 자극, 자외선에 의한 자극 또는 적외선에 의한 자극일 수 있다.
상기 손상되는 세포는 피부 섬유아세포 또는 각질형성세포 일 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 피부세포 내에서 섬유 단백질 합성 유전자의 발현 증가를 유도할 수 있다. 따라서, 상기 펩타이드는 섬유 단백질의 합성을 증가시킴에 따라 피부의 주름 및 탄력을 개선할 수 있으며, 피부 장벽을 개선시킴에 따라 외부 자극으로부터 피부세포의 저항력과 생존력을 증가시키고, 외부 자극 또는 노화로 인해 손상받은 피부의 재생력을 증진시킬 수 있다. 피부의 노화가 진행됨에 따라 피부세포 내에서 발현량이 변화하는 세포 증식과 관련된 단백질이나 항노화 유전자 및 섬유 단백질의 발현량을 확인함으로써, 본 발명의 상기 펩타이드의 피부 노화 억제 및 피부 재생 효과를 확인할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 피부 노화 억제 또는 피부 재생용 조성물은 피부세포 내에서 콜라겐(Collagen), 피브로넥틴(fibronectin), 또는 엘라스틴(elastin)의 발현을 증가시킬 수 있다.
일 구현예에서, 상기 피부 노화 억제 또는 피부 재생용 조성물은 피부 장벽 강화 인자인 SIRT1 또는 AQP3의 발현을 증가시킬 수 있다.
일 구현예에서, 상기 피부 노화 억제 또는 피부 재생용 조성물은 자외선에 의한 활성산소(ROS)의 생성을 억제할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 피부 노화 억제 또는 피부 재생용 조성물은 자외선에 의해 감소된 SIRT1 또는 AQP3의 발현을 증가시킬 수 있다.
일 구현예에서, 상기 피부 노화 억제 또는 피부 재생용 조성물은 자외선에 의해 증가된 Cleaved PART-1 또는 Cleaved Caspase-3의 발현을 억제할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 섬유아세포 및 각질형성세포에서 Col1a1, 피브로넥틴(fibronectin) 및 엘라스틴(elastin)의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다.
또한, 상기 펩타이드는 각질형성세포에서 SIRT1 및 AQP3와 같은 피부 장벽 강화 유전자의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다.
또한, 상기 펩타이드는 자외선에 의해 손상된 각질형성세포에서 세포 내 활성산소(ROS) 레벨을 감소시키는 것으로 나타났다.
또한, 상기 펩타이드는 자외선에 의해 손상된 각질형성세포에서 SIRT1 및 AQP3와 같은 피부 장벽 강화 유전자의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다.
또한, 상기 펩타이드는 자외선에 의해 손상된 각질형성세포에서 Cleaved PARP-1, Bax, Cleaved Caspase-3와 같은 세포사멸 유도인자(apoptotic-inducing factor)의 발현을 감소시키는 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명의 상기 펩타이드는 피부 세포의 노화 현상과 관련된 유전자의 발현을 조절함으로 피부 노화 억제 또는 피부 재생 활성을 가짐이 분명하고, 본 발명의 상기 펩타이드는 피부 노화 억제 또는 피부 재생을 위한 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 피부 노화 억제 또는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 피부 노화 억제 또는 피부 재생은 피부 주름의 예방 또는 개선, 피부 탄력 증진, 피부 장벽 강화, 색소침착의 예방 또는 피부 광노화 개선일 수 있다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 상기 '피부 노화 억제 또는 피부 재생용 조성물' 항목에서 설명한 펩타이드와 동일한바, 구체적인 설명은 위에서 기재한 내용을 원용하고, 이하에서는 피부 노화 억제 또는 피부 재생용 화장료 조성물에 특유한 구성에 대해서만 설명하도록 한다.
상기 화장료 조성물은 본 기술분야에서 통상적으로 제조되는 임의의 제형으로 제조될 수 있고, 예를 들면, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이, 파우더, 헤어토닉, 헤어크림, 헤어로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어컨디셔너, 헤어스프레이, 헤어 에어졸, 포마드, 젤 등과 같은 용액, 솔젤, 에멀젼, 오일, 왁스, 에어졸 등의 다양한 형태로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물은 부형제, 담체 등 기타 첨가제를 포함할 수 있으며 일반 피부 화장료에 배합되는 보통의 성분을 필요한 만큼 적용 배합하는 것이 가능하다.
