KR20210075098A - 피부 노화 및 광 노화 치료 및 예방에 사용하기 위한 펩타이드 - Google Patents

피부 노화 및 광 노화 치료 및 예방에 사용하기 위한 펩타이드 Download PDF

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KR20210075098A
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파블로 펠레그리니
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콜로세움 콤비나토리얼 케미스트리 센터 포 테크놀로지 소시에타 아 리스폰사빌리타` 리미타타 인 포르마 아브레비아타 씨4티 에스.알.엘.
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Abstract

본 발명은 피부 노화 및 광 노화의 치료 및 예방에서 서열 ID No. 1을 포함하는 펩타이드 및 이의 화장용 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

피부 노화 및 광 노화 치료 및 예방에 사용하기 위한 펩타이드
본 발명은 화장품 응용분야를 위한 펩타이드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 피부 노화와 광 노화를 줄일 수 있는 서열 ID No. 1을 갖는 펩타이드에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 또한 서열 ID No. 1을 갖는 펩타이드 및 적어도 하나의 화장용으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 화장용 조성물에 관한 것이다.
신경 성장 인자(NGF)는 특정 표적 뉴런의 성장, 유지, 증식 및 생존의 조절에 주로 관여하는 신경 영양 인자 및 신경 펩타이드이다.
NGF는 워싱턴 대학의 동물학 연구소의 리타 레비-몬탈시니 교수(Levi-Montalcini R., Harvey Lect., 60:217, 1966)가 발견했으며, 그 발견은 NGF는 뉴런의 생물학적 기능의 발달과 보존 및 재생에 영향을 미칠 수 있기 때문에 신경 세포의 성장 및 분화 메커니즘에 대한 연구에 현저한 발전을 제공하였다. 이 분자를 발견하고 말초 신경계와 중추 신경계 모두에서 생물학적 기능을 특성화한 공로로 1986년 리타 레비-몬탈시니 교수는 노벨의학 및 생리학상을 수상하였다.
많은 시험관 내 및 생체 내 연구가 NGF가 외과적, 화학적, 기계적 및 허혈성의 신경 손상을 예방하는 데 있어 NGF의 병태생리학적 중요성을 입증하여, 이를 말초 및 중추 신경계의 여러 상태를 치료하는 데 이상적인 후보로 만들었다(Hefti F., J. Neurobiol., 25 : 1418, 1994; Fricker J., Lancet, 349 : 480, 1997). 사실, 수년 전부터 파킨슨 병과 알츠하이머 병을 앓고 있는 환자에 대한 임상 시험이 쥐과 NGF의 뇌내 투여에 의해 수행되었다(예를 들어, Olson L. et al., J. Neural Trans.: Parkinson's Disease and Dementia Section, 4: 79, 1992 참조). 이 연구의 결과는 동물 모델에서 이루어진 관찰을 확인했으며 쥐과 NGF 투여 후 가능한 부작용이 없음을 보여주었다. 이 특징은 이후 인간 재조합 NGF에 대해 확인되었다(Petty B.G. et al., Annals of Neurology, 36 : 244-246, 1994).
이러한 이벤트는 두 개의 세포 표면 수용체인 TrkA 및 p75에 결합한 결과로 NGF에 의해 매개된다. p75 수용체와 Trk NGF 수용체에 대한 두 유전자의 공동 발현은 잠재적으로 NGF에 대한 더 큰 반응성을 유발할 수 있으며 뉴로트로핀 인자 패밀리에 대한 추가 수준의 조절을 제안한다(Chao MV, Hempstead BL., "p75 and Trk: a two-receptor system", Trends Neurosci. 1995;18:321-6). 병아리 배아 감각 뉴런은 각각 10-9M 및 10-11M의 해리 상수를 갖는 두 가지 다른 부류의 뉴로트로핀 수용체 p75 및 Trk를 나타내며, 이는 더 높은 친화성 수용체의 낮은 점유만이 뉴로트로핀의 생물학적 작용을 매개하기 위해 필요함을 의미한다(Meakin SO, Shooter EM, "The nerve growth factor family of receptors", Trends Neurosci. 1992;15:323-31(Meakin SO, Shooter EM, "The nerve growth factor family of receptors", Trends Neurosci. 1992;15:323-31).
TrkA는 NGF에 대한 고 친화성 결합 부위를 형성하는 티로신 키나아제 활성을 갖는 수용체이다.
p75는 NGF에 대한 낮은 친화성 결합 부위를 형성하는 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 수퍼패밀리에 속하는 식별 가능한 세포질 촉매 도메인이 없는 막 횡단 단백질이다.
국제 특허 공개 WO2004026329A1, WO2011116090, WO2011049758A1 및 WO2005019266A2는 인간 신경 성장 인자(NGF)와 상호 작용하거나 결합하고 NGF의 기능을 중화시키는 펩타이드 또는 항체 및 일광 화상 및 백반증을 포함하여 NGF 활성이 해로운 다양한 질환 및 장애의 예방 및/또는 치료에서 이의 용도에 관한 것이다.
국제 특허 공보 WO2013065078A2는 상기 인용된 특허 공보에서 제시한 것과 달리, NGF 함유 제제를 피부에 국소 투여하면 색소 침착증의 영향을 받지 않는 건강한 피부의 경우 피부색 강화, 즉 색소 침착 증가를 달성하는데 효과적일 뿐만 아니라 백반증의 경우처럼 피부 무색증 또는 저 색소증과 관련된 피부병 상태의 개선을 달성하는데 효과적이다.
