ME00226B - Humana anti-ngf neutrališuća antitijela kao selektivni inhibitori ngf signalne kaskade - Google Patents

Humana anti-ngf neutrališuća antitijela kao selektivni inhibitori ngf signalne kaskade

Info

Publication number
ME00226B
ME00226B MEP-2008-315A MEP2008315A ME00226B ME 00226 B ME00226 B ME 00226B ME P2008315 A MEP2008315 A ME P2008315A ME 00226 B ME00226 B ME 00226B
Authority
ME
Montenegro
Prior art keywords
amino acid
sequence
seq
ngf
antibody
Prior art date
Application number
MEP-2008-315A
Other languages
English (en)
Inventor
Kenneth D Wild Jr
James J S Treanor
Haichun Huang
Heather Inoue
Tie J Zhang
Frank Martin
Original Assignee
Medarex Llc
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=43466840&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ME00226(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Medarex Llc, Amgen Inc filed Critical Medarex Llc
Priority claimed from EP04778409A external-priority patent/EP1648509B8/en
Publication of ME00226B publication Critical patent/ME00226B/me

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/32—Alcohol-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A61P29/02—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID] without antiinflammatory effect
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C12N15/68—Stabilisation of the vector
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G03—PHOTOGRAPHY; CINEMATOGRAPHY; ANALOGOUS TECHNIQUES USING WAVES OTHER THAN OPTICAL WAVES; ELECTROGRAPHY; HOLOGRAPHY
    • G03F—PHOTOMECHANICAL PRODUCTION OF TEXTURED OR PATTERNED SURFACES, e.g. FOR PRINTING, FOR PROCESSING OF SEMICONDUCTOR DEVICES; MATERIALS THEREFOR; ORIGINALS THEREFOR; APPARATUS SPECIALLY ADAPTED THEREFOR
    • G03F7/00—Photomechanical, e.g. photolithographic, production of textured or patterned surfaces, e.g. printing surfaces; Materials therefor, e.g. comprising photoresists; Apparatus specially adapted therefor
    • G03F7/004—Photosensitive materials
    • G03F7/09—Photosensitive materials characterised by structural details, e.g. supports, auxiliary layers
    • G03F7/091—Photosensitive materials characterised by structural details, e.g. supports, auxiliary layers characterised by antireflection means or light filtering or absorbing means, e.g. anti-halation, contrast enhancement
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)

Abstract

Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja interaguju sa ili se vezuju za humani faktor rasta nerava (NGF - Nerve Growth Factor) i tako neutrališu funkciju NGF. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske preparate navedenih antitela i postupke neutralizacije funkcije NGF, a posebno obezbeđuje postupak za tretiranje poremećaja koji su povezani sa NGF (npr., hronični bol) primenom farmaceutski efikasne količine anti-NGF antitela. Takođe, obezbeđeni su postupci za detekciju određene količine NGF u uzorku korišćenjem anti-NGF antitela.

Description

Poziv na povezanu patentnu prijavu
Predmetna patentna prijava je povezana sa i ima prioritet u odnosu na U.S. privremenu patentnu prijavu serijski br. 60/487,431, podnetu 15.07.2003., čiji je opis ovde inkorporiran po referenci.
Oblast pronalaska
Predmetni pronalazak se odnosi na humana monoklonska antitela koja se vezuju za humani faktor rasta nerava (NGF). Takođe, opisani su i preparati i postupci za tretiranje bola i poremećaja koji su udruženi sa bolom.
Pozadina pronalaska
Svakoga dana, više od dva miliona ljudi u S.A.D. pati od hroničnog bola (Jessell & Kellz, 1991, "Pain and Analgesia" u knjizi "Principles of Neural Science", 3. izdanje, urednici Kandel, Schwartz & Jessell, Elsevier, NY). Nažalost, trenutno postojeći tretmani za bol samo su delimično efikasni, a mnogi od navedenih tretmana sami po sebi izazivaju onesposobljenost ili poseduju opasne neželjene efekte. Na primer, iako su nesteroidni anti-inflamatorni lekovi (NSAIL), kao što su aspirin, ibuprofen i indometacin umereno efikasni protiv inflamatornog bola, oni su takođe toksični za bubrege, a u visokim dozama pokazuju tendenciju da izazovu gastrointestinalnu iritaciju, ulceraciju, krvarenje i mentalnu konfuziju. Pacijenti koji su tretirani opioidima takođe često iskuse konfuziju, a dugotrajna upotreba opioida je udružena sa tolerancijom i zavisnošću. Lokalni anestetici, kao što su lidokain i meksiletin, istovremeno inhibiraju bol i izazivaju gubitak normalnog senzibiliteta.
Bol predstavlja opažaj signala koji su izazvani okruženjem i koji se prenose i obrađuju u ventralnom nervnom sistemu (za revijski prikaz, videti Millan, 1999, Prog. Neurobiol. 57: 1 - 164). Štetni stimulusi, kao što su toplota i čulo dodira pokreću specijalizovane senzorne receptore u koži da proizvode i šalju signale ka centralnom nervnom sistemu (CNS). Pomenuti proces se naziva nocicepcija, a periferni nervi koji posreduju u njemu se nazivaju nociceptorima. U zavisnosti od jačine signala iz nociceptora, kao i od apstrakcije i obrade tog signala od strane CNS, subjekat određeni štetni stimulus opaža ili ne opaža kao bolan. Kada je opažanje bola kod subjekta na odgovarajući način kalibrisano prema jačini stimulusa, bol ispunjava svoju predviđenu zaštitnu funkciju. Međutim, određeni tipovi tkivnog oštećenja dovode do pojave koja je poznata kao hiperalgezija ili pronocicepcija, u kojoj relativno beznačajani stimulusi bivaju opaženi ka bolni, jer je prag za bol kod datog subjekta snižen. Hiperalgeziju mogu da izazovu inflamacija i oštećenje nerva. Osobe koje su pogođene inflamatornim stanjima, kao što su opekotine od Sunca, osteoartritis, kolitis, karditis, dermatitis, miozitis, neuritis, kolagene vaskularne bolesti (u koje spadaju reumatoidni artritis i lupus) i slične bolesti, često imaju povećan osećaj bola. Slično tome, trauma, hirurška intervencija, apsces, kauzalgija, kolagene vaskularne bolesti, demijelinizirajuće bolesti, neuralgija trigeminusa, kancer, hronični alkoholizam, moždani udar, sindrom talamičkog bola, herpesne infekcije, sindrom stečene imunodeficijencije (HIV bolest), toksini i hemoterapijska sredstva izazivaju oštećenje nerava koje rezultuje prekomernim bolom.
Kako se stiče bolje razumevanje mehanizama kojim nociceptori prevode spoljašnje signale u normalnim uslovima i uslovima hiperalgezije, postaje moguće da se ciljano utiče na procese koji su uključeni u nastanak hiperalgezije u cilju inhibicije smanjenja praga za bol, čime se smanjuje jačina bola koji se oseća.
Pokazano je da neurotrofni faktori imaju značajne uloge u prevođenju fiziološkog i patološkog bola. Izgleda da je faktor rasta nerava (NGF) od posebne važnosti (za revijski prikaz videti McMahon, 1996, Phil. Trans. R. SOc. Lond. 351: 431 - 40; Apfel, 2000, The Clinical Journal of Pain 16: S7 - S11). Pokazano je da i okalna i sistemska primena NGF izaziva hiperalgeziju i alodiniju (Lewin et al., 1994, Eur. J. Neurosci. 6: 1903 - 1912). Intravenska infuzija NGF kod ljudi izaziva mialgiju u čitavom telu, a lokalna primena pored sistemskih dejstava izaziva hiperalgeziju i alodiniju na mestu injiciranja (Apfel et al., 1998, Neurology 51: 695 - 702). Takođe, postoje brojni dokazi koji ukazuju na učešće endogenog NGF u stanjima u kojima je bol izražena karakteristika. Na prime, dolazi do regulacije na gore NGF Švanovim ćelijama gangliona dorzalnog nervnog korena (DRG - Dorsal Root Ganglion) u trajanju od najmanje 2 meseca nakon oštećenja perifernog nerva, a saopšten je i nalaz povećanog nivoa NGF u zglobovima životinja koje se koriste u raznim modelima artritisa (npr., Aloe et al., 1993, Growth Factors 9: 149 - 155). Kod ljudi, nivoi NGF su povišeni u sinovijskoj tečnosti kod pacijenata sa reumatoidnim artritisom ili sa drugim tipovima artritisa (npr., Aloe et al., 1992, Arthritis and Rheumatism 35: 351 - 355). Dalje, pokazano je da antagonističko dejstvo na funkciju NGF sprečava nastanak hiperalgezije i alodinije u modelima neuropatskog i hroničnog inflamatornog bola. Na primer, u životinjskim modelima neuropatskog bola (npr., kod ligacije stabla nerva ili kičmenog živca), sistemska injekcija anti-NGF neutrališućih antitela sprečava nastanak i alodinije i hiperalgezije (Ramer et al., 1999, Eur. J. Neurosci. 11: 837 - 846; Ro et al., 1999, Pain 79: 265 - 274). Primeri anti-NGF antitela su poznati u struci i obuhvataju, na primer, PCT publikacije br. WO 01/78698, WO 01/64247, WO 02/096458 i WO 2004/032870; U.S. patenti br. 5,844,092, 5,877,016 i 6,153,189; Hongo et al., 2000, Hybridoma 19: 215 - 227; Hongo et al., 1993, Cell. Mol. Biol 13: 559 - 568; i GenBan pristupni brojevi U39608, U39609, L17078 ili L17077.
Jasno je da postoji potreba za novim, sigurnim i efikasnim tretmanima za bol, posebno onim koji su usmereni ka medijatorima čiji su molekuli mali ili ka pojačivačima bola, kao što je to NGF.
Suština pronalaska
Predmetni pronalazak obezbeđuje nova, humana, monoklonska antitela, koja su terapijski korisna za tretman bola. Specifično, predmetni pronalazak obezbeđuje monoklonska antitela, koja se vezuju za faktor rasta nerava (NGF). Poželjno, monoklonska antitela su humana monoklonska antitela, koja neutrališu biološka dejstva NGF i koja su korisna za ublažavanje efekata koji dovode do osećaja bola posredovanog sa NGF. Takođe, predmetni pronalazak obezbeđuje ćelije koje proizvode, a najpoželjnije ćelije koje sekretuju u podlogu ćelijske kulture monoklonska antitela prema predmetnom pronalasku. Kao dodatak njihovoj upotrebi za tretiranje i ublažavanje bola, antitela prema predmetnom pronalasku su korisna za tretiranje neuropatskog i inflamatornog bola.
Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje fuzione proteine koji sadrže sekvencu Fc regiona antitela i jednu ili više sekvenci koje su označene kao: sekvenca ID br.: 10, sekvenca ID br.: 12, sekvenca ID br.: 14, sekvenca ID br.: 16, sekvenca ID br.: 20, sekvenca ID br.: 22 i sekvenca ID br.: 79-130. Takvi molekuli mogu da se dobiju korišćenjem postupaka koji su opisani, na primer, u međunarodnoj patentnoj prijavi, publikacija br. WO 00/24782, koja je ovde inkorporirana po referenci. Takvi molekuli mogu biti eksprimirani, npr., u ćelijama sisara (npr., u ćelijama jajnika kineskog hrčka) ili u bakterijskim ćelijama (npr., u ćelijama E. coli).
U određenim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela, poželjno monoklonska antitela, a najpoželjnije humana antitela i humana monoklonska antitela, koja sadrže teški lanac i laki lanac, pri čemu teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.: 2, sekvenca ID br.: 4 ili sekvenca ID br.: 6, ili sadrži antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment teškog lanca, a varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.: 10, ili njen antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment. Poželjno, teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.: 4.
U određenim aspektima, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela, poželjno humana antitela, a najpoželjnije monoklonska antitela i još poželjnije humana monoklonska antitela, koja sadrže teški lanac i laki lanac, pri čemu se teški lanac sastoji od konstantnog regiona teškog lanca koji je izabran iz grupe koju čine IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA i IgE konstantni regioni teškog lanca ili bilo koju njihovu alelnu varijantu (kao što je opisano u Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), a varijabilni region teškog lanca se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je predstavljena kao sekvenca ID br.: 10, ili od njenog antigen-vezujućeg ili imunološki funkcionalnog imunoglobulinskog fragmeta. Poželjno, antitelo prema predmetnom pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona teškog lanca IgG2 koja je označena kao sekvenca ID br.: 4 ili sadrži njen antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
U određenim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela, poželjno humana antitela, a još poželjnije monoklonska antitela, najpoželjnije humana monoklonska antitela, koja sadrže teški lanac i laki lanac, pri čemu laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.: 8 ili njen antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, a varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.: 12, ili njen antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
U određenim rešenjima antitela prema predmetnom pronalasku sadrže teški lanac i laki lanac, pri čemu varijabilni region teškog lanca sadrži sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.: 10, ili antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment ove sekvence. U drugim rešenjima, varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao sekvenca ID br.: 12 ili njen antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment. U dodatnim rešenjima, teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.: 14, sekvenca br.: 18 ili sekvenca ID br.: 20, ili njihove antigen-vezujuće ili imunološki funkcionalne imunoglobulinske fragmente. U daljim rešenjima, laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.: 16, 20, 24 ili njihove antigen-vezujuće ili imunološki funkcionalne imunoglobulinske fragmente.
Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za NGF, pri čemu teški lanac antitela sadrži varijabilni region koji poseduje aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 10 ili njen antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, a laki lanac antitela poseduje varijabilni region koji poseduje aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 12, ili njen antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje izolovana humana antitela koja se specifično vezuju za NGF, pri čemu navedena antitela sadrže:
(a) teški lanac koji poseduje varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 79, ili njen antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, a laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca koji poseduje aminokiselinsku sekvencu predstavljenu kao sekvenca ID br.: 80, ili njen antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment;
(b) teški lanac koji poseduje varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 81, ili njen antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, a laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca koji poseduje aminokiselinsku sekvencu predstavljenu kao sekvenca ID br.: 82, ili njen antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment;
(c) teški lanac koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 83, ili njen antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, a laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca koji poseduje aminokiselinsku sekvencu predstavljenu kao sekvenca ID br.: 84, ili njen antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment;
(d) teški lanac koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 86, ili njen antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, a laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca koji poseduje aminokiselinsku sekvencu predstavljenu kao sekvenca ID br.: 87, ili njen antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
U određenim rešenjima, predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje antitela koja poseduju teški lanac i laki lanac, pri čemu teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca, gde varijabilni region teškog lanca sadrži sekvencu koja poseduje stepen identičnosti od najmanje 75%, poželjno 80%, još poželjnije najmanje 85%, još poželjnije najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, a najpoželjnije oko 99%, u poređenju sa aminokiselinskom sekvencom koja je označena kao sekvenca ID br.: 10, a laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca, pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži sekvencu koja poseduje stepen identičnosti od najmanje 80%, poželjno najmanje 85%, još poželjnije najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, a najpoželjnije oko 99% sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 12, pri čemu se antitelo specifično vezuje za NGF.
Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za NGF, pri čemu teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao sekvenca ID br.: 14, ili njen antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, a laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao sekvenca ID br.: 16, ili njen antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
U određenim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja sadrže teški lanac i laki lanac, pri čemu teški lanac poseduje varijabilni region teškog lanca, pri čemu varijabilni region teškog lanca poseduje sekvencu sa stepenom identičnosti od najmanje 75%, poželjno 80%, još poželjnije najmanje 85%, a još poželjnije najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, a najpoželjnije najmanje oko 99%, u poređenju sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 14, sekvenca ID br.: 18 ili sekvenca ID br.: 22, gde laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca, pri čemu varijabilni region lakog lanca poseduje aminokiselinsku sekvencu sa stepenom identičnosti od najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, a najpoželjnije najmanje oko 99%, u poređenju sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 16, pri čemu se navedeno antitelo specifično vezuje za NGF.
Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje jednolančana antitela, jednolančana Fv antitela, F(ab) antitela, F(ab)' antitela, (Fab')2 antitela.
U određenim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.: 16, ili njen antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
Dodatno, predmetni pronalazak obezbeđuje teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 14, sekvenca ID br.: 18, ili sekvenca ID br.: 22, ili njihov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
Predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje izolovana humana antitela koja se specifično vezuju za NGF, pri čemu navedena antitela sadrže: (a) okvirne regione humanog teškog lanca, CDR1 region humanog teškog lanca, CDR2 region humanog teškog lanca i CDR3 region humanog teškog lanca; i (b) okvirne regione humanog lakog lanca, CDR1 region humanog lakog lanca, CDR2 region humanog lakog lanca i CDR3 region humanog lakog lanca. U određenim rešenjima, CDR1 region humanog teškog lanca može biti CDR1 region teškog lanca monoklonskog antitela (mAt) koje je označeno kao 4D4 antitelo, što je prikazano u sekvenci ID br.: 22, a CDR1 region humanog lakog lanca može biti CDR1 region lakog lanca mAt 4D4, kao što je prikazano u sekvenci ID br.: 24. U drugim rešenjima, CDR2 region humanog teškog lanca može biti CDR2 region teškog lanca mAt 4D4, kao što je prikazano u sekvenci ID br.: 18, a CDR2 region humanog lakog lanca može biti CDR2 region lakog lanca mAt 4D4, kao što je prikazano u sekvenci ID br.: 20. U daljim rešenjima, CDR3 region humanog teškog lanca je CDR3 teškog lanca mAt 4D4, kao što je prikazano u sekvenci ID br.: 14, a CDR3 region humanog lakog lanca je CDR3 lakog lanca mAt 4D4, kao što je prikazano u sekvenci ID br.: 16.
Predmetni pronalazak se takođe odnosi na izolovana humana antitela koja se specifično vezuju za faktor rasta nerava, koja sadrže teški lanac i laki lanac, pri čemu teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca koji poseduje aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 10, sekvenca ID br.: 79, sekvenca ID br.: 81, sekvenca ID br.: 83, sekvenca ID br.: 85 ili sekvenca ID br. 87, ili sadrži njihove antigen-vezujuće ili imunološki funkcionalne imunoglobulinske fragmente.
Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje izolovana humana antitela koja se specifično vezuju za NGF i koja sadrže teški lanac i laki lanac, pri čemu laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca koji poseduje aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 12, sekvenca ID br.: 80, sekvenca ID br.: 82, sekvenca ID br.: 84, sekvenca ID br.: 86, sekvenca ID br.: 88, sekvenca ID br.: 89, sekvenca ID br.: 90, sekvenca ID br.: 91 ili sekvenca ID br.: 131, ili sadrži njihove antigen-vezujuće ili imunološki funkcionalne imunoglobulinske fragmente.
Antitela prema predmetnom pronalasku se karakterišu sposobnošću da antagonizuju najmanje jednu in vitro i /in vivo aktivnost koja je specifična za NGF polipeptide. Poželjno, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovana anti-humani NGF humana antitela sa visokim afinitetom vezivanja za NGF polipeptide, pri čemu se navedena antitela vezuju za humani NGF polipeptid i disociraju od humanog NGF polipeptida sa konstantom disocijacije (Kd) od oko 50 × 10-12 M ili manjom, što je određeno upotrebom KinExA, ili koja inhibiraju preživljavanje indukovano sa NGF u in vitro testu neutralizacije sa IC50 od oko 1 × 10-8 M ili manjom.
U poželjnom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano anti-humani NGF humano antitelo koje poseduje sledeće karakteristike:
a) inhibira preživljavanje indukovano sa NGF u in vitro testu neutralizacije sa IC50 od oko 1 × 10-8 M ili manjom;
b) poseduje CDR3 region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 14; i
c) poseduje CDR3 region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 16.
Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje izolovana humana antitela ili njihove antigen-vezujuće ili imunološki funkcionalne imunoglobulinske fragmente koji se specifično vezuju za NGF sa visokim afinitetom, pri čemu navedena antitela ili njihovi fragmenti disociraju od humanog NGF polipeptida sa KD od oko 1 × 10-9 M ili manjom i takođe nautrališu biološku aktivnost humanog NGF u standardnom in vitro testu sa IC50 sa oko 1 × 10-8 M ili manjom, pri čemu pomenuta antitela ili njihovi fragmenti sadrže varijabilni region teškog lanca koji poseduje:
a) CDR1 region koji poseduje aminokiselinsku sekvencu formule
a1a2a3a4a5,
pri čemu je a1 ostatak polarne hidrofilne amino kiseline; a2 je ostatak aromatične aminokiseline; a3 je ostatak alifatične, polarne hidrofilne, aromatične aminokiseline; a4 je ostatak neutralne hidrofobne ili alifatične aminokiseline; i a5 je ostatak alifatične ili polarne hidrofilne aminokiseline;
b) CDR2 region sadrži aminokiselinsku sekvencu formule
b1b2b3b4b5b6b7b8b9b10b11b12b13b14b15b16b17
pri čemu je b1 ostatak alifatične, polarne hidrofobne ili aromatične aminokiseline; b2 je ostatak alifatične hidrofobne aminokiseline, b3 je ostatak polarne hidrofilne ili aromatične aminokiseline; b4 je ostatak polarne hidrofilne, hidrofobne ili aromatične aminokiseline; b5-b9 su nezavisno ostaci polarne hidrofilne ili aromatične aminokiseline; b10 je ostatak polarne hidrofilne, aromatične ili alifatične aminokiseline; b11 je ostatak aromatične ili hidrofobne aminokiseline; b12 je ostatak alifatične hidrofobne ili polarne hidrofilne aminokiseline; b13 je ostatak alifatične, hidrofobne ili polarne hidrofilne aminokiseline; b14 i b16 su nezavisno ostaci polarne hidrofilne aminokiseline; b15 je ostatak alifatične ili aromatične hidrofobne aminokiseline i b17 je ostatak alifatične kisele aminokiseline; i
c) CDR3 region sadrži aminokiselinsku sekvencu formule
c1c2c3c4c5c6c7c8c9c10c11c12c13c14c15c16c17
pri čemu je c1 odsutno ili je ostatak alifatične aminokiseline; c2 je odsutno ili je ostatak polarne hidrofilne ili aromatične hidrofobne aminokiseline; c3 i c4 su nezavisno odsutni ili su ostaci polarne hidrofilne, amoratične hidrofobne ili alifatične aminokiseline; c5 je odsutno ili je ostatak polarne hidrofilne, alifatične ili aromatične aminokiseline; c6 je odsutno ili je ostatak polarne hidrofilne ili alifatične aminokiseline; c7 je ostatak polarne hidrofilne ili alifatične aminokiseline; c8 je ostatak polarne hidrofilne, hidrofobne ili aromatične aminokiseline; c9 je ostatak polarne hidrofilne, alifatične ili aromatične hidrofobne aminokiseline, c10 je ostatak polarne hidrofilne, aromatične hidrofobne ili alifatične hidrofobne aminokiseline, c11 - c13 su nezavisno ostaci polarne hidrofilne ili aromatične hidrofobne aminokiseline; c14 je ostatak alifatične ili aromatične hidrofobne amino kiseline; c15 je ostatak polarne hidrofilne ili neutralne hidrofobne aminokiseline; c16 je odsutno ili je ostatak polarne hidrofilne aminokiseline; i c17 je ostatak aromatične hidrofobne ili alifatične hidrofobne aminokiseline.
U jednom rešenju, a1 je ostatak polarne hidrofilne aminokiseline; a2 je ostatak aromatične hidrofobne aminokiseline, a3 je ostatak alifatične hidrofobne aminokiseline; a4 je ostatak neutralne hidrofobne aminokiseline; a5 je ostatak polarne hidrofilne aminokiseline; b1 je ostatak alifatične ili aromatične aminokiseline; b2 je Ile; b3 je ostatak polarne hidrofilne aminokiseline; b4 je ostatak polarne hidrofilne ili aromatične aminokiseline; b5 - b9 su nezavisno ostaci polarne hidrofilne ili alifatične aminokiseline; b10 je ostatak alifatične aminokiseline; b11 je Tyr; b12 je ostatak alifatične hidrofobne aminokiseline; b13 je ostatak alifatične ili polarne hidrofilne aminokiseline; b14 i b16 su nezavisno ostaci polarne hidrofilne aminokiseline; b15 je ostatak alifatične hidrofobne aminokiseline; b17 je ostatak alifatične kisele aminokiseline; c1 je odsutno ili je ostatak alifatične aminokiseline; c2 je odsutno ili je ostatak polarne hidrofilne ili aromatične hidrofobne aminokiseline, c3 i c4 su nezavisno odsutni ili su ostaci polarne hidrofilne, aromatične hidrofobne ili alifatične aminokiseline; c5 je odsutno ili je ostatak polarne hidrofilne aminokiseline; c6 je odsutno ili je ostatak polarne hidrofilne ili alifatične aminokiseline, c7 je ostatak polarne hidrofilne ili alifatične aminokiseline; c8 je ostatak polarne hidrofilne, hidrofobne ili aromatične aminokiseline; c9 je ostatak polarne hidrofilne, alifatične ili aromatične hidrofobne aminokiseline; c10 je ostatak polarne hidrofilne, aromatično hidrofobne ili alifatično hidrofobne aminokiseline, c11 - c13 su nezavisno ostaci polarno hidrofilne ili aromatično hidrofobne aminokiseline; c14 je ostatak alifatične ili aromatične hidrofobne aminokiseline; c15 je ostatak polarne hidrofilne ili neutralno hidrofobne aminokiseline; c16 je odsutno ili je ostatak polarne hidrofilne aminokiseline; i c17 je ostatak aromatične hidrofilne ili alifatične hidrofobne aminokiseline.
U posebnom rešenju, a1 je Ser; Asp, ili Thr; a2 je Tyr, a3 je Ala, Ser, Trp ili Gly; a4 je Met ili Ile; a5 je His, Gly ili Asn; b1 je Tyr, Gly, Ile ili Asp; b2 je Ile; b3 je Ser, Thr, Tyr ili Asn; b4 je Trp, Arg ili Pro; b5 je Ser, Asn ili Gly; b6 je Ser, Arg, Asp ili Gly; b7 je Ser, His ili Gly; b8 je Ser, Ile, Asp ili Thr; b9 je Leu, Ile ili Thr; b10 je Gly, Lys ili Phe; b11 je Tyr; b12 je Ala ili Ser; b13 je Asp, Gly ili Pro; b14 je Ser; b15 je Val ili Phe; b16 je Lys ili Gln; b17 je Gly; c1 je odsutno ili je ostatak alifatične aminokiseline; c2 je odsutno ili je Tyr; c3 i c4 su nezavisno odsutne, Tyr, Asn, Val, ili Gly; c5 je odsutno, Ser, Gly ili Trp; c6 je odsutno, Ser, Gly, Glu ili Leu; c7 je Gly, Arg, ili Asp; c8 je Trp, Pro, Ser ili Thr; c9 je His, Gly ili Tyr; c10 je Val, Tyr ili Arg; c11 - c13 su nezavisno Ser, Phe, Tyr, Asp ili Asn; c14 su Phe, Val, ili Gly; c15 su Asp; c16 je odsutno, Asp ili Asn i c17 je Tyr ili Val.
U drugom posebnom rešenju, a1 je Ser ili Asp; a2 je Tyr; a3 je Ala ili Ser; a4 je Met ili Ile; a5 je His ili Asn; b1 je Tyr ili Gly; b2 je Ile; b3 je Ser, Thr, Tyr, ili Asn; b4 je Trp, Arg ili Pro; b5 je Ser ili Asn; b6 je Ser ili Arg; b7 je His ili Gly; b8 je Ile ili Thr; b9 je Leu, Ile ili Thr; b10 je Gly ili Phe; b11 je Tyr; b12 je Ala ili Ser; b13 je Asp ili Gly; b14 je Ser; b15 je Val ili Phe; b16 je Lys ili Gln; b17 je Gly; c1 je odsutno ili je Gly; c2 je odsutno ili je Tyr; c3 i c4 su nezavisno odsutne, Tyr, Gly ili Val; c5 je odsutno ili Ser; c6 je Ser ili Gly; c7 je Gly ili Arg; c8 je Trp ili Pro; c9 je His, Gly ili Tyr; c10 je Val ili Tyr; c11 - c13 su nezavisno Ser, Tyr, Phe ili Asp; c14 su Phe ili Val; c15 su Met ili Asp; c16 je odsutno ili Asp; i c17 je Tyr ili Val.
U drugim posebnim rešenjima:
a) CDR1 region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.; 22, CDR2 region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.; 18, a CDR3 region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.; 14;
b) CDR1 region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.; 92, CDR2 region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.; 93, a CDR3 region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.; 94;
c) CDR1 region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.; 98, CDR2 region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.; 99, a CDR3 region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.; 100;
d) CDR1 region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.; 104, CDR2 region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.; 105, a CDR3 region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.; 106;
e) CDR1 region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.; 110, CDR2 region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.; 111, a CDR3 region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.; 112;
f) CDR1 region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.; 116, CDR2 region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.; 117, a CDR3 region teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca ID br.; 118.
Predmetni pronalazk takođe obezbeđuje izolovano humano antitelo ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment koji se specifično vezuje za NGF, pri čemu navedeno antitelo ili njegov fragment sadrže varijabilni region lakog lanca koji poseduje:
a) CDR1 region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu formule
a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12
pri čemu a1 je ostatak polarne hidrofilne aminokiseline; a2, a11 i a12 su nezavisno ostaci alifatične ili hidrofobne aminokiseline; a3, a5, a7 i a8 su nezavisno ostaci alifatične, polarne hidrofilne ili hidrofobne aminokiseline; a4 je ostatak polarne hidrofilne aminokiseline; a6 je ostatak alifatične ili hidrofobne aminokiseline; a9 je odsutno ili je ostatak alifatične ili polarne hidrofilne aminokiseline; i a10 je ostatak alifatične, aromatične ili hidrofobne aminokiseline;
b) CDR2 region sadrži aminokiselinsku sekvencu formule
b1b2b3b4b5b6b7
pri čemu b1 je ostatak alifatične, polarne hidrofobne ili hidrofobne aminokiseline; b2 je ostatak alifatične ili hidrofobne aminokiseline; b3 i b4 su nezavisno ostaci polarne hidrofilne, alifatične ili hidrofobne aminokiseline; b5 je ostatak polarne hidrofilne ili alifatične hidrofobne aminokiseline; b6 je ostatak polarne hidrofilne ili alifatične hidrofobne aminokiseline; i b7 je ostatak polarne hidrofilne aminokiseline; i
c) CDR3 region sadrži aminokiselinsku sekvencu formule
c1c2c3c4c5c6c7c8c9c10c11c12c13c14c15c16c17
pri čemu c1 i c2 su nezavisno ostaci polarne hidrofilne aminokiseline; c3 je ostatak polarne hidrofilne, alifatične ili hidrofobne aminokiseline; c4, c5 i c6 su nezavisno ostaci alifatične, polarne hidrofilne, ili hidrofobne aminokiseline; c7 je odsutno ili je ostatak polarne hidrofilne ili alifatične hidrofobne aminokiseline; c8 je ostatak polarne hidrofilne ili hidrofobne aminokiseline; i c9 je ostatak polarne hidrofilne aminokiseline, i pri čemu navedeno antitelo ili njegov fragment disocira od humanog NGF polipeptida sa KD od oko 1 × 10-9 M ili manjom i neutrališe biološku aktivnost humanog NGF u standardnom in vitro testu sa IC50 od oko 1 × 10-8 M ili manjom.
U jednom rešenju a1, a3, a4, a7 i a8 su nezavisno ostaci polarne hidrofilne aminokiseline; a2, a6, a11 i a12 su nezavisno ostaci alifatične hidrofobne aminokiseline; a5 je ostatak polarne hidrofilne ili alifatične aminokiseline; a9 je odsutno ili je ostatak alifatične ili polarne hidrofilne aminokiseline; a10 je ostatak alifatične ili aromatične aminokiseline; b1 je ostatak alifatične, polarne hidrofobne, ili hidrofobne aminokiseline; b2 je ostatak alifatične hidrofobne aminokiseline; b3, b4 i b7 su nezavisno ostaci polarne hidrofilne aminokiseline; b5 i b6 su nezavisno ostaci polarne hidrofilne ili alifatične hidrofobne aminokiseline; c1 i c2 su nezavisno ostaci polarne hidrofilne aminokiseline; c3 je ostatak polarne hidrofilne, alifatične ili hidrofobne aminokiseline; c4, c5 i c6 su nezavisno ostaci alifatične, polarno hidrofilne ili hidrofobne aminokiseline; c7 je odsutno ili je ostatak alifatične hidrofobne aminokiseline; c8 je ostatak hidrofobne aminokiseline; i c9 je ostatak polarne hidrofilne aminokiseline.
U određenom rešenju, a1, a3, a4 i a7 su Arg, Ser, Gln i Ser, respektivno; a2 je Ala; a5 je Gly ili Ser; a8 je Ser ili Ile; a9 je odsutno, Ser ili Gly; a10 je Ala, Tyr, Trp ili Phe; b1 je Asp, Gly, Ala ili Val; b2 i b3 su Ala i Ser, respektivno; b4 je Ser ili Asn; b5 je Leu ili Arg; b6 je Glu, Ala ili Gln; b7 je Ser ili Thr; c1 i c2 su Gln; c3 je Phe, Tyr, Arg ili Ala; c4 je Asn, Gly ili Ser; c5 je Ser ili Asn; c6 je Tyr, Ser, Trp ili Phe; c7 je odsutno, Pro ili His; c8 je Leu, Trp, Tyr ili Arg; i c9 je Thr.
U drugom posebnom rešenju, a1, a2, a3, a4 i a7 su Arg, Ala, Ser, Gln i Ser respektivno, a5 je Gly ili Ser; a8 je Ser ili Ile; a9 je odsutno, Ser ili Gly; a10 je Ala ili Tyr; b1 je Asp ili Gly; b2 i b3 su Ala i Ser, respektivno; b4 je Ser ili Asn; b5 je Leu ili Arg; b6 je Glu, Ala ili Gln; b7 je Ser ili Thr; c1 i c2 su Gln; c3 je Phe, Tyr, Arg ili Ala, c4 je Asn, Gly ili Ser; c5 je Ser ili Asn; c6 je Tyr, Ser, Trp ili Phe; c7 je odsutno, Pro ili His; c8 je Leu, Trp, Tyr ili Arg; i c9 je Thr.