상기 화장료 조성물의 제형의 형태가 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀루로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형의 형태가 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토오스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 사용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체가 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물의 제형의 형태가 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용될 수 있고, 예를 들면 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형의 형태가 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 등과 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 헤어샴푸인 경우에는 본 발명의 펩타이드에 증점제, 계면활성제, 점도 조절제, 보습제, pH 조절제, 방부제, 에센셜 오일 등과 같이 샴푸를 조성하기 위한 베이스 성분들이 혼합될 수 있다. 상기 증점제로는 CDE가 사용될 수 있고, 상기 계면활성제로는 음이온 계면활성제인 LES와, 양쪽성 계면활성제인 코코 베타인이 사용될 수 있고, 상기 점도조절제로는 폴리 쿼터가 사용될 수 있으며, 상기 보습제로는 글리세린이 사용될 수 있고, 상기 pH 조절제로는 구연산, 수산화나트륨이 사용될 수 있다. 상기 방부제로는 자몽 추출물 등이 사용될 수 있고, 이 외에도 시더우드, 페퍼민트, 로즈마리 등의 에센셜 오일과 실크 아미노산, 펜타올 또는 비타민 E가 첨가될 수 있다.
상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 본 발명의 펩타이드와 담체 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 사용되는 성분들, 예를 들면 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 등을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 광노화 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 상기 '피부 노화 억제 또는 피부 재생용 조성물' 항목에서 설명한 펩타이드와 동일한바, 구체적인 설명은 위에서 기재한 내용을 원용하고, 이하에서는 광노화 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 특유한 구성에 대해서만 설명하도록 한다.
본 명세서에서, 상기 “광노화”는 태양광선에 반복적이거나 장기간 노출시 피부손상, 색소침착, 주름생성 또는 피부의 탄력이 저하되는 현상을 의미한다.
본 명세서에서, “예방”은 본 발명의 펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물에 의해 광노화의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서, “개선 또는 치료”는 본 발명의 펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물에 의해 광노화의 진행을 지연, 중단 또는 역전시키는 등, 광노화와 관련하여 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 펩타이드는 자외선에 의해 손상된 각질형성세포에서 활성산소의 생성 및 축적을 억제하고, SIRT1 및 AQP3와 같은 피부 장벽 강화 인자의 발현을 증가시키고, Cleaved PARP-1 및 Cleaved Caspase-3와 같은 세포사멸 유도 인자의 발현을 억제함으로써 광노화를 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있다. 또한 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체로는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995)에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들어, 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구적인 투여방법으로는 이에 제한되는 것은 아니나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있고, 비경구 투여용 제제는 구체적으로 주사용 제제 또는 외용제의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 '약학적으로 유효한 양'은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있으며, 예를 들어 상기 약학적 조성물을 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.0001㎍ 내지 500mg, 바람직하게는 0.01㎍ 내지 100mg 투여할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 펩타이드는 피부 노화 억제 및 피부 재생 효과가 뛰어나므로, 피부 노화 억제 또는 피부 재생을 목적으로 하는 화장품 또는 광노화의 예방, 개선 또는 치료를 목적으로 하는 의약품의 원료로 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 치료적 유효량의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 재생 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 치료적 유효량의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 광노화의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 상기 '피부 노화 억제 또는 피부 재생용 조성물' 항목에서 설명한 펩타이드와 동일한바, 구체적인 설명은 위에서 기재한 내용을 원용한다.