인간 NGF(NGF1-14)의 1-14 서열을 함유하는 펩타이드 단편은 일부 참조 문헌에 개시된 바와 같이 당업계에 NGF 모방체로 알려져 있다(P. Di Pietro et al., "Immobilization of Neurotrophin Peptides on Gold Nanoparticles by Direct and Lipid-Mediated Interaction: A New Multipotential Therapeutic Nanoplatform for CNS Disorders", ACS Omega (2017), 2(8), 4071-4079 e C. Satriano et al., "Neurotrophin-mimicking peptides at the biointerface with gold respond to copper ion stimuli", Physical Chemistry Chemical Physics (2016), 18(44), 30595-30604).
반면에, NGF1-14는 P75 수용체와 상호 작용하지 않고 ERK1/2 인산화를 유도하지 않고, 특히 PI3/Akt 캐스케이드의 활성화 및 CREB 인산화와 함께 TrkA 수용체와만 상호 작용하는 것으로 입증되었다(A. Travaglia et al., "A small linear peptide encompassing the NGF N-terminus partly mimics the biological activities of the entire neurotrophin in PC12 cells", ACS Chem Neurosci. 2015 Aug 19;6(8):1379-92).
마지막으로, WO99/39728은 p75가 단독으로 활성화될 때 각질 세포 및 멜라닌 세포 자멸사에 대해 신호를 보내지만, 대신 Trk 패밀리의 수용체와 함께 활성화될 때 세포 생존에 대한 신호를 보낸다는 것을 개시하였다.
때때로 모순되게, 최첨단 기술에서 얻은 지식에서 시작하여 출원인은 화장품 응용분야를 위한 NGF1-14의 잠재적인 사용을 조사하였다.
NGF1-14는 다음 순서로 표시된다:
서열 ID No. 1 : SSSHPIFHRGEFSV
광범위한 실험 동안, 출원인은 놀랍게도 NGF1-14가 프로 콜라겐 I 및 엘라스틴의 생산을 촉진할 수 있을뿐만 아니라 멜라닌 생산을 위한 멜라닌 세포를 활성화할 수 있다는 것을 발견하였다. 이 발견은 피부 노화 및 광 노화의 치료 및 예방을위한 화장용 조성물에 NGF1-14의 사용을 제안하였다.
또한, 출원인은 NGF1-14 펩타이드가 피부과용으로 바람직한 모든 rh-NGF 효과를 유지한다는 것을 발견하였다.
출원인에 의해 발견된 추가 이점은 전체 단백질과 반대되는 NGF1-14가 통상적인 펩타이드 합성 접근법에 의해 쉽게 합성될 수 있고 온화한 조건하에서 장기간 동안 저장될 수 있다는 것이다.
이러한 장점은 생산 비용의 현저한 감소를 유도하였고 NGF1-14를 화장품 용도에 매우 적합하고 매력적이게 만들었다.
출원인은 또한 NGF1-14의 활성을 실질적으로 변경하지 않고 NGF1-14의 아미노산 수 및 유형에 일부 변형이 일어날 수 있음을 발견하였다.
따라서, 본 발명의 첫 번째 목적은 피부 노화 및 광 노화의 치료 및 예방에 사용하기 위한 서열 ID No. 1 또는 서열 ID No. 1과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 및 더욱 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 펩타이드 및 이의 유도체 또는 염에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 두 번째 목적은 피부 노화 및 광 노화의 치료 및 예방에 사용하기 위한 서열 ID No. 1 또는 서열 ID No. 1과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 및 더욱 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 펩타이드 및 이의 유도체 또는 염 및 적어도 하나의 화장용으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 화장용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 세 번째 목적은 피부 노화 및 광 노화의 치료 및 예방에 사용하기 위한 서열 ID No. 1 또는 서열 ID No. 1과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 및 더욱 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 펩타이드 및 이의 유도체 또는 염 및 적어도 하나의 화장용으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 화장용 조성물의 국소 도포를 포함하여, 필요한 사람에서 피부 노화 및 광 노화의 치료 및 예방을 위한 비 치료 방법에 관한 것이다.
유리하게는, 본 발명의 비 치료 방법은 저주파 초음파 영동(LFS)에 의한 피부 전처리를 포함한다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1은 실시예 1에 기술된 바와 같이 참조 네저민(Negermin)™ 화합물(도 1a) 및 EC50 곡선(도 1b)과 함께 다양한 농도에서 NGF1-14의 활성 도표를 보여준다.
도 2는 실시예 2에 기술된 실험에 의해 관심이 있는 피부 영역의 처리 계획을 보여준다.
도 3은 실시예 2에 기술된 처리 후 측정된 표피(도 3a) 및 진피(도 3b)에 대한 NGF1-14의 수준을 보여준다.
도 4는 실시예 2에 기술된 처리 후 검출된 TrkA 수용체의 인산화 수준을 보여준다.
도 5는 실시예 3에 기술된 단일 투여 테스트 후 측정된 쥐의 진피에서 프로 콜라겐 I(도 5a) 및 엘라스틴(도 5b)의 수준을 보여준다.
도 6은 실시예 3에 기술된 2주 투여 테스트 후 측정된 쥐의 진피에서 프로 콜라겐 I(도 6a) 및 엘라스틴(도 6b)의 수준을 보여준다.
본 발명의 첫 번째 목적은 피부 노화 및 광 노화의 치료 및 예방에 사용하기위한 서열 ID No. 1을 포함하는 펩타이드에 관한 것이다.
본 발명에 따른 서열 ID No. 1은 서열 SSSHPIFHRGEFSV로 표현된다.
본 발명에 사용된 아미노산 서열의 약어는 다음 표 A에 보고된 IUPAC-IUB 명명법에 따른다.