U drugim posebnim rešenjima:
a) CDR1 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 24, CDR2 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 20, i CDR3 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 16;
b) CDR1 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 95, CDR2 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 96, i CDR3 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 97;
c) CDR1 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 101, CDR2 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 102, i CDR3 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 103;
d) CDR1 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 107, CDR2 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 108, i CDR3 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 109;
e) CDR1 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 113, CDR2 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 114, i CDR3 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 115;
f) CDR1 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 119, CDR2 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 120, i CDR3 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 121;
g) CDR1 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 122, CDR2 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 123, i CDR3 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 124;
h) CDR1 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 125, CDR2 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 126, i CDR3 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 127;
i) CDR1 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 128, CDR2 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 129, i CDR3 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 130;
j) CDR1 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 132, CDR2 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 133, i CDR3 region lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca ID br.: 134.
Takođe, predmetni pronalazak se odnosi na polinukleotidne sekvence koje kodiraju nova anti-humani NGF humana antitela, vekotore koji sadrže polinukleotidne sekvence koje kodiraju anti-humani NGF humana antitela, ćelije-domaćine koje su transformirane vektorima koji sadrže polinukleotide koji kodiraju anti-humani NGF humana antitela, formulacije koje sadrže anti-humani NGF humana antitela, kao i postupke za dobijanje i korišćenje navedenih.
Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupke za detetkciju nivoa NGF u biološkom uzorku, pri čemu postupci obuhvataju korak uspostavljanja kontakta između uzorka i antitela prema predmetnom pronalasku ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. Anti-NGF antitelo prema predmetnom pronalasku može da se koristi u bilo kom poznatom postupku testiranja, kao što je, na primer, test kompetitivnog vezivanja, direktni i indirektni sendvič testovi, testovi imunoprecipitacije i sa enzimom povezani imunosorbentni testovi (ELISA) (Videti, Sola, 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, stranica 147-158, CRC Press, Inc.), koji se koriste za detekciju i kvantifikaciju NGF. Antitela mogu da se vežu za NGF visokim afinitetom, što odgovara postupku testiranja koji se koristi.
Dodatno, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za tretiranje bolesti koje su udružene sa povišenom proizvodnjom NGF ili sa povišenom osetljivošću na NGF, pri čemu postupci obuhvataju korak primene farmaceutski efikasne količine farmaceutskog preparata koji sadrži makar jedno antitelo prema predmentom pronalasku ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, i koji se primenjuje kod pojedinca kome je to potrebno.
Specifična poželjna rešenja prema predmetnom pronalasku postaće jasna na osnovu detaljnijih opisa poželjnih rešenja, kao i patentnih zahteva u tekstu koji sledi.
Kratak opis crteža
Slika 1 prikazuje grafikone koji demonstriraju neutralizaciju aktivnosti NGF u biološkom testu neutralizacije koji koristi DRG neurone pomoću 4D4 monoklonskih antitela koja su prečišćena iz kondicioniranih podloga hibridoma.
Slika 2 prikazuje grafikone koji demonstriraju VR1 ekspesiju stimulisanu aktivnošću humanog NGF i neutralizaciju aktivnosti NGF u biološkim testovima neutralizacije koji koriste DRG neurone pomoću anti-NGF monoklonskog antitela (4D4) koje je prečišćeno iz kondicioniranih podloga hibridoma.
Slika 3 prikazuje grafikone koji demonstriraju neutralizaciju aktivnosti NGF u biološkim testovima neutralizacije koji se zasnivaju na DRG neuronima putem prolazno eksprimiranih rekombinantnih anti-NGF 4D4 monoklonskih antitela, koja su eksprimirana ili kao ili kao IgG1 ili kao IgG2 u ćelijama koje su uzgajane ili u kulturi koja se nalazi u roler-bočici (R) ili u spiner-flašici (S).
Slika 4 prikazuje poravnanja sekvence neurotrofina. Numeracija i elementi sekundarne strukture iznad sekvence označavaju zreli humani NGF. Konzervirani ostaci su označeni zvezdicom, a regioni sa malom homologijom sekvence su osenčeni. Sekvenca ID br.: 135 označava humani NGF; sekvenca ID br.: 136 označava mišiji NGF; sekvenca ID br.: 137 označava BDNF; sekvenca ID br.: 138 označava NT3.
Slika 5 prikazuje poravnanje i procenat identičnosti CDR1 regiona teškog lanca anti-NGF za antitela 14D10 (sekvenca ID br.: 98); 6H9 (sekvenca ID br.: 104); 7H2 (sekvenca ID br.: 110); 4G6 (sekvenca ID br.: 116); 14D11 (sekvenca ID br.: 92); i 4D4 (sekvenca ID br.: 22).
Slika 6 prikazuje poravnanje i procenat identičnosti CDR2 regiona teškog lanca anti-NGF za antitela 14D10 (sekvenca ID br.: 99); 6H9 (sekvenca ID br.: 105); 7H2 (sekvenca ID br.: 111); 4G6 (sekvenca ID br.: 117); 14D11 (sekvenca ID br.: 93); i 4D4 (sekvenca ID br.: 18).
Slika 7 prikazuje poravnanje i procenat identičnosti CDR3 regiona teškog lanca anti-NGF za antitela 14D10 (sekvenca ID br.: 100); 6H9 (sekvenca ID br.: 106); 7H2 (sekvenca ID br.: 112); 4G6 (sekvenca ID br.: 118); 14D11 (sekvenca ID br.: 94); i 4D4 (sekvenca ID br.: 14).
Slika 8 prikazuje poravnanje i procenat identičnosti CDR1 regiona lakog lanca anti-NGF antitela za antitela 14D10 (sekvenca ID br.; 95); 6H9 (sekvenca ID br.: 107); 7H2 (sekvenca ID br.: 113); 4G6a (sekvenca ID br.: 119); 4G6b (sekvenca ID br.: 122); 4G6c (sekvenca ID br.: 125); 4G6d (sekvenca ID br.: 128); 4G6e (sekvenca ID br.: 132); 14D11 (sekvenca ID br.: 95), i 4D4 (sekvenca ID br.: 24) (4G6a se odnosi na različite slike, kao što je 20031028340; 4G6b se odnosi na različite slike, kao što je 20031028351; 4G6c se odnosi na različite slike, kao što je 20031071526; 4G6d se odnosi na različite slike, kao što je 20031028344; 4G6e se odnosi na različite slike, kao što je 20031000528).
Slika 9 prikazuje poravnanje i procenat identičnosti CDR2 regiona lakog lanca anti-NGF antitela za antitela 14D10 (sekvenca ID br.: 96); 6H9 (sekvenca ID br.: 108); 7H2 (sekvenca ID br.: 114); 4G6a (sekvenca ID br.: 120); 4G6b (sekvenca ID br.: 123); 4G6c (sekvenca ID br.: 126); 4G6d (sekvenca ID br.: 129); 4G6e (sekvenca ID br.: 133); 14D11 (sekvenca ID br.: 96), i 4D4 (sekvenca ID br.: 20) (4G6a se odnosi na različite slike, kao što je 20031028340; 4G6b se odnosi na različite slike, kao što je 20031028351; 4G6c se odnosi na različite slike, kao što je 20031071526; 4G6d se odnosi na različite slike, kao što je 20031028344; 4G6e se odnosi na različite slike, kao što je 20031000528).
Slika 10 prikazuje poravnanje i procenat identičnosti CDR3 regiona lakog lanca anti-NGF antitela za antitela 14D10 (sekvenca ID br.: 97); 6H9 (sekvenca ID br.: 109); 7H2 (sekvenca ID br.: 115); 4G6a (sekvenca ID br.: 121); 4G6b (sekvenca ID br.: 124); 4G6c (sekvenca ID br.: 127); 4G6d (sekvenca ID br.: 130); 4G6e (sekvenca ID br.: 134); 14D11 (sekvenca ID br.: 97), i 4D4 (sekvenca ID br.: 16) (4G6a se odnosi na različite slike, kao što je 20031028340; 4G6b se odnosi na različite slike, kao što je 20031028351; 4G6c se odnosi na različite slike, kao što je 20031071526; 4G6d se odnosi na različite slike, kao što je 20031028344; 4G6e se odnosi na različite slike, kao što je 20031000528).
Slika 11 prikazuje poravnanje i procenat identičnosti lakog lanca anti-NGF za antitela14D10 (sekvenca ID br.: 82); 6H9 (sekvenca ID br.: 84); 7H2 (sekvenca ID br.: 86); 4G6a (sekvenca ID br.: 88); 4G6b (sekvenca ID br.: 89); 4G6c (sekvenca ID br.: 90); 4G6d (sekvenca ID br.: 91); 4G6e (sekvenca ID br.: 131); 14D11 (sekvenca ID br.: 80), i 4D4 (sekvenca ID br.: 12) (4G6a se odnosi na različite slike, kao što je 20031028340; 4G6b se odnosi na različite slike, kao što je 20031028351; 4G6c se odnosi na različite slike, kao što je 20031071526; 4G6d se odnosi na različite slike, kao što je 20031028344; 4G6e se odnosi na različite slike, kao što je 20031000528).
Slika 12 prikazuje poravnanje i procenat identičnosti teškog lanca anti-NGF za antitela 4D4 (sekvenca ID br.: 10); 4G6 (sekvenca ID br.: 87); 14D10 (sekvenca ID br.: 81); 14D11 (sekvenca ID br.: 79); 7H2 (sekvenca ID br.: 85) i 6H9 (sekvenca ID br.: 83).
Detaljan opis određenih poželjnih rešenja
Naslovi podpoglavlja koji se ovde koriste služe samo u organizacione svrhe i ni na koji način ne ograničavaju opisanu subjektnu materiju. Sve reference koje su citirane u patentnoj prijavi su ekspresivno inkorporirane po referenci u ovom teksu u bilo koju svrhu da se koriste.
Definicije
Za postupke rekobinantne DNA, za sintezu olegonukleotida i za kulturu tkiva i transformaciju (npr., za elektroporaciju, lipofekciju) mogu da se koriste konvencionalne tehnike. Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja mogu da se izvode prema upustvima izvođača ili na način koji je uobičajen u struci ili na način koji je ovde opisan. Napred navedene tehnike i postupci mogu generalno da se izvode shodno postupcima koji su poznati u struci i koji su opisani u različitim opštim i specifičnim referencama citiranim i diskutovanim u određenim delovima predmetne specifikacije. Videti, na primer, Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3. izdanje, Cold Spring Harbor Laboratory Press, cold Spring Harbor, N.Y., koja je ovde inkorporirana po referenci u bilo koju svrhu da se koristi. Osim ukoliko nisu obezbeđene specifične definicije, nomenklatura koja se koristi, kao i laboratorijski postupci i tehnike analitičke hemije, sintetske organske hemije i medicinske i farmaceutske hemije koji su ovde opisani, identični su onima koji se uobičajeno koriste u struci. Slično tome, za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutske preparacije, formulacije i dopremanje leka, kao i za tretman pacijenata mogu da se koriste konvencionalne tehnike.
Kao što se koriste u predmetnom opisu, sledeći pojmovi, osim ukoliko nije naznačeno drugačije, poseduju sledeća značenja. Fraze «biološko svojstvo», «biološka karakteristika» i pojam «aktivnost», kada se odnose na antitelo prema predmetnom pronalasku, koriste se naizmenično u predmetnoj specifikaciji i obuhvataju, bez ograničenja, afinitet i specifičnost epitopa (npr., vezivanje anti-humanog NGF humanog antitela za humani NGF), sposobnost da se antagonizuje aktivnost polipeptida-mete (npr., aktivnost NGF), in vivo stabilnost antitela, kao i imunogena svojstva antitela. Druga biološka svojsva ili karakteristike antitela koji mogu da se identifikuju i koje su priznate u struci obuhvataju, na primer, ukrštenu reaktivnost ( tj., ukrštenu reaktivnost sa ne-humanim homologima za polipeptid-metu ili sa drugim proteinima ili tkivima) kao i sposobnost da se očuvaju visoki nivoi ekspresije proteina u ćelijama sisara. Napred navedena svojstva i karakteristike mogu da se posmatraju ili identifikuju korišćenjem tehnika koje su poznate u struci u koje spadaju, bez ograničenja, ELISA, kompetitivna ELISA, analiza rezonance površinske membrane, testovi neutralizacije in vitro i in vivo ( npr., Primer 2) kao i tehnike imunohistohemije tkivnih isečaka dobijenih iz različitih izvora, uključujući organizam čoveka, primata ili nekog drugog organizma po potrebi. Specifične aktivnosti i biološka svojstva anti-humanog NGF humanog antitela su opisana detaljnije u primerima koji slede.
Pojam «izolovani polinukleotid», kao što se ovde koristi, označava polinukleotid genomskog porekla, cDNA ili sintetskog porekla ili neku njihovu kombinaciju, pri čemu usled svog porekla izolovani polinukleotid (1) nije udružen sa belim ili sa belom polinukleotida sa kojima se navedeni izolovani polinukleotid inače nalazi u prirodi, (2) povezan je sa polinukleotidom sa kojim inače nije povezan u prirodi ili (3) ne postoji u prirodi kao deo neke veće sekvence.
Pojam «izolovani protein» odnosi se na subjektni protein (1) koji nije udružen sa ili je udružen sa malom količinom drugih proteina sa kojima se normalno nalazi u prirodi, (2) suštinski nije udružen sa drugim proteinima koji potiču iz istog izvora, npr., iz organizma iste vrste, (3) eksprimiran je od strane ćelije koja potiče od druge vrste, (4) razdvojen je od najmanje 50% polinukleotida, lipida, ugljenih hidrata ili drugih materijala sa kojima je inače združen u prirodi, (5) nije udružen (putem kovalentne ili nekovalentne interakcije) sa delovima proteina na kojim je «izolovani protein» inače udružen u prirodi, (6) operativno je udružen (putem kovalentne ili nekovalentne interakcije) sa polipeptidom sa kojim inače nije udružen u prirodi, ili (7) ne postoji u prirodnom izvoru. Takav izolovani protein može biti kodiran od strane genomske DNK, cDNK, iRNK ili od druge RNK, od strane polinukleotida sintetskog porekla ili bilo koje njihove kombinacije. Poželjno, izolovani protein suštinski nije udružen sa proteinima ili polipeptidima ili sa drugim kontaminantima koji se nalaze u njegovom prirodnom okruženju i koji bi inače interferirali sa njegovom upotrebom (terapisjkom, dijagnostičkom, profilaktičkom, istraživačkom ili nekom drugom).
«Izolovano» antitelo je ono antitelo koje je identifikovano i separisano i ili koje je prikupljeno iz neke komponente njegovog prirodnog okruženja. Kontaminirajuće komponente u prirodnom okruženju antitela jesu materijali koji interferiraju sa dijagnostičkom ili terapijskom upotrebom antitela i oni obuhvataju enzime, hormone i druge sastojke proteinskih ili ne-proteinskih rastvora. U poželjnim rešenjima, antitelo je prečišćeno u stepenu (1) većem od 95% na osnovu molekulske mase antitela, što se određuje postupkom po Louriju, a najpoželjnije u stepenu većem od 99% masenih, (2) u stepenu koji je dovoljan da obezbedi najmanje 15 ostataka N-terminalne ili interne aminokiselinske sekvence putem upotrebe sekvencionera sa rotirajućim sudom ili (3) koji je prečišćen do homogenosti pomoću SDS-PAGE u redukujućim ili neredukujućim uslovima uz upotrebu Coomassie blue ili poželjno srebrne boje. Izolovano antitelo obuhvata antitelo in situ u okviru rekombinantnih ćelija, s obzirom da najmanje jedna komponenta iz prirodnog okruženja antitela nije prisutna.
Termini «polipeptid» ili «protein» označavaju molekule koji imaju sekvencu nativnih proteina, tj., proteine koji su proizvedeni od strane prirodnih i specifično ne-rekombinantnih ćelija, ili su proizvedene od strane genetskim inženjeringom izmenjenih ili rekombinantnih ćelija, a sadrže molekule koji imaju aminokiselinsku sekvencu nativnog proteina, ili molekule koji poseduju delecije, adicije i/ili supstitucije jedne ili više aminokiselina u odnosu na nativnu sekvencu. Pojmovi «polipeptid» i «protein» specifično obuhvataju anti-NGF antitela ili sekvence koje poseduju delecije, adicije i/ili supstitucije jedne ili više aminokiselina sekvence anti-NGF antitela.
Pojam «polipeptidni fragment» označava polipeptid koji poseduje amino-terminalnu deleciju, karboksi-terminalnu deleciju i/ili internu deleciju. U određenim rešenjima, fragmenti poseduju dužinu od najmanje 5 do oko 500 aminokiselina. Treba napomenuti da u određenim rešenjima, fragmenti poseduju dužinu od najmanje 5, 6, 8 ,10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 ili 450 aminokiselina. Posebno su korisni polipeptidni fragmenti koji obuhvataju funkcionalne domene, uključujući i vezujuće domene. U slučaju anti-NGF antitela, korisni fragmenti obuhvataju, bez ograničenja, CDR region, varijabilni domen teškog ili lakog lanca, deo lanca antitela ili samo njegov varijabilni region uključujući dva CDR i slično.
Pojam «sredstvo za specifično vezivanje» označava prirodni ili sintetski molekul koji se specifično vezuje za molekul-metu. Primeri sredstava za specifično vezivanje obuhvataju, bez ograničenja, proteine, peptide, nukleinske kiseline, ugljene hidrate i lipide. U određenim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje je antitelo.
Pojam «sredstvo za specifično vezivanje za NGF» označava sredstvo za specifično vezivanje koje se specifično vezuje za bilo koji deo NGF. U određenim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje za NGF je antitelo koje se specifično vezuje za NGF.
Pojam «imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment», kao što se ovde koristi, označava polipeptidni fragment koji sadrži makar one CDR-ove u okviru teškog i lakog lanca imunoglobulina. Imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment prema predmetnom pronalasku je sposoban da se veže za antigen. U poželjnim rešenjima, antigen je ligant koji se specifično vezuje za receptor. U ovim rešenjima, vezivanje imunološkog funkcionalnog imunoglobulinskog fragmenta prema predmetnom pronalasku sprečava vezivanje liganda za njegov receptor, i na taj način prekida biološki odgovor koji nastaje usled vezivanja liganda za odgovarajući receptor. Poželjno, imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment prema predmentom pronalasku se specifično vezuje za NGF. Najpoželjnije, pomenuti fragment se specifično vezuje za humani NGF.
Pojam «onaj koji se javlja u prirodi», kao što se ovde koristi, i koji se odnosi na objekte, označava činjenicu da navedeni objekat može biti pronađen u prirodi. Na primer, polipeptid ili polinukleotidna sekvenca koja je prisutna u određenom organizmu ( uključujući i viruse) i koja može biti izolovana iz nekog izvora u prirodi i koja nije sa namerom modifikovana od strane čoveka, označava se kao struktura koja se može naći u prirodi.
Pojam «onaj koji je operativno povezan» označava da se komponente na koje se pojam odnosi nalaze u odnosu koji im omogućava da sačuvaju svoje inherentne funkcije u odgovarajućim uslovima. Na primer, kontrolna sekvenca je «operativno povezana» sa sekvencom koja kodira protein onda kada se ekspresija sekvence koja kodira protein postiže u uslovima koji su kompatibilni sa transkripcionom aktivnošću kontrolnih sekvenci.
Pojam « kontrolna sekvenca», kao što se ovde koristi, odnosi se na polunukleotidne sekvence koje mogu da utiču na ekspresiju, obradu ili unutarćelijsku lokalizaciju kodirajućih sekvenci sa kojima su ligirane. Priroda takvih kontrolnih sekvenci zavisi od organizma domaćina. U određenim rešenjima, kontrolne sekvence za prokariote mogu da sadrže promoter, mesto vezivanja ribozoma, sekvencu za terminaciju transkripcije. U drugim posebnim rešenjima, kontrolne sekvence za eukariote mogu da sadrže promotere koji obuhvataju jedno ili mnoštvo mesta za prepoznavanje faktora transkripcije, sekvence za pospešivanje transkripcije, sekvence za terminacije transkripcije i poliadenilacione sekvence. U određenim rešenjima, pojam «kontrolne sekvence» može da obuhvati i vodeće sekvence i/ili sekvence fuzionog partnera.
Pojam «polinukleotid» kao što se ovde koristi, označava jednolančane ili dvolančane polimere nukleinskih kiselina koje su najmanje duge 10 nukleotida. U određenim rešenjima, nukleotidi koji sačinjavaju polinukleotid mogu biti ribonukleotidi ili deoksirubeonukleotidi ili modifikovani oblik bilo kog tipa nukleotida. Navedene modifikacije obuhvataju modifikacije baze kao što je to slučaj sa bromudirinom, modifikacije riboze kao što je to slučaj sa arabinozidom i 2',3'-dideoksiribozom i modifikacije internukleotidnih veza, kao što je to slučaj sa fosforitioatnom, fosforodipioatnom, fosforoselenoatnom, fosforodiselenoatnom, fosforoamilotilatnom, fosforoamiladaknom i fosforoamidatnom vezom. Pojam «polunuklotid» specifično obuhvata jednolančana i dvolančane oblike DNK.
Pojam «oligonukleotid», kao što se ovde koristi, obuhvata prirodne i modifikovane nukleotide koji su zajedno povezani prirodnim i/ili veštačkim oligonukleotidnim vezama. Oligonukleotidi su podgrupa polinukleotida koja obuhvata članove, u opštem slučaju jednolančane, pa dužinom od 200 nukleotida ili sa manjom dužinom. U određenim rešenjima, oligonukleotidi su dugi od 10 do 60 nukleotida. U određenim rešenjima, oligonukleotidi poseduju dužinu od 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 do 40 nukleotida. Oligonukleotidi mogu biti jednolančani ili dvolančani, npr., mogu da se koriste u konstrukciji genetskog mutanta. Oligonukleotidi prema predmetnom pronalasku mogu biti kodirajući ili nekodirajući oligonukleotidi što se određuje u odnosu na sekvencu koja kodira protein.
Pojam «nukleotidi koji se javljaju u prirodi» obuhvataju deoksiribonukleotide i ribonukleotide. Pojam «modifikovani nukleotidi» obuhvata nukleotide sa modifikovanim ili supstituisanim šećernim grupama i sličnim. Pojam «oligonukleotidne veze» obuhvata oligonukleotidne veze kao što su fosforodilatna, fosforodipilatna, fosforoselenoatna, fosforodiselenoatna, fosforoamilotilatna, fosforamiladatna, fosforoamidatna veza i sliča. Videti, na primer, LaPlanche et al., 1986, Nucl. Acids Res., 14:9081; Stec et al., 1984, J. Am. Chem. Soc., 106:6077; Stein et al., 1988, Nucl. Acids Res., 16:3209; Zon et al., 1991, Anti-Cancer Drug Design, 6:539; Zon et al., 1991, OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, pp. 87-108 (F. Eckstein, urednik), Oxford University Press, Oxford England; Stec et al., U.S. Pat. br. 5,151,510; Uhlmann i Peyman, 1990, Chemical Reviews, 90:543, pri čemu su naveden reference ovde inkorporirane po referenci u bilo koju svrhu da se koriste. Oligonukleotid može da obuhvati detektabilnu oznaku koja omogućava detekciju oligonukleotida ili njenu hibridizaciju.
Pojam «vektor» obuhvata molekulnukleinske kiseline koji je sposoban za prenos druge nukleinske kiseline sa kojim je povezan. Jedan tip vektora jeste «plasmid», koji predstavlja kružnu dvolančanu DNK petlju u koju mogu biti ligirani dodatni DNK segmenti. Drugi vid vektora je virusni vektor, u kome dodatni DNK segmenti mogu biti ligirani u virusni genom. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćinu u koju su uvedeni (npr., to su bakterijski vektori koji imaju bakterijsko mesto porekla replikacije i epizomski sisarski vektor). Drugi vektori (npr., ne-epizomski sisarski vektori) mogu biti integrisani u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u unutrašnjost ćelije domaćina, nakon čega se repliciraju zajedno sa genomom ćelije domaćina. Šta više, određeni vektori su sposobni da usmere ekspresiju gena sa kojima su operativno povezani. Takvi vektori se ovde označavaju kao «rekombinantni vektori za ekspresiju» (ili jednostavno «vektori za ekspresiju»). Generalno, ekspesivni vektori koji se mogu koristiti u tehnikama rekombinantne DNK se često nalaze u oblik plazmida. U predmetnoj specifikaciji, pojmovi «plazmid» i «vektor» mogu da se koriste naizmenično, jer se plazmid najčešće koristi kao vektor. Međutim, predmetni pronalazak obimom zaštite obuhvata i navedene druge oblike ekspresionih vektora, kao što su virusni vektori (npr., retrovirusi sa defektnom replikacijom, adenovirusi i virusi koji su udruženi sa adenovirusima), koji služe za ekvivalentne svrhe.
Izraz «rekombinantna ćelija domaćin» (ili jednostavno «ćelija domaćin») obuhvata ćeliju u koju je uveden rekombinantni vektor za ekspresiju. Treba napomenuti stručnjacima da se navedeni pojmovi ne odnose samo na određenu subjektnu ćeliju, već i na potomstvo takve ćelije. S obzirom da mogu da se jave određene modifikacije u generacijama potomaka usled mutacije ili uticaja sredine, navedeno potomstvo, u stvari ne mora biti identično sa ćelijom domaćinom, ali se još uvek smatra da spada pod obim pojma «ćelija domaćin», kao što se taj pojam ovde koristi. Za ekspresiju antitela prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste različiti sistemi za ekspresiju u organizmu domaćinu, što obuhvata bakterijske, gljivične, vakulovirusne sisarske ekspresione sisteme (kao i sisteme za ekspresiju fagnih biblioteka). Primer odgovarajućeg bakterijskog vektora ekspresije je pUC19. Da bi eksprimirala rekombinantno antitelo, ćelija domaćin biva transkicirana jednim ili sa više rekombinantnih ekspresionih vektora koji nose DNK fragmente koji kodiruju laki i teški lanac antitela, na primer, tako da su laki i teški lanac eksprimirani u ćeliji domaćinu i poželjno da se sekretuju u podlogu u kojoj je ćelija domaćin kultivisana, pri čemu iz navedene podloge mogu da se prikupe ta antitela. Za dobijanje gena za teški i laki lanac, kao i za inkorporaciju ovih gena u vektore za rekombinantnu ekspresiju i uvođenje ovih vektora u ćelije domaćine koriste se standardne metodologije rekombinantne DNK, kao što su one koje su opisan u Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories, Ausubel, F.M et al. urednici Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) i u U.S Patent br. 4,816, 397, koji je predmet ove strane.
Pojam «ćelija domaćin» se koristi da označi ćeliju koja je transformirana ili koja je sposobna da bude transformirana sekvencom nukleinske kiseline, a potom i da eksprimira izabrane gene od interesa. Navedeni pojam obuhvata potomstvo ćelije roditelja, bez obzira da li je to potomstvo identično morfološki, genetski sa orginalnom ćelijom roditelja, sve dotle dok je izabrani gen prisutan u potomstvu.
Pojam «transdukcija» se koristi da označi transfer gena iz jedne bakterije u drugu, obično posredstvom faga. Pojam «transdukcija» se takođe odnosi na akviziciju i transfer eukariotskih nukleotidnih sekvenci od strane retro virusa.
Pojam «transfekcija» se koristi da označi preuzimanje strane ili egzogene DNK od strane ćelije, a ćelija se smatra «transficiranom» onda kada je egzogena DNK uvedena u okvir ćelijske membrane. U struci su poznate i ovde su opisane brojne tehnike za transfekciju. Videti, npr., Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories; Davis et al., 1986, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier, i Chu et al., 1981, Gene 13:197. Navedene tehnike mogu da se koriste za uvođenje jednog ili više molekula egzogene DNK u odgovarajuće ćelije domaćina.
Pojam «transformacija», kao što se ovde koristi, označava promenu genetskih karakteristika ćelije a ćelije se smatra transformiranom onda kada je modifikovana tako da sadrži novu DNK. Na primer, ćelija se smatra transformiranom onda kada je genetski modifikovana u odnosu na svoje prirodno stanje. Nakon transfekcije ili transdukcije, transformišuća DNK može da se rekombinuje sa DNK ćelije i da se fizički integriše u hromozom te ćelije ili može prolazno da se održava u vidu epizomskog elementa koji se ne replicira ili koji može da se nezavisno replicira kao plazmid. Smatra se da je ćelija stabilno transformirana onda kada se DNK replicira uporedo sa ćelijskom deobom.
Pojam «onaj koji se prirodno javlja» ili «nativni», u slučaju da se koristi za biološke materijale, kao što su molekuli nukleinske kiseline, polipeptidi, ćelije domaćini i slični, odnosi se na materijale koji se nalaze u prirodi i koji nisu modifikovani od strane čoveka. Slično tome, pojmovi «onaj koji se ne javlja u prirodi» ili «ne-nativni» kao što se ovde koriste, označavaju materijale koji se ne mogu naći u prirodi ili koji su strukturno modifikovani ili sintetisani od strane čoveka.
Pojam «antigen» označava molekul ili deo molekula koji poseduje sposobnost da bude vezan od strane sredstva za selektivno vezivanje, kao što je to antitelo, i koji poseduje dodatnu sposobnost da može da se koristi kod životinje za proizvodnju antitela koja su sposobna za vezivanje za epitop na tom antigenu. Antigen može da poseduje jedan ili više epitopa.
Pojam ''identičnost'', kao što je poznato u struci, označava odnos između sekvenci dva ili više molekula polipeptida ili dva ili više molekula nukleinskih kiselina, koji se određuje upoređivanjem ovih sekvenci. U struci, pojam ''identičnost'' takođe označava stepen povezanosti sekvenci molekula nukleinskih kiselina ili polipeptida, koji se određuje poklapanjem između dva ili više nukleotida u niti polinukleotida ili između dve ili više aminokiselina u aminokiselinskoj sekvenci. Pojmom ''identičnost'' se označava procenat identičnih poklapanja između dve ili više sekvenci uz korišćenje poravnanja sa prazninama (ukoliko takve postoje) upotrebom specifičnog matematičkog modela ili kompjuterskog programa (tj., upotrebom takozvanih ''algoritama'').
Pojam "sličnost" se koristi u struci da označi koncept koji je u vezi sa prethodno objašnjenim,ali nasuprot pojmu "identičnost", pojam "sličnost" se odnosi na meru povezanosti koja obuhvata i identična poklapanja i poklapanja konzervativnih supstitucija. Ukoliko dve polipeptidne sekvence imaju, na primer, 10/20 identičnih aminokiselina, a ostatak su nekonzervativne supstitucije, tada je procenat identičnosti i sličnosti 50%. Ukoliko u istom primeru postoji pet ili više pozicija na kojima su konzervativne supstitucije, tada procenat identičnosti ostaje 50%, ali je procenat sličnosti 75% (15/20). Stoga, u slučajevima u kojima postoje konzervativne supstitucije, proenat sličnosti između dva polipetida će biti veći od procenta identičnosti između ova dva polipeptida.
Identitet i sličnost povezanih nukleinskih kiselina i polipeptida se može lako izračunati korišćenjem poznatih postupaka. Ovi postupci obuhvataju, bez ograničenja, one koji su opisani u "Computational Molecular Biology", Lesk, A.M., urednik, Oxford University Press, New York Press (1988); "Biocomputing: Informatics and Genome Projects", Smith, D.W., urednik, Academic Press, New York (1993); "Computer Analysis of Sequence Data, Part 1", Griffin, A.M. & Griffin, H.G., urednici, Humana Press, New Jersey (1994); "Sequence Analysis in Molecular Biology", von Heinje, G., Academic Press (1987); "Sequence Analysis Primer", Gribskov, M. & Devereux, J., urednici, M. Stockton Press, New York (1991); Carillo et al., SIAM, J. Applied Math., 48 : 1073 (1988); i Durbin et al., Biological Sequence Analysis, 1998, Cambridge University Press.
Poželjni postupci za određivanje identiteta su tako dizajnirani da daju podatke o najvećem poklapanju između ispitivanih sekvenci. Postupci kojim se određuje identitet su opisani u javno dostupnim kompjuterskim programima. Poželjni postupci koji uključuju upotrebu kompjuterskog programa za određivanje identiteta između dve sekvence obuhvataju, bez ograničenja, GCG programski paket, uključujući GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12: 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconskin, Medison, WI), BLASTP, BLASTN i FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403 - 410 (1990)). BLASTX program je javno dostupan od strane Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (National Center for Biotechnology Information - NCBI) i iz drugih izvora (BLAST Manual, Altschul et al., NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., gore navedeno (1990)). Dobro poznati Smith Waterman algoritam takođe može biti korišćen za određivanje identiteta.
Određene šeme poravnanja koje se koriste za poravnanje dve aminokiselinske sekvence mogu da rezultuju u poklapanju samo kratkih regiona dve sekvence, a ove male poravnate regije mogu posedovati veoma veliki stepen identičnosti sekvenci, iako nema značajnog odnosa između sekvenci u punoj dužini. Shodno tome, u određenim rešenjima, primena određenog postupka poravnavanja (GAP program) dovešće do poravnanja koje se proteže na najmanje 50 susednih aminokiselina ciljnog polipeptida.
Na primer, korišćenjem GAP kompjuterskog algoritma (Genetics Computers Group, University of Wisconsin, Medison, WI), dva polipeptida, za koje treba da se odredi stepen identičnosti sekvenci, poravnati su radi optimalnog poklapanja njihovih odgovarajućih aminokiselinskih sekvenci ("poklapanje segmenata", koje je utvrđeno algoritmom). U određenim rešenjima, zajedno sa algoritmom su korišćeni zabrana za praznine na početku (koja se izračunava kao 3 × prosečna dijagonala; "prosečna dijagonala" je prosečna vrednost dijagonale matriksa za poređenje koji se koristi; "dijagonala" je vrednost ili broj koji je dodeljen svakom perfektnom poklapanju aminokiselina od strane određenog matriksa za poređenje) i zabrana za praznine u produžetku (koja je obično 1/10 puta u odnosu na veličinu zabrane za praznine na početku), a korišćen je i matriks za poređenje, na primer, PAM 250 ili BLOSUM 62. U određenim rešenjima, algoritam takođe koristi standardni matriks za poređenje (videti Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5 : 345 - 352, za PAM 250 matriks za poređenje; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89 : 10915 - 10919 za BLOSUM 62 matriks za poređenje).
U određenim rešenjima, parametri za poređenje polipeptidne sekvence obuhvataju sledeće:
Algoritam: Needleman et al., J. Mol. Biol., 48 : 443 - 453 (1970):
Matrica za poređenje: BLOSUM 62, Henikoff et al., gore navedeno (1992);
Zabrana za praznine na početku: 12
Zabrana za dužinu praznine: 4
Prag sličnosti: 0
GAP program može biti od koristi uz upotrebu gore navedenih parametara. U određenim rešenjima, prethodno navedeni parametri su standardni parametri za poređenje polipeptida (bez zabrane za prazninu na kraju) pri korišćenju GAP algoritma.