본 명세서에 있어서, 상기 용어 "치료적 유효량"은 상기 펩타이드의 처치 동안, 질환의 발병 빈도를 개선시키기 위한 목적을 달성하되, 통상 다른 치료법과 관련된 유해한 부작용은 피하는 펩타이드의 양을 의미한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 광노화의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 서열번호 1의 아미노산 서열의 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[합성예 1]
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 합성
자동 펩타이드 합성기(Liberty, CEM Corporation, 미국)를 이용하여 하기의 [표 1]에 기재된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 합성하고, C18 역상 고성능액체크로마토그래피(HPLC)(U-3000, Thermo fisher scientific, 미국)를 이용하여 이들 합성된 펩타이드를 순수 분리하였다. 컬럼은 Pursuit XRs C18(250 * 4.65 mm 100Å, Agilent, 미국)을 이용하였다.
| 서열번호 | 펩타이드의 아미노산 서열 |
| 1 | EYIPNRVCRR |
[실험예 1]
펩타이드 처리에 따른 자연노화 억제 확인
1-1. 세포외기질(ECM, extracellular matrix) 구성성분(콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴)의 발현 증가 확인
섬유아세포(fibroblast)를 대상으로 세포에서 자연적으로 진행되는 세포 노화현상을 본 발명의 펩타이드가 억제시켜줄 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 자연노화와 관련된 유전자의 발현 수준을 확인하였다.
먼저, NIH3T3 세포(mouse fibroblast cell line)를 5×105 cell/well의 세포 밀도로 6-well plate에 seeding 후 24시간 동안 10 % Fetal bovine serum (FBS)을 포함한 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양한 세포를 무혈청 DMEM 배지(serum free DMEM media)로 1회 세척하고, 상기 무혈청 DMEM 배지 1mL에 본 발명의 펩타이드를 각각 10, 50, 100 μM의 농도로 혼합하여 상기 세포에 분주하였다. PC(positive control)은 상기 펩타이드 대신에 bFGF 100 nM를 처리한 것으로 하였다. 세포를 24시간 동안 37℃의 CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
상기 배양한 세포를 PBS로 2회 세척하고 easy blue (iNtRON, Cat. No.: 17061, Korea)를 이용하여 세포로부터 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 RNA 키트 (enzynomics, Cat. No.: P581T, Korea) 를 이용하여 RT-PCR을 진행하였다. RT-PCR시에 사용한 콜라겐(Col1a1), 피브로넥틴, 엘라스틴의 프라이머와 각 처리군의 전체 RNA 량 비교를 위해 사용된 GAPDH의 프라이머의 서열을 [표 2]에 나타내었다.
| 유전자 | 프라이머 | 서열(5'->3') | 서열번호 |
| Col1a1 | F | CAC CCT CAA GAG CCT GAG TC | 2 |
| R | AGA CGG CTG AGT AGG GAA CA | 3 | |
| Fibronectin | F | CCA GGA ACC GAG TAC ACC AT | 4 |
| R | ATA CCC AGG TTG GGT GAT GA | 5 | |
| Elastin | F | GCAAGACCTGGCTTTGGACT | 6 |
| R | GGGAGTTTCTGGTTAGGGCTG | 7 | |
| GAPDH | F | GGA GCC AAA AGG GTC ATC AT | 8 |
| R | GTG ATG GCA TGG ACT GTG GT | 9 |
그 결과, 도 1a 내지 도 1d에 나타난 바와 같이 상기 펩타이드를 처리한 경우 펩타이드의 농도가 증가함에 따라 점차 Col1a1, 피브로넥틴, 엘라스틴 유전자의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.이로부터, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 의하여 섬유아세포의 진피를 구성하는 세포외 기질 단백질인, 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴 발현이 증가됨에 따라 피부 주름 등과 같은 자연 노화가 억제 또는 개선되는 효과가 있음을 알 수 있다.
1-2. 세포외기질(ECM, extracellular matrix) 구성성분(콜라겐 및 히알루론산)의 단백질량 증가 확인
섬유아세포(fibroblast)와 각질형성세포(keratinocyte)를 대상으로 세포에서 자연적으로 진행되는 세포 노화현상을 본 발명의 펩타이드가 억제시켜줄 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 자연노화와 관련된 단백질의 양을 확인하였다.