표 A
Figure pct00001
본 발명에 따른 펩타이드는 최적으로 정렬되었을 때 서열 ID No. 1에 대해 적어도 85%, 적어도 90% 및 적어도 95% 서열 동일성을 가질 수 있다. 서열의 최적 정렬은 다양한 공지된 방법 및 공지된 알고리즘의 컴퓨터화된 구현에 의해 수행될 수 있다(예를 들어, Wisconsin Genetics Software Package, Release 7.0, Genetics Computer Group, Madison, WI와 같은 BLAST, TFASTA, BESTFIT). 소프트웨어는 생물공학 정보에 대한 국제 센터 www.ncbi.nlm.nih.gov/를 통해 소프트웨어를 얻을 수 있는 BLAST 알고리즘(Altschul et al., Mol. Biol. (1990), 215, 403-410)이 사용될 수 있다.
펩타이드 서열에 대한 "백분율 서열 동일성"은 두 서열에서 동일한 잔기의 백분율을 의미한다. 백분율 서열 동일성(% SI)은 다음 공식으로 계산된다:
% SI = (nt-nd) x 100/nt
여기서 nt는 기본 서열의 잔기 수이고 nd는 최대 아미노산 수가 동일하도록 정렬될 때 마주 보는 서열에서 동일하지 않은 잔기의 총 수이다. 따라서, 서열 SSSHPIFHRGDFSV는 서열 ID No.1과 약 92.8%의 서열 동일성을 가질 것이다(nd = 1 및 nt = 14).
본 발명에 따른 펩타이드는 동일한 길이의 서열 ID No. 1의 동일한 길이 또는 최대 16개 아미노산 길이를 가질 수 있다.
본 발명의 서열 ID No. 1을 포함하는 펩타이드에서 아미노산 서열의 변이는 펩타이드 활성에 영향을 미치지 않는 아미노산의 보존적 치환을 포함한다. 펩타이드 활성을 유지할 수 있는 치환은 (a) 시트 또는 나선형 3차원 구조와 같은 치환 영역에서 펩타이드 주쇄의 구조를 유지하는 효능, (b) 전하를 유지하는 효능 또는 표적 영역에서 분자의 소수성 또는 (c) 측쇄의 부피를 유지하는 효능의 기준으로 선택된다.
보존적 치환의 예는 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루타민산 및 아스파라긴산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(류신, 이소류신, 발린 및 메티오닌), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신) 및 소형 아미노산(글리신, 알라닌, 세린 및 트레오닌)으로 이루어진 그룹에 속한다.
일반적으로 특정 활성을 변경하지 않는 아미노산 치환은 본 발명의 기술 분야에 알려져 있다.
가장 일반적으로 일어난 변경은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 및 반대 변경이다. 보존적 치환의 또 다른 예는 다음 표 C에 도시된다.
표 C
Figure pct00002
길이에 따라, 본 발명의 펩타이드는 당업계에 주지된 방법, 예를 들어 자동 펩타이드 합성기에 의해 합성되거나 유전 공학 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 융합 파트너와 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 융합 유전자는 유전 공학에 의해 제조된 후 숙주 세포로 형질 전환되어 융합 단백질을 발현한다. 그 후, 본 발명의 펩타이드는 원하는 펩타이드를 생산하기 위해 프로테아제 또는 화합물을 사용하여 융합 단백질로부터 절단 및 분리된다. 이를 위해, 인자 Xa 또는 엔테로키나제와 같은 프로테아제 또는 CNBr 또는 하이드록실아민과 같은 화합물에 의해 절단될 수 있는 아미노산 잔기를 암호화하는 DNA 서열은 본 발명의 융합 파트너와 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 사이에 삽입될 수 있다.
본 발명의 화장용 조성물은 서열 ID No. 1을 포함하는 펩타이드 및 적어도 하나의 화장용으로 허용 가능한 부형제를 포함한다.
본 발명의 화장용 조성물은 0.00000001중량% 내지 20중량%, 바람직하게는 0.000001중량% 내지 15중량%, 더욱 바람직하게는 0.0001중량% 내지 10중량% 및 더욱더 바람직하게는 0.0001중량% 내지 5중량% 범위 양의 펩타이드, 또는 이의 유도체 및/또는 염을 포함할 수 있다.
본 발명의 화장용 조성물은 이러한 조성물을 더 미용적으로 또는 심미적으로 허용 가능하게 하거나 추가 사용 이점을 제공하기에 적합한 다양한 다른 선택적 구성 요소를 함유할 수 있다. 이러한 통상적인 선택적 성분은 당업자에게 잘 알려져있다. 이들은 베닌저와 맥이웬이 편집한 CTFA 국제 화장품 성분 사전 및 핸드북, 7판(The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association, Inc., Washington, D.C., 1997)에서 발견된 것과 같은 임의의 화장용으로 허용 가능한 모든 성분을 포함한다. 본 발명에서 사용되는 "화장용으로 허용 가능한"은 아래에 정의된 바와 같이 피부, 모발 또는 다른 적합한 기질과 접촉하여 사용하기에 적합한 재료(예를 들어, 화합물 또는 조성물)를 의미한다.