Pojam "homologija" označava stepen sličnosti između proteinskih sekvenci ili između sekvenci nukleinskih kiselina. Podaci o homologiji su korisni za razumevanje genetske povezanosti određenih proteinskih klasa molekula ili klasa molekula nukleinskih kiselina. Homologija može da se odredi poravnanjem i upoređivanjem sekvenci. Tipično, za određivanje homologije aminokiselina, proteinska sekvenca se poredi sa bazom podataka u kojoj su poznate proteinske sekvence. Homologe sekvence poseduju zajednički funkcionalni identitet u nekom delu svojih sekvenci. Visok stepen sličnosti ili identičnosti obično ukazuje na homologiju, iako nizak stepen sličnosti ili identičnosti ne ukazuje obavezno na nedostatak homologije.
Za poređenje aminokiselina iz jedne sekvence sa aminokiselinama druge sekvence u cilju određivanja homologije mogu da se koriste bojni pristupi. Generalno, ovi pristupi spadaju u dve kategorije: (1) poređenje fizičkih karakteristika, kao što su polarnost, naelektrisanje i Van der Waals-ova zapremina, kako bi se generisala matrica sličnosti; i (2) poređenje mogućih supstitucija aminokiselina u sekvenci sa bilo kojom drugom aminokiselinom, što se zasniva na posmatranju mnogobrojnih proteinskih sekvenci poznatih homologih proteina, kako bi se generisala matrica tačkastih prihvatljivih mutacija (PAM - Point Accepted Mutations).
Procenat identičnosti, takođe, može da se izračuna upotrebom programa Needle (EMBOSS programski paket) ili programa Stretcher (EMBOSS programski paket) ili programa Align X, koji je modula vektora NTI suite 9.0.0 programskog paketa, korišćenjem osnovnih parametara (npr., zabrana za dužinu praznine 5, zabrana za prazninu na početku 15, zabrana za ekstenziju praznine 6.6).
Kao što se ovde upotrebljavaju, dvadeset konvencionalnih aminokiselina i njihove skraćenice se koriste na konvencionalan način. Videti: "Immunology - A Synthesis", 2. izdanje, (urednici E. S. Golub & D. R. Gren), Sinauer Associates: Sunderland, MA (1991), koja je ovde inkorporirana po referenci u bilo koju svrhu da se koristi. Stereoizomeri (npr., D-aminokiseline) dvadeset konvencionalnih aminokiselina, aminokiseline koje se ne javljaju u prirodi, kao što su α-, α-disupstituisane aminokiseline, N-alkil aminokiseline, mlečna kiselina i druge nekonvencionalne aminokiseline, takođe mogu biti pogodne komponente za polipeptide prema predmetnom pronalasku. Primeri nekonvencionalnih aminokiselina obuhvataju: 4-hidroksiprolin, γ-karboksiglutamat, ε-N,N,N-trimetil lizin, ε-N-acetil lizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, σ-N-metilarginin i druge slične amino i imino kiseline (npr. 4-hidroksiprolin). U nomenklaturi polipeptida koja se ovde koristi, L smer je smer amino terminala, a R smer je smer karboksi terminala, shodno standardnoj upotrebi i konvenciji.
Prirodni aminokiselinski ostaci se mogu podeliti u klase na osnovu zajedničkih osobina bočnih lanaca:
1) hidrofobni: norleucin (Nor ili Nle), Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr, Pro;
2) polarni hidrofilni: Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr;
3) alifatični: Ala, Gly, Ile, Leu, Val, Pro;
4) aliftični hidrofobni: Ala, Ile, Leu, Val, Pro;
5) neutralni hidrofilni: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
6) kiseli: Asp, Glu;
7) bazni: His, Lys, Arg;
8) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;
9) aromatični: His, Trp, Tyr, Phe; i
10) aromatični hidrofobni: Phe, Trp, Tyr.
Konzervativne aminokiselinske supstitucije mogu da obuhvate zamenu jednog člana neke od navedenih klasa sa drugim članom iste klase. Konzervativne aminokiselinske supstitucije obuhvataju veštačke aminokiselinske ostatke, koji su tipično inkorporirani hemijskom sintezom peptida, pre nego sintezom u biološkim sistemima. Ovde spadaju peptidomimetski i drugi obrnuti ili invertovani oblici aminokiselinskih podjedinica.
Nekonzervativne supstitucije obuhvataju izmenu člana jedne klase sa članom druge klase. Ovako supstituisani ostaci se mogu uvesti u regione humanog antitela koji su homologi sa ne-humanim antitelima, ili u nehomologe regione molekula.
Prema određenim rešenjima, pri pravljenu ovakvih izmena se mora uzeti u obzir hidropatski indeks aminokiselina. Svakoj aminokiselini je priprisan hidropatski indeks na osnovu njene hidrofobičnosti i karakteristika naelektrisanja. Vrednosti ovih indeksa su: izoleucin (+4,5); valin (+4,2); leucin (+3,8); fenilalanin (+2,8); cistein/cistin (+2,5); metionin (+1,9); alanin (+1,8); glicin (-0,4); treonin (-0,7); serin (-0,8); triptofan (-0,9); tirozin (-1,3); prolin (-1,6); histidin (-3,2); glutamat (-3,5); glutamin (-3,5); aspartat (-3,5); asparagin (-3,5); lizin (-3,9) i arginin (-4,5).
Važnost hidropatskog indeksa aminokiselina u ispoljavanju interaktivne biološke funkcije na proteinu je poznata u struci (videti, na primer, Kyte et al., J. Mol. Biol., 157 : 105 - 131 (1982)). Poznato je da određene aminokiseline mogu biti supstituisane drugim aminokiselinama koje poseduju sličan hidropatski indeks ili vrednost, nakon čega one još uvek zadržavaju sličnu biološku aktivnost. Prilikom pravljenja promena zasnovanih na hidropatskom indeksu, u određenim rešenjima, obuhvaćene su supstitucije aminokiselina čiji se hidropatski indeksi nalaze u intervalu od ± 2. U određenim rešenjima, takođe su obuhvaćene i supstitucije aminokiselina čiji se hidropatski indeksi nalaze u intervalu od ± 1, a u određenim rešenjima, obuhvaćene su i supstitucije aminokiselina čiji se hidropatski indeksi nalaze u intervalu od ± 0,5.
U struci je takođe poznato da se mogu efikasno napraviti supstitucije aminokiselina koje su slične po hidrofilnosti, posebno onda kada su biološki funkcionalni protein ili peptid koji su kreirani na taj način namenjeni upotrebi u imunološkim rešenjima, kao što je to slučaj u predmetnom pronalasku. U određenim rešenjima, najveća lokalna prosečna hidrofilnost proteina, koja je određena hidrofilnošću susednih aminokiselina, korelira sa imunogenošću i antigenošću, tj. sa biološkim svojstvima proteina.
Aminokiselinskim ostacima su pripisane sledeće vrednosti hidrofilnosti: arginin (+3,0); aspartat (+3,0 ± 1); glutamat (+3,0 ± 1); serin (+0,3); asparagin (+0,2); glutamin (+0,2); glicin (0); treonin (-0,4); prolin (-0,5 ± 1); alanin (-0,5); cistein (-1,0); metionin (-1,3); valin (-1,5); leucin (-1,8); izoleucin (-1,8); tirozin (-2,3); fenilalanin (-2,5) i triptofan (-3,4). Prilikom pravljenja promena zasnovanih na sličnim vrednostima hidrofilnosti, u određenim rešenjima su uključene supstitucije aminokiselina čije se vrednosti hidrofilnosti nalaze u opsegu od ± 2, u određenim rešenjima su uključene supstitucije aminokiselina čije se vrednosti hidrofilnosti nalaze u opsegu od ± 1, a u određenim rešenjima su uključene supstitucije aminokiselina čije se vrednosti hidrofilnosti nalaze u opsegu od ± 0,5. Takođe, na osnovu hidrofilnosti se mogu identifikovati epitopi od primarnih aminokiselinskih sekvenci. Ovakvi regioni se takođe označavaju i kao "osnovni epitopski regioni".
Primeri aminokiselinskih supstitucija su prikazani u Tabeli 1.
Tabela 1: Aminokiselinske supstitucije
Originalni ostaci
Primeri supstitucija
Poželjne supstitucije
Ala
Val, Leu, Ile
Val
Arg
Lys, Gln, Asn
Lys
Asn
Gln
Gln
Asp
Glu
Glu
Cys
Ser, Ala
Ser
Gln
Asn
Asn
Glu
Asp
Asp
Gly
Pro, Ala
Ala
His
Asn, Gln, Lys, Arg
Arg
Ile
Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucin
Leu
Leu
Norleucin, Ile, Val, Met, Ala, Phe
Ile
Lys
Arg, 1,4 diamino-buterna kiselina, Gln, Asn
Arg
Met
Leu, Phe, Ile
Leu
Phe
Leu, Val, Ile, Ala, Tyr
Leu
Pro
Ala
Gly
Ser
Thr, Ala, Cys
Thr
Thr
Ser
Ser
Trp
Tyr, Phe
Tyr
Tyr
Trp, Phe, Thr, Ser
Phe
Val
Ile, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucin
Leu
Iskusni stručnjak može da odredi odgovarajuće varijante polipeptida koji su ovde predstavljeni korišćenjem dobro poznatih tehnika. U određenim rešenjima, stručnjak može da identifikuje odgovarajuća područja molekula koja se mogu promeniti bez uništavanja aktivnosti ciljanjem regiona za koje se veruje da nisu važni za ispoljavanje aktivnosti. U određenim rešenjima, mogu se identifikovati ostaci i delovi molekula koji su konzervirani kod različitih polipeptida. U određenim rešenjima, čak se i područja koja mogu biti značajna za ispoljavanja biološke aktivnosti ili za strukturu mogu podvrgnuti konzervativnim supstitucijama aminokiselina bez narušavanja biološke aktivnosti ili negativnog uticaja na strukturu polipeptida.
Dodatno, stručnjak može da izvrši ispitivanja povezanosti strukture i funkcije identifikujući ostatke u sličnim polipeptidima koji su važni za ispoljavanje aktivnosti ili za strukturu. S obzirom na ovakvo poređenje, može se predvideti važnost aminokisleinskih ostataka u proteinu koji koreliraju sa aminokiselinskim ostacima važnim za ispoljavanje aktivnosti ili za strukturu sličnih proteina. Stručnjak može izabrati hemijski slične aminokiselinske ostatke za supstitucije predviđenih važnih aminokiselinskih ostataka.
Stručnjak takođe može da analizira trodimenzionalnu strukturu i aminokiselinsku sekvencu u odnosu na strukturu sličnih polipeptida. Na osnovu takvih informacija, stručnjak može da predvidi redosled aminokiselinskih ostataka antitela u odnosu na njegovu trodimenzionalnu strukturu. U određenim rešenjima, stručnjak može da izabere da ne pravi radikalne promene aminokiselinskih ostataka predviđenih da budu na površini proteina, jer takvi ostaci mogu biti uključeni u važne interakcije sa drugim molekulima. Štaviše, stručnjak može da napravi test varijante koje sadrže jednu aminokiselinsku supstituciju na svakom željenom aminokiselinskom ostatku. Tada varijante mogu da budu ispitane korišćenjem testova koji su poznati stručnjacima. Takve varijante mogu da posluže za prikupljanje informacija o pogodnim varijantama. Na primer, ukoliko se otkrije da promena određenog aminokiselinskog ostatka dovodi do gubitka, neželjenog smanjenja ili ispoljavanja nepoželjne aktivnosti, varijante sa takvom promenom mogu da se izbegnu. Drugim rečima, na osnovu informacija koje se prikupljaju tokom ovih rutinskih eksperimenata, stručnjak može lako da odredi aminokiseline kod kojih dalje supstitucije treba izbegavati, bilo same po sebi ili u kombinaciji sa drugim mutacijama.
Brojne naučne publikacije su posvećene predviđanju sekundarne strukture. Videti: Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7 (4) : 422 - 427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13 : 222 - 245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113 (2) : 211 - 222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47 : 45 - 148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47 : 251 - 276 i Chou et al., Biophys. J., 26 : 367 - 384 (1979). Štaviše, trenutno su dostupni kompjuterski programi koji su od pomoći u predviđanju sekundarne strukture. Jedan postupak za predviđanje sekundarne strukture se zasniva na modelovanju homologijom. Na primer, dva polipeptida ili proteina čije sekvence poseduju identičnost veću od 30% ili sličnost veću od 40%, obično imaju slične strukturne topologije. Rast banke podataka proteinske strukture (Protein Structural Database - PBD) omogućava poboljšano predviđanje sekundarne strukture, uključujući potencijalni broj pregiba unutar polipeptidne ili proteinske strukture. Videti, Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27 (1) : 244 - 247 (1999). Sugerisano je (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7 (3) : 369 - 376 (1997)) da postoji ograničen broj pregiba u datom polipeptidu ili proteinu i da onda kada se razreši kritičan broj struktura, predviđanje strukture postaje dramatično preciznije.
Dodatni postupci predviđanja sekundarne strukture obuhvataju "razmenu" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. biol., 7 (3) : 377 - 87 (1997); Sippl et al., Structure, 4 (1): 15 - 19 (1996)), "analizu profila" (Bowie et al., Science, 253 : 164 - 170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enyzm., 183 : 146 - 159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84 (13) : 4355 - 4358 (1987)) i "evolucionu vezu" (videti Holm, navedeno ranije (1999) i Brenner, navedeno ranije (1997)).
U određenim rešenjima, varijante antitela obuhvataju glikozilirane varijante kod kojih je broj i/ili tip glikozilacionih mesta izmenjen u poređenju sa aminokiselinskim sekvencama roditeljskog polipeptida. U određenim rešenjima, varijante proteina obuhvataju veći ili manji broj glikozilacionih mesta sa N-vezom u poređenju sa nativnim proteinom. Mesto za glikozilaciju povezano za N je okarakterisano sekvencom: Asn - X - Ser ili Asn - X - Thr, pri čemu aminokiselinski ostatak označen sa X može biti bilo koji aminokiselinski ostatak izuzev prolina. Supstitucija aminokiselinskih ostataka u cilju stvaranja ove sekvence obezbeđuje potencijalno novo mesto za adiciju na N povezanog ugljenohidratnog lanca. Alternativno, supstitucije koje eliminišu ovu sekvencu uklanjaju postojeći ugljenohidratni lanac povezan za N. Takođe, obezbeđeno je preuređivanje za N povezanih ugljenohidratnih lanaca kod kojih je jedno ili više za N povezanih mesta za glikozilaciju (tipično ona koja se prirodno javljaju) eliminisano i kod kojih je jedno ili više novih za N povezanih mesta kreirano. Dodatne poželjne varijante antitela obuhvataju varijante sa cisteinom kod kojih je jedan ili više cisteinskih ostataka deletirano ili supstituisano drugim aminokiselinama (npr., serin) u odnosu na roditeljsku aminokiselinsku sekvencu. Cisteinske varijante mogu biti korisne onda kada se antitelo mora ponovo saviti u biološki aktivnu komformaciju, kao što je to slučaj nakon izolacije nerastvornih inkluzionih tela. Cisteinske varijante generalno imaju manje cisteinskih ostataka od nativnog proteina i tipično poseduju paran broj tih ostataka u cilju minimiziranja interakcija nastalih postojanjem neuparenih cisteina.
U dodatnim rešenjima, varijante antitela obuhvataju antitela koja sadrže modifikovani Fc fragment ili modifikovani konstantni region teškog lanca. Fc fragment, što konkretno znači "fragment koji kristalizuje", ili konstantni region teškog lanca mogu biti modifikovani mutacijom koja menja karakteristike vezivanja antitela. Videti, na primer, Burton & Wolf, 1992, Advances in Immunology 51: 1 - 84; Ravetsc & Bolland, 2001, Annu. Rev. Immunol. 19: 275 - 90; Shields et al., 2001, Journal of Biol. Chem. 276: 6591 - 6604; Telleman & Junghaus, 2000, Immunology 100: 245 - 251; Medesan et al., 1998, Eur. J. Immunol. 28: 2092 - 2100; pri čemu su sve navedene publikacije ovde inkorporirane po referenci. Navedene mutacije obuhvataju supstitucije, adicije, delecije, ili bilo koju njihovu kombinaciju, i tipično se izvode pomoću mutageneze usmerene na određeno mesto korišćenjem jednog ili više mutagenih nukleotida prema postupcima koji su ovde opisani, kao i prema postupcima koji su poznati u struci (videti, npr., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. izdanje, 2001, Cold Springs Harbor, NY i Berger & Kimmel, Methods in Enzymology, Vol. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Inc., San Diego, CA, koje su ovde inkorporirane po referenci).
Prema određenim rešenjima, poželjne aminokiselinske supstitucije su one koje: (1) smanjuju podložnost proteolizi, (2) smanjuju podložnost oksidaciji, (3) menjaju afinitet vezivanja za nastanak proteinskih kompleksa, (4) menjaju afinitete vezivanja i/ili (5) predstavljaju ili modifikuju druga fizičko-hemijska ili funkcionalna svojstva takvih polipeptida. Prema određenim rešenjima, pojedinačne ili višestruke aminokiselinske supstitucije (u određenim rešenjima, konzervativne aminokiselinske supstitucije) mogu da se naprave u prirodnoj sekvenci (u određenim rešenjima, u delu polipeptida van domena koji stvaraju intermolekulske kontakte). U određenim rešenjima, konzervativne aminokiselinske supstitucije tipično ne mogu značajno da menjaju strukturne karakteristike roditeljske sekvence (npr. zamena aminokiseline ne treba da narušava heliks koji postoji u roditeljskoj sekvenci ili da narušava druge tipove sekundarne strukture koji su karakteristični za roditeljsku sekvencu). Primeri u struci priznatih polipeptidnih sekundarnih i tercijarnih struktura su opisani u publikaciji "Proteins, Structures and Molecular Principles", Creighton, urednik, W. H. Freeman & Company, New York (1984); "Introduction to Protein Structure", C. Branden & J. Tooze, urednici, Garland Publishing, New York, N.Y. (1991); i Thornton et al., Nature, 354 : 105 (1991), koje su sve ovde inkorporirane po referenci.
Peptidni analozi se uobičajeno koriste u farmaceutsakoj industriji kao ne-peptidni lekovi sa svojstvima koja su analogna onima koje poseduje peptid koji služi za uzor. Pomenuti tipovi ne-peptidnog jedinjenja se označavaju kao "peptidni mimetici" ili "peptidomimetici". Videti Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15 : 29 (1986); Veber & Freidinger, TINS str. 392 (1985); i Evans et al., J. Med. Chem. 30 : 1229 (1987), koje su ovde uključene po referenci u bilo koju svrhu da se koriste. Ova jedinjenja se često razvijaju uz pomoć kompjuterizovanog molekulskog modelovanja. Peptidni mimetici koji su strukturno slični terapeutski korisnim peptidima, mogu da se koriste za dobijanje sličnog terapijskog ili profilaktičkog dejstva. Generalno, peptidomimetici su strukturno slični polipeptidu koji služi kao osnovni uzor (tj. peptidu ili polipeptidu koji poseduje određeno biohemijsko svojstvo ili farmakološku aktivnost), kao što je humano antitelo, ali koji poseduje jednu ili više peptidnih veza opciono zamenjenih vezom izabranom između: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH- (cis i trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- i -CH2SO-, postupcima koji su dobro poznati u struci. Sistematska supstitucija jedne ili više amino kiselina konsenzus sekvence sa D-amino kiselinom istog tipa (npr., D-lizin umesto L-lizina), može da se koristi u određenim rešenjima kako bi se dobili poželjniji peptidi. Dodatno, konzervativni peptidi, koji sadrže konsenzus sekvencu ili praktično identičnu varijaciju konsenzus sekvence, mogu da se dobiju postupcima koji su poznati u struci (Rizo i Geirasch, Ann. Rev. Biochem. 61 : 387 (1992), koja je ovde uključena po referenci u bilo koju svrhu da se koristi); na primer, dodavanjem unutrašnjih cisteinskih ostataka sposobnih za formiranje intramolekulskih disulfidnih mostova, koji dovode do ciklizacije peptida.
Pojam "antitelo" ili "peptidi antitela" se odnosi na intaktno antitelo, ili na njegov vezujući fragment koji se pri specifičnom vezivanju nadmeće sa intaktnim antitelom i obuhvata himerična, humanizovana, potpuno humana i bispecifična antitela. U određenim rešenjima, vezujući fragmenti se dobijaju tehnikama rekombinantne DNK. U dodatnim rešenjima, vezujući fragmenti se dobijaju enzimskim ili hemijskim cepanjem intaktnih antitela. Vezujući fragmenti obuhvataju, bez ograničenja, Fab, Fab', F(ab')2, Fv i jednolančana antitela.
Pojam "teški lanac" obuhvata bilo koji imunoglobulinski polipeptid koji ima dovoljnu dužinu sekvence varijabilnog regiona da ispolje specifičnost za NGF. Pojam "laki lanac" obuhvata bilo koji imunoglobulinski polipeptid koji ima dovoljnu dužinu sekvence varijabilnog regiona da ispolje specifičnost za NGF. Teški lanac pune dužine obuhvata domen varijabilnog regiona, VH, i tri domena konstantnog regiona, CH1, CH2, CH3. VH domen je na amino terminalu polipeptida, a CH3 domen je na karboksi terminalu. Pojam "teški lanac", kako se ovde koristi, obuhvata teški lanac pune dužine i njegove fragmene. Laki lanac pune dužine obuhvata domen varijabilnog regiona, VL, i domen konstantnog regiona, CL. Kao kod teškog lanca, domen varijabilnog regiona lakog lanca se nalazi na amino terminalu polipeptida. Pojam "laki lanac", kako se ovde koristi, obuhvata laki lanac pune dužine i njegove fragmente. Fab fragment se sastoji od jednog lakog ranca i od CH1 i od varijabilnih regiona jednog teškog ranca. Teški lanac Fab molekula ne može da formira disulfidnu vezu sa drugim molekulom teškog lanca. Fab' fragment sadrži jedan laki lanac i jedan teški lanac koji ima više od konstantnog regiona, između domena CH1 i CH2, tako da se disulfidna veza između lanaca može stvoriti između dva teška lanca, kako bi nastao molekul F(ab')2. Fv region sadrži varijabilne regione poreklom i od teškog i od lakog lanca, ali mu nedostaju konstantni regioni. Jednolančana antitela su Fv molekuli u kojima su varijabilni regioni teškog i lakog lanca povezani fleksibilnim veznikom, kako bi se dobio pojedinačni polipeptidni lanac koji formira antigen-vezujući region. O jednolančanim antitelima se detaljno diskutuje u Mežunarodnoj patentnoj patentnoj prijavi br. WO 88/01649 i u U.S. patentima br. 4,946,788 i 5,260,203.
"Bivalentno antitelo" koje se razlikuje od "multispecifičnog" ili od "multifunkcionalnog" antitela, u određenim rešenjima tipično poseduje identična vezujuća mesta.
U proceni vezivanja i specifičnosti antitela prema predmetnom pronalasku, smatra se da antitelo u značajnoj meri inhibira adheziju liganda za receptor, onda kada višak antitela smanjuje količinu liganda koji je vezan za receptor za najmanje 20%, 40%, 60%, 80%, 85% ili za više (što se meri, između ostalog, primenom in vitro testa kompetitivnog vezivanja).
Pojam "neutrališuće antitelo" označava molekul antitela koji je sposoban da blokira ili u značajnoj meri smanji efektorsku funkciju antigena - mete za koji se vezuje. Shodno tome, "neutrališuće" anti-NGF antitelo je sposobno da blokira ili u značajnoj meri smanji efektorsku funkciju NGF, kao što je to vezivanje za njegov receptor i/ili izazivanje ćelijskog odgovora na NGF. Fraza "u značajnoj meri smanjiti" označava da je efektorska funkcija antigena - mete (npr., humanog NGF) smanjena za najmanje 60%, poželjno za najmanje 70%, još poželjnije za najmanje 75%, još poželjnije za najmanje 80%, još poželjnije za najmanje 85%, a najpoželjnije za najmanje 90%.
Pojam ''epitop'' obuhvata svaku determinantnu, poželjno polipeptidnu determinantu, koja je sposobna da se specifično veže za molekul imunoglobulina ili T- ćelijski receptor. U određenim rešenjima, epitopske determinante obuhvataju hemijski aktivne površinske grupe molekula kao što su aminokiseline, šećerni bočni lanci, fosforil ili sulfonil grupe, a u određenim rešenjima mogu da poseduju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifično naelektrisanje. Epitop je region na antigenu koji se vezuje za antitelo. U određenim rešenjim aza antitelo se kaže da se specifično vezuje za antigen onda kada specifično prepoznaje svoj ciljni antigen u kompleksnoj smeši proteina i/ili makromolekula. U poželjnim rešenjima za antitelo se kaže da specifično vezuje antigen onda kada je konstanta disocijacije ekvilibrijuma ≤10-8 M, poželjnije kada je konstanta disocijacije ekvilibrijuma ≤10-9 M a najpoželjnije je kada je konstanta disocijacije ekvilibrijuma ≤10-10 M.
Fraza da se antitelo vezuje za "suštinski isti epitop" se odnosi na situaciju u kojoj dva antitela prepoznaju identične ili sterično preklapajuće epitope. Najšire korišćeni i brzi postupci za određivanje da li se dva antitela vezuju za identične ili sterično preklapajuće epitope jesu kompetitivni testovi, koji mogu biti konfigurisani u brojnim različitim formatima, korišćenjem ili obeleženog antigena ili obeleženog antitela. Uobičajeno se antigen imobiliše na supstratu, pa se posle toga meri sposobnost neobeleženih antitela da blokiraju vezivanje obeleženih antitela, korišćenjem radioaktivnih ili enzimskih oznaka.
Pojam "sredstvo" označava hemijsko jedinjenje, smešu hemijskih jedinjenja, biološki makromolekul ili ekstrakt dobijen iz bioloških materijala.
Kao što se ovde koriste, pojmovi "oznaka" ili "obeležen" odnose se na uključivanje markera koji se mogu detektovati, npr., na inkorporaciju radioaktivno obeležene amino kiseline ili na vezivanje biotinskih podjedinica za polipeptid, koje se mogu detektovati obeleženim avidinom (npr., streptavidinom koji poželjno sadrži marker, kao što je fluoroscentni marker, hemiluminescentni marker ili enzimsku aktivnost koja se može detektovati optičkim ili kolorimetrijskim postupcima). U određenim rešenjima, oznaka ili marker takođe može da poseduje terapijsku vrednost. Različiti postupci obeležavanja polipeptida i glikoproteina su poznati u struci i mogu ovde poželjno da se primene. Primeri oznaka za polipeptide obuhvataju, bez ograničenja, sledeće: radioizotope ilii radionuklide (npr., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), fluoroscentne oznake (npr., fluorescein izotiocijanat (FITC), rodamin ili lantanid fosfori), enzimske oznake (npr, peroksidaza rena, β-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza), hemiluminiscentne oznake, haptenske oznake kao što su biotinil grupe, kao i prethodno određene polipeptidne epitope koje prepoznaju sekundarni reporteri (npr., leucinske uklapajuće parne sekvence, vezujuća mesta za sekundarna antitela, domene za vezivanje metala, epitopske oznake). U određenim rešenjima, oznake su prikačene kracima za razdvajanje (kao što je (CH2)n, gde je n < 20) različitih dužina u cilju smanjenja potencijalne sterične prenapregnutosti.
Pojam "biološki uzorak", kao što se ovd koristi, obuhvata, bez ograničenja, bilo koju količinu supstance poreklom iz živog bića ili bića koje je bilo živo. Pomenuta živa bića obuhvataju, bez ograničenja, ljude, miševe, majmune, pacove, zečeve i druge životinje. Pomenute supstance obuhvataju, bez ograničenja, krv, serum, urin, ćelije, organe, tkiva, kost, kostnu srž, limfne čvorove i kožu.
Pojam "farmaceutsko sredstvo ili "lek", kao što se ovde koristi, označava hemijsko jedinjenje ili preparat koji je sposoban da indukuje pojavu željenog terapijskog dejstva pošto se na odgovarajući način primeni kod pacijenta. Izraz "farmaceutski efikasna količina", kada se koristi za farmaceutski preparat koji sadrži jedno ili više antitela prema predmetnom pronalasku, označava količinu navedenog farmaceutskog preparata koji je sposoban da kod određenog pacijenta obustavi smanjenje praga bolne osetljivosti na spoljašnje nadražaje i da vrati nivo ove osetljivosti na nivo koji postoji kod zdravih subjekata.
Pojam "poremećaj" označava bilo koje stanje koje može da se poboljša tretmanom prema premetnom pronalasku. Pojmovi "poremećaj" i "stanje" se ovde koriste naizmenično i obuhvataju hronične i akutne poremećaje koji su posredovani sa NGF ili oboljenja koja su posredovana sa NGF, uključujući ona patološka stanja koja određenu životinju čine podložnom tom poremećaju.
Pojmovi "oboljenje koje je posredovano sa NGF" i "stanje koje je posredovano sa NGF" obuhvataju bilo koje medicinsko stanje ili poremećaj koji su udruženi sa povišenim nivoima NGF ili sa povećanom osetljivošću na NGF, uključujući, bez ograničenja, akutni bol, dentalni bol, bol usled traume, hirurški bol, bol nakon amputacije ili apscesa, kauzalgiju, demijelizacione bolesti, neuralgije trigeminusa, kancer, hronični alkoholizam, moždani udar, sindrom talamičkog bola, šećernu bolest, sindrom stečene imunodeficijencije (HIV bolest), dejstvo toksina i hemoterapije, običnu glavobolju, migrenu, serijsku glavobolju, vaskularne i nevaskularne sindrome, tenzionu glavobolju, opšte zapaljenje, artritis, reumatske bolesti, lupus, osteoartritis, inflamatorne poremećaje creva, sindrom iritabilnih creva, inflamatorne poremećaje očiju, inflamatorne poremećaje mokraćne bešike ili poremećaj nestabilne mok. bešike, psorijazu, stanja na koži sa inflamatornim komponentama, opekotine od Sunca, karditis, dermatitis, miozitis, neuritis, kolagena vaskularna oboljenja, hronična inflamatorna stanja, bol kod inflamacije i pridruženu hiperalgeziju i alodiniju, neuropatski bol i pridruženu hiperalgeziju i alodiniju, bol kod dijabetične neuropatije, kauzalgiju, bol posredovan simpatetičkim vlaknima, deaferentacione sindrome, astmu, oštećenje ili disfunkciju epitelnog tkiva, herpes simpleks infelkciju, poremećaje visceralnog motiliteta u respiratornom, genitourinarnom, gastrointestinalnom ili vaskularnom traktu, rane, opekotine, alergijske kožne reakcije, pruritus, vitiligo, opšte gastrointestinalne poremećaje, kolitis, gastrični ulkus, duodenalne ulkuse, vazomotorni ili alergijski rinitis, ili bronhijalne poremećaje, dismenoreju, dispepsiju, gastroezofagealni refluks, pankreatitis i visceralgiju.
Kao što se ovde koriste, pojmovi "efikasna količina" i "terapijski efikasna količina", kada se koriste u kontekstu vehikuluma ili farmaceutskog preparata koji sadrži jedno ili više anti-humanih NGF antitela, odnose se na količinu ili dozu koja je dovoljna da izazove željeni efekat (tj., kod terapije sa vehikulumom ili anti-humanim NGF antitelima prema predmetnom pronalasku, željeni rezultat je smanjenje intenziteta inflamacije i/ili bola) ili da podrži primećeno smanjenje nivo jedne ili više bioloških aktivnosti NGF. Specifično, terapeutski efikasna količina je ona količina anti-humanog NGF humanog antitela koja je dovoljna da inhibira, tokom odrešenog vremenskog perioda, jedan ili više klinički definisanih patoloških procesa koji su udruženi sa određenim stanjem tkiva, npr., sa inflamacijom ili sa bolom, kod subjekta koji se in vivo tretira datim sredstvom. U praksi predmetnog pronalaska, "efikasna količina" anti-NGF antitela može da spreči nastanak, zaustavi, kontroliše ili smanji percepciju bola koji je udružen sa nekim bolnim medicinskim stanjem. U postupcima prema predmetnom pronalasku, pojam "kontrola" i njegove gramatičke varijante se koristi da označi sprečavanje nastanka, delimičnu ili potpunu inhibiciju, redukciju, odlaganje ili usporavanje nastanka neželjenog događaja, npr., bola. Efikasna količina može da varira u zavisnosti od specifičnog vehikuluma ili anti-humanog NGF humanog antitela koje je izabrano, a takođe zavisi od brojnih činilaca i stanja koja su povezana sa subjektom koji se tretira i od ozbiljnosti poremećaja. Na primer, ukoliko vehikulum ili anti-humano NGF humano antitelo treba da se primeni in vivo, navedeni činioci koji treba da se uzmu u obzir su starosna dob, telesna masa i opšte zdravstveno stanje pacijenta, kao i krivulja doza - efekat i podaci o toksičnosti koji su dobijeni u prekliničkom istraživanju na životinjama. Ukoliko sredstvo treba da stupi u kontakt sa ćelijama in vitro, neophodno je dizajnirati brojne prekliničke in vitro studije da bi se procenili takvi parametri kao što su preuzimanje, poluživot, doza, toksičnost i sl. Određivanje efikasne količine ili terapeutski efikasne količine datog sredstva spada u domen kompetencije stručnjaka.
Kao što se ovde koriste, pojmovi "faktor rasta nerva" i "NGF" su definisani kao nativna sekvenca NGF poreklom iz sisara, uključujući rekombinantni humani NGF 1 - 120, prikazan kao sekvenca ID br. 30.
Kao što se ovde koriste, pojmovi "suštinski čist" ili "suštinski prečišćen" označava da je jedinjenje ili molekulska vrsta dominantno među prisutnim molekulskim vrstama (tj., na molarnoj bazi, ta molekulska vrsta je u većoj količini od bilo koje druge pojedinačne molekulske vrste u preparatu).U određenim rešenjima, suštinski prečišćena frakcija je preparat u kome željena molekulska vrsta predstavlja najmanje oko 50% (na molarnoj osnovi) smeše svih prisutnih makromolekulskih vrsta. U određenim rešenjima, suštinski čist preparat predstavlja najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95% ili 99% smeše svih prisutnih makromolekulskih vrsta koje su prisutne u preparatu. U određenim rešenjima, makromolekulska vrsta je prečišćena do suštinske homogenosti (kontaminanti ne mogu da se detektuju u preparatu primenom konvencionalnih postupaka detekcije) onda kada se preparat suštinski sastoji samo od jedne makromolekulske vrste.