먼저, NIH3T3 세포 및 HaCaT 세포(Human keratinocyte cell line)를 1×104cell/well의 세포 밀도로 24-well plate에 seeding 후 24시간 동안 10 % Fetal bovine serum (FBS)을 포함한 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양한 세포를 무혈청 DMEM 배지(serum free DMEM media)로 1회 세척하고, 상기 무혈청 DMEM 배지 2mL에 본 발명의 펩타이드를 각각 50μM, 100 μM 및 5 ng/ml의 농도로 혼합하여 한 조건당 500 μL씩 3개의 웰에 분주하였다. PC(positive control)은 NIH3T3 세포의 경우 상기 펩타이드 대신에 TGF-β1 5 ng/ml를 처리한 것으로 하였다. HaCaT 세포의 경우 상기 펩타이드 대신에 IGF-1 100 nM을 처리한 것을 PC로 하였다. 세포를 72시간 동안 37℃의 CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
상기 배양한 NIH3T3 및 HaCaT 세포의 배지를 원심분리를 통해 부유물을 가라앉힌 뒤 상층액을 e-tube로 옮기고, 이를 이용하여 각각 콜라겐 ELISA (abcam, Cat No.: ab210579, UK) 및 히알루론산(Hyaluronic acid, HA) ELISA (ECHELON biosciences, Cat No.: K-1200, USA) 를 진행하였다.
그 결과, 도 2a 및 도 2b에 나타난 바와 같이 상기 펩타이드를 처리한 경우 펩타이드의 농도가 증가함에 따라 점차 콜라겐 및 히알루론산의 단백질 양이 증가하는 것을 확인하였다.
이로부터, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 의하여 섬유아세포 및 각질형성세포의 진피를 구성하는 세포외 기질 단백질인, 콜라겐 및 히알루론산 단백질의 양이 증가됨에 따라 피부 주름 등과 같은 자연 노화가 억제 또는 개선되는 효과가 있음을 알 수 있다.
1-3. 피부 장벽 기능 관련 유전자(SIRT1 및 AQP3)의 발현 증가 확인
각질형성세포(keratinocyte)를 대상으로 세포에서 자연적으로 진행되는 세포 노화현상을 본 발명의 펩타이드가 억제시켜줄 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 자연노화와 관련된 유전자의 발현 수준을 확인하였다.
먼저, HaCaT 세포를 3×105 cell/well의 세포 밀도로 6-well plate에 seeding 후 24시간 동안 10 % Fetal bovine serum (FBS)을 포함한 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양한 세포를 무혈청 DMEM 배지(serum free DMEM media)로 1회 세척한 뒤, 상기 무혈청 DMEM 배지 1mL에 본 발명의 펩타이드를 각각 10, 50, 100 μM의 농도로 혼합하여 상기 세포에 분주하였다. PC(positive control)은 상기 펩타이드 대신에 EGF 100 nM를 처리한 것으로 하였다. 세포를 24시간 동안 37℃의 CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
상기 배양한 세포를 PBS로 2회 세척한 후, easy blue (iNtRON, Cat. No.: 17061, Korea)를 이용하여 세포로부터 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 키트 (enzynomics, Cat. No.: RT200, Korea) 를 이용하여 RT 반응을 진행하였다. 이후, PCR키트(enzynomics, Cat. No.: R581T, Korea)를 이용하여 RT-PCR을 진행하였다. RT-PCR시에 사용한 SIRT1, AQP3 프라이머의 서열을 [표 3]에 나타내었다. 각 처리군의 전체 RNA 량 비교를 위해 사용된 GAPDH의 프라이머의 서열은 상기 [표 2]에 나타내었다.
| 유전자 | 프라이머 | 서열(5'->3') | 서열번호 |
| SIRT1 | F | TCA GTG GCT GGA ACA GTG AG | 10 |
| R | TCT GGC ATG TCC CAC TAT CA | 11 | |
| AQP3 | F | CCT TCT TGG GTG CTG GAA TA | 12 |
| R | ACA CGA TAA GGG AGG CTG TG | 13 |
그 결과, 도 3a 내지 도 3c에 나타난 바와 같이 상기 펩타이드를 처리한 경우 피부 장벽 강화 인자인 SIRT1 및 AQP3의 mRNA 레벨이 증가하는 것을 확인하였다.이로부터, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 의하여 각질형성세포에서 피부 장벽 강화 인자인 SIRT1 및 AQP3의 발현 수준이 증가됨에 따라 자연 노화가 억제 또는 개선되는 효과가 있음을 알 수 있다.