본 발명에 유용한 화장용으로 허용 가능한 성분은 화장용으로 허용 가능한 담체, 휘발성 및 비 휘발성 용매, 물 및 기타 추가 성분, 예컨대 계면 활성제, 방부제, 흡수제, 킬레이트제, 윤활제, 보습제 발수제, 항산화제, UV 흡수제, 항자극제, 비타민, 미량 금속, 항균제, 향료, 염료 및 색소 성분 및/또는 구조화제를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 표현 "화장용으로 허용 가능한 담체"는 상기 정의된 바와 같이 화장용으로 허용 가능한 하나 이상의 혼용 가능한 고체 또는 액체 충전제, 희석제, 증량제 등을 의미한다. 본 발명에 사용되는 용어 "혼용 가능한"은 본 발명의 조성물의 구성요소는 일반적인 사용 상황에서 조성물의 효능을 실질적으로 감소시킬 수 있는 상호 작용이 없는 방식으로 본 발명의 1차 활성제 및 서로 조합될 수 있음을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 담체의 유형은 원하는 제품의 유형에 따라 다르다. 본 발명에 유용한 조성물은 매우 다양한 제품 형태일 수 있다. 이들은 로션, 크림, 겔, 스틱, 스프레이, 연고, 페이스트, 무스 및 화장품(예를 들어, 파운데이션을 포함한 고체, 반고체 또는 액체 메이크업)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
이러한 제품 형태는 용액, 에어로졸, 에멀젼(수중유 또는 유중수 포함), 겔, 고체 및 리포좀을 포함하나 이에 제한되지 않는 여러 유형의 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 조성물의 형태에 따라 상이한 양으로 물을 포함할 수 있다. 물의 양은, 존재한다면, 총 조성물의 중량에 대해 1중량% 미만 내지 99중량% 초과의 범위일 수 있다. 본 발명의 수성 조성물은 특히 수성 로션 또는 유중수 또는 수중유 에멀젼 또는 다중 에멀젼(유중수중유 또는 수중유중수 삼중 에멀젼)으로 제제화된다. 이러한 에멀젼은 공지되어 있으며, 예를 들어 "Cosmetics and Toiletries"- November 1986- Vol. 101 - pages 101-112에서 C. FOX에 의해 기술된다.
고체 조성물, 스프레이 조성물 및 유중수 크림은 일반적으로 조성물의 총 중량에 대해 10중량% 미만, 보다 바람직하게는 5중량% 미만 양의 물을 포함한다. 롤온(Roll-on) 조성물, 수성 조성물 및 탈취제는 일반적으로 조성물의 총 중량에 대해 약 15중량% 내지 약 99중량%, 보다 바람직하게는 약 30중량% 내지 약 90중량%, 더욱더 바람직하게는 약 50중량% 내지 약 80중량% 양의 물을 포함한다.
본 발명의 조성물은 하나 이상의 휘발성 용매를 포함할 수 있다. 존재한다면, 휘발성 용매 또는 용매의 혼합물은 일반적으로 조성물의 총 중량에 대해 약 10중량% 내지 약 90중량%, 더욱 바람직하게는 약 25중량% 내지 약 75중량%, 더욱더 바람직하게는 약 35중량% 내지 약 65중량% 수준일 것이다. 본 발명에서 유용한 용매는 바람직하게는 유기 휘발성 용매이다.
본 발명에서 사용되는 "휘발성"은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 주변 조건하에서 상당한 양의 증기압을 갖는 물질을 의미한다.
본 발명에서 사용하기 위한 휘발성 용매는 바람직하게는 25℃에서 약 2kPa 이상, 더욱 바람직하게는 약 6kPa 이상의 증기압을 가질 것이다. 본 발명에서 사용하기 위한 휘발성 용매는 바람직하게는 약 150℃ 미만, 보다 바람직하게는 약 100℃ 미만, 더욱더 바람직하게는 약 90℃ 미만, 더욱더 바람직하게는 여전히 약 80℃ 미만의 정상 대기(1 atm) 하에서 비등점을 가질 것이다.
바람직하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 휘발성 용매는 비교적 무취이고 인간 피부에 사용하기에 안전할 것이다. 적합한 휘발성 용매는 C1-C4 알코올, 휘발성 실리콘 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 휘발성 용매는 C1-C4 알코올 및 이들의 혼합물이다. 본 발명에서 사용하기에 더 바람직한 것은 에탄올이다.
본 발명의 조성물은 또한 하나 이상의 비 휘발성 용매를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 비 휘발성 용매 또는 용매 혼합물은 일반적으로 조성물의 총 중량에 대해 약 1중량% 내지 약 20중량%, 더욱 바람직하게는 약 2중량% 내지 약 10중량%, 더욱더 바람직하게는 약 3중량% 내지 약 5중량% 수준일 것이다. 적합한 비 휘발성 용매는 벤질 벤조에이트, 세테아릴 알코올, 세틸 알코올, 다이에틸 프탈레이트, 아이소프로필 미리스테이트, 다이메티콘, 카프릴릴메티콘 및 이들의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
몇 가지 다른 추가 성분이 본 발명의 조성물에 존재할 수 있다. 이들은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리바이닐피롤리돈(PVP), 하이드록시프로필 메틸셀룰로스(HPMC) 및 폴록사머로부터 선택된 친수성 폴리머; 벤조페논-3과 같은 UV 안정화제; 토코페릴 아세테이트와 같은 항산화제; 페녹시에탄올, 벤질 알코올, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤과 같은 방부제; 젖산, 구연산, 구연산 나트륨, 숙신산, 인산, 수산화나트륨, 탄산나트륨과 같은 pH 조절제; 파네솔, 아연 페놀설포네이트 및 에틸헥실글리세린과 같은 탈취제 및 항균제; 트라이베헤닌, 글리세린과 같은 보습제; 알란토인과 같은 피부 컨디셔닝제; 트라이메틸 아이소프로필 부탄아미드 및 멘톨과 같은 냉각제; 판테놀, 판테틴, 판토테인, 판테닐 에틸 에터 및 이들의 조합과 같은 헤어 컨디셔닝 성분; 프로페인, 아이소프로페인, 부테인 및 아이소부테인과 같은 추진제; 아세트산칼륨 및 염화나트륨 및 이들의 혼합물과 같은 일반적인 염; 향수와 염료를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
존재하는 경우, 이러한 추가 성분은 바람직하게는 조성물의 총 중량에 대해 10중량% 미만, 더욱 바람직하게는 5중량% 미만의 수준으로 존재할 것이다.