Pojam "pacijent" obuhvata ljude i životinje.
Pojam "tretman" ili "tretirati" se odnosi i na terapeutski tretman i na profilaktičke ili preventivne mere. Subjekti kojima je tretman potreba obuhvataju one koji već poseduju poremećaj, kao i one koji su skloni nastanku poremećaja ili one kod koji pojava poremećaja treba da bude sprečena.
Osim ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, pojmovi u jednini obuhvataju i oblike u množini, a važi i obratno.
Prema određenim rešenjima prema predmetnom pronalasku, antitela koja su specifična za NGF mogu da se koriste za lečenje neuropatskog i inflamatornog bola, kao i poremećaja koji su posredovani sa NGF, uključujući, bez ograničenja, one poremećaje koji su ranije pomenuti.
U jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje potpuno humana monoklonska antitela koja su napravljena za i koja poseduju biološku i imunološku specifičnost za vezivanje za humani NGF. U drugom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje nukleotidne sekvence koje kodiraju aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca molekula imunoglobulina, posebno one sekvence koje odgovaraju njihovim varijabilnim regionima. Posebna rešenja ovog aspekta predmetnog pronalaska obezbeđuju sekvence koje odgovaraju regionima za određivanje komplementarnosti (CDR), specifično CDR1 do CDR3 teškog i lakog lanca. U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obzbeđuje ćelije hibridoma i ćelijske linije koje eksprimiraju imnoglobulinske molekule i antitela, poželjno monoklonska antitela prema predmetnom pronalasku. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje biološki i imunološki prečišćene preparate antitela, poželjno monoklonskih antitela koja su usmerena prema i koja poseduju biološku i imunološku specifičnost za vezivanje za humani NGF.
Sposobnost da se klonira i rekonstruiše humani lokus veličine megabaze u veštačkim hromozomima gljivica (YAC - yeast artificial chromosomes), kao i sposobnost da se isti uvedu u mišije germinativne ćelije, predstavlja poželjni pristup razjašnjavanju funkcionalnih komponenti veoma velikih ili grubo mapiranih lokusa kao i za stvaranje korisnih modela humanih oboljenja. Dalje, korišćenje takve tehnologije za supstituciju mišijih lokusa sa njihovim humanim ekvivalentima, omogućava jedinstvene uvide u ekspresiju i regulaciju proizvoda humanog gena tokom razvoja, uvide u njihovu komunikaciju sa drugim sistemima i uvide u njihovu uključenost u pokretanje i progresiju bolesti.
Važna praktična primena takve strategije jeste ''humanizacja'' mišijeg humoralnog imunog sistema. Uvođenje humanih imunoglobulinskih (Ig) lokusa u organizam miša u kome su endogeni Ig geni inaktivirani daje mogućnost za proučavanje mehanizama koji se nalaze u osnovi programirane ekspresije i sklapanja antitela, ako i njihove uloge u razvoju B-ćelija. Dalje, takve strategija obezbeđuje izvor proizvodnje potpuno humanih monoklonskih antitela (MAt).
Pojam "humano antitelo" obuhvata antitela koja poseduju varijabilne i konstantne regione koji suštinski odgovaraju humanim imunoglobulinskim sekvencama kodiranim u germinativnim ćelijama. U odrešenim rešenjima, humana antitela se proizvode u ne-humanim sisarima, uključujući, bez ograničenja, glodare, kao što su miš i pacov, kao i lagomorfe, kao što je zec. U određenim rešenjima, humana antitela se proizvode u hibridomskim ćelijama. U određenim rešenjima, humana antitela se proizvode rekombinantno.
Pojam "rekombinantni", kada se odnosi na antitelo, obuhvata antitela koja su dobijena, eksprimirana, kreirana ili izolovana primenom rekombinantne tehnike. Reprezentativni primeri obuhvataju antitela koja su eksprimirana korišćenjem rekombinantnog ekspresionog vektora koji je transficiran u ćeliju domaćina, antitela koja su izolovana iz rekombinantne kombinatorne humane biblioteke antitela, antitela koja su izolovana iz životinje (npr., iz miša) koja je transgena i poseduje humane imunoglobulinske gene (videti, npr., Taylor, L. D. et al., Nucl. Acids Res. 20: 6287 - 6295 (1992)); ili antitela koja su dobijena, eksprimirana, kreirana ili izolovana na bilo koji način koji uključuje isecanje sekvence humanog imunoglobulinskog gena i njegovo ligiranje sa drugim DNK sekvencama. Takva rekombinantna humana antitela poseduju varijabilni i konstantni region koji je deriviran iz sekvenci humanog imunoglobulinskog gena iz germinativnih ćelija.
Humana antitela poseduju najmanje tri prednosti u odnosu na ne-humana i himerična antitela koja se se koriste u terapiji ljudi:
1) usled prisustva efektorskog dela antitela kod ljudi, ono može bolje da interaguje sa drugim komponentama imunog sistema (npr., može efikasnije da ubija ćelije - mete putem citotoksičnosti koja je posredovana komplementom (CDC) ili putem ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC));
2) humani imunološki sistem bi trebalo da ne prepoznaje humana antitela kao strana, pa je tako humoralni odgovor protiv takvih injektiranih antitela manji od onog koji se javlja nakon primene potpuno stranih, ne-humanih antitela ili delimično stranih himaričnih antitela;
3) primećeno je da injektirana ne-humana antitela poseduju poluživot u cirkulaciji ljudskog organizma koji je mnogo kraći od poluživota humanih antitela. Injektirana humana antitela poseduju poluživot koji je praktično identičan prirodnim humanim antitelima, što omogućava primenu manjih i ređih doza.
Na osnovu izloženog, očekuje se da potpuno humana antitela izazovu minimalne imunogene i alergijske odgovore koji su specifični za mišija mAt ili za mAt koja su izvedena iz mišijih, tako da povećavaju efikasnost i sigurnost primenjenih preparata. Potpuno humana antitela prema predmetnom pronalasku zato mogu da se koriste u tretmanu hroničnog i rekurentnog bola, pri čemu njihov tretman zahteva ponavljanu primenu antitela. Stoga, jedna posebna prednost anti-NGF antitela prema predmetnom pronalasku jeste da su navedena antitela potpuno humana i da mogu da se primenjuju kod pacijenata na način koji nije akutan, uz minimalne neželjene reakcije koje su obično udružene sa humanim anti-mišijim antitelima ili sa drugim prethodno opisanim antitelima koja nisu potpuno humana i koja potiču iz vrsta koje se razlikuju od ljudi.
Stručnjak može genetskim inžinjeringom da stvori sojeve miševa koji su deficijentni za proizvodnju mišijih antitela i koji poseduju velike fragmente humanih Ig lokusa, tako da ti miševi proizvode humana antitela, a ne proizvode mišija antitela. Veliki humani Ig fragmenti mogu da sačuvaju veliku raznovrsnost gena za varijabilni region, kao i odgovarajuću regulaciju proizvodnje i ekspresije antitela. Korišćenjem mišije mašinerije za diverzifikaciju antitela i njihovu selekciju i odsustvo imunološke tolerancije prema humanim proteinaima, reprodukovani repertoar humanih antitela u ovim sojevima miševa obezbeđuje antitela visokog afiniteta protiv bilo kog antigena od interesa, uključujući i humane antigene. Korišćenjem tehnologije hibridoma, mogu se dobiti i selekcionirati antigen specifična humana MAt sa željenom specifičnošću.
Koriste se transgene životinje (npr., miševi) koje su sposobne da nakon imunizacije proizvode pun repertoar humanih antitela, a nisu sposobne da proizvode endogene imunoglobuline. Transfer segmenta sa humanim imunoglobulinskim genom iz germinativnih ćelija kod navedenih mutantnih miševa dovodi do proizvodnje humanih antitela nakon izlaganja antigenu (videti, npr., Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 - 2555; Jakobovits et al., 1993, Nature 362: 255 - 258; i Bruggermann et al., 1993, Year in Immunol. 7: 33; Nature 148: 1547 - 1553 (1994); Mature Biotechnology 14: 826 (1996); Gross, J.A. et al., Nature, 404: 995 - 999 (2000); i U.S. ptaenti br. 5,877,397, 5,874,299, 5,814,318, 5,789,650, 5,770,429, 5,661,016,5,633,425, 5,625,126, 5,569,825 i 5,545,806 (od kojih je svaki inkorporian ovde po referenci u potpunosti u bilo koju svrhu da se koristi)). Potpuno humana antitela, takođe, mogu da se dobiju pomoću biblioteka faga (Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227: 381; i Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581). Tehnike opisane od Cole et al. i od Boerner et al. su, takođe, dostupne za dobijanje humanih monoklonskih antitela (Cole et al., Monoclonal antibodies and Cancer Therapz, Alan R. Liss, str 77 (1985) i Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86 - 95 (1991)).
Rekombinantna antitela mogu, takođe, da budu podvrgnuta in vitro mutagenezi (ili in vivo mutagenezi, u slučaju kada se koristi životinja koja je transgena za humanu Ig sekvence), tako da aminokiselinske sekvence VH i VL regiona rekombinantnog antitela, iako su izvedene iz sekvenci koje su povezane sa sekvencama humanih VH i VL regiona iz germinativnih ćelija, ne moraju da postoje u prirodi u okviru in vivo repertoara humanih antitela germinativnih ćelija.
U određenim rešenjima, kod navedenih miševa, iskusni stručnjak može da koristi konstantne regione iz drugih ne-humanih vrsta zajedno sa humanim varijabilnim regionima, u cilju proizvodnje himeričkih antitela.
Struktura prirodnih antitela
Strukturne jedinice prirodnih antitela su tipično tetrameri. Svaki takav tetramer se tipično sastoji od 2 identična para polipeptidnih lanaca, pri čemu svaki par ima jedan "laki" lanac kompletne dužine (u određenim rešenjima oko 25 kDa) i jedan "teški" lanac kompletne dužine (u određenim rešenjima oko 50-70 kDa). Amino-terminalni deo svakog lanca tipično obuhvata varijabilni region od oko 100-110 ili više amino kiselina, koje su tipično odgovorne za prepoznavanje antigena. Na karboksi-terminalnom delu svakog lanca je tipično definisan konstantni region koji može biti odgovoran za efektorsku funkciju. Humani laki lanci su tipično klasifikovani kao κ i λ laki lanci. Teški lanci su tipično klasifikovani kao μ, δ, γ, α ili ε i oni definišu izotip antitela IgM, IgD, IgG, IgA i IgE, respektivno. IgG poseduje nekoliko podklasa, uključujući, bez ograničenja, IgG1 i IgG2, IgG3 i IgG4. IgM poseduje nekoliko podklasa, uključujući, bez ograničenja IgM1 i IgM2. IgA je slično podeljena na podklase, uključujući, bez ograničenja, IgA1 i IgA2. Tipično, u okviru lakih i teških lanaca pune dužine, varijabilni i konstantni regioni su povezani sa "J" regionom od oko 12 ili više amino kiselina, pri čemu teški lanac takođe sadrži "D" region od oko 10 ili više amino kiselina. Videti, na primer, "Fundamental immunology", poglavlje 7 (Paul, W. ed., 2 izdanje, Raven Press, N.Y. (1989)) (koja je ovde uključena u celosti u bilo koju svrhu da se koristi). Varijabilni regioni para lakog i teškog lanca, tipično formiraju antigen-vezujuće mesto.
Varijabilni regioni tipčno pokazuju istu opštu strukturu relativno konzerviranih okvirnih regiona (FR - framework) koji su povezani sa tri hipervarijabilna regiona, koji se takođe nazivaju regionima koji određuju komplementarnost ili CDR. CDR-ovi iz dva lanca svakog para su tipično poređani od strane okvirnih regiona, koji mogu da omoguće vezivanje za specifičan epitop. Od N-terminala do C-terminala, varijabilni regioni i lakih i teških lanaca tipično sadrže domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Dodeljivanje amino kiselina svakom domenu tipično je u saglasnosti sa definicijama Kabat klasifikacije sekvenci proteina koji su od interesa za imunologiju (Nacionalni instituti za zdravlje, Bethesda, MD (1987 i 1991)) ili su u saglasnosti sa definicijama datim u Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196 : 901 - 917 (1987); Chothia et al., Nature 342 : 878 - 883 (1989).
Bispecifična ili bifunkcionalna antitela
"Bispecifično" ili "bifunkcionalno" antitelo je tipično veštačko hibridno antitelo koje poseduje dva različita para teškog i lakog lanca i dva različita vezna mesta. Bispecifična antitela mogu da se dobiju upotrebom raznih postupaka, uključujući, bez ograničenja, fuziju hibridoma ili povezivanje F(ab') fragmenata. Videti, npr., Songsvilai & Lachmann (1990), Clin. Exp. Immunol. 79 : 315 - 321; Kostelny et al. (1992), J. Immunol. 148 : 1547 - 1553.
Dobijanje antitela
Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja se vezuju za humani NGF. Ova antitela mogu da se dobiju imunizacijom sa NGF pune dužine ili njegovim fragmentima. Antitela prema predmetnom pronalasku mogu biti poliklonska ili monoklonska i/ili mogu biti rekombinantna antitela. U poželjnim rešenjima, antitela prema predmetnom pronalasku su humana antitela koja su dobijena, na primer, imunizacijom transgenih životinja koje su sposobne da proizvode humana antitela (videti, na primer, Međunarodnu patentnu prijavu, Publikacija WO 93/12227).
Regioni za određivanje komplementarnosti (CDR) varijabilnih regiona lakog i teškog lanca anti-NGF antitela mogu da se presade na okvirne regione (FR) molekula poreklom iz iste ili neke druge vrste. U određenim rešenjima, CDR varijabilnoh regiona lakog i teškog lanca anti-NGF antitela mogu da se presade na humane konsenzus FR. Da bi se kreirao humani konsenzus FR, potrebno je da se FR iz nekoliko humanih aminokiselinskih sekvenci teškog ili lakog lanca poravnaju da bi se identifikovala konsenzus aminokiselinska sekvenca. FR teškog ili lakog lanca anti-NGF antitela može da se zameni sa FR iz različitog teškog ili lakog lanca. Retke aminokiseline iz FR teškog i lakog lanca anti-NGF antitela se tipično ne zamenjuju, dok ostatak aminokiselina FR može da se zameni. Retke aminokiseline su specifične aminokiseline koje se nalaze na položajima na kojima se obično ne nalaze u FR. Presađeni varijabilni regioni iz anti-NGF antitela prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste sa konstantnim regionom koji je različit od konstantnog regiona anti-NGF antitela. Alternativno, presađeni varijabilni regioni su deo jednolančanog Fv antitela. Presađivanje CDR je opisano, npr., u U.S. patentima br. 6,180,370, 5,693,762, 5,693,761, 5,585,089 i 5,530,101, koji su ivde inkorporirani po referenci u potpunosti u bilo koju svrhu da se koriste.
Antitela prema predmetnom pronalasku se poželjno dobijaju korišćenjem transgenih miševa koji poseduju značajan deo proizvodnog lokusa humanog antitela koji je insertovanu ćelije miša koje proizvode antitela, a koje su dalje izmenjene genetskim inženjeringom tako da su deficijentne za proizvodnju endogenih mišijih antitela. Navedeni miševi su sposobni da proizvode humane imunoglobulinske molekule i antitela, a da ne proizvode uopšte ili da proizvode u značajno smanjenim količinama mišije imunoglobulinske molekule i antitela. Tehnologije koje se koriste za postizanje opisanog su opisane u patentima, patentnim prijavama i referencama koje su navedene u patentnoj specifikaciji. U poželjnim rešenjima, iskusni stručnjak može da iskoristi postupke koji su opisani u Međunarodnoj patentnoj prijavi, Publikacija WO 98/24893, koja je ovde inkorporirana po referenci u bilo koju svrhu da se koristi. Videti, takođe, Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15: 146 - 156, koja je ovde inkorporirana po referenci u bilo koju svrhu da se koristi.
Monoklonska antitela (MAt) prema predmetnom pronalasku mogu da se dobiju korišćenjem brojnih tehnika, uključujući konvencionalnu metodologiju za dobijanje monoklonskih antitela, npr., standardu tehniku hibridizacije somatskih ćelija koja je opisana od strane Kohler & Milstein (1975, Nature 256: 495). Iako su poželjni postupci hibridizacije somatskih ćelija u principu, mogu se koristiti druge tehnike za dobijanje monoklonskih antitela, npr., tehnike virusne ili onkogene transformacije B-limfocita.
Poželjni animalni sistem za dobijanje hibridoma predstavlja organizam miša. Proizvodnja hibridoma kod miševa je dobro poverena i poznata tehnika, a u struci su poznati protokoli imunizacije, kao i tehnike za izolaciju imunizovanih splenocita koji se koriste za fuziju. Takođe, poznati su i fuzioni partneri (npr., mišije mijelomske ćelije) i postupci fuzije.
U poželjnom rešenju humana monoklonska antitela, koja su usmerena protiv NGF mogu da se dobiju korišćenjem transgenih miševa, koji poseduju određene komponente humanog imunog sistema, pre nego komponente mišijeg imunog sistema. Navedeni transgeni miševi, koji su ovde označeni kao ''HuMAt'' miševi, poseduju minilokus humanog imunoglobulinskog gena koji kodira nerearanžirane sekvence humanog teškog (μ i γ) i κ lakog lanca imunoglobulina, kao i ciljane mutacije kojima se aktiviraju endogeni μ i κ lokusi (Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856 - 859). Shodno tome, kod miševa koji pokazuju smanjenu ekspresiju mišijih IgM ili κ lanaca u odgovoru na imunizaciju, uvedeni humani transgeni za teški i laki lanac podležu procesu promene klase antitela i somatske mutacije, kako bi se dobila visoko afinitetna humana IgG κ monoklonska antitela (Lonberg et al., gore navedeno; Lonberg & Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93; Harding & Lonberg, 1995, Ann, N.Y. Acad. Sci. 764: 536). Proizvodnja HuMat miševa je detaljno opisana u referencama: Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20: 6287 - 6295; Chen et al., 1993, International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1994, J. Immunol. 152: 2912 - 2920; Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856 - 859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113: 49 - 101; Taylor et al., 1994, International Immunology 6: 579-591; Lonberg & Huszar, 1995, Internat. Rev. Immunol. 13: 65 - 93; Harding & Lonberg, 1995, Ann. N.Y. Acad. Sci. 764: 536 - 546; Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14: 845-851, koje su ovde u potpunosti inkorporirane po referenci u bilo koju svrhu da se koriste. Videti dalje, U.S. patente 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; i 5,770,429; svi podneti od strane Lonberg & Kay; videti, takođe, i U.S. patent broj 5,545,807 podnet od strane Surani et al.; međunarodnu patentnu prijavu WO 93/1227, objavljenu 24 juna 1993; WO 92/22646, objavljenu 23. decembra 1992; i WO 92/03918, objavljenu 19. marta 1992, koje su ovde inkorporirane po referenci u bilo koju svrhu da se koriste. Alternativno, za proizvodnju humanih anti-NGF antitela mogu da se koriste HCo7, HCo12 i KM sojevi trangenih miševa koji su opisani u odeljku sa Primerima.
Predmetni pronalazak obezbeđuje humana monoklonska antitela koja su specifična i koja neutralizuju biološki aktivne humane NGF polipeptide. Takođe, predmetni pronalazak obezbeđuje aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca antitela koje su visoko specifične za i neutrališu NGF polipeptide, onda kada se vežu za njih. Ova visoka specifičnost omogućava anti-humanim NGF humanim antitelima, kao i humanim monoklonskim antitelima sa sličnom specifičnosšću, da budu efikasna imunoterapija za oboljenja koja su udružena sa odeređenim nivoima NGF.
U jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovana humana antitela koja se vezuju za isti ili suštinski sličan epitop kao i ovde obezbeđena 4D4 antitela.
U jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovana humana antitela koja sadrže barem jednu od aminokiselinskih sekvenci koje su prikazane ka sekvence ID br.: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 i 79 - 130, koje se vezuju za epitop NGF polipeptida visokim afinitetom i koja poseduju sposobnost da antagonizuju aktivnost NGF polipeptida. Poželjno, ova antitela se vezuju za isti ili suštinski sličan epitop, kao i ovde obezbeđena 4D4 antitela.
U poželjnim rešenjima, izolovana humana antitela se vezuju za NGF polipeptid sa konstantom disocijacije (KD) od 1 × 10-9 M ili manjom i inhibiraju preživljavanje indukovan sa NGF u in vitro testu neutralizacije sa IC50 od 1 × 10-7 M ili manjom. U poželjnijim rešenjima, izolovana humana antitela se vezuju za NGF polipeptid sa konstantom disocijacije (KD) od 1 × 10-10 M ili manjom i inhibiraju preživljavanje indukovan sa NGF u in vitro testu neutralizacije sa IC50 od 1 × 10-8 M ili manjom. U jednom još poželjnijem rešenju, izolovana anti-NGF humana antitela se vezuju za NGF polipeptid sa konstantom disocijacije (KD) od 1 × 10-11 M ili manjom i inhibiraju preživljavanje indukovan sa NGF u in vitro testu neutralizacije sa IC50 od 1 × 10-9 M ili manjom. Ovde su obezbeđeni primeri anti-humanih NGF humanih antitela koja ispunjavaju kriterijume gore navedenog vezivanja i neutralizacije.
Najpoželjnija anti-humani NGF humana antitela prema predmetnom pronalasku su ovde označena kao 4D4 antitela i poseduju VL i VH polipeptidne sekvence označene kao sekvenca ID br.: 12 i sekvenca ID br.: 10, respektivno. Polinukleotidna sekvenca koja kodira VL i VH polipeptide 4D4 antitela je označena kao sekvenca ID br.: 11 i sekvenca ID br.: 9, respektivno. Svojstva humanih anti-humani NGF antitela prema predmetnom pronalasku su specifično opisana u Primerima. Posebno se ističe visoki afinitet prema NGF polipeptidu i izražena sposobnost da se antagonizuje aktivnost NGF polipeptida, koje su ovde prikazane.
Konstanta disocijacije (KD) anti.humani NGF humanih antitela može da se odredi pomoću površinske plazmonske rezonance, kao što je generalno opisano u Primeru 9. Generalno, analiza površinske plazmonske rezonance meri interakcije vezivanja u realnom vremenu između liganda (rekombinantni NGF polipeptid koji je imobilisan na biosenzornom matriksu) i supstance koja se analizira (antitela u rastvoru) putem površinske plazmonske rezonance (SPR) korišćenjem BIAcore sistema (Pharmacia Biosensor, Pitscataway, NJ). Analiza površinske plazmonske rezonance, takođe, može da se izvodi imobilizacijom analita (antitela na biosenzorskoj matrici) i prezentujućeg liganda (rekombinanni V u rastvoru). Konstanta disocijacije (KD) anti-humani NGF humanih antitela može da se odredi upotrebom KinExA metodologije. U određenim rešenjima prema predmetnm pronalasku, antitela se vezuju za NGF sa KD koja je između 10-8 M i 10-12 M. Pojam "KD", kao što se ovde koristi, označava konstantu disocijacije u određenoj interakciji antitelo-antigen. Zbog prikaza u predmetnom pronalasku, određivanje KD je pokazano u Primeru 9.
U poželjnim rešenjima, antitela prema predmetnom pronalasku su IgG1, IgG2, ili IgG4 izotipa. Poželjno, antitela su IgG3 izotipa. Poželjnije, antitela su IgG1 izotipa. Najpoželjnije, antitela su IgG2 izotipa. U drugim rešenjima prema predmetnom pronalasku, antitela sadrže humane κ lake lance i humane IgG1, IgG2 ili IgG4 teške lance. Ekspresija antitela prema predmetnom pronalasku koja sadrže konstantni region teškog lanca IgG1 ili IgG2 je prikazana u Primerima koji slede. U određenim rešenjima, varijabilni regioni antitela su ligirani sa konstantnim regionima koji se razlikuju od konstantnog regiona IgG1, IgG2 ili IgG4 izotipa. U određenim rešenjima, antitela prema predmetnom pronalasku su klonirana za ekspresiju u ćelijama sisara.
U određenim rešenjima, konzervativne modifikacije teškog i lakog lanca anti-NGF antitela (kao i odgovarajuće modifikacije kodirajućih nukleotida) omogućavaju proizvodnju anti-NGF antitela sa funkcionalnim i hemijskim karakteristikama koje su slične onima kje imaju ovde opisana anti-NGF antitela. Nasuprot tome, zančajna modifikacija funkcionalnih i/ili hemijskih karakteristika anti-NGF antitela, može da se ostvari izborom supstitucija aminokiselinskih sekvenci teškog i lakog lanca koje se značajno razlikuju po svom efektu na održavanje: (a) strukture molekulskog skeleta u području supstitucije, tako što dovode do promene naborane ili heliksne konformacije, (b) naelektrisanja ili hidrofobnosti molekula na ciljnom mestu ili (c) izbočenosti bočnog lanca.
Na primer, ''konzervativna aminokiselinska supstitucija'' podrazumeva supstituciju nativnog aminokiselinskog ostatka ne-nativnim ostatkom, tako da efekat na polarnost ili na naelektrisanje aminokiselinskog ostatka na tom položaju ne postoji ili je mali. Dalje, bilo koji nativni ostatak u polipeptidu takođe može biti supstituisan alaninom, što je prethodno opisano kod ''alaninske skenirajuće mutageneze''.
Željene aminokiselinske supstitucije (konzervativne ili ne-konzervativne) mogu biti određene od strane stručnjaka u onom trenutku kada su takve supstitucije potrebne. U određenim rešenjima, aminokiselinske supstitucije mogu da se koriste za identifikaciju važnih ostataka anti-NGF antitela, ili za povećanje ili smanjenje afiniteta anti-NGF antitela koja su ovde opisana.
Kao što je dobro poznato, manje promene aminokiselinske sekvence u smislu delecije, adicije ili supstitucije jedne ili nekoliko aminokiselina mogu da dovedu do nastanka alelnog oblika orginalnog proteina koji poseduje suštinski identična svojstva kao protein od koga je nastao. Tako, kao dodatak antitelima koja su ovde specifično opisana, jednostavno mogu biti dizajnirana i proizvedena druga «suštinski homologa» korišćenjem različitih tehnika rekombinantne DNK, koje su dobro poznate stručnjacima. Generalno, modifikacija gena mogu lako da se postignu primenom brojnih dobro poznatih tehnika, kao što je na primer na određeno mesto usmerena mutogeneza. Na taj način predmetni pronalazak obezbeđuje «varijante» ili «mutante» anti-NGF humanih antitela koji poseduju suštinski slične karakteristike kao i anti-NGF humana antitela koja su ovde opisana (videti, na primer, WO 00/56772, koja je ovde korporirana po referenci). Pojam «varijanta» ili «mutant» označava, u kontekstu anti-NGF humanog antitela, bilo koji vezujući molekul (molekul X): (i) kod koga su hipervarijabilni regioni CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca ili hipervarijabilni regioni CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca, uzeti kao celina, najmanje 80% homologi, poželjno najmanje 90% homologi, još poželjnije najmanje 95% homologi sa hipervarijabilnim regionima koji su prikazani u sekvencama ID br.: 14, 18, i 22 ili u sekvencama ID br.: 16, 20 i 24 respektivno, i (ii) kod kojih je varijanta ili mutant sposoban da infibira aktivnost humanog NGF u istoj meri kao i referento anti-NGF antitelo koje poseduje okvirne regione identične sa okvirnim regionima molekula X.
Obično anti-NGF humano antitelo u obliku varijante poseduje CDR-ove lakog i/ili teškog lanca koji, uzeti kao celina, imaju stepen identičnosti aminokiselinske sekvence od najmanje 80%, poželjno od najmanje od 85%, još poželjnije najmanje oko 90%, još poželjnije od najmanje 91%, još poželjnije od najmanje 92%, još poželjnije od najmanje 93%, još poželjnije od najmanje 94%, još poželjnije od najmanje 95%, još poželjnije od najmanje 96%, još poželjnije od najmanje 97%, još poželjnije od najmanje 98%, još poželjnije od najmanje 99% sa aminokiselinskom sekvencom koja je prikazana kao sekvenca ID br.: 14, 18 i 22 i/ili sekvenca ID br.: 16, 20 i 24, respektivno.
Još poželjnije, varijanta anti-NGF humanog antitela poseduje varijabilni region lakog lanca koji, uzet kao celina, poseduje stepen identičnosti aminokiselinske sekvence od najmanje 80%, još poželjnije od najmanje 81%, još poželjnije od najmanje 82%, još poželjnije od najmanje 83%, još poželjnije od najmanje 84%, još poželjnije od najmanje 85%, još poželjnije od najmanje 86%, još poželjnije od najmanje 87%, još poželjnije od najmanje 88%, još poželjnije od najmanje 89%, još poželjnije od najmanje 90%, još poželjnije od najmanje 91%, još poželjnije od najmanje 92%, još poželjnije od najmanje 93%, još poželjnije od najmanje 94%, još poželjnije od najmanje 95%, još poželjnije od najmanje 96%, još poželjnije od najmanje 97%, još poželjnije od najmanje 98%, još poželjnije od najmanje 99% sa aminokiselinskom sekvencom koja je prikazana kao sekvenca ID br.: 12, 80, 82, 84, 86, 88, 89, 90 ili 91 i/ili varijanta anti-NGF humanog antitela poseduje varijabilni region teškog lanca koji uzet kao celina, poseduje stepen identičnosti aminokiselinske sekvence od najmanje 70%, poželjnije od najmanje 75%, još poželjnije od najmanje 80%, još poželjnije od najmanje 81%, još poželjnije od najmanje 82%, još poželjnije od najmanje 83%, još poželjnije od najmanje 84%, još poželjnije od najmanje 85%, još poželjnije od najmanje 86%, još poželjnije od najmanje 87%, još poželjnije od najmanje 88%, još poželjnije od najmanje 89%, još poželjnije od najmanje 90%, još poželjnije od najmanje 91%, još poželjnije od najmanje 92%, još poželjnije od najmanje 93%, još poželjnije od najmanje 94%, još poželjnije od najmanje 95%, još poželjnije od najmanje 96%, još poželjnije od najmanje 97%, još poželjnije od najmanje 98%, još poželjnije od najmanje 99% sa aminokiselinskom sekvencom označenom kao sekvenca ID br.: 10, 81, 83, 85 ili 87.
Pojam «varijanta» u kontekstu polinukleotida označava molekul nukleonske kiseline koji poseduje stepen identičnosti sekvence nukleinske kiseline od najmanje 75% sa polinukleotidnom sekvencom prema predmetnom pronalasku. Uobičajeno, varijanta polinukleotida poseduje stepen identičnosti sekvence nukleinske kiseline od najmanje 75%, poželjnije od najmanje od 80%, još poželjnije od najmanje 81%, još poželjnije od najmanje 82%, još poželjnije od najmanje 83%, još poželjnije od najmanje 84%, još poželjnije od najmanje 85%, još poželjnije od najmanje 86%, još poželjnije od najmanje 87%, još poželjnije od najmanje 88%, još poželjnije od najmanje 89%, još poželjnije od najmanje 90%, još poželjnije od najmanje 91%, još poželjnije od najmanje 92%, još poželjnije od najmanje 93%, još poželjnije od najmanje 94%, još poželjnije od najmanje 95%, još poželjnije od najmanje 96%, još poželjnije od najmanje 97%, još poželjnije od najmanje 98%, još poželjnije od najmanje 99% sa novom sekvencom nukleinske kiseline koja je ovde napisana.
U određenim rešenjima, predmenti pronalazak obezbeđuje antitela koji poseduju odrešeni procenat identičnosti sa antitelom prema predmetnom pronalasku ili obezbeđuju antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca, varijabilni region lakog lanca, CDR1, CDR2 ili CDR3 region koji poseduju određeni procenat identičnosti sa varijabilnim regionom teškog lanca, varijabilnim regionom lakog lanca, CDR1, CDR2 ili CDR3 regionom prema predmetnom pronalasku, kao što je prikazano u Primeru 10 i na Slikama 5-10.
U određenim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano humano antitelo koje se specifično vezuje za faktor rasta nerva i koje sadrži teški lanac i laki lanac, pri čemu teški lanac ima varijabilni region teškog lanca koji poseduje aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70% ili 75% identična sa aminokiselinskom sekvencom koja je označena kao sekvenca ID br.: 10, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom, koji je najmanje 70%, 80%, 85% ili 95% homolog sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 81, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; koji poseduje stepen identičnosti od najmanje 70%, 80%, 85% ili 95% sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 83, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; koji poseduje stepen identičnosti od najmanje 75%, 80% ili 85% sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 85, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; koji poseduje stepen identičnosti od najmanje 70%, 75% ili 80% sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 87, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; koji poseduje stepen identičnosti od najmanje 56% sa aminokiselinskom sekvencom označenom kao sekvenca ID br.: 79, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom.
U određenim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovana antihumana antitela koja se specifično vezuju za faktor rasta nerva i koja sadrže teški lanac i laki lanac, pri čemu laki lanac obuhvata varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima: stepen identičnosti od najmanje 70%, 75%, 80% ili 90% sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 12, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; stepen identičnosti od najmanje 70%, 85% ili 90% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 80, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; koji poseduje stepen identičnosti od najmanje 70%, 74%, 90% ili 94% sa aminokiselinskom sekvencom označenom kao sekvenca ID br.: 88, sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; koji poseduje stepen idetničnosti od najmanje 70%, 80%, 85% ili 87% sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 90, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; koji poseduje stepen idetničnosti od najmanje 70%, 85%, 90%, 95% ili 99% sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 91, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; koji poseduje stepen idetničnosti od najmanje 70%, 80%, 90%, 95% ili 96% sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 82, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; koji poseduje stepen idetničnosti od najmanje 70%, 85%, 90%, 95%, 98% ili 99% sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 84, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; koji poseduje stepen idetničnosti od najmanje 70%, 85%, 90%, 95%, 98% ili 99% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 86, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom.
U određenim drugim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano humano antitelo koje se specifično vezuje za faktor rasta nerva i koje obuhvata CDR1 humanog teškog lanca, pri čemu CDR1 humanog teškog lanca predstavlja aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 40% ili 60% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 98, sekvenca ID br.: 105, sekvenca ID br.: 110 ili sekvenca ID br.: 22, ili sa njihovim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom.
U drugim rešenjima predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano humano antitelo koje se specifično vezuje za faktor rasta nerva i koji obuhvata CDR2 humanog teškog lanca, pri čemu CDR2 humanog teškog lanca predstavlja aminokiselinsku sekvencu koja je: najmanje 70%, 82% ili 94% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 99, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; najmanje 70% ili 76% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 106, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; najmanje 59% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 18, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; najmanje 70% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 117, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; ili koja je najmanje 70%, 75% ili 80% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 111, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom.