[실험예 2]
펩타이드 처리에 따른 외인성 노화 억제 확인
2-1. 자외선에 의해 증가된 활성산소 억제 효과 확인
UV가 조사되면 활성산소의 레벨이 증가하므로, 본 발명의 펩타이드를 처리하는 경우 활성산소 레벨이 다시 감소하여 세포의 산화적 스트레스에 의한 노화 현상을 억제 할 수 있는지 여부를 확인하였다.
먼저, HaCaT 세포를 5×105 cell/well의 세포 밀도로 6-well plate에 seeding 후 24시간 동안 10 % Fetal bovine serum (FBS)을 포함한 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양한 세포를 무혈청 DMEM 배지(serum free DMEM media)로 1회 세척한 뒤, 상기 무혈청 DMEM 배지 1mL에 본 발명의 펩타이드를 각각 10, 50, 100 μM의 농도로 혼합하여 상기 세포에 분주하였다. PC(Positive Control)은 상기 펩타이드 대신에 Trolox 25 μM을 처리한 것으로 하였다.
1시간 동안 37℃, CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 상기 배양한 세포의 배지를 튜브로 옮기고, 1 ml의 PBS를 가한 후 UV 조사기(VILBER LOURMAT, Cat No.: 3102-BSU, 프랑스)를 이용하여 15 J/cm2의 UVB를 조사하였다. PBS를 제거한 뒤 상기 튜브에 옮겨진 배지 900 μL 를 분주하여 24시간 동안 37℃, CO2 인큐베이터에서 배양하였다. DCFH-DA(dichloro-dihydro-fluorescein diacetate)를 10 μM 처리한 뒤 호일로 감싸 30분 동안 37℃, CO2 인큐베이터에서 배양하였다. PBS 로 2회 세척 한 뒤, 1XTE 500 μL 분주하여 세포를 분리하였다. 원심분리 한 뒤 PBS로 세포를 세척한 뒤, FACS를 통해 형광 값을 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 HaCaT 세포에 본 발명의 펩타이드를 처리하면 UV 조사에 의해 증가한 세포 내 활성산소 레벨이 감소하는 것을 확인하였다.
이로부터, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 의하여 각질형성세포에서 UV 조사에 의해 증가되었던 활성산소 레벨이 다시 감소하고, 산화적 스트레스가 저해됨에 따라 세포의 광노화 현상이 방지되는 효과가 있음을 알 수 있다.
2-2. 자외선에 의해 억제된 피부 장벽 기능 관련 유전자(SIRT1 및 AQP3)의 발현 증가 확인
UV가 조사되면 피부 장벽 기능 관련 유전자의 발현이 저해되므로, 본 발명의 펩타이드를 처리하는 경우 SIRT1 및 AQP3 유전자의 발현량이 다시 회복되어 증가하는지 여부를 확인함으로써 세포의 광노화 현상을 억제할 수 있는지 여부를 확인하였다.
먼저, HaCaT 세포를 3×105 cell/well의 세포 밀도로 6-well plate에 seeding 후 24시간 동안 10 % Fetal bovine serum (FBS)을 포함한 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양한 세포를 무혈청 DMEM 배지(serum free DMEM media)로 1회 세척한 뒤, 상기 무혈청 DMEM 배지 1mL에 본 발명의 펩타이드를 각각 10, 50, 100 μM의 농도로 혼합하여 상기 세포에 분주하였다. PC(positive control)은 상기 펩타이드 대신에 N-Acetylcystein(NaC) 2.5 mM를 처리한 것으로 하였다. 세포를 1시간 동안 37℃의 CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
상기 배양한 세포를 PBS로 2회 세척한 후, 1 ml의 PBS를 가하고 UV 조사기(VILBER LOURMAT, Cat No.: 3102-BSU, 프랑스)를 이용하여 15 J/cm2의 UVB를 조사하였다. PBS를 제거한 뒤 상기 튜브에 옮겨진 배지 900 μL 를 분주하여 24시간 동안 37℃, CO2 인큐베이터에서 배양하였다. PBS 로 2회 세척 한 뒤, easy blue (iNtRON, Cat. No.: 17061, Korea)를 이용하여 세포로부터 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 RNA 키트 (enzynomics, Cat. No.: P581T, Korea) 를 이용하여 RT 반응 을 진행하였다. 이후, PCR키트(enzynomics, Cat. No.: R581T, Korea)를 이용하여 RT-PCR을 진행하였다. RT-PCR시에 사용한 SIRT1, AQP3 프라이머의 서열과 각 처리군의 전체 RNA 량 비교를 위해 사용된 GAPDH의 프라이머의 서열은 상기 [표 2] 및 [표 3]에 나타내었다.