본 발명의 펩타이드는 프로 콜라겐 I 및 엘라스틴의 생산을 촉진할뿐만 아니라 멜라닌 생산을 위한 멜라닌 세포를 활성화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 화장용 조성물은 피부 노화 및 광 노화의 치료 및 예방에 특히 유용하다.
본 발명은 청구 범위에 기술된 본 발명의 범위를 제한하지 않는 하기 실시예에서 추가로 기술될 것이다.
실시예 1
시험관 내 활성
쥐 갈색 세포종 세포주(PC12)의 NGF 처리는 c-fos mRNA 및 단백질 발현을 초래한다(J. Milbrandt, "Nerve growth factor rapidly induces c-fos mRNA in PC12 rat pheochromocytoma cells", Proc Natl Acad Sci U S A. 1986 Jul;83(13):4789-93).
밀브란트의 연구를 시작으로, 출원인은 루시페라제 리포터 유전자(PC12-Luci)를 구동하는 인간 c-fos 프로모터로 안정적으로 형질감염된 클론(B9)을 사용하여 NFG 수용체의 활성화를 관찰하였다. 이 클론은 NGF1-14의 활성 특성화를 위한 기능 및 정량 분석을 설정하는 데 사용하였다. 실험은 NGF 수용체, TrkA 및 p75를 내생적으로 발현하는 PC12-Luci 세포에서 수행하였다. 세포는 다음을 포함하는 완전한 배양 배지에서 유지하였다:
● DMEM-F12 혼합물(DMEM-F12 Glutamax; Life Technologies, GIBCO 10565-018)
● 5% 소 태아 혈청(FBS, Sigma Aldrich, F7524)
● 10% 말 혈청(HS, Sigma Aldrich, H1138)
● 1% 페니실린-스트렙토마이신(Life Technologies, GIBCO 15140-122)
계대를 위해, 세포를 PBS로 부드럽게 세척한 다음 실온 또는 37℃에서 5분 동안 트립신과 함께 배양하였다. 배지를 첨가하고 세포를 재현탁시켰다(6-8회).
실험은 50μg/ml 콜라겐 I 형으로 이전에 코팅된 검은색 96 웰에서 연속적으로 수행하였다.
PC-12-Luci 세포를 100μl 완전 성장 배지에 25000/웰로 접종하였다. 24시간 후 세포 배지를 조심스럽게 제거하였다. 그런 다음 세포를 37℃에서 4시간 동안 0.1% BSA(50μl/웰)가 포함된 표준 티로드(Tyrode) 완충액에서 NGF1-14의 5가지 농도(범위 30ng/ml-300μg/ml, 1:10 연속 희석)와 함께 배양하였다. 참조 네저민(Negermin)™ 화합물(MimeTech Srl에 의해)은 참조로서 30μg/ml로 추가하였다. NGF1-14의 저장 용액을 멸균수에 재현탁하고 분취하여 -20℃에 보관하였다. 네저민(Negermin)™ 화합물의 저장 용액을 제제 완충액에 재현탁하고 -20℃에 보관하였다.
배양 후, EnSpire 멀티모드 플레이트 리더(PerkinElmer)를 사용하여 30초 동안 기본 발광 수준을 관찰하였다. 그런 다음, 트립톤-루시페린 혼합물을 1:1 비율로 세포(50μl/well)에 첨가하여 세포 용해를 유도하였다. 얻어진 발광 신호를 추가 60초 동안 관찰하였다.
위에 언급된 용액 및 완충액은 다음과 같은 조성물을 가진다:
● 제제 완충액: 50mM NaH2PO4, 100mM NaCl, pH 7.2,
● 티로드 완충액: pH 7.4의 물 속 130mM NaCl, 5mM KCl, 2mM CaCl2, 1mM MgCl2, 5mM NaHCO3, 20mM HEPES; 멸균 여과하고 4℃에서 보관,
● 소 혈청 알부민(BSA), 무 지방산(Sigma, A8806); 저장 용액: 티로드 완충액 속 10%; 분취하고 -20℃에서 보관,
● 트리톤 용해 저장 용액: 25mM TRIS, 25mM Na2HPO4, 2mM DTT, 10% 글리세롤, 2% TRITON X-100; 분취하고 -20℃에서 보관,
● 루시페린 저장 용액: 20mM 트리신, 2.67mM MgSO4, 0.1mM EDTA, 33.3mM DTT, 270μM 조효소 A, 470μM 루시페린, 530μM ATP; 분취하고 -80℃에서 보관.
모든 발광 값은 기본 발광 수준에 대해 정규되었다. 반응 값은 기록된 동역학의 발광 평균으로 계산되었다.
데이터를 추가로 분석하였고(예를 들어, 용량-반응 곡선 및 EC50 값 계산) 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)(GraphPad Software, Inc.)을 사용하여 그래프를 그렸다. 결과는 참조 네저민(Negermin)™ 화합물(도 1a) 및 EC50 곡선(도 1b)과 함께 다양한 농도에서 NGF1-14의 활성 플롯을 보여주는 도 1에 예시된다. 결과는 NGF1-14가 용량 의존적 방식(Ec50 = 290.95ng/ml)으로 기저 발광 수준을 증가시키는 것을 나타내었다.
결론적으로, 이러한 결과는 NGF1-14가 기능적 활성을 가지고 있음을 보여주며, 참조 표준 네저민(Negermin)™ 화합물보다 높지만 rhNGF(Ec50 rhNGF 1.4 ng/ml)보다 낮은 시험관 내 효능을 나타낸다. 감소된 효능은 제안된 화장품 용도와 일치한다.
실시예 2
전임상 연구
각막 층을 관통하고 진피에 도달하며, 또한 초음파 영동 유사 전략을 사용하여 피부 침투를 촉진하는 NGF1-14 겔 제제의 능력을 평가하도록 분포 실험을 수행하였다.