U još jednom drugom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano humano antitelo koje se specifično vezuje za faktor rasta nerva i koji obuhvata CDR1 humanog lakog lanca, pri čemu je navedeni CDR1 aminokiselinska sekvenca koja je: najmanje 70% ili 80% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 101, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; najmanje 70%, 75%, 80% ili 90% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 95, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; najmanje 75%, 80% ili 90% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 119, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; najmanje 75%, 80% ili 90% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 122, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; najmanje 80% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 125, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; najmanje 75%, 80% ili 90% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 24, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; najmanje 70% ili 80% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 107, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; ili koja je najmanje 70% ili 80% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 113, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom.
U dodatnim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano humano antitelo koje se specifično vezuje za faktor rasta nerva i koji sadrže CDR2 region humanog lakog lanca, pri čemu je navedeni CDR2 aminokiselinska sekvenca koja je: najmanje 70% ili 85% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 102, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; najmanje 70% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 96, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; najmanje 70% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 120, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; najmanje 70% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 123, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; najmanje 70% ili 85% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 126, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; najmanje 70% ili 85% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 129, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; najmanje 70% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 20, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; najmanje 70% ili 85% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 108, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; najmanje 70% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 133, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; ili koja je najmanje 70% ili 85% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 114, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom.
U još jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano humano antitelo koje se specifično vezuje za faktor rasta nerva i koji sadrže CDR3 humanog lakog lanca, pri čemu je CDR3 aminokiselinska sekvenca: najmanje 70% ili 85% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 103, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; najmanje 70% ili 85% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 97, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; najmanje 70% ili 78% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 121, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; najmanje 70% ili 78% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 127, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; najmanje 70% ili 78% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 130, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; najmanje 70% ili 78% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 16, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; najmanje 70% ili 85% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 109, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; najmanje 78% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 134, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; ili koja je najmanje 85% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao sekvenca ID br.: 115, ili sa njenim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom.
Sekvence varijabilnih regiona teškog lanca i lakog lanca antitela 4D4 su prikazani u sekvencama ID br.: 10 i 12, respektivno. Međutim, mnogi potencijalni aminokiselinski ostaci koji stupaju u kontakt sa CDR-ovima mogu biti supstituisani drugim aminokiselinama, pri čemu navedena promena još uvek omogućava da antitelo zadrži značajno veliki afinitet za dati antigen. Slično tome, mnogi ostaci u okvirnom regionu koji nisu u kontaktu sa CDR-ovima u teškom i lakom lancu mogu biti supstituisani sa aminokiselinama koje su prisutne na odgovarajućim položajima u drugim humanim antitelima, zatim mogu biti supstituisani konsenzus humanim aminokiselinama ili aminokiselinama na odgovarajućim položajima u mišjim antitelima, bez značajnog gubitka afiniteta uz očuvanu ne-imunogenost kao kod humanih antitela. Brojne različite alternativne aminokiseline mogu da se koriste za dobijanje verzija opisanih anti-NGF antitela i njihovih fragmenata sa različitim kombinacijama vrednosti afiniteta, specifičnosti, ne-imunogenosti, jednostavnosti proizvodnje i sa drugim željenim svojstvima.
U alternativnim rešenjima, antitela prema predmetnom pronalasku mogu biti eksprimirana u ćelijskim linijama koja se razlikuju od hibridomskih ćelijskih linija. U ovim rešenjima, za transformaciju odgovarajuće sisarske ćelije domaćina mogu da se koriste sekvence koje kodiraju specifična antitela. Prema ovim rešenjima, transformacija može da se postigne upotrebom bilo kog postupka za uvođenje polinukleotida u ćeliju domaćina, uključujući, na primer, pakovanje polinukleotida u virus ( ili u virusni vektor) i transdukciju ćelije domaćina virusom ( ili vektorom) ili postupcima transfekcije koji su poznati u struci, kao što su oni opisani u U.S. Patentima br. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 i 4,959,455 ( pri čemu su svi oni ovde inkorporirani u referenci u bilo koju svrhu da se koriste). Generalno, postupak transformacije koji se koristi zavisi od ćelije domaćina koja treba da bude transformirana. Postupci za uvođenje heterologih polinukleotida u sisarske ćelije su dobro poznate u struci i obuhvataju, bez ograničenja, transfekciju posredovanu dekstranom, precipitaciju kalcijum fosfatom, transfekciju posredovanu polibrenom, fuziju protoplasta, elektroporaciju, enkapsulaciju polinukleotida u lipozome i direktno mikroinjektiranje DNK u jedro.
Molekul nukleinske kiseline koji kodira aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona teškog lanca, varijabilnog regiona teškog lanca, konstantnog regiona lakog lanca ili varijabilnog regiona lakog lanca NGF antitela prema predmetnom pronalasku insertuje se u odgovarajući vektor za ekspresiju korišćenjem standardnih tehnika ligacije. U poželjnom rešenju, konstantni region teškog lanca i lakog lanca anti-NGF antitela se dodaje na C-terminal odgovarajućeg varijabilnog regiona, a potom se litira u vektor za ekspresiju. Navedeni vektor se tipično bira tako da bude funkcionalan u odgovarajućoj ćeliji domaćinu koja se koristi ( tj. vektor je kompatibilan sa mašinerijom ćelije domaćina, tako da je omogućena amplifikacija gena i/ili ekspresija datog gena). Za revijski prikaz ekspresionih vektora pogledati METH. ENZ. 185 (Goeddel, urednik), 1990, Academic Press.
Tipično, vektori za ekspresiju koji se koriste u određenim ćelijama domaćinima sadrže sekvence za održavanje plazmida i sekvence za kloniranje i ekspresiju egzogenih nukleotida. Takve sekvence, koje se kolektivno označavaju kao “bočne sekvence” u određenim rešenjima tipično sadrže jednu ili više sledećih nukleotidnih sekvenci: promoter, jednu ili više pospešivačkih sekvenci, mesto početka replikacije, sekvencu za terminaciju tanskripcije, kompletnu intromsku sekvencu koja sadrži tonorsko i akceptorsko mesto za isecanje, sekvencu koja kodira vodeću sekvencu za sekreciju polipeptida, mesto vezivanja ribozoma, sekvencu za poliademilaciju, region poli-veznika za inserciju nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji treba da se eksprimira i element selektibilnog markera. Svaka od navedenih sekvenci je opisana u tekstu koji sledi.
Opciono, vektor može da sadrži sekvencu koja kodira “oznaku”, tj. molekul oligonukleotida koji je lociran na 5’ ili 3’ kraju sekvence koja kodira polipeptid anti-NGF antitela; oligonukleotidna sekvenca kodira poliHis (kao što je heksaHis) ili drugu “oznaku”, kao što su FLAG, HA ( hemaglutinin influenca virus), ili myc, za koje postoje komercijalno dostupna antitela. Navedena oznaka je tipično fuzionisana sa polipeptidom nakon ekspresije polipeptida i može da služi kao sredstvo za afinitetno prečišćavanje ili za detekciju NGF antitela iz ćelije domaćina. Afinitetno pročišćavanje može da se izvede, na primer, pomoću hromotografije na koloni korišćenjem antitela protiv oznake kao afinitetnog matriks. Opciono, oznaka može naknadno da bude uklonjena iz prečišćenog polipeptida anti-NGF antitela upotrebom različitih sredstava, na primer, upotrebom određenim peptidaza za enzimsko isecanje oznake.
Bočne sekvence mogu biti homologe (tj., poreklom iz iste vrste i/ili istog soja ćelije domaćina), heterologe (tj., iz vrste koja se razlikuje od vrste ćelije domaćina ili soja), hibridne (tj., kombinacija bočnih sekvenci iz više od jednog izvora), sintetske ili nativne. Tako, izvor bočne sekvence može biti bilo koji prokariotski ili eukariotski organizam, bilo koji kičmenjak ili bezkičmenjak ili bilo koja biljka, uz uslov da je bočna sekvenca funkcionalna i da može biti aktivirana od strane mašinerije ćelije domaćina.
Bočne sekvence koje su od koristi u vektorima prema predmetnom pronalasku mogu da se dobiju primenom nekoliko postupaka koji su dobro poznati u struci. Tipično bočne sekvence koje su ovde od koristi su prethodno identifikovane mapiranjem i/ili digestijom restikcionim endonukleazama i tako mogu biti izolovane iz odgovarajućeg tkivnog izvora upotrebom odgovarajućih restrikcionih endonukleaza. U nekim slučajevima, nukleotidna sekvenca bočne sekvence u punoj dužini može biti već poznata. U ovom slučaju, bočna sekvenca može biti sintetisana korišćenjem postupaka koji su ovde opisani za sintezu ili kloniranje nukleinske kiseline.
Bez obzira da li je bočna sekvenca poznata u potpunosti ili samo delimčno ona može da se dobije korišćenjem lančane reakcije polimeraze (PCR) i/ili ispitivanjem genomske biblioteke sa odgovarajućim probama kao što su oligonukleotidni fragment i/ili fragment bočne sekvence iz iste ili druge vrste. U slučaju kada bočna sekvenca nije poznata, fragment DNK koji sadrži bočnu sekvencu može biti izolovan iz većeg dela DNK koji može da sadrži, na primer, kodirajuću sekvencu ili čak drugi gen ili druge gene. Izolacija može da se izvede digestijom restrikcionim endonukleazama, čime se dobija odgovarajući DNK fragment, a potom se izolacija nastavlja korišćenjem prečišćavanja na agaroza gelu, korišćenjem Qiagen hromotografije na koloni (Chatsworth, CA), ili primenom drugih postupaka koji su poznati stručnjaku. Izbor odgovarajućih enzima za ostvarenje ovog cilja poznat je prosečnom stručnjaku.
Mesto početka replikacije je tipično deo onih prokariotskih vektora za ekspresiju koji se komercijalno naručuju, i ono pomaže u amplifikaciji vektora u ćeliji domaćinu. Ukoliko vektor koji je izabran ne sadrži mesto porekla replikacije, ono može biti hemijski sintetisano na osnovu poznate sekvence a potom ligirano u vektor. Na primer, mesto početka replikacije za plazmid pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) odgovara za većinu gram-negativnih bakterija, dok je za klonirajuće vektore u sisarske ćelije od koristi neko od brojnih virusnih mesta početka replikacije (npr., mesto početka replikacije SV40, polioma virusa, adenovirusa, virusa vezikularnog stomatitisa (VSV) ili papiloma virusa kao što su HPV ili BPV). Generalno, mesto početka replikacije kao komponenta vektora nije potrebno u sisarskim vektorima za ekspresiju (na primer, mesto početka replikacije SV40 se koristi samo zato što sadrži rani virusni promoter).
Sekvenca za terminaciju transkripcije je tipično locirana na 3’ položaju u odnosu na kraj kodirajućeg regiona polipeptida i služi za okončanje transkripcije. Obično sekvenca za terminaciju sekvence u prokariotskim ćelijama jeste fragment koji je bogat u G-C parovima nakon koga sledi poli-T sekvenca. Iako ova sekvenca može biti lako klonirana iz genomske biblioteke ili čak naručena komercijalno kao deo vektora, ona takođe može biti lako sintetisana korišćenjem postupaka za sintezu nukleinske kiseline, kao što su oni postupci koji su ovde opisani.
Selektibilni marker gen kodira gen koji je potreban za preživljavanje i rast ćelije domaćina u selektivnoj podlozi za kulturu tkiva. Tipični marker geni za selekciju kodiraju proteine koji: (a) omogućavaju rezistenciju na antibiotike ili druge toksine, npr., na anpicilin, petraciklin ili kanamicin za prokariotske ćelije domaćina; (b) nadoknađuju auksotrofne deficijencije date ćelije; ili (c) omogućavaju dopremanje kritičnih hranljivih sastojaka koji nisu dostupni iz složenih ili definisanih podloga. Poželjni selektibilni marker geni su geni za rezistenciju na kanamicin, gen za rezistenciju na anpicilin i gen za rezistenciju na petraciklin. Takođe i za selekciju i kod prokariotskih i kod eukariotskih ćelija domaćina može da se koristi gen za rezistenciju na neomicin.
Drugi selektabilni geni mogu da se koriste za amplifikaciju gena koji treba da bude eksprimiran. Amplifikacija je proces u kome geni koji su potrebni za proizvodnju proteina koji je kritičan za rast ili razvoj ćelije bivaju umnoženi u tandemu sa hromozomima u sukcesivnim generacijama rekombinantnih ćelija. Primeri odgovarajućih selektabilnih markera za sisarske ćelije obuhvataju gen za dihidrofolat reduktazu ( DHFR) i gen za timidinkinazu bez promotera. Transformanti sisarske ćelije se izlažu selekcionom pritisku, pri čemu su samo transformanti sa navedenim genima adaptirani i preživljavaju pomoću selektabilnih gena koji su prisutni u vektoru. Selekcioni pritisak se ostvaruje kultivacijom transformiranih ćelija u uslovima u kojima je koncentracija sredstva za selekciju u podlozi sukcesivno povećavana, pri čemu nastaje amplifikacija i selektivilnog gena i DNK koja kodira drugi gen, kao što je antitelo koje se vezuje za NGF polipeptid. Kao rezultat toga, na osnovu amplifikovane DNK se sintetišu povišene količine polipeptida kao što je anti-NGF antitelo.
Mesto vezivanja ribozoma je obično neophodno za inicijaciju translacije sa iRNK i okarakterisano je prisustvom Shine-Dalgarno sekvenca (kod prokariota) ili kozak sekvence (kod eukariota). Navedeni element je tipično lociran na 3' kraju u odnosu na promoter i na 5' u odnosu na kodirajuću sekvencu polipeptida koji treba da bude eksprimiran.
U nekim slučajevima, kao onda kada je poželjna glikolizacija u ekspresionom sistemu eukariotske ćelije domaćina, moguće je manipulisati različitim pre-pro sekvencama kako bi se poboljšala glikolizacija ili prinos. Na primer, moguće je izmeniti mesto cepanja peptidazom kod određenog signalnog peptida ili je moguće dodati pro-sekvence koje takođe mogu da utiču na glikolizaciju. Krajnji proteinski proizvod može da poseduje na položaju -1 (u odnosu na prvu aminokiselinu zrelog proteina) jednu ili više dodatnih aminokiselina koje postoje nakon ekspresije i koje ne moraju da budu u potpunosti uklonjene. Na primer, krajnji proteinski proizvod može da poseduje jedan ili dva aminokiselinska ostatka koja se nalaze na mestu cepanja peptidazom prikačena za amino-terminal. Alternativno, upotreba nekih mesta za cepanja enzimom može da dovede do pojave blago okrnjenog oblika željenog polipeptida, u slučaju da enzim izvrši isecanje ograničenog područja u okviru zrelog polipeptida.
Vektori za ekspresiju i kloniranje prema predmetnom pronalasku tipično sadrže promoter koji prepoznaje organizam domaćina i koji je operativno povezan sa molekulom koji kodira anti-NGF antitelo. Promoteri su sekvence koje se ne transkribuju i koje su locirane proksimalno (tj., na 5' kraju) u odnosu na stark kodon strukturnog gena (generalno u okviru segmenta od oko 100 do 1000 bp) i kontrolišu transkripciju strukturalnog gena. Promoteri se konvencionalno klasifikuju u jednu od dve klase: inducibilne promotere i konstitutivne promotere. Inducibilni promoteri iniciraju transkripciju sa DNK koja je pod njihovom kontrolom u povišenim nivoima u odgovoru na neku promenu u uslovima kultivacije ćelija, kao što je to prisustvo ili odsustvo određenog hranljivog sastojka ili usled promene temperature. Sa druge strane konstitutivni promoteri uniforbno transkribuju gen za koji su operativno vezani, tj., ispoljavaju malo ili nimalo kontrole na ekspresiju gena. Poznat je veliki broj promotera koji bivaju prepoznati od strane različitih potencijalnih ćelija domaćina. Odgovarajući promoter je operativno povezan sa DNK molekulom koji kodira teški lanac ili laki lanac koji čine anti-NGF antitelo prema predmetnom pronalasku postupkom uklanjanja promotera iz izvorne DNK digestijom restriktivnim enzimima i insercijom željene promoterske sekvence u dati vektor za ekspresiju.
Odgovarajući promoteri koji se upotrebljavaju u ćelijama domaćinima koje su ćelije gljivica, takođe su dobro poznate u struci. Poželjno se zajedno sa promoterima za gene gljivica koriste i pospešivači transkripcije za gljivice. Odgovarajući promoteri koji se koriste kod sisarskih ćelija domaćina dobro su poznati struci i obuhvataju bez ograničenja, one promotere koji su dobijeni iz genoma virusa, npr., kao što su polioma virus, poks virus živine, adeno virus (npr., adeno virus 2), goveđi papiloma virus, virus sarkoma ptica, citomegalovirus, retrovirusi, virus hepatitisa B, a najpoželjnije Simian virusa 40 (SV40). Drugi odgovarajući sisarski promoteri obuhvataju heterologe sisarske promotere, na primer, promotere proteina toplotnog šoka i aktinski promoter.
Dodatni promoteri koji mogu biti od interesa obuhvataju, bez ograničenja: rani promoter SV40 (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-10); promoter CMV (Thomsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. USA 81:659-663); promoter koji je sadržan u 3' dugačkoj terminalnoj ponovnoj sekvenci Rous sarkoma virusa (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-97); promoter herpes timirinkaze (Wagner el al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-45); promoter i regulatorne sekvence iz gena za metalotianonin (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); i prokariotske promotere kao što je promoter beta-laktamaze (Villa-Kamaroff el al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-31); ili tac promoter (DeBoer el al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:21-25). Takođe, od interesa mogu biti i sledeći regioni za kontrolu transkripcije kod životinja, koji pokazuju tkivnu specifičnost i koji se koriste kod transgenih životinja: region za kontrolu gena za elastazu I koji je aktivan u ćelijama pankreasnih acinusa (Swift el al., 1984, Cell 38:639-46; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); region za kontrolu insulinskog gena koji je aktivan u beta pankreasnim ćelijama (Hanahan, 1985, Nature 315:115-22); region za kontrolu imunoglobulinskog gena koji je aktivan u limfnim ćelijama (Grosschedl el al., 1984, Cell 38:647-58; Adames el al., 1985, Nature 318:533-38; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 7:1436-44); region za kontrolu mišjeg virusa tumora dojke koji je aktivan u testikularnim ćelijama, ćelijama tkiva dojke, limfoidnim ćelijama i u mastocitima (Leder el al., 1986, Cell 45:485-95); region za kontrolu albuminskog gena koji je aktivan u jetri (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-76); region za kontrolu gena alfa-feto proteina koji je aktivan u jetri (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 5:1639-48; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); region za kontrolu gena za alfa-1-antitripsin koji je aktivan u jetri (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-71); region za kontrolu gena za beta-globin koji je aktivan u mieloidnim ćelijama (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-40, Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); region za kontrolu gena za bazni protein mielina koji je aktivan u oligodendrocitnim ćelijama mozga (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-12); region za kontrolu gena za miozimski laki lanac II koji je aktivan u skeletnim mišićima ( Sani, 1985, Nature et al., 314:283-86); i region za kontrolu gena za gonadotropni odpuštajući hormon koji je aktivan u hipotalamusu (Mason et al., 1986, Science 234:1372-78).
Sekvence koje pospešuju transkripciju mogu biti insertovane u vektor kako bi se povećala transkripcija sa DNK molekula koji kodira laki lanac ili teški lanac koji sačinjavaju anti-NGF antitelo prema predmetnom pronalasku kod viših eukariota. Pospešivačke sekvence su cis-delujući elementi DNK, obično dužine 10-300 bp, koji deluju na promoter u smislu povećavanja transkripcije. Pospešivačke sekvence su relativno nezavisne od orjentacije i položaja i mogu se naći na položajima koji su i na 5' i na 3' kraju u odnosu na transkripcionu jedinicu. Poznato je nekoliko pospešivačkih sekvenci koje su dostupne iz gena sisara (npr., gena za globin, elastaze, albumin, alfa-feto-protein i insulin). Tipično, međutim, koristi se istraživačka sekvenca iz virusa. Primeri elemenata za pospešivanje transkripcije koji služe za aktivaciju eukariotskih promotera i koji su poznati u struci jesu pospešivačka sekvenca SV40, pospešivačka sekvenca ranog promotera CMV, pospešivačka sekvenca polioma virusa i pospešivačka sekvenca adeno virusa. Iako pospešivačka sekvenca može da bude pozicionirana u vektoru za ekspresiju i na 5' i na 3' kraju u odnosu na kodirajuću sekvencu ona je tipično locirana na 5' kraju u odnosu na promoter.
Vektori za ekspresiju prema predmetnom pronalasku mogu biti konstruisani iz početnog vektora, kao što je to komercijalno dostupni vektor. Takvi vektori mogu, mada ne moraju, da sadrže sve željene bočne sekvence. Onda kada jedna ili više bočnih sekvenci koje su ovde opisane nije prisutna u datom vektoru, one mogu individualno da se dobiju i ligiraju u vektor. Postupci koji se koriste za dobijanje svake od bočnih sekvenci dobro su poznati stručnjacima.
Nakon konstrukcije vektora i nakon insercije molekula nukleinske kiseline koji kodira laki lanac, teški lanac, ili laki lanac ili teški lanac koji sačinjavaju anti-NGF antitelo na odgovarajuće mesto u dati vektor, tako kompletirani vektor može biti insertovan u odgovarajuću ćeliju domaćina radi amplifikacije i/ili ekspresije polipeptida. Transformacija vektora ekspresije za anti-NGF antitelo u izabranu ćeliju domaćina može da se postigne dobro poznatim postupcima koji obuhvataju transfekciju, infekciju, ko-precipitaciju sa kalcijumfosfatom, elektroporaciju, mikroinjektiranje, lipofekciju, transfekciju posredovanu sa DEAE-dekstanom ili primenom druge poznate tehnike. Izabrani postupak je delimično zavisan od tipa ćelije domaćina koja se koristi. Navedeni postpci i druge odgovarajuće metode su dobro poznati stručnjacima i opisani su, na primer, u Sambrook et al., kako je navedeno u tekstu iznad.
Ćelija domaćin, onda kada je kultivisana u odgovarajućim uslovima, sintetiše anti-NGF antitelo koje naknadno može biti prikupljeno iz podloge kulture (ukoliko ćelija domaćin sekretuje antitelo u podlogu) ili može biti prikupljeno direktno iz ćelije domaćina koja ga proizvodi ( u slučaju kada nije sekretovano). Izbor odgovarajuće ćelije domaćina zavisi od različitih faktora, kao što su željeni nivoi ekspresije, polipeptidne modifikacije koje su poželjne ili neophodne za aktivnost (npr., glikolizacija ili fosforilacija), kao i jednostavnost sklapanja proteina u biološki aktivan molekul.
U struci su dobro poznate sisarske ćelijske linije koje su dostupne kao domaćini za ekspresiju i one obuhvataju, bez ograničenja, i mortalizovane ćelijske linije koje su dostupne u Američkoj kolekciji tipskih kultura (ATCC), uključujući, bez ograničenja, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije), HeLa ćelije, ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK ćelije), ćelije bubrega majmuna (COS), ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (Hep G2 ćelije), i brojne druge ćelijske linije. U određenim rešenjima, ćelijske linije mogu biti izabrane putem određivanja onih ćelijskih linija koje poseduju visoke nivoe ekspresije i koje konstitutivno proizvode antitela sa NGF vezujućim svojstvima. U drugom rešenju, može biti izabrana ćelijska linija iz B ćelijske porodice koja ne proizvodi sopstvena antitela, ali koja poseduje kapacitet da proizvodi i sekretuje heterologa antitela.
Antitela prema predmetnom pronalasku su korisna za detekciju NGF u biološkim uzorcima i za identifikaciju ćelija ili tkiva koje proizvode NGF protein. Antitela prema predmetnom pronalasku koja se specifično vezuju za NGF mogu biti od koristi u tretmanu bolesti koje su posredovane sa NGF. Navedena antitela mogu da se koriste u testovima vezivanja za detekciju NGF i za inhibiciju aktivnosti NGF da stvara kompleks sa NGF receptorima. Navedena antitela koja se vezuju za NGF i koja blokiraju interakciju sa drugim vezujućim jedinjenjima mogu da poseduju tarapeutsku vrednost zbog mogućnosti da moduliraju oboljenja koja su posredovana sa NGF. U poželjnim rešenjima, antitela protiv NGF mogu da blokiraju vezivanje NGF za njegov receptor, što može da dovede do prekidanja signalne kaskade koja je indukovana sa NGF.
Predmetni pronalazak se takođe odnosi na upotrebu jednog ili više antitela prema predmetnom pronalasku u proizvodnji medikamenta za tretman bolnog poremećaja ili stanja koje je izazvano povišenom ekspresijom NGF ili povišenom senzitivnošću na NGF, kod pacijenata koji boluju od jednog od poremećaja ili stanja koja su ovde opisana.
U poželjnim rešenjima predmenti pronalazak obezbeđuje farmaceutske preparate koji sadrže terapeutski efikasnu količinu jednog ili više antitela prema predmetnom pronalasku zajedno sa farmaceutski prihvatljivim diluentom, nosiocem, sredstvom za rastvaranje, sredstvom za emongovanje, konzervansom i/ili adivansom. Poželjno, materijali koji su prihvatljivi za formulaciju su netoksični za recipijante u dozama i kocentracijama koje se koriste. U poželjnim rešenjima, faramaceutski preparati sadrže terapeutski efikasnu količinu anti-NGF antitela.
U određenim rešenjima, materijali koji su prihvatljivi za formulaciju poželjno su netoksični za recepijente u dozama i kocentracijama u kojima se upotrebljavaju.
U određenim rešenjima, farmaceutski preparat može da sadrži materijale za formulaciju koji služe za modifikaciju, održavanje ili konzervaciju, na primer, pH vrednosti, osmolarnosti, viskoznosti, bistrine, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili otpuštanja, atsorpcije ili penetracije datog preparata. U takvim rešenjima, materijali koji su pogodni za formulaciju obuhvataju, bez ograničenja, aminokiseline (kao što su glicin, glitamin, asparagin, arginin ili lizin); antimikrobna sredstva, antioksidante (kao što su askorbinska kiselina, natrijum sulfit ili natrijum hidrogen sulfit); pufere (kao što su boratni, bikarbonantni, Tris-HCl, citratni, fosfatni i drugi organski puferi); sredstva za bubrenje (kao što su manitol ili glicin); sredstva za heliranje (kao što su etilen diamin, tetrasirćetna kiselina (EDTA)); sredstva za stvaranje kompleksa (kao što su kafen, polivinilpiridon, beta-ciklodekstrin ili hidrocipropil-beta-ciklodekstrin); punioci; monosaharidi; bisaharidi; kao i drugi ugljeni hidrati (kao što je glukoza, manoza ili dekstrini); proteini (kao što su serumski albumin, gelatin ili imunoglobulini); sredstva za bojenje, veštačke arome i za razblaživanje, sredstva za emulgovanje; hidrofolne polimere (kao što je polivinilpuridon); polipeptide male molekulske mase; jone koji se koriste za dobijanje soli (kao što je natrijumov jon); konzervanse (kao što je benzalkolnium hlorid, benzoila kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil alkofol, metil paraben, propil paraben, hlorheksidin, sorbinska kiselina ili vodonik peroksid); rastvarače (kao što je glicerin, propilenglikol ili polietilenglikol); šećerne alkohole (kao što su manitol ili sorbitol); sredstva za suspendovanje; surfatante ili sredstva za vlaženje (kao što su pluronici, PEG, sorbitan estri, polisorbati, kao što je polisorbat 20, polisorbat 80, triton, trometamin, lecitin, holesterol, tiloksapal); sredstva za pospešivanje stabilnosti (kao što su sukroza ili sorbitol); sredstva za pospešivanje toničnosti (kao što su halidi alkalnih metala, poželjno natrijum ili kalijum hlorid, manitol, sorbitol), felikulume za dopremanje; diluente; ekscepijente i/ili farmaceutske adivanse. Videti REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18. izdanje, Edition, (A.R. Gennaro, urednik), 1990, Mack Pulishing Company.
U određenim rešenjima, optimalni farmaceutski preparat je određen od strane stručnjaka na osnovu, na primer, željenog puta primene, formata za dopremanje ili željene doze. Videti, na primer REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, navedeno iznad. U određenim rešenjima, takvi preparati mogu da utiču na fizičko stanje, stabilnost, brzinu odpuštanja in vivo kao i na brzinu klirensa in vivo antitela prema predmetnom pronalasku.
U određenim rešenjima, primarni vefikulum ili nosilac u farmaceutskom preparatu može biti voda ili ne-vodena supstanca. Na primer, odgovarajći vefikulum ili nosilac može biti voda za inekcije, fiziološki rastvor NCL ili veštačka cerebrospinalna tečnost, sa mogućnošću dodatka drugih materijala koji su uobičajeni u preparatima za parentralnu primenu. Dalji primeri verfikuluma jesu neutralni, fusterovani fiziološki rastvor ili fiziološki rastvor koji je pomešan sa serumskim albumimom. U poželjnim rešenjima, farmaceutski preparati prema predmetnom pronalasku sadrže tris pufer sa pH vrednošću od 7.0-8.5, ili acetat pufer sa pH vrednošću od 4.0-5.5, a mogu dalje da sadrže surbitol, sukrozu, Tween-20 i/ili njihovu odgovarajuću supstituciju. U određenim rešenjima prema predmetnom pronalasku, preparat anti-NGF antitela može da bude pripremljen za skladištenje tako što se željeni preparat sa željenim stepenom čistoće meša sa opcionim sredstvima za formulaciju (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, kao što je navedeno iznad), u obliku vilfilizovanog praška ili vodenog rastvora. Dalje, u određenim rešenjima, anti-NGF antitelo u preparatu može biti formulisano u obliku liofilizata korišćenjem odgovarajućih ekscepijenata kao što je sukroza.
Farmaceutski preparati prema predmetnom pronalasku mogu biti izabrani za parenteralnu upotrebu. Alternativno, preparati mogu biti izabrani za inhalaciju ili za dopremanje putem digestivnog frakta, na primer, oralnim putem. U određenim rešenjima, za održavanje fiziološke pH vrednosti ili nešto niže pH vrednosti koriste se puferi, tipično u pH opsegu od oko 5 do oko 8.
Kada je poželjna parenteralna primena, terapeutski preparati za upotrebu prema predmetnom pronalasku mogu biti formulisani u obliku parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora bez hidrogena koji sadrži željeno anti-NGF antitelo u farmaceutski prihvatljivom vehikulumu. Posebno pogodan vehikulum za parenteralnu inekciju je sterilna destilovana voda u kojoj je anti-NGF antitelo definisano u vidu sterilnog, izotoničnog rastvora koji je konzerviran na odgovarajući način. U određenim rešenjima, preparat može da sadrži formulaciju željenog molekula sa sredstvima kao što su injektabilne mikrosfere, biološki razgradljive čestice, kao što su polimerna jedinjenja ( poliaktilna kiselina ili poliglikolna kiselina), perlice ili lipozomi, koja mogu da obezbede kontrolisano ili produženo otpuštanje proizvoda i koja mogu biti dopremljena putem depo inekcija. U određenim rešenjima, takođe je moguće da se koristi hiauronska kiselina koja poseduje efekat pospešivanja produženog trajanja u cirkulaciji. U određenim rešenjima, za uvođenje željenog molekula antitela u organizam mogu da se koriste uređaji za dopremanje leka koji se implantiraju.
Farmaceutski preparati prema predmetnom pronalasku mogu biti formulisani za inhalaciju. U ovim rešenjima, anti-NGF antitela se poželjno formulišu u vidu suvog praha za inhalaciju. U poželjnim rešenjima, mogu biti formulisana i u obliku rastvora za inhalaciju sa odgovarajućim propelantom za primenu u vidu aerosola. U određenim rešenjima, rastvori mogu biti nebulizovani. Primena preko sluzokože pluća i odgovarajući postupci formulacije su dalje opisani u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US94/001875, koja je ovde inkorporirana po referenci i koja opisuje dopremanje preko sluzokože pluća hemijski modifikovanih proteina.
Predmenti pronalazak takođe obuhvata formulacije za oralnu primenu. Anti-NGF antitela koja se primenjuju na ovaj način mogu biti formulisana sa ili bez nosioca koji se uobičajeno koriste u formulaciji čvrstih doznih oblika kao što su tablete i kapsule. U određenim rešenjima, kapsule mogu biti tako dizajnirane da otpuštaju aktivni deo formulacije u onoj tački gastrointestatilnog trakta u kojoj je biološka raspoloživost supstance maksimalna, a presistemska degradacija minimalna. U preparat mogu biti uključena dodatna sredstva koja pospešuju apsorpciju anti-NGF antitela. Takođe, mogu da se koriste diluenti, veštačke arome, voskovi sa niskom tačkom topljenja, biljna ulja, lubrikanti, sredstvo za suspendovanje, sredstvo za dezintegraciju tablete i veznici.
Farmaceutiski preparat prema predmetnom pronalasku poželjno sadrži efikasnu količinu jednog ili više anti-NGF antitela u smesi sa netoksičnim ekscipijentima koji su pogodni za proizvodnju tableta. Rastvaranjem tableta u sterilnoj vodi ili drugom odgovarajućem verifikulumu, mogu da se dobiju rastvori u obliku jedinične doze. Odgovarajući ekscepijenti obuhvataju, bez ograničenja, inertne dilente kao što su natrijum karbonat ili bikarbonat, laktoza ili kalcijum fosfat; ili vezujuća sredstva kao što su skrob, laktoza ili guma akacije; ili lubrikante kao što su magnezijumstearat, stearenska kiselina ili talk.