그 결과, 도 5a 내지 도 5c에 나타난 바와 같이 HaCaT 세포에 본 발명의 펩타이드를 처리하면 UV 조사에 의해 감소된 피부 장벽 관련 인자들의 mRNA 레벨이 다시 증가하는 것을 확인하였다.
이로부터, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 의하여 각질형성세포에서 UV 조사에 의해 감소되었던 피부 장벽 관련 인자들의 발현 수준이 다시 회복됨에 따라 세포의 광노화 현상이 억제되는 효과가 있음을 알 수 있다.
2-3. 자외선에 의해 증가된 세포사멸 유도 인자(Cleaved PARP-1 및 Cleaved Caspase-3)의 발현 억제 확인
UV가 조사되면 세포사멸 유도 인자의 발현이 증가하므로, 본 발명의 펩타이드를 처리하는 경우 증가된 세포사멸 유도 인자인 cleaved PARP-1 및 cleaved Caspase-3의 발현량이 다시 감소되는지 여부를 확인함으로써 세포의 광노화 현상을 억제하고 손상된 세포를 재생할 수 있는지 여부를 확인하였다.
먼저, HaCaT 세포를 5×105 cell/well의 세포 밀도로 6-well plate에 seeding 후 24시간 동안 10 % Fetal bovine serum (FBS)을 포함한 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양한 세포를 무혈청 DMEM 배지(serum free DMEM media)으로 1회 세척한 뒤, 상기 무혈청 DMEM 배지 1mL에 본 발명의 펩타이드를 각각 10, 50, 100 μM의 농도로 혼합하여, 상기 세포에 분주하였다. PC(positive control)은 상기 펩타이드 대신에 2.5 mM의 N-Acetylcysteine(NaC)를 처리한 것으로 하였다.
상기 세포를 1시간 동안 37℃, CO2 인큐베이터에서 배양하고, 배양한 세포의 배지를 튜브에 옮기고, 1 mL의 PBS를 가한 후 UV 조사기(VILBER LOURMAT, Cat No.: 3102-BSU, 프랑스)로 15 J/cm2의 UVB를 조사하였다. PBS를 제거한 뒤 상기 튜브에 옮겨 두었던 배지 900 μl 를 다시 첨가하고 24시간 동안 37℃, CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 그 후 세포를 PBS로 2회 세척한 다음 세포용해 완충액(cell lysis buffer)으로 세포를 용해(lysis)하였다. 5X sample buffer를 처리하여 sample 준비 후 10% SDS-PAGE 겔을 이용하여 SDS-PAGE를 진행하고, 이를 통해 분리한 단백질을 PVDF membrane으로 옮겼다. 5% skim milk를 이용하여 1시간 동안 실온에서 블로킹(blocking)시킨 후, 항-cleaved PARP-1 항체(CST, Cat. No.: 9541S, USA), 항-cleaved Caspase-3 항체(CST, Cat. No.: 9661S, USA), 및 항-β actin 항체 (Santa cruz, Cat. No.: SC-47778, USA) 를 1:1000으로 5% skim milk에 희석하여 membrane과 2시간 동안 반응시킨 후 0.1% PBS-T (0.1% Tween-20 in PBS) 로 10분씩 3회 세척하였다. Goat anti-rabbit IgG (Jackson Immunoresearch, Cat. No.: 111-035-033, USA), goat anti-mouse IgG (Jackson Immunoresearch, Cat. No.: 111-035-003, USA) 를 1:3000으로 5% skim milk에 희석하여 membrane과 2시간 동안 반응시키고, ECL solution (GE Healthcare, Cat. No.: RPN2232, USA)을 이용하여 film으로 검출하였다.