암컷 성인 Sprague Dawley(SD) 쥐(10-12개월)의 면도된 등쪽 부위에 테이프 스트리핑(Tape-striping) 및 초음파를 적용하였다.
저주파 초음파 영동(LFS)은 일반적인 임상 관행에 따라 20KHz의 주파수(약 2cm의 팁 변위, 연속 모드)에서 작동하는 소닉스 초음파 프로세서 모델 VCX 400을 사용하여 6분 또는 10분 동안 적용하였는데 이는 초음파 영동의 연장된 사용은 피부 투과를 증가시키는 것으로 알려져 있지만 사용에 적합하지 않은 상당한 열 손상을 유발하는 것으로 알려져 있다(참조. International Journal of Health Sciences & Research 477 Vol.5; Issue: 5; May 2015: A Review on Ultrasound Parameters and Methods of Application in Transdermal Drug Delivery).
비히클 대조군 및 NGF1-14 겔 제제는 LFS(S)로 전처리된 피부 부분 또는 면도/테이프 스트리핑 피부(NS)에 투여하였다.
비히클 대조군 및 NGF1-14 겔 제제의 조성물은 다음 표 1에 보고되어 있다.
비히클 대조군 NGF1-14
히알루론산 나트륨계 하이드로겔 약 90-95% 약 90-95%
폴리바이닐 알코올(Sigma Aldrich　 Mowiol®　40-88) 5-10% 5-10%
파라벤 안정화제(Sigma Aldrich) 1% 미만 1% 미만
NGF1-14 - 0.1%
히알루론산 나트륨계 하이드로겔은 50 내지 150 KDa 범위의 분자량을 갖는 히알루론산 나트륨(콘티프로 제조)을 물에 용해시켜 제조하였다.
2시간 후에 처리를 반복하고, 두 번째 겔/NGF 모방체 적용 2시간 후에 피부 샘플을 절개하기 위해 쥐를 희생시켰다.
처리 계획은 도 2에 도시되며, 여기서 N 및 G는 각각 NGF1-14 및 비히클 겔로 LFS 없이 처리된 영역을 나타내고 NS 및 GS는 각각 NGF1-14 및 비히클 겔로 LFS로 처리된 영역을 나타낸다. NL 및 GL은 LFS 영역에 인접하고 겹치지 않는 피부 영역을 나타낸다.
초음파 처리된(S) 및 초음파 처리되지 않은(NS) 피부 영역으로부터의 표피 및 진피를 랜싯을 사용하여 분리하고 PBS로 세척하고 두 부분으로 절단하였다. 전자는 -80℃에서 멸균 튜브에 보관하여 전체 단백질 추출 및 생화학적 분석을 위해 처리하였다.
피부 부분을 PFA 4%에 담가 후속 조직학 및 면역조직화학 평가를 위해 처리하였다.
표피 및 진피에서 추출한 단백질 추출물을 사용하여 각막 층을 관통하여 진피에 도달하는 NGF1-14 겔 제제의 능력에 대한 LFS 적용의 효과를 평가하였다.
NGF 1-14의 정량은 포스페이트 완충액(pH 7.4) 및 아세토나이트릴로 용리하는 역상 C4 컬럼에서 HPLC-UV에 의해 결정하였다. HPLC-UV 방법은 선형성, 반복성, 재현성 및 회수율에 대해 검증하였다.
결과는 도 3a 및 3b에 도시된다. 비히클 처리와 비교하여, LFS 후 표피와 진피에서 NGF1-14의 현저한 증가가 발견되었다.
NGF 모방체/LFS 적용의 효능은 NGF 생존/영양 수용체 TrkA의 발현 수준 및 활성화를 분석함으로써 확인하였다.
TrkA의 인산화에 대한 NGF(1-14)의 효과는 일반적인 실험실 관행에 따라 P-TrkA에 대한 항체를 사용하여 펩타이드로 처리된 PC12 세포 배양액에서 얻은 단백질 추출물의 웨스턴 블롯 분석에 의해 테스트하였다.
도 4에서 볼 수 있듯이, TrkA의 증가된 인산화 수준은 관련 비히클 대조군과 비교할 때 LFS가 있거나 없는 NGF1-14 적용을 받은 모든 진피 샘플에서 발견되었다.
실시예 3
피부 노화와 광 노화
세포 외 기질 콜라겐과 엘라스틴의 단백질은 상처 회복, 피부 노화 및 광 노화에 관여하기 때문에, 이 두 단백질 수준에 대한 NGF1-14의 국소 도포의 영향도 분석하였다.
프로 콜라겐 I 및 엘라스틴은 상용 엘리사 키트를 사용하여, 처음에는 단일 투여 테스트에서 2주 투여 테스트로 측정하였다.
단일 투여 테스트의 결과는 도 5에 요약되어 있다. 두 단백질을 분석하여 유사한 경향을 관찰하였다: 초음파 처리 후 0.1% 용량에서 NGF1-14 처리된 쥐의 진피에서 프로 콜라겐 I(A)와 엘라스틴(B) 모두의 증가가 탐지되었다. 그 효과는 초음파를 적용하지 않고는 눈에 띄지 않았다. 실험 오차 내에서 엘라스틴의 약간의 증가가 감지된 반면, 콜라겐 I의 값은 양성 대조군 값과 비슷하였다.
단일 및 2주 투여 테스트
0.1% 용량(P 0.1%)에서 NGF1-14의 보호 작용은 단일 투여 테스트(1일)에서 처음으로 그런 후에 처리 전 3주 동안 UV-B의 하위 홍반 수준(MED = 60mJ/cm2 1일 2회)에 노출된 성인 피부에 대해 평가하였다. 이 실험 절차는 노화에서 발생하는 구조적 및 분자적 변화를 유도하기 때문에 광 노화 모델(PAG)이라고도 한다.