Dodatni farmaceutski preparati su očigledni stručnjacima, i obuhvataju formulacije anti-NGF antitela sa produženim ili kontrolisanim otpuštanjem. Stručnjacima su takođe poznate tehnike za formulaciju preparata sa produženim ili kontrolisanim otpuštanjem, kao što su preparati sa lipozomskim nosjacima, biološkim razgradljivim mikročesticama ili poroznim perlicama i depo inekcijama. Videti, na primer, Međunarodnu patentnu prijavu br. PCT/US93/00829, koja je ovde inkorporirana po referenci i koja opisuje kontrolisano otpuštanje aktivne supstance iz poroznih polimernih mikročestica koje služe za dopremanje farmaceutskih preparata. U preparate sa produženim otpuštanjem spadaju polupropusni polimerni matriksi u obliku po želji, npr., u obliku filmova ili mikrokapsula. U matrikse sa produženim otpuštanjem spadaju poliestri, hidrogelovi, poliaktidi (kao što je opisano u U.S. patentu br. 3,773,919 i u Evropskoj patentnoj prijavi, publikacija br. EP 058481, koje su ovde inkorporirane po referenci), kopolimeri M-glutaminske kiseline i gama etil-L-glutamata (Sidman et al., 1983, Biopolymers 22:547-556), poli (2-hidroksietil-metakrilat) (Langer et al., 1981, J.Biomed. Mater. Res. 15;167-277 i Langer, 1982, Chem. Tech. 12;98-105), etilen vinil acetat (Langer et al., supra) ili poli-D(-)-3-hidroksibuterna kiselina (Evropska patentna prijava Publikacija br. EP 133,988). U preparate sa produženim otpuštanjem takođe spadaju lipozomi koji se dobijaju na bilo koji od brojnih načina koji su poznati u struci. Videti, npr., Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692; Evropska patentna prijava Publikacija br. EP 036,676; EP 088,046 i EP 143,949, koje su ovde inkorporirane po referenci.
Farmaceutski preparati koji se koriste za in vivo administraciju tipično su obezbeđeni u vidu sterilnih preparata. Sterilizacija se postiže filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. Onda kada je preparat tiofilizovan, sterilizacija koja koristi ovaj postupak može da se sprovede ili pre ili nakon liofilizacije i rekonstitucije. Preparat za parenteralnu upotrebu mogu da budu uskladišteni u liofilizovanom obliku ili u obliku rastvora. Preparati za parenteralnu upotrebu se generalno čuvaju u kontejneru koji poseduje sterilni pristup, na primer, u vidu vreće za intravenski rastvor ili u bočici koja poseduje deo koji može da se probuši sa hipodermnom iglom za injektiranje.
Onda kada je farmaceutski preparat formulisan, on može biti uskladišten u sterilnim bočicama u vidu rastvora, suspenzije, gela, emulzije, čvrste suspance ili u vidu dehidatizovanom ili liofilizovanog preparata. Takve formulacije mogu biti uskladištene ili u obliku koji služi za neposredne primene ili u obliku (npr., u slučaju liofilizacije) koji se rekonstituiše neposredno pre primene.
Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje komplete za proizvodnju pojedinačne doze za primenu. Kompleti prema predmentom pronalasku sadrže prvi kontejner sa isušenim proteinom i drugi kontejner sa vodenom formulacijom. U određenim rešenjima prema predmetnom pronalasku, kompleti sadrže špriceve sa jednom ili sa više komora koje su prethodno napunjene (npr., špriceve sa tečnošću ili liošpriceve).
Efikasna količina anti-NGF antitela u obliku farmaceutskog preparata koji se koristi u terapiji zavisi od, na primer, terapeutskog konteksta i ciljeva terapije. Stručnjak shvata da odgovarajući dozni nivoi za tretman zavise, delimično, od molekula koji se primenje, od indikacije zbog koje se koristi anti-NGF antitelo, od načina primene, kao i veličine (telesne mase, površine tela ili veličine organa) i/ili stanja (starosne dobi i opšteg zdravstvenog stanja) određenog pacijenta. U određenim rešenjima, lekar kliničar može da filtrira dozu i modifikuje način primene kako bi postigao optimalni terapeutski efekat. Tipična doza se nalazi u opsegu od oko 0.1 mikrogram po kilogramu do oko 30 miligrama po kilogramu ili više, u zavisnosti od faktora koji su navedeni ranije. U poželjnim rešenjima, doza se nalazi u opsegu od oko 0.1 mikrogram po kilogramu do oko 30 miligrama po kilogramu; poželjnije od oko 1 mikrogram po kilogramu do oko 30 miligrama po kilogramu; još poželjnije od oko 5 mikrograma po kilogramu do oko 30 miligrama po kilogramu.
Učestalost doziranja zavisi od farmakokinetskih parametara određenog anti-NGF antitela u formulaciji koja se koristi. Tipično, lekar kliničar primenjuje preparat sve dok se ne postigne doza koja izaziva željeni efekat. Tako, preparat može biti primenjen u vidu jedne doze ili u vidu dve ili više doza (koje mogu, mada ne moraju, da sadrže istu količinu željenog molekula) tokom određenog vremena, ili u vidu kontinuirane infuzije implantiranog uređaja ili katetera. Dalje fino podešavanje nivoa doze rutinski se vrši od strane stručnjaka i spada u obim zadataka koje stručnjaci rutinski izvode. Odgovarajuće doze mogu da se odrede upotrebom odgovarajućih podataka o odgovoru na datu dozu. U određenim rešenjima, antitela prema predmetnom pronalasku mogu da se primene kod pacijenata u toku produženog vremenskog perioda. Hronična primena antitela prema predmetnom pronalasku minimizira neželjene imunološke ili alergijske odgovore koja su obično udruženi sa antitelima koja su usmerena protiv humanog antibila u ne-humanoj životinji, na primer, protiv nepotpuno humanog antitela proizvedenog u nekoj nepotpuno humanoj vrsti.
Način primene farmaceutskog preparata obuhvata poznate postupke, npr., to je oralna primena, primena putem injekcije kao što je intravenska, intraperitonealna, intracerabralna (intraparehimska), intracerebroventikularna, intramuskularna, intra-okularna, intra-arterijska, intraportalna, ili intralezionalna injekcija; putem sistema za produženu upotrebu ili putem uredjaja koji se implantiraju. U određenim rešenjima, preparati mogu da se primene putem bonus inekcije ili putem kontinuirane infuzije ili putem uređaja koji se implantira.
Preparat takođe može da se primeni lokalnu putem implementacije membrane, sunđera ili drugog odgovarajućeg materijala na kome je željeni molekul apsorbovan ili u kome je inkapsuliran. U određenim rešenjima u kojima se koristi uređaj koji se implantira, navedeni uređaj može biti implantiran u bilo koje pogododno tkivo ili organ, a dopremanje željenog molekula može da se odvija putem difuzije, bolusa koji se primenjuje u određenom trenutku ili putem kontinuirane primene.
Takođe, može biti poželjna primena atni-NGF antitela u obliku farmaceutskog preparata shodno predmetnom pronalasku ex vivo. U takvim slučajevima, ćelije, tkiva ili organi koji su uklonjeni iz pacijenta izlažu se farmaceutskim preparatima sa anti-NGF antitelom nakon čega se ćelije, tkiva i/ili organi naknadno implantiraju nazad u organizam pacijenta. Posebno atni-NGF antitela mogu da se dopreme implantacijom od pređenih ćelija koje su genetskim inženjeringom modifikovane, korišćenjem postupaka kao što su oni opisani ovde, kako bi eksprimirale i sekretovale dati polipeptid. U određenim rešenjima, takve ćelije mogu biti životinjske ili humane ćelije i mogu biti autologe, heterologe ili ksenogene. U određenim rešenjima ćelije mogu biti imortalizovane. U drugim rešenjima, kako bi se smanjila šansa za razvoj imunološkog odgovora, ćelije mogu biti inkapsulirane kako bi se izbegla infiltracija tkiva koje ih okružuju. U daljim rešenjima, materijali koji se koriste za enkapsulaciju koji su tipično biološki kopatibilni, polupropusne polimerne obloge ili membrane koje omogućavaju otpuštanje proteinskih proizvoda, i istovremeno sprečavaju razgradnju ćelija od strane imunološkog sistema pacijenta ili putem drugih oštećujućih činioca poreklom iz tkiva koja okružuju ćeliju.
Primeri
Primeri koji slede, uključujući izvedene eksperimente i dobijene rezultate, dati su samo kao ilustracija te ne treba smatrati da ograničavaju obim zaštite predmetnog pronalaska.
Primer 1: Dobijanje humanog NGF proteina iz ćelija E. coli
Kloniranje rHu-NGF (1 - 120)
Nukleotidna sekvenca koja kodira humani NGF amplifikovana je iz cDNK upotrebom oligonukleotidnih prajmera sa sekvencama koje su prikazane kao sekvenca čiji je ID broj: 27 i sekvenca čiji je ID broj: 28 i standardne tehnologije PCR. 5' prajmer uvodi NdeI restrikciono mesto i metioninski kodon inicijacije koji se nalazi neposredno pre kodona 1 (serin) zrele sekvence. 3' prajmer uvodi BamHI restrikciono mesto neposredno posle terminacionog kodona. Dobijeni proizvod PCR je prečišćen u gelu, hidrolizovan dejstvom restrikcionih endonukleaza NdeI i BamHI i potom vezan u pCFM1656 vektor, koji je takođe hidrolizovan dejstvom restrikcionih endonukleaza NdeI i BamHI. Aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog NGF 1 - 120 data je kao sekvenca čiji je ID broj: 30.
Ekspresioni vektor pCFM1656 (ATCC #69576) dobijen je iz ekspresionog vektorskog sistema opisanog u US Patentu br. 4,710,473. Plazmid pCFM1656 može da se dobije iz opisanog plazmida pCFM836 (US Patent br. 4,710,473) tako što se: (a) dva endogena NdeI restrikciona mesta unište popunjavanjem krajeva enzimom T4 polimerazom, praćenim povezivanjem ravnih krajeva; (b) DNK sekvenca između jedinstvenih AatI i ClaI restrikcionih mesta, koja sadrži sintetički PL promoter, zameni sličnim fragmentom dobijenim iz pCFM636 (Patent br. 4,710,473) koji sadrži PL promoter i potom se (c) izvrši supstitucija kratke sekvence DNK između jedinstvenih ClaI i KpnI restrikcionih mesta oligonukleotidom dobijenim ciklizacijom dve probe čije su sekvence date kao sekvenca čiji je ID broj: 31 i sekvenca čiji je ID broj: 32.
Domaćinski soj E. coli K12 (Amgen soj 657) izveden je iz E. coli W1485 (K12 soj), dobijenog iz E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, CT (CGSC soj 6159).
Ekspresija rHu-NGF (1 - 120)
Fermentacija E. coli koje sadrže ekspresioni konstrukt NGF (koji je predhodno opisan) izvršena je u bogatoj hranljivoj podlozi, uz dodavanje hranljive podloge (postupak "dopunjavanog bača", "fed batch"). Ćelije su gajene na 30 oC do optičke gustine od 49 na 600 nm, a potom indukovane povećanjem temperature na 42 oC. Četiri sata nakon indukcije, ćelije su sakupljene centrifugiranjem. Konačna optička gustina bila je 75. Izračunato je da je prinos ekspresije bio 0,15 g/L.
Ponovno uvijanje i prečišćavanje rHu-NGF (1 - 120)
Ćelije su lizirane u Microfluidizer uređaju, centrifugirane na 10000 x g tokom 30 minuta, talog je ispran 1% deoksiholnom kiselinom i ponovo centrifugiran. Dobijeni talog (WIB, "washed inclusion bodies", isprana inkluziona tela) suspendovan je u denaturišućem sredstvu, 8 M guanidin HCl, 50 mM Tris pH 8,5 koji sadrži 10 mM DTT i solubilizovan na sobnoj temperaturi 1 čas, centrifugiran na 10000 x g 30 minuta, nakon čega je supernatant pažljivo odliven a potom razblažen 25 puta vodenim puferom koji sadrži redoks par na 4 oC, a zatim ostavljen da stoji 5 dana. Dobijeni ponovno uvijeni protein je potom titrovan do pH 3,0, proceđen kroz 0.45 �M filter. Ponovno savijeni protein je prečišćen na Sp-Sepharose fast flow koloni sa brzim protokom pomoću standardnog gradijenta NaCl. Sakupljeni eluat sa katjonitske jonoizmenjivačke kolone je potom koncentrovan, a alikvoti su zamrznuti na -80 oC. Čistoća proteina određivana je elektroforezom na SDS poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE) i analizirana bojenjem sa Coomassie blue bojom. Prečišćeni protein sačinjavao je više od 90% glavne trake, prema ovom postupku.
Primer 2: Dobijanje humanih monoklonskih antitela na faktor rasta nerva (NGF)
Transgeni HuMab i KM miševi
Potpuno humana monoklonska antitela na NGF dobijena su korišćenjem HCo7, HCo12, HCo7 + HCo12 i KM sojeva transgenih miševa, od kojih svaki eksprimira gene za humana antitela. Kod svakog od ovih sojeva miševa, endogeni mišji gen za kapa laki lanac je homozigotno prekinut kao što je opisano u Chen et al., (1993, EMBO J. 12: 811 - 820), dok je endogeni mišji gen za teški lanac homozigotno prekinut kao što je opisano u Primeru 1 međunarodne patentne prijave br. WO 01/09187 (koja je inkorporirana po referenci). Svaki od ovih sojeva miševa nosi transgen za humani kapa laki lanac, KCo5, kao što je opisano u Fishwild et al. (1996, Nature Biotechnology 14: 845 - 851). Soj HCo7 nosi HCo7 transgen za humani teški lanac kao što je opisano u US Patentima br. 5,545,806, 5,625,825 i 5,545,807 (koji su inkorporirani po referenci). Soj HCo12 nosi HCo12 transgen za humani teški lanac kao što je opisano u primeru 2 međunarodne patentne prijave br. WO 01/09187 (koja je inkorporirana po referenci). Soj HCo7 + HCo12 nosi i HCo7 i HCo12 transgene za teški lanac i hemizigotan je za svaki od ovih transgena. KM miševi nose SC20 transgen za teški lanac kao što je opisano u Tomizuka et al. (1997, Nature Genet. 16, 133 - 143 i 2000, Proc. Natl. Acad. Sci, 97, 722 - 727). Ovaj transgen nije integrisan u mišji hromozom, već podleže propagaciji kao nezavisan fragment hromozoma. Ovaj fragment obuhvata približno 15 MB humanog hromozoma br. 14. On sadrži potpuni humani lokus za teški lanac, uključujući sve VH, D i JH segmente gena i sve izotipove konstantnog regiona teškog lanca. Svi ovi sojevi će ovde biti označeni kao HuMab miševi.
Imunizacija HuMab
Kako bi se dobila potpuno humana antitela na NGF, HuMab miševi su imunizovani prečišćenim rekombinantnim NGF dobijenim iz E. coli ćelija kao antigenom (primer 1). Opšti rasporedi imunizacije za HuMab miševe opisan je u Lonberg et al. (1994, Nature 368: 856 - 859; Fishwild et al, supra., i međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 98/24884, koje su sve ovde inkorporirane po referenci). U vreme prve infuzije antigena miševi su bili stari od 6 do 16 nedelja. Za intraperitonealnu (IP) ili potkožnu (SC) imunizaciju HuMab miševa korišćen je prečišćeni rekombinantni preparat NGF antigena (25 - 100 �g).
U imunizaciji HuMab transgenih miševa korišćen je antigen u potpunom Frojndovom adjuvansu, u dve injekcije, nakon čega je usledilo 2 do 4 nedelje IP imunizacija (do ukupno 9 imunizacija) antigenom u nepotpunom Frojndovom adjuvansu. Svakim antigenom imunizovano je nekoliko desetina miševa. NGF antigenom ukupno je imunizovano 118 miševa HCo7, HCo12, HCo7 + HCo12 i KM sojeva. Imuni odgovor praćen je na osnovu uzoraka krvi dobijenim retroorbitalno.
Kako bi se odabrali miševi koji proizvode antitela koja vezuju humani NGF, serumi imunizovanih miševa ispitani su ELISA testom kao što je opisano u Fishwild et al., supra. Ukratko, mikrotitar ploče su obložene prečišćenim rekombinantnim NGF iz E. coli (primer 1) pri koncentraciji od 1 do 2 �g/ml u PBS te je 50 �l/polju inkubirano na 4oC preko noći, a potom su ploče blokirane pomoću 200 �l/polju 5% kokošjeg seruma u PBS/Tween (0,05%). Razblaženja plazme iz miševa imunizovanih na NGF dodata su u svako polje i inkubirana 1 do 2 časa na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane u PBS/Tween, a potom inkubirane sa poliklonskim kozjim anti-humani IgG sredstvom specifičnim za Fc konjugovanim za peroksidazu iz rena (HRP), 1 čas na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja, ploče su razvijene pomoću ABTS supstrata (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, kataloški br. A-1888, 0,22 mg/ml) i analizirane spektrofotometrijski određivanjem optičke gustine (OD) na talasnim dužinama od 415 do 495 nm. Miševi sa odgovarajućim titrom humanog anti-NGF imunoglobulina korišćeni su za proizvodnju monoklonskih antitela kao što je opisano dole.
Dobijanje hibridoma koji proizvode humana monoklonska antitela na NGF
Miševi su pripremljeni za proizvodnju monoklonskih antitela davanjem intravenskih revakcina antigena 2 dana pre žrtvovanja, nakon čega su slezine uklonjene. Iz HuMab miševa su izolovani mišji splenociti, a potom fuzionisani sa PEG za ćelijsku liniju mišjeg mijeloma prema standardnim protokolima. Obično je vršeno po 10 do 20 fuzija za svaki antigen.
Ukratko, suspenzije pojedinačnih ćelija limfocita iz slezine imunizovanih miševa fuzionisane su za P3X63-Ag8.653 nesekretujuće ćelije mišjeg mijeloma (ATCC, redni br. CRL 1580), čiji je broj bio 4 puta manji od broja limfocita, sa 50% PEG (Sigma). Ćelije su zasejane u pločama, približno po 1 x 105 ćelija po polju u mikrotirar pločama sa ravnim dnom, nakon čega su inkubirane dve nedelje u selektivnoj podlozi koja sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma, 10% P388D1 (ATCC, redni br. CRL TIB-63) kondicioniranoj podlozi, 3 do 5% origena (IGEN) u DMEM (Mediatech, kataloški br. CRL 10013, sa visokom koncentracijom glukoze, L-glutamina i natrijum piruvata), uz dodatak 5 mM HEPES, 0,055 mM 2-merkaptoetanola, 50 mg/ml gentamicina i 1 x HAT (Sigma, kataloški br. CRL P-7185). Nakon 1 do 2 nedelje, ćelije su gajene u kulturi u podlozi u kojoj je HAT zamenjen HT-om.
Dobijeni hibridomi su ispitani na proizvodnju antigen-specifičnih antitela. Svako pojedinačno polje ispitano je ELISA testom (kao što je predhodno opisano) na humana anti-NGF monoklonska IgG antitela. Kada je jednom došlo do značajnog rasta hibridoma, podloga je praćena obično nakon 10 do 14 dana. Hibridomi koji su lučili antitela su ponovo zasejani i, ako su opet pokazali pozitivan rezultat na humani IgG, anti-NGF monoklonska antitela su podklonirana najmanje dva puta ograničavajućim razblaženjem. Stabilni podklonovi su potom gajeni u kulturi in vitro kako bi se dobile male količine antitela u podlozi za gajenje tkiva za karakterizaciju.
Selekcija humanih monoklonskih antitela koja se vezuju za NGF
Za ispitivanje hibridoma koji su pokazali pozitivnu reaktivnost prema NGF imunogenu korišćen je ELISA test kao što je predhodno opisano. Hibridomi koji su lučili monoklonsko antitelo koje se sa visokim aviditetom vezivalo za NGF podklonirani su i okarakterisani detaljnije. Po jedan klon od svakog hibridoma, koji je zadržao reaktivnost roditeljskih ćelija (što je određeno pomoću ELISA testa), izabran je za dobijanje banke od 5 do 10 bočica ćelija čuvanih u tečnom azotu.
ELISA test specifičan za određeni izotip izvršen je kako bi se odredio izotip monoklonskog antitela koje je dobijeno na ovde opisani način. U ovim eksperimentima, mikrotitar ploče su obložene sa po 50 �l/polju rastvora mišjeg anti-humani kapa lanac antitela u PBS, koncentracije 1 �g/ml, te inkubirane na 4oC preko noći. Nakon blokiranja 5% kokošjim serumom, u pločama je izvedena reakcija sa supernatantima iz svakog od testiranih monoklonskih antitela, kao i sa prečišćenom kontrolom za izotip. Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi tokom 1 do 2 časa. U poljima je potom izvršena reakcija sa različitim kozjim anti-humanim poliklonskim antiserumima specifičnim za IgG i konjugovanim za peroksidazu iz rena, te su ploče razvijene i analizirane kao što je predhodno opisano.
Monoklonska antitela prečišćena iz supernatanata hibridoma koji su pokazivali značajno vezivanje za NGF, što je određeno ELISA testovima, dalje su ispitivana na biološku aktivnost pomoću različitih biotestova, kao što će biti opisano ispod.
Primer 3: Odabir i kloniranje anti-NGF antitela sa visokom aktivnošću neutralizacije NGF
Delotvornost antitela koja su prvobitno identivikovana u primeru 2 kao inhibitori NGF aktivnosti (t.j. koja poseduju osobinu "neutralizacije" NGF) ispitana su merenjem sposobnosti svakog modifikovanog peptida da zaustavi indukciju ekspresije vaniloidnog receptora-1 (VR1) u kojoj posreduje NGF.
Kulture neurona gangliona dorzalnog korena
Ganglije dorzalnog korena (DRG) iz svih spinalnih segmenata embriona pacova starih 19 dana (E19 pacovi), hirurški uklonjenih iz materice terminalno anesteziranih Spargue-Dawley pacova čija je trudnoća vremenski praćena (Charles River, Wilmington, MA), secirane su jedna po jedna u aseptičnim uslovima. DRG su sakupljene u ledeno hladnu L-15 podlogu (GibcoBRL, Grand Island, NY) koja sadrži 5% konjski serum inaktiviran toplotom (GibcoBRL), nakon čega je uklonjeno bilo kakvo slabo vezano vezivno tkivo i krvni sudovi. DRG su isprane dva puta u Dulbecco fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom u kome nema Ca2+ i Mg2+ (DPBS), pH 7,4 (GibcoBRL). DRG su potom razdvojene u suspenziju pojedinačnih ćelija pomoću papainskog sistema za razdvajanje (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ). Ukratko, DRG su inkubirane u rastvoru za digestiju koji sadrži 20 U/ml papaina u Erlovom uravnoteženom rastvoru soli (Earle's Balanced Salt Solution, EBSS) pedeset minuta na 37 oC. Ćelije su razdvojene ponavljanim istiskivanjem kroz Pasterovu pipetu koja je ispolirana na vatri, u podlozi za razdvajanje koja se sastoji od MEM/Hamovog F12, 1 : 1, 1 mg/ml ovomukoidnog inhibitora i 1 mg/ml ovalbumina, kao i 0,005% dezoksiribonukleaze (DNaze).
Razdvojene ćelije su istaložene centrifugiranjem na 200 x g 5 minuta, a potom ponovo suspendovane u EBSS koji sadrži 1 mg/ml ovomukoidnog inhibitora, 1 mg/ml ovalbumina i 0,005% DNaze. Suspenzija ćelija centrifugirana je kroz gradijentni rastvor koji sadrži 10 mg/ml ovomukoidnog inhibitora i 10 mg/ml ovalbumina na 200 x g 5 minuta, kako bi se uklonili ostaci ćelija, a potom proceđena kroz 88-�m najlonsku mrežu (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) kako bi se uklonile eventualne grudvice. Broj ćelija određen je pomoću hemocitometra, te su ćelije zasejane u ploče sa po 96 polja presvučene poliornitinom 100 �g/ml (Sigma, St. Louis, MO) i mišjim lamininom 1 �g/ml (GibcoBRL), pri koncentraciji ćelija od 10 x 103 ćelija po polju u potpunoj podlozi. Potpuna podloga sastojala se od minimalne esencijalne podloge (MEM) i Hamovog F12, 1 : 1, penicilina (100 U/ml), streptomicina (100 �g/ml) i 10% inaktiviranog konjskog seruma (Gibco BRL). Kulture su gajene na 37 oC, pri 5% CO2 i 100% vlažnosti. Za kontrolu rasra ne-neuronskih ćelija u podlogu su dodati 5-fluor-2'-deoksiuridin (75��M) i uridin (180 �M).
Tretman pomoću NGF i anti-NGF
Dva sata nakon zasejavanja u ploče, ćelije su tretirane rekombinantnim humanim �-NGF (Amgen), ili rekombinantim �-NGF pacova (R&D Systems, Minneapolis, MN) u koncentraciji od 10 ng/ml (0,38 nM). Pozitivne kontrole koje su sadržale serijska razblaženja anti-NGF antitela (R&D Systems) nanesene su na svaku ploču. Test antitela su dodata u deset koncentracija, upotrebom serijskih razblaženja u kojima je svaka koncentracija 3,61 puta manja od prethodne. Svi uzorci su razblaženi u potpunoj podlozi pre dodavanja kulturama. Inkubacija pre merenja ekspresije VR1 trajala je 40 časova.
Merenje ekspresije VR1 u neuronima DRG
Kulture su fiksirane 4% formaldehidom u Henksovom uravnoteženom rastvoru soli petnaest minuta, blokirane Superblokom (Pierce, Rockford, IL) i permeabilizovane pomoću 0,25% Nonidet P-40 (Sigma) u fiziološkom rastvoru puferisanom pomoću TrisHCl (Sigma) (TBS) jedan čas na sobnoj temperaturi. Kulture su isprane jednom u TBS koji sadrži 0,1% Tween 20 (Sigma) i inkubirane sa zečjim anti-VR1 IgG jedan i po čas na sobnoj temperaturi, nakon čega su inkubirane sa drugim, anti-zečjim antitelom obeleženim Eu (Wallac Oy, Turku, Finska) jedan čas na sobnoj temperaturi. Nakon svake inkubacije sa antitelima vršeno je ispiranje u TBS (3 x pet minuta, us sporo mućkanje). U kulture je dodat rastvor za pojačavanje (150 �l po polju, Wallac Oy). Signal fluorescencije je meren u fluorimetru sa praćenjem vremena (Wallac Oy). Ekspresija VR1 u uzorcima koji su tretirani modifikovanim peptidima određena je poređenjem sa standardnom krivom titracije NGF od 0 do 1000 ng/ml. Procenat inhibicije (u poređenju sa najvećom mogućom inhibicijom) dejstva NGF na ekspresiju VR1 u DRG neuronima određen je poređenjem sa kontrolama koje nisu bile izložene dejstvu NGF. Rezultati su dati u tabelama 2 i 5.
Ćelijske linije su označene kao #110 do #129. Antitela iz ćelijskih linija #119, #124 i #125 pokazala su izuzetno visoku aktivnost neutralizacije NGF (slika 1). Ćelijska linija #124 bila je roditeljska ćelijska linija, koja se još označava i kao 4D4. Ćelijske linije #119 i #125 bile su podklonovi 4D4 roditelja. Odgojen je još jedan dodatni uzorak iz originalne bočice u kojoj se nalazio hibridom #124 (4D4) i on je označen kao #167 (4D4).
Test neutralizacije NGF zasnovan na istim DRG neuronima, isti kao za predhodne uzorke, sproveden je i sa antitelima koja su dobijena iz hibridoma #167 (4D4). Antitelo #167 (4D4) pokazalo je visoku anti-NGF aktivnost sa IC50 vrednošću od 0,50 nM (slika 2), što je u saglasnosti sa aktivnostima uzoraka #119, #124 i #125. Aktivnosti ova 4 uzorka prikazane su u tabeli 2.