그 결과, 도 6a 내지 도 6c에 나타난 바와 같이 본 발명의 펩타이드는 UV 조사에 의해 손상된 세포에서 발현이 증가된 사포사멸 유도 인자의 발현을 억제시키는 것을 확인하였다.
이를 통해, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 의하여 UV 조사에 의해 증가되었던 세포사멸 유도 인자의 발현이 다시 감소하고, 세포의 광노화 현상이 억제됨에 따라 피부재생이 촉진되는 효과가 있음을 알 수 있다.
이상에서 본 발명은 기재된 실시예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 청구범위에 속함은 당연한 것이다.
Claims (11)
- 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
- 청구항 1에 있어서,상기 펩타이드는 피부 노화 억제 활성 또는 피부 재생 활성을 갖는 것인 펩타이드.
- 청구항 1의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부재생용 조성물.
- 청구항 3에 있어서,상기 조성물은 노화 또는 외부 자극에 의한 세포 손상에 대한 저항성을 증진시키는 것인, 피부 노화 억제 또는 피부재생용 조성물.
- 청구항 4에 있어서,상기 외부 자극은 자외선 또는 적외선인, 피부 노화 억제 또는 피부 재생용 조성물.
- 청구항 4에 있어서,상기 세포는 피부 섬유아세포 또는 각질형성세포인, 피부 노화 억제 또는 피부 재생용 조성물.
- 청구항 3에 있어서,상기 조성물은 i) 콜라겐(Collagen), 피브로넥틴(fibronectin), 또는 엘라스틴(elastin)의 발현 또는 분비를 증가시키고, ii) SIRT1 또는 AQP3의 발현을 증가시키는 것인, 피부 노화 억제 또는 피부 재생용 조성물.
- 청구항 3에 있어서,상기 조성물은 i) 자외선에 의한 활성산소(ROS)의 생성을 억제하고, ii) 자외선에 의해 감소된 SIRT1 또는 AQP3의 발현을 증가시키고, iii) 자외선에 의해 증가된 Cleaved PART-1 또는 Cleaved Caspase-3의 발현을 억제하는 것인, 피부 노화 억제 또는 피부 재생용 조성물.
- 청구항 1의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 피부 노화 억제 또는 피부 재생용 화장료 조성물.
- 청구항 9에 있어서,상기 피부 노화 억제 또는 피부 재생은 피부 주름의 예방 또는 개선, 피부 탄력 증진, 피부 장벽 강화, 색소침착의 예방 또는 피부 광노화 개선인 것인, 피부 노화 억제 또는 피부 재생용 화장료 조성물.
- 청구항 1의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 광노화 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR102065171B1 (ko) * | 2019-02-20 | 2020-01-13 | (주)케어젠 | 대기오염물질에 의한 피부 손상 방지 및 항노화용 펩타이드와 이의 용도 |
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| KR20210022405A (ko) * | 2019-08-20 | 2021-03-03 | (주)케어젠 | 피부 상태 개선 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 |
| KR20210075098A (ko) * | 2018-10-11 | 2021-06-22 | 콜로세움 콤비나토리얼 케미스트리 센터 포 테크놀로지 소시에타 아 리스폰사빌리타` 리미타타 인 포르마 아브레비아타 씨4티 에스.알.엘. | 피부 노화 및 광 노화 치료 및 예방에 사용하기 위한 펩타이드 |
-
2021
- 2021-09-30 KR KR1020210130422A patent/KR20230046873A/ko not_active Application Discontinuation
-
2022
- 2022-09-27 WO PCT/KR2022/014397 patent/WO2023055011A1/ko unknown
- 2022-09-27 CN CN202280065728.5A patent/CN118019753A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| S EDGAR ET AL.: "Effects of collagen-derived bioactive peptides and natural antioxidant compounds on proliferation and matrix protein synthesis by cultured normal human dermal fibroblasts", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 8, 2018, pages 10474 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20230046873A (ko) | 2023-04-06 |
| CN118019753A (zh) | 2024-05-10 |
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