P 0.1% 또는 비히클 겔로 국소 처리를 2주 동안 PAG 및 PAG가 없는 쥐의 면도된 등쪽 피부에 적용하였다. UV-B 노출(MED = 60mJ/cm2 하루 1회)도 지난 주 처리 중에 수행하였다.
쥐를 희생시키고 란셋을 사용하여 피부를 절개하고 PBS로 세척하고 두 부분으로 자른다. 전자를 전체 단백질 추출 및 생화학적 분석을 위해 처리하기 위해 -80℃에서 멸균 튜브에 보관하였다. 후자를 PFA 4%에 담그고 조직학적 및 면역조직 화학적 평가를 위해 처리하였다.
단일 투여 연구와 일치하여, 광 노화는 진피(도 6a) 및 검출된 엘라스틴 발현(도 6b)에서 프로 콜라겐 I의 감소를 유도하였다.
P 0.1%의 적용은 그 효과가 건강한 피부에서 더 두드러졌지만, PAG가 없는 및 PAG 진피 모두에서 프로 콜라겐 I 증가를 초래하였다(도 6a). 변화는 엘라스틴 농도에서 덜 중요하였다.
실시예 4
태닝 작용
멜라닌 생산을 위한 멜라닌 세포의 활성화에 대한 NGF1-14의 국소 적용 효과를 평가하였다.
이미 설정된 프로토콜에 따르면, 정상적인 인간 멜라닌 세포의 1차 세포 배양액을 페트리 접시에 시드하고 다양한 농도에서 NGF 1-14의 존재 유무에 관계없이 1주일 동안 배양하였다. 멜라닌 함량은 효소 면역분석 ELISA로 측정하였다. 펩타이드가 풍부한 배양액에서 증가가 관찰되었다.
실시예 5
피부 자극 테스트
피부 자극 테스트는 피부 화장품 응용분야를 위한 맞춤형 분석 프로토콜, 즉 MTT 비색 분석 및 LDH 방출 분석을 적용하여 수행하였다.
MTT 비색 분석은 살아있는 세포에서만 활성화되고 MTT(노란색)와 반응하여 청색 염을 형성하는 미토콘드리아 효소 숙시네이트 탈수소효소의 활성을 측정하며, 살아있는 수에 비례하는 광학 밀도(ODn)는 570nm의 파장에서 분광 광도계로 정량화된다.
LDH 방출 분석은 세포질 효소인 젖산 탈수소효소의 배양 배지 속 양을 측정하며, 방출은 세포막의 완전성 손실을 의미한다. 양은 490nm의 파장에서 특정 시약을 사용하여 분광 광도계로 정량화된다.
테스트는 EPI-100-ASY 분석 배지 속 EpiDermTM 조직(MatTek Corporation, Bratislava, Slovakia)에서 활성 물질(0.1%)보다 3배 높은 0.3% 용량의 NGF1-14 겔 제제의 두 샘플(1 및 2)로 3회 수행하였다. 양성 대조군으로 1% Triton X-100 용액을 사용하였다. 음성 대조군으로 펩타이드가 없는 겔 매트릭스를 사용하였다. 양성 및 음성 대조군은 2회 실행하였다. 샘플을 18시간 동안 밤새 접촉시켰다. 테스트 결과는 다음 표 2(MTT) 및 3(LDH)에 요약되어 있다.
평균 값(OD) ± SD 정규화 값 ± SD
음성 대조군 2.0±0.1 100.0±3.1
양성 대조군 0.7±0.0 33.3±2.0
샘플 1 1.8±0.0 91.6±1.8
샘플 2 1.9±0.1 99.3±3.8
평균 값(OD)±SD 정규화 값±SD
음성 대조군 0.13±0.00 1.0±0.0
양성 대조군 1.04±0.04 8.0±0.3
샘플 1 0.24±0.04 1.9±0.3
샘플 2 0.14±0.05 1.1±0.4
MTT 분석에서, 음성 대조군에 비해 활력이 70% 이상일 때 샘플은 "자극성이없는" 것으로 간주된다. LDH 분석에서 LDH 방출 값이 음성 대조군에 등록된 값의 5 배보다 낮을 때 샘플은 "자극성이 없는" 것으로 간주된다. 그런 다음 샘플 1과 2는 모두 "자극이 없는" 것으로 간주되었다.
실시예 6
피부 민감화 테스트
엘리사 키트를 사용하여 IL-18 방출 분석을 적용하여 피부 민감화 테스트를 수행하였다.
IL-18 방출 분석은 배양 배지 속 인터루킨 18(IL-18)의 양을 측정한다. IL-18은 알레르기성 접촉 민감화를 유도하는 데 핵심적인 역할을 하는 전 염증성 사이토카인이다. 양은 직접 ELISA 방법으로 정량화되는데, 즉, 발색은 배양 배지의 사이토카인 양에 정비례한다.
테스트는 EPI-100-ASY 분석 배지 속 EpiDermTM 조직(MatTek Corporation, Bratislava, Slovakia)에서 활성 물질(0.1%)보다 3배 높은 0.3% 용량의 NGF1-14 겔 제제의 두 샘플(1 및 2)로 3회 수행하였다. 양성 대조군으로 0.15% DNCB(2,4-DiNitroChloroBenzene) 용액을 사용하였다. 음성 대조군으로 펩타이드가 없는 겔 매트릭스를 사용하였다. 양성 및 음성 대조군은 2회 실행하였다. 샘플을 18시간 동안 밤새 접촉시켰다. 테스트 결과는 다음 표 4에 요약되어 있다.