Tabela 2
Anti-hNGF aktivnost u DRG ćelijama uz upotrebu 0,38 nMhNGF
Šifra#
IC50
119 (iz 124)
<1,2nM
124 (roditelj)
< 0,57 nM
125 (iz 124)
<0,3nM
167 (iz istog uzorka kao i 124)* ;0,50 nM ;N-terminalno sekvenciranje i masena spektrometrija ;Prečišćena anti-NGF antitela iz hibridoma pripremljena su za sekvenciranje proteina i LC/MS analizu. Antitela su prečišćena iz kondicionirane podloge koncentrovanjem podloge pomoću Amicon centriprep-30 uređaja, sve dok zapremina nije pala ispod 15 ml. Jedno punjenje rProA smole (Pharmacia) isprano je 4 x u PBS, te je nakon poslednjeg ispiranja napravljena 50% smeša smole i PBS. Odgovarajuća količina rProA smole (približno 5 �g antitela po �l smole, ali ne manje od 50 �l smole) dodata je uzorku antitela, te je smeša inkubirana preko noći na 4 oC. Smeša At-smola je centrifugirana te je sakupljena nevezana frakcija. Nakon dodatka 0,5 ml PBS, i prebacivanja u 0,45 �m Spin-X (CoStar) kivetu uzorak je centrifugiran na 10000 rpm 3 minuta. Smola je potom isprana najmanje 3 puta sa po 0,5 ml PBS, a potom je dodat 0,1 M glicin (pH 2,7) u zapremini koja je 1,5 x veća od zapremine smole, smeša je inkubirana 10 minuta na sobnoj temperaturi nakon čega je usledilo još jedno centrifugiranje 3 minuta na 10000 rpm posle koga je sakupljen supernatant. Ovaj korak elucije ponovljen je još dva puta a potom je kombinovani supernatant neutralisan jednom dvadesetpetinom zapremine 1,0 M tris (pH 9,2). ;Nakon konačnog koraka filtracije kroz novu Spin-X kivetu (0,2 �m), antitelo je kvantifikovano korišćenjem standardnog Bredfordovog testa, uz upotrebu humanog IgG kao standarda, ili je, za veće uzorke, korišćena apsorbanca na 280 nm. Takođe je kroz gel propušteno po 2 �g svakog uzorka kao i 2 �g humanog IgG1,� (Sigma). Za masenu spektrometriju, po četiri mikrograma uzoraka je deglikozilovano, redukovano i naneseno na HPLC (HP1090) koja je povezana za Finigan LCQ maseni spektrometar. Laki lanac je odvojen od teškog lanca reverzno faznom HPLC. Laki lanci i teški lanci su takođe sakupljeni za analizu pomoću N-terminalnog sekvenciranja proteina. ;N-terminalne sekvence lakog lanca i teškog lanca uzorka anti-NGF #167 (4D4) antitela poklapale su se sa N-terminalnim sekvencama uzorka anti-NGF #119 (4D4) antitela. Uz to, izmerene mase antitela pokazivale su da su antitela izolovana iz hibridoma #119 i #167 ista. Izmerena, dekonvulisana masa (23096) lakog lanca anti-NGF #167 poklapala se sa izmerenom masom (23096) lakog lanca anti NGF At #119. ;Kloniranje lakih i teških lanaca anti-NGF antitela ;Hibridom koji je eksprimirao monoklonsko antitelo sa najjačim vezivanjem NGF, 4D4.D7, korišćen je kao izvor za izolovanje ukupnih RNK pomoću TRIzol® reagensa (Invitrogen). Prvi lanac cDNK sintetisan je pomoću prajmera nasumične sekvence sa adapterom za produžavanje (5'- GGC CGG ATA GGC CTC CAN NNN NNT-3') (sekvenca čiji je ID broj: 33), te je izvršen 5' RACE ("Rapid amplification of cDNA ends", brza amplifikacija krajeva cDNK) postupak pomoću GeneRacerTM kompleta (Invitrogen) prema uputstvima proizvođača. Kako bi se dobila potpuna cDNK koja kodira laki lanac, prajmer za reakciju ka napred bio je GeneRacerTM prajmer, dok je reverzni prajmer bio 5'-GGG GTC AGG CTG GAA CTG AGG-3' (sekvenca čiji je ID broj: 34). Za dobijanje cDNK koja kodira varijabilni region teškog lanca, prajmer za reakciju ka napred bio je GeneRacerTM prajmer, dok je reverzni prajmer bio 5'- TGA GGA CGC TGA CCA CAC G-3' (sekvenca čiji je ID broj: 35). Proizvodi RACE postupka klonirani su u pCR4-TOPO (Invitrogen) te su određene njihove sekvence. Za dobijanje prajmera za PCR amplifikaciju lanaca antitela potpune dužine upotrebljene su koncenzus sekvence. ;Za dobijanje cDNK koja kodira kapa laki lanac anti-NGF 4D4.D7, 5' prajmer za PCR kodirao je amino terminalni kraj signalne sekvence, restrikciono mesto XbaI enzima, optimizovanu Kozakovu sekvencu (5'-CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA CAT GAG GGT GCC CGC TCA GCT CCT GGG-3'; sekvenca čiji je ID broj: 36). 3' prajmer je kodirao karboksil kraj i terminacioni kodon, kao i SalI restrikciono mesto (5'-CTT GTC GAC TCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT C-3'; sekvenca čiji je ID broj: 37). Dobijeni fragment koji je proizvod PCR je prečišćen, hidrolizovan dejstvom XbaI i SalI enzima, a potom izolovan u gelu i vezan u sisarski ekspresioni vektor pDSR�20 (videti Međunarodnu prijavu, publikaciju br. WO 90/14363, koja je ovde inkorporirana po referenci za koju god svrhu da se koristi. pDSR�20 je dobijen supstitucijom nukleotida 2563 u pDSR�19 iz guanozina u adenozin pomoću mutageneze usmerene ka određenom mestu). ;Za dobijanje cDNK koja kodira teški lanac anti-NGF 4D4.D7 5' prajmer za PCR kodirao je amino terminalni kraj signalne sekvence, restrikciono mesto XbaI enzima, optimizovanu Kozakovu sekvencu (5'-CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA GTT GGG GCT GTG CTG GGT TTT CCT TGT T-3'; sekvenca čiji je ID broj: 38). 3' prajmer je kodirao karboksil kraj i terminacioni kodon, kao i SalI restrikciono mesto (5'-GCA TGT CGA CTC ATT TAC CCG GAG ACA GGG AGA G-3'; sekvenca čiji je ID broj: 39). Dobijeni proizvod PCR je prečišćen, hidrolizovan dejstvom XbaI i SalI enzima, a potom izolovan u gelu i vezan u pDSR�20 vektor. ;Izračunata masa (23099) DNK sekvence lakog lanca anti-NGF At 4D4 klona, koja je određena prevođenjem nukleotidne sekvence u predviđene aminokiseline i sabiranjem molekulskih masa aminokiselina, odgovarala je masi određenoj pomoću masene sprektrometrije. Izmerena, dekonvulisana masa (49479) teškog lanca anti-NGF At #167 odgovarala je izmerenoj masi (49484) teškog lanca anti-NGF At #119, kao i teoretskoj masi (49484) DNK sekvence teškog lanca anti-NGF At 4D4 klona (tabela 3), u okviru devijacije instrumenta. ;Podaci dobijeni N-terminalnim sekvenciranjem proteina i LC/MS potvrdili su da hibridom #119 eksprimira isto antitelo kao hibridom #167. Uz to, mase antitela izračunate na osnovu sekvence dodatno su potvrdila ovaj zaključak. ;Tabela 3 - Pregled rezultata dobijenih masenom spektrometrijom ;anti NGF At ;Izmerena masa At#167 ;Izmerena masa At#119 ;Teoretska masa izvedena iz DNK sekvence At 4D4 ;laki lanac ;23096 ;23096 ;23099 ;teški lanac ;49479 ;49484 ;49484 ;Primer 4: Ekspresija anti-NGF antitela u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO ćelijama) ;Stabilna ekspresija 4D4 anti-NGF mAt postignuta je kotransfekcijom 4D4-teški lanac/pDSR�19 IgG2 ili 4D4-teški lanac/pDSR�19 IgG1 i NGF-kapa/pDSR�19 plazmida u ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije) deficijentne dihidrofolat reduktazom (DHFR-) prilagođene podlozi bez seruma pomoću kalcijum fosfatnog postupka. Transficirane ćelije su selekcionisane u podlozi koja sadrži dijalizovani serum ali koja ne sadrži hipoksantin - timidin kako bi se obezbedio rast ćelija koje eksprimiraju DHFR enzim. Transficirani klonovi su ispitani korišćenjem testova kao što je ELISA kako bi se otkrila ekspresija 4D4-anti NGF mAt u kondicioniranoj podlozi. Klonovi sa najvećom ekspresijom podvrgnuti su sve većim koncentracijama metotreksata (MTX) kako bi se amplifikovala DHFR. Klonovi amplifikovani pomoću MTX ispitani su testovima kao što je ELISA kako bi se pronašao klon sa najvećom ekspresijom 4D4-anti NGF mAb u kondicioniranoj podlozi. Klonovi sa najvećom ekspresijom podvrgnuti su podkloniranju kako bi se dobila homogena populacija i stvorile banke ćelija. ;Rekombinantna anti-NGF antitela predmetnog pronalaska mogu da nastanu u ćelijama jajnika kineskog hrčka deficijentnim za DHFR prema istom protokolu opisanim predhodno za anti-NGF monoklonska antitela. DNK sekvence koje kodiraju potpuni teški lanac ili potpuni laki lanac svakog od anti-NGF antitela predmetnog pronalaska kloniraju se u ekspresione vektore. CHOd-ćelije se kotransficiraju ekspresionim vektorom koji je u stanju da eksprimira potpuni teški lanac i ekspresionim vektorom koji je u stanju da eksprimira potpuni laki lanac odgovarajućeg anti-NGF antitela. Na primer, kako bi se dobilo anti-NGF antitelo, ćelije se kotransficiraju vektorom koji je u stanju da eksprimira potpuni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao sekvenca čiji je ID broj: 40 i vektorom koji je u stanju da eksprimira potpuni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao sekvenca čiji je ID broj: 44. U tabeli 4 dat je pregled potpunih teških i lakih lanaca za 4D4 antitela koja imaju različite konstante regione teškog lanca IgG. ;Tabela 4 ;Antitelo ;Varijabilni region teškog lanca ;+ ;Konstantni region teškog lanca ;Potpun teški lanac ;4D4(IgG2) ;Sekvenca čiji je ID br: 10 + Sekvenca čiji je ID br: 4 ;Sekvenca čiji je ID br: 40 ;4D4(IgGl) ;Sekvenca čiji je ID br: 10 + Sekvenca čiji je ID br: 2 ;Sekvenca čiji je ID br: 41 ;Antitelo ;Varijabilni region teškog lanca ;+ ;Konstantni region teškog lanca ;Potpun teški lanac ;4D4(IgG4) ;Sekvenca čiji je ID br: 10 + Sekvenca čiji je ID br: 6 ;Sekvenca čiji je ID br: 42 ;4D4(IgG3) ;Sekvenca čiji je ID br: 10 + Sekvenca čiji je ID br: 26 ;Sekvenca čiji je ID br: 43 ;Antitelo ;Varijabilni region lakog lanca ;+ ;Konstantni region lakog lanca ;Potpun laki lanac ;4D4 ;Sekvenca čiji je ID br: 12 + Sekvenca čiji je ID br: 8 ;Sekvenca čiji je ID br: 44 ;Primer 5: Karakterizacija aktivnosti anti-NGF 4D4 antitela ;Prolazno eksprimirana anti-NGF 4D4 antitela, dobijena u ćelijama gajenim u trogrlim bocama za gajenje kulture ("spinner", S) ili u kotrljajućim bocama za gajenje kulture ("roller", R) ispitane su kako bi se potvrdila njihova sposobnost da neutrališu NGF u testu neutralizacije NGF zasnovanom na neuronu DRG, koji je izveden kao što je predhodno opisano (primer 3). ;NGF antitela eksprimirana su prolazno u 293 T ćelijama prilagođenim na rast u suspenziji bez seruma. Transfekcije su izvršene u kulturama od 500 ml ili 1 l. Ukratko, inokulum sa ćelijama (5,0 x 105 ćelija/ml x zapremina kulture) centrifugiran je na 2500 rpm 10 minuta na 4 oC kako bi se uklonila kondicionirana podloga. Ćelije su ponovo suspendovane u DMEM bez seruma, a potom ponovo centrifgirane na 2500 rpm 10 minuta na 4 oC. Nakon aspiracije rastvora kojim su ćelije isprane, ćelije su ponovo suspendovane u podlozi za rast (DMEM/F12 (3 : 1) + 1 x dodatak sa insulinom, transferinom i selenom + 1 x Pen Strep Glut + 2 mM L-glutamin + 20 mM HEPES + 0,01% Pluronic F68) u trogrlim bocama za gajenje kulture od 1 l ili 3 l. Kultura u trogrlim bocama je održavana na magnetnoj mešalici podešenoj na 125 rpm koja je postavljena u inkubatoru sa održavanjem vlažnosti, sa temperaturom podešenom na 37 oC i uz 5% CO2. Plazmidna DNK je kompleksirana za reagens za transfekciju u konusnoj kiveti od 50 ml. Kompleks DNK - reagens za transfekciju pripremljen je u 5% konačne zapremine kulture u DMEM bez seruma. 1 �g plazmidne DNK/ml kulture prvo je dodat u DMEM bez seruma, nakon čega je dodato 1 �l X-TremeGene RO-1539/ml kulture. Kompleksi su inkubirani na sobnoj temperaturi približno 30 minuta a potom dodati ćelijama u trogrlim bocama. Transfekcija/ekspresija vršena je 7 dana, nakon čega je kondicionirana podloga sakupljena centrifugiranjem na 4000 rpm 60 minuta na 4 oC. ;Za prolazne transfekcije u kotrljajućim bocama upotrebljene su 293T ćelije koje su gajene i održavane u DMEM kojoj je dodat 5% FBS + 1 x neesencijalnih aminokiselina + 1 x Pen Strep Glut + 1 x natrijum piruvata. Približno 4 do 5 x 107 293T ćelija zasejano je u kotrljajuće boce od 850 cm2 preko noći. Predhodno zasejane ćelije su sledećeg dana transficirane pomoću FuGene6 sredstva za transfekciju. Smeša DNK i reagensa za transfekciju pripremljena je u približno 6,75 ml DMEM bez seruma. Prvo je dodato 675 �l FuGene6 reagensa, nakon čega je dodato 112,5 �g plazmidne DNK. Kompleks je inkubiran 30 minuta na sobnoj temperaturi. Smeša je potom prebačena u kotrljajuću bocu. U kotrljajuću bocu uvedena je smeša gasa sa 5% CO2, boca je čvrsto zatvorena i ostavljena u inkubatoru na 37 oC na polici za kotrljanje koja se okreće pri 0,35 rpm. Transfekcija je vršena 24 časa, nakon čega je podloga zamenjena sa 100 ml DMEM + 1 x dodatak sa insulinom, transferinom i selenom + 1 x Pen Strep Glut + 1 x neesencijalnih aminokiselina + 1 x natrijum piruvata. Obično je sakupljano po 100 ml podloge nakon 48 časova iz svake kotrljajuće boce, po dva puta. Sakupljene kondicionirane podloge bez seruma su pripojene jedna drugoj i centrifugirane 30 minuta na 4000 rpm na 4 oC. ;I 4D4.IgG1 i 4D4.IgG2 pokazali su visoku aktivnost sa IC50 vrednostima od oko 0,14 nM do oko 0,2 nM prema humanom NGF (slika 2). Rezultati ispitivanja aktivnosti dati su u tabeli 5. Antitela su pokazala nisku aktivnost prema NGF pacova (slika 3). Rezultati podsećaju na aktivnost antitela testiranih neposredno iz hibridoma koji su predhodno opisani. ;Tabela 5 ;At ;IC50 prema hNGF (nM) ;IC50 prema rNGF (nM) ;4D4.IgGl.R ;0,1488 ;>34nM ;4D4.IgGl.S ;0,1587 ;>45nM ;4D4.IgG2.R ;0,2047 ;>59nM ;4D4.IgG2.S ;0,2063 ;>37nM ;hNGF = humani NGF, rNGF = NGF pacova, R = kultura u kotrljajućoj bočici, S - kultura u trogrloj boci ;Primer 6: Proizvodnja anti-NGF antitela ;Anti-NGF antitelo se proizvodi ekspresijom u klonalnoj liniji CHO ćelija. U svakom ciklusu proizvodnje, ćelije iz pojedinačne boce se odlede u podlozi za gajenje kulture bez seruma. Ćelije su prvo gajene u T bocama, nakon čega su prebačene u trogrle boce a potom su gajene u reaktorima od nerđajućeg čelika sve većih dimenzija, na kraju dostižući bioreaktore od 2000 l. Proizvodnja se odvija u bioreaktorima od 2000 l u postupku koji podrazumeva dodavanje hranljive podloge koja sadrži koncentrovane sastojke podloge kako bi se održao rast ćelija i vijabilnost kulture. Proizvodnja traje približno dve nedelje tokom kojih se anti-NGF antitela konstitutivno proizvode u ćelijama i luče u podlogu u kojoj kultura raste. ;U proizvodnom reaktoru održava se predhodno zadat pH, temperatura i koncentracija rastvorenog kiseonika: pH se kontroliše dodavanjem gasovitog ugljen dioksida i natrijum karbonata; koncentracija rastvorenog kiseonika kontroliše se preko protoka vazduha, azota i kiseonika. ;Na kraju proizvodnje, fermentaciona tečnost prebaci se u centrifugu sa serijom diskova te se supernatant kulture odvoji od ćelija. Koncentrat se dalje razbistrava kroz dubinski filter, a potom kroz filter od 0,2 �m. Razbistrena kondicionirana podloga se potom koncentruje ultrafiltracijom sa tangencijalnim protokom. Kondicionirana podloga koncentruje se 15 do 30 puta. Dobijena koncentrovana kondicionirana podloga se potom obrađuje prečišćavanjem, ili se zamrzava kako bi bila prečišćena kasnije. ;Primer 7: Ukrštena reaktivnost sa drugim neutrofinima ;4D4 antitela ispitana su na ukrštenu reaktivnost prema humanom NT3 ili humanom BDNF u različitim biotestovima, uključujući test preživljavanja DRG neurona za humani NT3 i test unosa DA u DA neuronima gajenim u kulturi za humani BDNF. ;Tretman DRG kultura NT3, anti-NT3 i anti-NGF antitelima ;Dva časa nakon zasejavanja, DRG ćelije (procedura izolovanja opisana je predhodno u primeru 3) tretirane su rekombinantnim hNT-3 100 ng/ml (3,8 nM). Serijska razblaženja anti-hNT3 antitela (R&D) korišćena su kao pozitivna kontrola. Nepoznati uzorci (uzorci anti-NGF At) dodati su u različitim koncentracijama sa 10 tačaka serijskih razblaženja koja se međusobno razlikuju po 3,16 puta. Svi uzorci razblaženi su u potpunoj podlozi pre dodavanja kulturama. ;Merenje ekspresije MAP2 u DRG neuronima ;Kulture su fiksirane 4% formaldehidom u Henksovom uravnoteženom rastvoru soli 15 minuta, blokirane pomoću Superblock (Pierce) 1 čas a potom permeabilizovane pomoću 0,25% Nonidet P-40 (Sigma) u fiziološkom rastvoru puferisanom Tris-HCl (Sigma) (TBS) 1 čas na sobnoj temperaturi (ST). Kulture su isprane jednom u TBS koji sadrži 0,1% Tween20 (Sigma) i inkubirane sa mišjim anti-MAP2 IgG (Chemicon, Temecula, CA) 1,5 čas na sobnoj temperaturi, nakon čega su inkubirane sa sekundarnim anti-mišjim antitelom obeleženim Eu (Wallac Oy, Turku, Finska) 1 čas na sobnoj temperaturi. Nakon svake inkubacije primenjeno je ispiranje u TBS (3 x 5 min uz blago mućkanje). Rastvor za pojačavanje (150 ml/polju, Wallac Oy) dodat je kulturama, te je meren signal fluorescencije u fluorimetru sa praćenjem vremena (Wallac Oy). ;Embrionska mezencefalična kultura ;Upotrebljeni su 19 dana stari (E19) embrioni Spargue-Dawley pacova (Jackson Labs). Ventralno tkivo srednjeg mozga obogaćeno dopaminergijskim neuronima uklonjeno je i prebačeno u hladan Dulbecco fiziološki rastvor puferisan fosfatom (DPBS), pH 7,4, bez Ca++ i Mg++ (Gibco). Fragmenti tkiva razdvojeni su u suspenziju pojedinačnih ćelija pomoću sistema razdvajanja sa papainom (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ). Ukratko, fragmenti tkiva su inkubirani u rastvoru za digestiju koji sadrži 20 jedinica/ml papaina u Erlovom uravnoteženom rastvoru soli (EBSS) na 37 oC, 50 min. Ćelije su razdvojene ponavljanim istiskivanjem kroz Pasterovu pipetu koja je ispolirana na vatri, u podlozi za razdvajanje koja se sastoji od MEM/Hamovog F12, 1 : 1, 1 mg/ml ovomukoidnog inhibitora i 1 mg/ml ovalbumina, kao i 0,005% dezoksiribonukleaze (DNaze). Razdvojene ćelije su istaložene centrifugiranjem na 200 x g 5 minuta, a potom ponovo suspendovane u EBSS koji sadrži 1 mg/ml ovomukoidnog inhibitora, 1 mg/ml ovalbumina i 0,005% DNaze. Suspenzija ćelija centrifugirana je kroz gradijentni rastvor koji sadrži 10 mg/ml ovomukoidnog inhibitora i 10 mg/ml ovalbumina na 200 x g 6 minuta, kako bi se uklonili ostaci ćelija, a potom proceđena kroz 25-�g Nitex najlonsku mrežu (Tetco, Inc.) kako bi se uklonile grudvice. Razdvojene ćelije su zasejane u ploče za gajenje kulture pri gustini od 100000/cm2. Ploče su predhodno presvučene poliornitinom 100 �g/ml (Sigma) i mišjim lamininom 1 �g/ml (GibcoBRL), kao što je predhodno opisano (Louis JC et al, J. Pharmacol. Exp. Ther. 1992; 262: 1274 - 1283.). Hranljiva podloga sastojala se od minimalne esencijalne podloge (MEM) i Hamovog F12, 1 : 1, 12% konjskog seruma (Gibco), 100 �g/ml transferina i 2,5 �g/ml insulina (Sigma). Kulture su gajene 6 dana na 37 oC, pri 5% CO2 i 100% vlažnosti. ;Tretman mezencefaličnih kultura BDNF, anti-BDNF ili anti-NGF antitelima ;2 časa nakon zasejavanja ćelijama je dodat BDNF pri koncentraciji od 10 ng/ml, nakon čega su dodate serijske koncentracije uzoraka anti-NGF At. Anti-BDNF antitelo (koje je proizvedeno od strane Amgen) upotrebljeno je kao pozitivna kontrola. ;Unos DA kod mezencefaličnih neurona ;Testovi unosa dopamina izvedeni su kao što je predhodno opisano (Friedman, L. & Mytilineou, C., Neuroscience Letters 1987; 79: 65 - 72). Šestog dana kulture su jedanput isprane predhodno zagrejanim Krebs-Ringerovim fosfatnim puferom (pH 7,4) koji sadrži 5,6 mM glukozu, 1,3 mM EDTA i 0,5 mM pargilin, inhibitor monoamin oksidaze. Kulture su potom inkubirane u puferu za unos koji sadrži 50 nM [3H]DA (NEN), 60 minuta na 37 oC. Unos je prekinut uklanjanjem pufera za unos, te su kulture isprane tri puta Krebs-Ringerovim fosfatnim puferom. Kako bi se oslobodio [3H]DA, ćelije su lizirane neposrednim dodavanjem tečnog koktela za scintilaciju, opticphase supermix (Wallac) u kulture. Radioaktivnost u ćelijskim lizatima je potom izmerena pomoću microbeta-plus scintilacionog brojača za tečnosti (Wallac, Inc.). Unos DA niskog afiniteta procenjen je dodavanjem 0,5 mM GBR12909, specifičnog inhibitora mesta za unos DA visokog afiniteta (Heikkila RE & Mazino L, European Journal of Pharmacology 1984; 103: 241 - 8) u pufer za unos, nakon čega je ova vrednost oduzeta od ukupne vrednosti unosa kako bi se dobila vrednost unosa DA visokog afiniteta. ;Tabela 6 ;Antitelo ;IC50 prema hNT-3 (nM) ;IC50 prema hBDNF (nM) ;4D4 (IgG2) ;> 13,75 ;> 13,75 ;Primer 8: Identifikacija epitopa za anti-NGF antitela ;Mapiranje epitopa ograničenom proteolizom ;Pet mikrograma (�g) NGF inkubirano je sa 4D4 (11 �g) 30 minuta na 4 oC u 0,1 M Tris puferu, pH 7,5. Kompleks je potom hidrolizovan dejstvom proteaze (subtilisin) 1 �g, na 37 oC tokom 1 i 2 časa. HPLC mape peptida su međusobno upoređene kako bi se pronašli peptidi koji su bili zaštićeni 4D4 antitelima. Ograničena proteoliza NGF ukazala je da je nekoliko glavnih peptida prvobitno oslobođeno iz NGF. Posebno značajni peptidi S18.3, S18.5 i S34 su dobijeni i zaštićeni antitelom od proteolize. Drugi vrhovi grafika nisu bili značajno formirani ili zaštićeni. Zaštićeni peptidi iz ova dva eksperimenta (digestija u trajanju od 1 i u trajanju od 2 časa) prikazani su u tabeli 7. ;Tabela 7 ;% zaštite ;1 čas digestije ;2 časa digestije ;S16.1 ;QAA (96 - 98) ;C-terminal ;— ;57 ;S18.3 ;FFETK (53 - 57) ;(Sekvenca čiji je ID br: 45) ;region petlje ;40 ;45 ;S18.5 ;SSSHPIFHR (l - 9) ;(Sekvenca čiji je ID br: 46) (HWNSY)*
(Sekvenca čiji je ID br: 47)
N-terminal
40
50
S34.4
NSVEKQYFFETK (46 - 57) (Sekvenca čiji je ID br: 48)
region petlje
69
38
Procenat zaštite izračunat je na osnovu visine vrha na grafiku koji odgovara datom peptidu. S18.5 je sadržao dva peptida, ali je samo jedan peptid (SSSHPIFHR; sekvenca čiji je ID br: 46) bio zaštićen 4D4 antitelom, obzirom da je drugi vrh (HWNSY; sekvenca čiji je ID br: 47) bio nepromenjen dodatkom 4D4 antitela, kao što je otkriveno na osnovu apsorbance na 280 nm. Peptid S18.3 bio je C-terminalni deo S34.4, oba su pripadala istom regionu petlje. N-terminalni kraj kao i centralni region petlje takođe su bili mogući epitopi.
Razdvajanje hidrolizovanih peptida pomoću Microcon kiveta
Materijal hidrolizovan subtilidinom (po 3 �g od svakog) inkubiran je sa aktivnim 4D4 antitelima i neaktivnim monoklonskim antitelom (#162) (8 �g) 30 minuta na 4 oC u 0,1 M Tris puferu, pH 7,5. Vezani/nevezani peptidi odvojeni su pomoću Microcon 10 (Millipore Corp., Bedford, Mass), te su obe frakcije (i vezana i nevezana) analizirane pomoću HPLC kako bi se pronašli peptidi vezani za antitela. Poređenjem sa HPLC nevezanih frakcija identifikovana su dva vrha koja su se izgubila nakon tretmana sa 4D4 antitelima i #162 i odvajanja pomoću Microcon kiveta, što je ukazivalo na vezane peptide. Peptidi koji su bili vezani za 4D4 bili su:
S1 (4.4) — SRKAVRR (113 - 119) (sekvenca čiji je ID br: 49), C-terminal; i
S2 (28.3) —EVMVL (35 - 39) (sekvenca čiji je ID br: 50), region petlje.
Uzorak NGF alternativno je hidrolizovan pomoću Lys-C (K) 24 časa. Cisteinski ostaci su redukovani i karboksimetilovani bez sredstva za denaturaciju. Uzorak je inkubiran sa monoklonskim antitelima 4D4 i AMG162, nakon čega je usledilo razdvajanje u Microcon kivetama. Vezane i nevezane frakcije su analizirane pomoću reverzno-fazne HPLC. Kao K-peptidi koji vezuju antitela identifikovana su samo dva peptida, kao što je prikazano ispod. Izračunata masa za peptide, određena pomoću analize sekvence poklopila se sa rezultatima masene spektrometrije. Kao što je naznačeno ispod, peptidi su mapirali u N-terminalnom i C-terminalnom regionu.
K1 (37.6) — SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDK (sekvenca čiji je ID br: 51) Izračunata masa = 2821; Pronađena masa = 2828,2; N-terminal
K2 (39.5) — QAAWRFIRIDTACVCVLSRK (sekvenca čiji je ID br: 52)
Izračunata masa = 2452; Pronađena masa = 2459,5; C-terminal
Ovi eksperimenti mapiranja epitopa ukazali su da su najmanje tri regiona mogući epitopi za 4D4 antitela, uključujući N-terminalni region (1 - 9), unutrašnji region (46 - 57) i C-terminalni region (96 - 98). Uz to, hidroliza pomoću AspN pokazala je da je fragment koji se sastoji od — SSHPIFHRGEFSVC — (sekvenca čiji je ID br: 53) bio zaštićen 4D4 antitelom, dok je hidroliza dejstvom tripsina pokazala da fragment koji se sastoji od — SSHPIFHR — (sekvenca čiji je ID br: 54) nije bio zaštićen 4D4 antitelom. Staoga, u N-terminalnom kraju, sekvenca GEFSVC (sekvenca čiji je ID br: 55) najbitnija je za vezivanje za 4D4 antitela.
Kako bi se jasnije definisao epitop za anti-NGF antitelo 4D4.IgG1, sintetički je dobijeno ukupno 23 peptida, korišćenjem standardnih tehnika, zasnovanih na sekvenci ukupnog humanog zrelog NGF (hNGF) (tabela 8). Peptidi bili dugački 15 aminokiselinskih ostataka, a preklapali su se po 10 aminokiselinskih ostataka, pri čemu je na njihove C-terminalne krajeve dodavan cisteinski rep kako bi se omogućila konjugacija za matriks. U eksperimentu mapiranja korišćen je humano anti-hNGF At 4D4.IgG1, koje je predhodno opisano.
Tabela 8
Br. peptida
Sekvenca
ID broj sekvence
33582-27-01
SSSHPIFHRGEFSVC (1 - 15)
56
33582-27-02
IFHRGEFSVADSVSVC (6 - 20)
57
33582-27-03
EFSVADSVSVWVGDKC (11 - 25)
58
33582-27-04
DSVSVWVGDKTTATDC (16 - 30)
59
33582-27-05
WVGDKTTATDIKGKEC (21 - 35)
60
33582-27-06
TTATDIKGKEVMVLGC (26 - 40)
61
33582-27-07
IKGKEVMVLGEVNIN (31 - 45)
62
33582-27-08
VMVLGEVNINNSVFKC (36 - 50)
63
33582-27-09
EVNINNSVFKQYFFEC (41 - 55)
64
33582-27-10
NSVFKQYFFETKARDC (46 - 60)
65
33582-27-11
QYFFETKARDPNPVDC (51 - 65)
66
33582-27-12
TKARDPNPVDSGARDC (56 - 70)
67
33582-27-13
PNPVDSGARDIDSKHC (61 - 75)
68
33582-27-14
SGARDIDSKHWNSYC (66 - 80)
69
33582-27-15
IDSKHWNSYATTTHTC (71 - 85)
70
33582-27-16
WNSYATTTHTFVKALC (76 - 90)
71
33582-27-17
TTTHTFVKALTMDGKC (81 - 95)
72
33582-27-18
FVKALTMDGKQAAWRC (86 - 100)
73
33582-27-19
TMDGKQAAWRFIRIDC (91 - 105)
74
33582-27-20
QAAWRFIRIDTAAVC (96 - 110)
75
33582-27-21
FIRIDTAAVAVLSRKC (101 - 115)
76
33582-27-22
TAAVAVLSRKAVRRAC (106 - 120)
77
33582-27-23
CAAVAVLSRKAVRRA (107 - 120)
78
Fragmenti humanog NGF peptida razblaženi su u PBS pomoću 5% DMSO, 1 mM EDTA, pH 6,23. Konačna koncentracija peptida normalizovana je na istu molarnu koncentraciju koja je 55 �M (približno 100 �g/ml). Peptidi su inkubirani u mikrotitar pločama sa po 96 polja aktiviranim pomoću Reacti-Bind Maleimide (Pierce kataloški br. 15150), 100 �l/polju, 2 časa na sobnoj temperaturi, a potom preko noći na 4 oC uz mućkanje. Kao pozitivna kontrola korišćen je humani NGF (100 �g/ml). Ploče su isprane puferom za ispiranje (KPL) i blokirane 0,2% nemasnim suvim mlekom (u PBS-EDTA puferu, pH 6,23) 2 časa na sobnoj temperaturi, nakon čega su dodatno blokirane 1 čas 5% BSA. Ploče su potom inkubirane sa humanim anti-NGF antitelom u raznim koncentracijama (0, 3, 10, 30 �g/ml), a nakon toga i 2 časa sa kozjim anti-hFc At-HRP (KPL). Signal je dobijen pomoću TMB supstrata i očitavan na 450 nm, nakon dodavanja rastvora za zaustavljanje reakcije (KPL).
Među 23 peptida humanog NGF, pojavila su se najmanje 4 velika vrha koja ukazuju na vezivanje 4D4. Ovi vrhovi na grafiku odgovarali su sledećim peptidima: peptid br. 1 (sekvenca čiji je ID br: 56), SSSHPIFHRGEFSVC (1 - 15); peptid br. 10 (sekvenca čiji je ID br: 65), NSVFKQYFFETKARD (46 - 60); peptidi br. 16 - 17 (sekvenca čiji je ID br: 71 - sekvenca čiji je ID br: 72), WNSYATTTHTFVKAL — (76 - 95); i peptidi br. 18 - 21 (sekvenca čiji je ID br: 73 - sekvenca čiji je ID br: 76), TTTHT — LSRKC (100 - 115).
Četiri vrha vezivanja 4D4 mapirala su na N-terminalnom kraju, C-terminalnom kraju, unutrašnjim domenima kao i u petljama L2 i L4 u NGF kao što je opisan u Weismann et al. (1999, Nature 401: 184 - 8). Rezultati su prikazani u tabeli 9.
Tabela 9
hNGF epitopi
N-terminalni kraj
L2
Interni
L4
Interni
C-terminalni kraj
Br. peptida
peptid br. 1 (sekvenca čiji je ID br: 56), SSSHPI—,
1 - 15
peptid br. 10 (sekvenca čiji je ID br: 65), NSVFKQ—, 46 - 60
peptid br. 16 (sekvenca čiji je ID br: 71), WNSYA—, 76 - 90
peptid br. 17 (sekvenca čiji je ID br: 72), TMDGKQ--,
81 - 95
peptid br.19 (sekvenca čiji je ID br: 74), TMDGK--,
91 - 105
peptidi br. 20 - 21 (sekvenca čiji je ID br: 75 -sekvenca čiji je ID br: 76), QAAWR—,
96 - 115
Signal vezivanja At
+++
+
++
++
+++
++
Wiesmann et al., razrešili su kristalnu strukturu hNGF vezanog za trkA receptor, koja je pokazala da je N-terminalni kraj (ostaci 2 do 9) važan za vezivanje receptora (Wiesmann et al, 1999, Nature 401: 184 - 8). Ostaci ovog dela NGF takođe su važni za specifičnost prema trkA u odnosu na trkB ili trkC receptore. Antitelo 4D4 selektivno je za humani NGF u odnosu na mišji NGF ili NGF pacova, kao i BDNF i NT-3, najverovatnije usled razlika u N-terminalnim krajevima humanog NGF i drugih neurotrofina.
Antitelo 4D4 se vezuje za peptid br. 10 (sekvenca čiji je ID br: 65) (NSFVK--, 46 - 60) i peptid br. 17 (sekvenca čiji je ID br: 72) (TTTHTFVKALTMDGKC, 81 - 95), što odgovara, respektivno, petljama L2 i L4, koje predstavljaju dva od sedam jasno određenih delova čija je raznolikost sekvence među neurotrofinima veća od prosečne. Eksperimenti zamenjivanja ovih delova između NGF i BDNF pokazali su da su L2 i L4 važne za biološku aktivnost NGF. Štaviše, supstitucija pet NT3 ostataka u petljama L2 i L4 ostacima NGF dovela je do aktivnosti koja je slična aktivnosti NGF iako je NT3 aktivnost zadržana. Stoga, L2 i L4 su verovatno regioni na NGF za koje 4D4 antitelo selektivno vezuje u odnosu na BDNF ili NT-3.
Antitelo 4D4 se takođe vezuje i za peptid br. 16 (sekvenca čiji je ID br: 71) (WNSYATTTHTFVKAL, 76 - 90), koji odgovara unutrašnjem domenu kristalne strukture NGF. Ovaj region humanog NGF je 100% homolog mišjem NGF, ali je različit od ostalih neurotrofina. 4D4 je pokazao mnogo slabiju aktivnost prema mišjem NGF ili NGF pacova u poređenju sa njegovom aktivnošću prema humanom NGF. Prema tome, vezivanje za ovaj deo NGF najverovatnije nije od kritičnog značaja za specifičnost u odnosu na vrste, ali jeste važno za selektivnost između neurotrofina.
Antitelo 4D4 se takođe vezuje za C-terminalni kraj NGF (peptidi br. 19 do 21, (sekvenca čiji je ID br: 74 do sekvence čiji je ID br: 76) TMDGK -- LSRKC, 91 do 115), koji je jedan od delova humanog NGF na osnovu kojeg se NGF razlikuje od drugih neurotrofina (BDNF i NT3). Vezivanje za ovaj region pomaže da se objasni zašto 4D4 nije aktivan prema drugim neurotrofinima. Štaviše, razlika između C-terminalnog kraja humanog NGF i mišjeg NGF je u jednom aminokiselinskom ostatku, što nagoveštava da bi ovaj jedan aminokiselinski ostatak mogao da bude jedan od razloga zašto je 4D4 selektivan za humani NGF u odnosu na NGF miša/pacova, slično kao N-terminalni kraj na kojem se ove razlike uočavaju.
Konačno, 4D4 interaguje i sa unutrašnjim domenom opisanim peptidom br. 10 (sekvenca čiji je ID br: 65) (-- KARDC, 50 do 60) humanog NGF, koji je važan deo za vezivanje NGF sa većim afinitetom za trkA u odnosu na trkB ili trkC, čime se dalje objašnjava njegova selektivna aktivnost neutralizacije prema humanom NGF.
Primer 9: Merenje afiniteta monoklonskih antitela pomoću KinExA
Vezivanje 4D4 At (38859 do 80) za huNGF (29714 do 91) ispitano je na KinExA. Ukratko, Reacti-Gel 6x (Pierce) predhodno su obloženi huNGF i blokirani pomoću BSA. 10 pM i 30 pM uzorci 4D4 At inkubirani su sa različitim koncentracijama huNGF (Amgen) na sobnoj temperaturi 8 časova pre nego što su propušteni kroz granule obložene huNGF. Količina antitela vezanih za granule određena je fluorescentno (Cy5) obeleženim kozjim anti-humani-IgG antitelom (Jackson Immuno Research). Signal vezivanja bio je proporcionalan koncentraciji slobodnog antitela u ravnotežnim uslovima. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) dobijena je nelinearnom regresijom kompeticionih krivih, korišćenjem modela homogenog vezivanja za jedno mesto sa dvostrukim krivim (KinExTM program). KD bila je oko 4 pM za vezivanje 4D4 At za huNGF.
Primer 10: Identifikacija dodatnih anti-NGF antitela
Dodatna anti-NGF antitela (označena kao 14D10, 6G9, 7H2, 14F11 i 4G6) dobijena i identifikovana kao što je predhodno opisao u primerima 2 i 3, izabrana su za dalja istraživanja. Ukratko, aktivnost vezivanja ispitana je u kondicioniranoj podlozi. Antitela iz podloge su prečišćena i sekvencirana. Predviđena molekulska masa upoređena je sa podacima dobijenim masenom spektrometrijom antitela iz kondicionirane podloge. Antitela su klonirana. Dva od ovih klonova su eksprimirana u CHO ćelijama, te je njihova aktivnost ispitana kao što je predhodno opisano. Rezultati su prikazani u tabeli 10.
Tabela 10
klon
IC50 prema hNGF (nM)
IC50 prema rNGF (nM)
Primedbe
Molekulski klon
IC50 prema hNGF (nM)
IC50 prema rNGF (nM)
7H2
3,294
1,748
kloniran
7H2-rFc
0,963
0,792
6H9
3,172
1,699
kloniran
6H9-rFc
13,93
0,653
14D10
0,3918
>13
kloniran
14D11
0,2803
>20
kloniran
4G6
0,414
>10
kloniran
Sekvence varijabilnih regiona lakog i teškog lanca ovih antitela su potom upoređene sa sekvencom 4D4 antitela, kao i međusobno (slike 5 i 6). U tabeli 11 dat je procenat homologije varijabilnih regiona teških lanaca identifikovan na ovaj način. U tabeli 12 dat je procenat homologije varijabilnih regiona lakih lanaca. Uz to, procenat homologije CDR regiona različitih antitela prikazan je na slikama 5 do 10.