평균 값(pg/ml)±SD 정규화 값±SD
음성 대조군 27.0±3.8 1.0±0.1
양성 대조군 252.3±16.4 9.3±0.6
샘플 1 38.3±5.6 1.4±0.2
샘플 2 45.6±8.2 1.7±0.3
IL-18 방출 분석에서 IL-18 방출 값이 음성 대조군에 등록된 값의 2 배보다 낮을 때 샘플은 "민감화되지 않음"으로 간주된다. 그런 다음 샘플 1과 2는 모두 "민감화되지 않음"으로 간주되었다.
실시예 7
NGF1-14 pKa 및 Log P 및 D 특징화
Ag/AgCl 이중 접합 기준 pH 전극, Sirius D-PAS 분광계 및 탁도 감지 장치가 장착된 자동 전위차 적정기 Sirius T3(Sirius Analytical Instruments Ltd., East Sussex, UK)를 사용하여 실험 pKa 및 분배 계수(log P 및 log D)를 결정하였다. pH 전극은 pH 범위 1.8-12.2에서 적정법으로 보정되었다. 오버헤드 교반기를 사용하였고 온도 프로브는 적정 과정 동안 온도를 관찰하였다. 적정 실험은 25 ± 1℃의 아르곤 분위기하에서 0.15M KCl 용액(ISA 물)에서 수행하였다. 모든 테스트는 표준화 된 0.5 M KOH 및 0.5 M HCl을 적정 시약으로 사용하여 수행되었으며, 분할 계수 테스트를 위해 ISA 물(ISA 물의 5%) 속 포화 옥탄올을 분할 용매로 사용하였다. pKa는 pH 미터 적정에 의한 전위차 방법에 의해 결정된다. 분말(약 0.5mg)을 1.5ml의 ISA 물에 용해시키고 적정을 pH 범위 2.0-12.0에서 3회 수행하였다. Log P는 분말(약 0.7mg)을 1ml의 ISA 물에 용해시킨 다음 세 가지 다른 비율의 옥탄올(일반적으로 50%, 60%, 70%)에서 pH 미터 적정을 수행하여 3회 수행하였다. 도구 모델에 대한 예측 pKa 및 계산된 log P는 ACD/Percepta를 사용하여 수행하였다.
결과는 다음 표 5에 예시되어 있다. Log P 값은 펩타이드가 절대 중성 분자가 아니므로 상대 값으로 간주되어야 된다.
산 pKa 4.42±0.05(n=50)
염기 pKa 7.41±0.07(n=50)
염기 pKa 6.43±0.06(n=50)
Log P (w/o) -8.50
Log D (7.4) -7.90
본 발명은 그 일부 특정 실시태양을 특별히 참조하여 개시되었지만, 첨부된 청구 범위에 정의된 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 당업자에 의해 수정 및 변경이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> COLOSSEUM COMBINATORIAL CHEMISTRY CENTRE FOR TECHNOLOGY SOCIETA A RESPONSABILITA' LIMITATA IN FORMA ABBREVIATA C4T S.R.L. <120> Peptide for cosmetic application <130> COL3P1WO <160> 1 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> None <400> 1 Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val 1 5 10

Claims (12)

  1. 피부 노화 및 광 노화의 치료 및 예방에 사용하기 위한 서열 ID No. 1 또는 서열 ID No. 1과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 및 더욱 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 펩타이드 및 이의 유도체 또는 염.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 최대 16개 아미노산, 바람직하게는 최대 15개 아미노산 및 더욱 바람직하게는 14개 아미노산 길이를 갖는 것인 펩타이드.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열 ID No. 1 또는 서열 ID No. 1과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 및 더욱 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 펩타이드 및 이의 유도체 또는 염.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유도체는 유기 화합물로 화학적으로 변형되거나 보호된 상기 펩타이드의 N- 및/또는 C-말단을 포함하는 것인 펩타이드.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 유기 화합물은 포스포릴, 글리코실, 아실, 알킬, 카복실, 하이드록실, 비오티닐, 유비퀴티닐 및 아미도기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 펩타이드.
  6. 피부 노화 및 광 노화의 치료 및 예방에 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 정의된 펩타이드, 및 적어도 하나의 화장용으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 것인 화장용 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 조성물은 0.00000001중량% 내지 20중량%, 바람직하게는 0.000001중량% 내지 15중량%, 더욱 바람직하게는 0.0001중량% 내지 10중량% 및 더욱더 바람직하게는 0.0001중량% 내지 5중량% 범위 양의 상기 펩타이드, 또는 이의 유도체 및/또는 염을 포함하는 것인 화장용 조성물.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 화장용으로 허용 가능한 부형제는 화장용으로 허용 가능한 담체, 휘발성 및 비 휘발성 용매, 물, 계면 활성제, 방부제, 흡수제, 킬레이트제, 윤활제, 보습제, 발수제, 항산화제, 자외선 흡수제, 자극 방지제, 비타민, 미량 금속, 항균제, 향수, 염료 및 착색제 및/또는 구조화제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 화장용 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 화장용으로 허용 가능한 담체는 용액, 에어로졸, 수중유 에멀젼, 유중수 에멀젼, 겔, 고체 및 리포솜을 포함하는 것인 화장용 조성물.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 화장용 조성물은 로션, 크림, 겔, 스틱, 스프레이, 연고, 페이스트, 무스 및 화장품의 형태인 화장용 조성물.
  11. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 정의된 펩타이드 및 적어도 하나의 화장용으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 화장용 조성물의 국소 도포를 포함하여 이를 필요로 하는 사람의 피부 노화 및 광 노화의 치료 및 예방을 위한 비 치료 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 방법은 저주파 초음파 영동(LFS)에 의한 피부 전처리를 포함하는 것인 비 치료 방법.
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