Tabela 11
4D4 VH
14D10 VH
6H9 VH
7H2 VH
14D11 VH
4G6 VH
4D4 VH
100%
70,9%
70,1%
75,6%
47,2.%
73,4%
14D10 VH
100%
95,3%
85%
54,3%
81,1%
6H9 VH
100%
86,6%
54,3%
81,1%
7H2 VH
100%
51,2%
79,8%
14D11 VH
100%
56,8%
4G6 VH
100%
Tabela 12
V4D4 VK
14D11 LC
4G6a LC
4G6b LC
4G6c LC
14D10 LC
6H9 LC
4G6d LC
7H2 LC
4G6e
V4D4 VK
100%
89%
91%
72%
74%
69%
71%
71%
70%
73%
14D11 LC
100%
94%
68%
71%
67%
68%
68%
68%
70%
4G6a LC
100%
69%
74%
68%
70%
70%
69%
71%
4G6b LC
100%
87%
83%
86%
86%
86%
96%
4G6c LC
100%
91%
94%
94%
94%
91%
14D10 LC
100%
91%
94%
94%
86%
6H9 LC
100%
99%
98%
89%
4G6d LC
100%
99%
89%
7H2 LC
100%
4G6e
100%
Treba da bude jasno da predhodno izlaganje stavlja naglasak na određena specifična rešenja predmetnog pronalaska i da sve modifikacije ili alternative koje su im ekvivalentne podpadaju pod duh i obim zaštite predmetnog pronalaska navedenog u pridodatim patentnim zahtevima.

Claims (94)

1. Izolovano humano antitelo koje se specifično vezuje za NGF, naznačeno time što to antitelo sadrži teški lanac koji ima varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca gde varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% identičnosti sekvence kao aminokiselinska sekvenca koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 10, ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
2. Antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time što varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sekvence kao aminokiselinska sekvenca koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 12, ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
3. Antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time što laki lanac sadrži CDR1 humanog lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85% identična aminokiselinskoj sekvenci koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 24, ili njegov antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
4. Antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time što laki lanac sadrži CDR3 humanog lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85% identična aminokiselinskoj sekvenci koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 16, ili njegov antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
5. Antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time što teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 10, ili njegov antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
6. Antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time što teški lanac sadrži CDR2 humanog teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična aminokiselinskoj sekvenci koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 18, ili njegov antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
7. Antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time što sadrži: a) teški lanac koji ima varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 10, ili njegov antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, kao i laki lanac koji ima varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 12, ili njegov antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment; b) teški lanac koji ima varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 14, ili njegov antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, kao i laki lanac koji ima varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 16, ili njegov antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment; c) teški lanac koji ima varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 18, ili njegov antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, kao i laki lanac koji ima varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 16, ili njegov antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment; ili d) teški lanac koji ima varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 22, ili njegov antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, kao i laki lanac koji ima varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 16, ili njegov antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
8. Antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time što teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 10, ili njegov antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, a laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 12, ili njegov antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
9. Antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time što teški lanac sadrži varijabilni region i konstantni region, a gde varijabilni region sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 10, ili njen antigen-vezujući ili imunogeni fragment.
10. Antitelo prema zahtevu 9, naznačeno time što teški lanac sadrži bilo koju od aminokiselinskih sekvenci datih kao sekvenca čiji je ID broj: 14, sekvenca čiji je ID broj: 18, sekvenca čiji je ID broj: 22, ili njihovih antigen-vezujućih ili imunogenih fragmenata.
11. Antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time što laki lanac sadrži varijabilni region i konstantni region, a gde varijabilni region sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 12, ili njen antigen-vezujući ili imunogeni fragment.
12. Antitelo prema zahtevu 11, naznačeno time što laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 16, ili njen antigen-vezujući ili imunogeni fragment.
13. Antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time što sadrži: a) regione okvira humanog teškog lanca, CDR1 region humanog teškog lanca, CDR2 region humanog teškog lanca i CDR3 region humanog teškog lanca, gde je CDR3 region humanog teškog lanca onaj CDR3 region humanog teškog lanca koji je prikazan kao sekvenca čiji je ID broj: 14; i b) regione okvira humanog lakog lanca, CDR1 region humanog lakog lanca, CDR2 region humanog lakog lanca i CDR3 region humanog lakog lanca, gde je CDR3 region humanog lakog lanca onaj CDR3 region humanog lakog lanca koji je prikazan kao sekvenca čiji je ID broj: 16.
14. Izolovano humano antitelo prema zahtevu 13, naznačeno time što je CDR2 region humanog teškog lanca onaj CDR2 region humanog teškog lanca koji je dat kao sekvenca čiji je ID broj: 18, a CDR2 region humanog lakog lanca onaj CDR2 region humanog lakog lanca koji je dat kao sekvenca čiji je ID broj: 20.
15. Izolovano humano antitelo prema zahtevu 13, naznačeno time što je CDR1 region humanog teškog lanca CDR1 region teškog lanca NGF koji je dat kao sekvenca čiji je ID broj: 22, a CDR1 region humanog lakog lanca onaj CDR1 region lakog lanca koji je dat kao sekvenca čiji je ID broj: 24.
16. Antitelo prema zahtevu 13, naznačeno time što to antitelo disosuje od polipeptida humanog NGF sa KD od oko 1 x 10-9 ili manjom i neutrališe bioaktivnost humanog NGF u standardnom in vitro testu sa IC50 od oko 1 x 10-8 M ili manjom.
17. Antitelo prema zahtevu 16, naznačeno time što to antitelo disosuje od polipeptida humanog NGF sa KD od oko 1 x 10-10 ili manjom i neutrališe bioaktivnost humanog NGF u standardnom in vitro testu sa IC50 od oko 1 x 10-9 M ili manjom.
18. Antitelo prema zahtevu 17, naznačeno time što to antitelo disosuje od polipeptida humanog NGF sa KD od oko 1 x 10-11 ili manjom i neutrališe bioaktivnost humanog NGF u standardnom in vitro testu sa IC50 od oko 0,2 x 10-9 M ili manjom.
19. Antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time što su teški lanac i laki lanac povezani fleksibilnim povezujućim regionom kako bi se dobilo jednolančano antitelo.
20. Antitelo prema zahtevu 19, naznačeno time što je jednolančano Fv antitelo.
21. Antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time što je Fab antitelo.
22. Antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time što je Fab' antitelo.
23. Antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time što je (Fab')2 antitelo.
24. Antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time što je to antitelo potpuno humano antitelo.
25. Antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time što to antitelo inhibira NGF signalizaciju.
26. Postupak za lečenje stanja prouzrokovanog povećanom ekspresijom NGF ili povišenom osetljivošću na NGF kod pacijenta, naznačen time što podrazumeva primenu farmaceutski delotvorne količine antitela iz zahteva 25 kod pacijenta.
27. Postupak prema zahtevu 26, naznačen time što je dato stanje akutni bol, dentalni bol, bol usled traume, hirurški bol, bol nakon amputacije ili apscesa, kauzalgija, demijelizacione bolesti, neuralgije trigeminusa, kancer, hronični alkoholizam, moždani udar, sindrom talamičkog bola, šećerna bolest, sindrom stečene imunodeficijencije (HIV bolest), dejstvo toksina i hemoterapije, obična glavobolja, migrena, serijska glavobolja, vaskularni i nevaskularni sindromi, tenziona glavobolja, opšte zapaljenje, artritis, reumatske bolesti, lupus, osteoartritis, fibromijalgija, inflamatorni poremećaji creva, sindrom iritabilnih creva, inflamatorni poremećaji očiju, inflamatorni poremećaji mokraćne bešike ili poremećaj nestabilne mok. bešike, psorijaza, stanja na koži sa inflamatornim komponentama, opekotine od Sunca, karditis, dermatitis, miozitis, neuritis, kolagena vaskularna oboljenja, hronična inflamatorna stanja, bol kod inflamacije i pridružena hiperalgezija i alodinija, neuropatski bol i pridružena hiperalgezija ili alodinija, bol kod dijabetične neuropatije, kauzalgija, bol posredovan simpatetičkim vlaknima, deaferentacioni sindromi, astma, oštećenje ili disfunkcija epitelnog tkiva, herpes simpleks infekcija, poremećaji visceralnog motiliteta u respiratornom, genitourinarnom, gastrointestinalnom ili vaskularnom traktu, rane, opekotine, alergijske kožne reakcije, pruritus, vitiligo, opšti gastrointestinalni poremećaji, kolitis, gastrični ulkus, duodenalni ulkusi, vazomotorni ili alergijski rinitis, ili bronhijalni poremećaji, dismenoreja, dispepsija, gastroezofagealni refluks, pankreatitis ili visceralgija.
28. Farmaceutski preparat naznačen time što sadrži farmaceutski prihvatljiv nosilac i terapeutski delotvornu količinu antitela iz zahteva 25.
29. Postupak lečenja stanja izazvanog povećanom ekspresijom NGF ili povišenom osetljivošću na NGF kod pacijenta, naznačen time što podrazumeva primenu farmaceutskog preparata iz zahteva 28 kod pacijenta.
30. Postupak za detekciju NGF u biološkom uzorku naznačen time što podrazumeva: a) dovođenje uzorka u dodir sa antitelom iz zahteva 1, pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje antitela za NGF; i b) merenje nivoa vezanog antitela u uzorku.
31. Izolovano humano antitelo koje se specifično vezuje za faktor rasta nerva, naznačeno time što sadrži teški lanac i laki lanac, gde teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična bilo kojoj od sekvenci koje su date kao sekvenca čiji je ID broj: 10, sekvenca čiji je ID broj: 79, sekvenca čiji je ID broj: 81, sekvenca čiji je ID broj: 83, sekvenca čiji je ID broj: 85 ili sekvenca čiji je ID broj: 87, ili njegov antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
32. Antitelo prema zahtevu 31, naznačeno time što teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 91% identična bilo kojoj od aminokiselinskih sekvenci koje su predstavljene kao sekvenca čiji je ID broj: 81, sekvenca čiji je ID broj: 83, sekvenca čiji je ID broj: 85, sekvenca čiji je ID broj: 87 ili sekvenca čiji je ID broj: 79, ili njegov antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
33. Izolovano humano antitelo koje se specifično vezuje za NGF, naznačeno time što sadrži teški lanac i laki lanac, gde laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85% identična bilo kojoj od sekvenci koje su date kao sekvenca čiji je ID broj: 12, sekvenca čiji je ID broj: 80, sekvenca čiji je ID broj: 82, sekvenca čiji je ID broj: 84, sekvenca čiji je ID broj: 86, sekvenca čiji je ID broj: 88, sekvenca čiji je ID broj: 89, sekvenca čiji je ID broj: 90, sekvenca čiji je ID broj: 91 ili sekvenca čiji je ID broj: 131, ili njegov antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
34. Izolovano humano antitelo prema zahtevu 33, naznačeno time što laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 86% identična bilo kojoj od aminokiselinskih sekvenci koje su date kao sekvenca čiji je ID broj: 12, sekvenca čiji je ID broj: 80, sekvenca čiji je ID broj: 88, sekvenca čiji je ID broj: 89, sekvenca čiji je ID broj: 90, sekvenca čiji je ID broj: 91, sekvenca čiji je ID broj: 82, sekvenca čiji je ID broj: 84, sekvenca čiji je ID broj: 86 ili sekvenca čiji je ID broj: 131, ili njegov antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
35. Antitelo prema zahtevu 33, naznačeno time što laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je: a) najmanje 89% ili 94% identična aminokiselinskoj sekvenci koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 80, ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment; b) najmanje 91% ili 94% identična aminokiselinskoj sekvenci koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 88, ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment; c) najmanje 86% ili 87% identična aminokiselinskoj sekvenci koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 89, ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment; d) najmanje 87%, 91% ili 94% identična aminokiselinskoj sekvenci koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 90, ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment; e) najmanje 86%, 94%, 96% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 91, ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment; f) najmanje 91%, 95% ili 96% identična aminokiselinskoj sekvenci koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 82, ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment; g) najmanje 86%, 94%, 95%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 84, ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment; h) najmanje 86%, 94%, 95%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 86, ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment; ili i) najmanje 86%, 89%, 91%, ili 96% identična aminokiselinskoj sekvenci koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 131, ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
36. Izolovano humano antitelo koje se specifično vezuje za NGF, naznačeno time što sadrži teški lanac i laki lanac, gde teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična bilo kojoj od aminokiselinskih sekvenci koje su date kao sekvenca čiji je ID broj: 14, sekvenca čiji je ID broj: 18, sekvenca čiji je ID broj: 22, sekvenca čiji je ID broj: 92, sekvenca čiji je ID broj: 93, sekvenca čiji je ID broj: 94, sekvenca čiji je ID broj: 98, sekvenca čiji je ID broj: 99, sekvenca čiji je ID broj: 100, sekvenca čiji je ID broj: 104, sekvenca čiji je ID broj: 105, sekvenca čiji je ID broj: 106, sekvenca čiji je ID broj: 110, sekvenca čiji je ID broj: 111, sekvenca čiji je ID broj: 112, sekvenca čiji je ID broj: 116, sekvenca čiji je ID broj: 117 ili sekvenca čiji je ID broj: 118, ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
37. Izolovano humano antitelo prema zahtevu 36, naznačeno time što teški lanac sadrži CDR2 humanog teškog laca, gde je taj CDR2 humanog teškog lanca aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 81% identična aminokiselinskoj sekvenci koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 99, sekvenca čiji je ID broj: 106, sekvenca čiji je ID broj: 117, sekvenca čiji je ID broj: 111 ili njegov antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
38. Izolovano humano antitelo koje se specifično vezuje za NGF, naznačeno time što sadrži teški lanac i laki lanac, gde laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85% identična bilo kojoj od aminokiselinskih sekvenci koje su date kao sekvenca čiji je ID broj: 16, sekvenca čiji je ID broj: 20, sekvenca čiji je ID broj: 24, sekvenca čiji je ID broj: 95, sekvenca čiji je ID broj: 96, sekvenca čiji je ID broj: 97, sekvenca čiji je ID broj: 101, sekvenca čiji je ID broj: 102, sekvenca čiji je ID broj: 103, sekvenca čiji je ID broj: 107, sekvenca čiji je ID broj: 108, sekvenca čiji je ID broj: 109, sekvenca čiji je ID broj: 113, sekvenca čiji je ID broj: 114, sekvenca čiji je ID broj: 115 ili bilo kojoj od aminokiselinskih sekvenci koje su date kao sekvenca čiji je ID broj od 119 do 134, ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
39. Izolovano humano antitelo prema zahtevu 38, naznačeno time što sadrži CDR1 humanog lakog laca, gde je taj CDR1 aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 86% identična aminokiselinskoj sekvenci koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 101, sekvenca čiji je ID broj: 95, sekvenca čiji je ID broj: 119, sekvenca čiji je ID broj: 122, sekvenca čiji je ID broj: 125, sekvenca čiji je ID broj: 107, sekvenca čiji je ID broj: 113 ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
40. Izolovano humano antitelo prema zahtevu 38, naznačeno time što sadrži CDR3 humanog lakog lanca, gde je taj CDR3 aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 86% identična aminokiselinskoj sekvenci koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 103, sekvenca čiji je ID broj: 97, sekvenca čiji je ID broj: 121, sekvenca čiji je ID broj: 127, sekvenca čiji je ID broj: 130, sekvenca čiji je ID broj: 109, sekvenca čiji je ID broj: 115, sekvenca čiji je ID broj: 134 ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
41. Izolovano humano antitelo koje se specifično vezuje za NGF, naznačeno time što sadrži CDR3 koji sadži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe sekvenci koja se sastoji od sekvence čiji je ID broj: 14, sekvence čiji je ID broj: 16, sekvence čiji je ID broj: 94, sekvence čiji je ID broj: 97, sekvence čiji je ID broj: 100, sekvence čiji je ID broj: 103, sekvence čiji je ID broj: 106, sekvence čiji je ID broj: 109, sekvence čiji je ID broj: 112, sekvence čiji je ID broj: 115, sekvence čiji je ID broj: 118, sekvence čiji je ID broj: 121, sekvence čiji je ID broj: 124, sekvence čiji je ID broj: 127, sekvence čiji je ID broj: 130, sekvence čiji je ID broj: 134 i njihovih varijanti, gde varijanta podrazumeva ne više od jedne aminokiselinske supstitucije, insercije ili delecije.
42. Izolovano humano antitelo koje se specifično vezuje za NGF, naznačeno time što sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična sekvenci izabranoj iz grupe sekvenci koja se sastoji od sekvence čiji je ID broj: 10, sekvence čiji je ID broj: 12, sekvence čiji je ID broj: 14, sekvence čiji je ID broj: 16, sekvence čiji je ID broj: 18, sekvence čiji je ID broj: 20 i sekvence čiji je ID broj: 22 i njihovih varijanti, gde varijanta podrazumeva ne više od jedne aminokiselinske supstitucije, insercije ili delecije.
43. Antitelo prema zahtevu 31, 33, 36, 38, 41 ili 42, naznačeno time što su teški lanac i laki lanac povezani fleksibilnim povezujućim regionom kako bi se dobilo jednolančano antitelo.
44. Antitelo prema zahtevu 43, naznačeno time što je jednolančano Fv antitelo.
45. Antitelo prema zahtevu 31, 33, 36, 38, 41 ili 42, naznačeno time što je Fab antitelo.
46. Antitelo prema zahtevu 31, 33, 36, 38, 41 ili 42, naznačeno time što je Fab' antitelo.
47. Antitelo prema zahtevu 31, 33, 36, 38, 41 ili 42, naznačeno time što je (Fab')2 antitelo.
48. Antitelo prema zahtevu 31, 33, 36, 38, 41 ili 42, naznačeno time što je to antitelo potpuno humano antitelo.
49. Antitelo prema zahtevu 31, 33, 36, 38, 41 ili 42, naznačeno time što to antitelo inhibira NGF signalizaciju.
50. Postupak lečenja stanja izazvanog povećanom ekspresijom NGF ili povišenom osetljivošću na NGF kod pacijenta naznačen time što podrazumeva primenu farmaceutski delotvorne količine antitela iz zahteva 49 kod pacijenta.
51. Postupak prema zahtevu 50, naznačen time što je dato stanje akutni bol, dentalni bol, bol usled traume, hirurški bol, bol nakon amputacije ili apscesa, kauzalgija, demijelizacione bolesti, neuralgije trigeminusa, kancer, hronični alkoholizam, moždani udar, sindrom talamičkog bola, šećerna bolest, sindrom stečene imunodeficijencije (HIV bolest), dejstvo toksina i hemoterapije, obična glavobolja, migrena, serijska glavobolja, vaskularni i nevaskularni sindromi, tenziona glavobolja, opšte zapaljenje, artritis, reumatske bolesti, lupus, osteoartritis, fibromijalgija, inflamatorni poremećaji creva, sindrom iritabilnih creva, inflamatorni poremećaji očiju, inflamatorni poremećaji mokraćne bešike ili poremećaj nestabilne mok. bešike, psorijaza, stanja na koži sa inflamatornim komponentama, opekotine od Sunca, karditis, dermatitis, miozitis, neuritis, kolagena vaskularna oboljenja, hronična inflamatorna stanja, bol kod inflamacije i pridružena hiperalgezija i alodinija, neuropatski bol i pridružena hiperalgezija ili alodinija, bol kod dijabetične neuropatije, kauzalgija, bol posredovan simpatetičkim vlaknima, deaferentacioni sindromi, astma, oštećenje ili disfunkcija epitelnog tkiva, herpes simpleks infekcija, poremećaji visceralnog motiliteta u respiratornom, genitourinarnom, gastrointestinalnom ili vaskularnom traktu, rane, opekotine, alergijske kožne reakcije, pruritus, vitiligo, opšti gastrointestinalni poremećaji, kolitis, gastrični ulkus, duodenalni ulkusi, vazomotorni ili alergijski rinitis, ili bronhijalni poremećaji, dismenoreja, dispepsija, gastroezofagealni refluks, pankreatitis ili visceralgija.
52. Farmaceutski preparat naznačen time što sadrži farmaceutski prihvatljiv nosilac i terapeutski delotvornu količinu antitela iz zahteva 49.
53. Postupak lečenja stanja izazvanog povećanom ekspresijom NGF ili povišenom osetljivošću na NGF kod pacijenta, naznačen time što podrazumeva primenu farmaceutskog preparata iz zahteva 52 kod pacijenta.
54. Postupak za detekciju NGF u biološkom uzorku naznačen time što podrazumeva: a) dovođenje uzorka u dodir sa antitelom iz zahteva 31, 33, 36, 38, 41 ili 42, pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje antitela za NGF; b) i merenje nivoa vezanog antitela u uzorku.
55. Molekul nukleinske kiseline naznačen time što kodira antitelo iz zahteva 31, 33, 36, 38, 41 ili 42.
56. Ćelija domaćin naznačena time što sadrži nukleinsku kiselinu iz zahteva 55.
57. Izolovana ćelijska linija naznačena time što proizvodi antitelo iz bilo kog od zahteva 31, 33, 36, 38, 41 ili 42.
58. Sredstvo za specifično vezivanje NGF naznačeno time što sadrži najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvence čiji je ID broj: 10, sekvence čiji je ID broj: 12, sekvence čiji je ID broj: 14, sekvence čiji je ID broj: 16, sekvence čiji je ID broj: 18, sekvence čiji je ID broj: 20, sekvence čiji je ID broj: 22 i bilo koje od sekvenci čiji su ID brojevi od 79 do 130, a gde to antitelo može da se veže za NGF.
59. Farmaceutski preparat naznačen time što sadrži farmaceutski prihvatljiv nosilac i terapeutski delotvornu količinu sredstva za vezivanje iz zahteva 58.
60. Postupak lečenja stanja izazvanog povećanom ekspresijom NGF ili povišenom osetljivošću na NGF kod pacijenta, naznačen time što podrazumeva primenu farmaceutskog preparata iz zahteva 59 kod pacijenta.
61. Sredstvo za vezivanje prema zahtevu 58 naznačeno time što je protein.
62. Molekul nukleinske kiseline naznačen time što kodira sredstvo za vezivanje iz zahteva 61.
63. Ćelija domaćin naznačena time što sadrži nukleinsku kiselinu iz zahteva 62.
64. Izolovana ćelijska linija naznačena time što proizvodi sredstvo za vezivanje iz zahteva 63.
65. Postupak lečenja stanja izazvanog povećanom ekspresijom NGF ili povišenom osetljivošću na NGF kod pacijenta naznačen time što podrazumeva primenu farmaceutski delotvorne količine sredstva za vezivanje iz zahteva 58 kod pacijenta.
66. Postupak prema zahtevu 65, naznačen time što je dato stanje akutni bol, dentalni bol, bol usled traume, hirurški bol, bol nakon amputacije ili apscesa, kauzalgija, demijelizacione bolesti, neuralgije trigeminusa, kancer, hronični alkoholizam, moždani udar, sindrom talamičkog bola, šećerna bolest, sindrom stečene imunodeficijencije (HIV bolest), dejstvo toksina i hemoterapije, obična glavobolja, migrena, serijska glavobolja, vaskularni i nevaskularni sindromi, tenziona glavobolja, opšte zapaljenje, artritis, reumatske bolesti, lupus, osteoartritis, fibromijalgija, inflamatorni poremećaji creva, sindrom iritabilnih creva, inflamatorni poremećaji očiju, inflamatorni poremećaji mokraćne bešike ili poremećaj nestabilne mok. bešike, psorijaza, stanja na koži sa inflamatornim komponentama, opekotine od Sunca, karditis, dermatitis, miozitis, neuritis, kolagena vaskularna oboljenja, hronična inflamatorna stanja, bol kod inflamacije i pridružena hiperalgezija i alodinija, neuropatski bol i pridružena hiperalgezija ili alodinija, bol kod dijabetične neuropatije, kauzalgija, bol posredovan simpatetičkim vlaknima, deaferentacioni sindromi, astma, oštećenje ili disfunkcija epitelnog tkiva, herpes simpleks infekcija, poremećaji visceralnog motiliteta u respiratornom, genitourinarnom, gastrointestinalnom ili vaskularnom traktu, rane, opekotine, alergijske kožne reakcije, pruritus, vitiligo, opšti gastrointestinalni poremećaji, kolitis, gastrični ulkus, duodenalni ulkusi, vazomotorni ili alergijski rinitis, ili bronhijalni poremećaji, dismenoreja, dispepsija, gastroezofagealni refluks, pankreatitis ili visceralgija.
67. Postupak za detekciju NGF u biološkom uzorku naznačen time što podrazumeva: a) dovođenje uzorka u dodir sa sredstvom za vezivanje iz zahteva 58, pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje sredstva za vezivanje za NGF; i b) merenje nivoa vezanog antitela u uzorku.
68. Izolovani molekul nukleinske kiseline naznačen time što sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiseline kao što je dato u bilo kojoj od sekvenci datih kao sekvenca čiji je ID broj: 10, sekvence čiji je ID broj: 12, sekvence čiji je ID broj: 14, sekvence čiji je ID broj: 16, sekvence čiji je ID broj: 18, sekvence čiji je ID broj: 20, sekvence čiji je ID broj: 22, sekvence čiji je ID broj: 24, sekvence čiji je ID broj: 40, sekvence čiji je ID broj: 41, sekvence čiji je ID broj: 42, sekvence čiji je ID broj: 43, sekvence čiji je ID broj: 44, ili bilo kojoj od sekvenci čiji su ID brojevi od 79 do 134.
69. Izolovano humano antitelo ili njegov antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment koji se specifično vezuje za NGF, naznačen time što to antitelo ili fragment sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži: a) CDR1 region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema formuli: a1a2a3a4a5 gde je: a1 ostatak polarne hidrofilne aminokiseline; a2 ostatak aromatične aminokiseline; a3 ostatak alifatične, polarne hidrofobne, aromatične aminokiseline; a4 ostatak neutralne hidrofobne ili alifatične aminokiseline; i a5 ostatak alifatične ili polarne hidrofilne aminokiseline; b) CDR2 region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema formuli: b1b2b3b4b5b6b7b8b9b10b11b12b13b14b15b16b17 gde je: b1 ostatak alifatične, polarne hidrofobne ili aromatične aminokiseline; b2 ostatak alifatične hidrofobne aminokiseline; b3 ostatak polarne hidrofilne ili aromatične aminokiseline; b4 ostatak polarne hidrofilne, hidrofobne ili aromatične aminokiseline; b5 do b9 su, nezavisno, ostaci polarne hidrofilne ili alifatične aminokiseline; b10 ostatak polarne hidrofilne, aromatične ili alifatične aminokiseline; b11 ostatak aromatične ili hidrofobne aminokiseline; b12 ostatak alifatične hidrofobne ili polarne hidrofilne aminokiseline; b13 ostatak alifatične, hidrofobne ili polarne hidrofilne aminokiseline; b14 i b16 su, nezavisno, ostaci polarne hidrofilne aminokiseline; b15 ostatak alifatične ili aromatične hidrofobne aminokiseline; i b17 ostatak alifatične kisele aminokiseline; i c) CDR3 region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema formuli: c1c2c3c4c5c6c7c8c9c10c11c12c13c14c15c16c17 gde: c1 nedostaje ili je ostatak alifatične aminokiseline; c2 nedostaje ili je ostatak polarne hidrofilne ili aromatične hidrofobne aminokiseline; c3 i c4, nezavisno, nedostaju ili su ostaci polarne hidrofilne, aromatične hidrofobne ili alifatične aminokiseline; c5 nedostaje ili je ostatak polarne hidrofilne, alifatične ili aromatične aminokiseline; c6 nedostaje ili je ostatak polarne hidrofilne ili alifatične aminokiseline; c7 je ostatak polarne hidrofilne ili alifatične aminokiseline; c8 je ostatak polarne hidrofilne, hidrofobne ili aromatične aminokiseline; c9 je ostatak polarne hidrofilne, alifatične ili aromatične hidrofobne aminokiseline; c10 je ostatak polarne hidrofilne, aromatične hidrofobne ili alifatične hidrofobne aminokiseline; c11 do c13 su, nezavisno, ostaci polarne hidrofilne ili aromatične hidrofobne aminokiseline; c14 je ostatak alifatične ili aromatične hidrofobne aminokiseline; c15 je ostatak polarne hidrofilne ili neutralne hidrofobne aminokiseline; c16 nedostaje ili je ostatak polarne hidrofilne aminokiseline; i c17 je ostatak aromatične hidrofobne ili alifatične hidrofobne aminokiseline, a gde dato antitelo ili fragment disosuje od polipeptida humanog NGF sa KD od oko 1 x 10-9 ili manjom i neutrališe bioaktivnost humanog NGF u standardnom in vitro testu sa IC50 od oko 1 x 10-8 M ili manjom.
70. Antitelo ili fragment prema zahtevu 69 naznačeno time što je: a1 ostatak polarne hidrofilne aminokiseline; a2 ostatak aromatične hidrofobne aminokiseline; a3 ostatak alifatične hidrofobne aminokiseline; a4 ostatak neutralne hidrofobne aminokiseline; a5 ostatak polarne hidrofilne aminokiseline; b1 ostatak alifatične ili aromatične aminokiseline; b2 Ile; b3 ostatak polarne hidrofilne aminokiseline; b4 ostatak polarne hidrofilne ili aromatične aminokiseline; b5 do b9 su, nezavisno, ostaci polarne hidrofilne ili alifatične aminokiseline; b10 ostatak alifatične aminokiseline; b11 Tyr; b12 ostatak alifatične hidrofobne aminokiseline; b13 ostatak alifatične ili polarne hidrofilne aminokiseline; b14 i b16 su, nezavisno, ostaci polarne hidrofilne aminokiseline; i b15 ostatak alifatične hidrofobne aminokiseline; b17 ostatak alifatične kisele aminokiseline; c1 nedostaje ili je ostatak alifatične aminokiseline; c2 nedostaje ili je ostatak polarne hidrofilne ili aromatične hidrofobne aminokiseline; c3 i c4, nezavisno, nedostaju ili su ostaci polarne hidrofilne, aromatične hidrofobne ili alifatične aminokiseline; c5 nedostaje ili je ostatak polarne hidrofilne aminokiseline; c6 nedostaje ili je ostatak polarne hidrofilne ili alifatične aminokiseline; c7 je ostatak polarne hidrofilne ili alifatične aminokiseline; c8 je ostatak polarne hidrofilne, hidrofobne ili aromatične aminokiseline; c9 je ostatak polarne hidrofilne, alifatične ili aromatične hidrofobne aminokiseline; c10 je ostatak polarne hidrofilne, aromatične hidrofobne ili alifatične hidrofobne aminokiseline; c11 do c13 su, nezavisno, ostaci polarne hidrofilne ili aromatične hidrofobne aminokiseline; c14 je ostatak alifatične ili aromatične hidrofobne aminokiseline; c15 je ostatak polarne hidrofilne ili neutralne hidrofobne aminokiseline; c16 nedostaje ili je ostatak polarne hidrofilne aminokiseline; i c17 je ostatak aromatične hidrofobne ili alifatične hidrofobne aminokiseline.
71. Antitelo ili fragment prema zahtevu 69 naznačeno time što: a1 je Ser, Asp, ili Thr; a2 je Tyr; a3 je Ala, Ser, Trp, ili Gly; a4 je Met ili Ile; a5 je His, Gly, ili Asn; b1 je Tyr, Gly, Ile ili Asp; b2 je Ile; b3 je Ser, Thr, Tyr ili Asn; b4 je Trp, Arg ili Pro; b5 je Ser, Asn ili Gly; b6 je Ser, Arg, Asp ili Gly; b7 je Ser, His ili Gly; b8 je Ser, Ile, Asp ili Thr; b9 je Leu, Ile ili Thr; b10 je Gly, Lys ili Phe; b11 je Tyr; b12 je Ala ili Ser; b13 je Asp, Gly ili Pro; b14 je Ser; b15 je Val ili Phe; b16 je Lys ili Gln; b17 je Gly; c1 nedostaje ili je ostatak alifatične aminokiseline; c2 nedostaje ili je Tyr; c3 i c4, nezavisno, nedostaju ili su Tyr, Asn, Val, ili Glu; c5 nedostaje ili je Ser, Gly, ili Trp; c6 nedostaje ili je Ser, Gly, Glu ili Leu; c7 je Gly, Arg ili Asp; c8 je Trp, Pro, Ser ili Thr; c9 je His, Gly ili Tyr; c10 je Val, Tyr ili Arg; c11 do c13 su, nezavisno, Ser, Phe, Tyr, Asp ili Asn; c14 je Phe, Val ili Gly; c15 je Met ili Asp; c16 nedostaje ili je Asp ili Asn; a c17 je Tyr ili Val.
72. Antitelo ili fragment prema zahtevu 69 naznačeno time što: a1 je Ser ili Asp; a2 je Tyr; a3 je Ala ili Ser; a4 je Met ili Ile; a5 je His ili Asn; b1 je Tyr ili Gly; b2 je Ile; b3 je Ser, Thr, Tyr ili Asn; b4 je Trp, Arg ili Pro; b5 je Ser ili Asn; b6 je Ser ili Arg; b7 je His ili Gly; b8 je Ile ili Thr; b9 je Leu, Ile ili Thr; b10 je Gly ili Phe; b11 je Tyr; b12 je Ala ili Ser; b13 je Asp ili Gly; b14 je Ser; b15 je Val ili Phe; b16 je Lys ili Gln; b17 je Gly; c1 nedostaje ili je Gly; c2 nedostaje ili je Tyr; c3 i c4, nezavisno, nedostaju ili su Tyr, Gly ili Val; c5 nedostaje ili je Ser; c6 je Ser ili Gly; c7 je Gly ili Arg; c8 je Trp ili Pro; c9 je His, Gly ili Tyr; c10 je Val ili Tyr; c11 do c13 su, nezavisno, Ser, Tyr, Phe ili Asp; c14 je Phe ili Val; c15 je Met ili Asp; c16 nedostaje ili je Asp; a c17 je Tyr ili Val.
73. Antitelo prema zahtevu 69 naznačeno time što: a) CDR1 teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 22, CDR2 teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 18 a CDR3 teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 14; b) CDR1 teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 92, CDR2 teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 93 a CDR3 teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 94; c) CDR1 teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 98, CDR2 teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 99 a CDR3 teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 100; d) CDR1 teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 104, CDR2 teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 105 a CDR3 teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 106; e) CDR1 teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 110, CDR2 teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 111 a CDR3 teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 112; ili f) CDR1 teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 116, CDR2 teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 117 a CDR3 teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 118.
74. Izolovano humano antitelo, ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalan imunoglobulinski fragment, koji se specifično vezuje za NGF, naznačen time što to antitelo ili fragment sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži: a) CDR1 region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema formuli: a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12 gde je: a1 ostatak polarne hidrofilne aminokiseline; a2, a11 i a12 su, nezavisno, ostaci alifatične ili hidrofobne aminokiseline; a3, a5, a7 i a8 su, nezavisno, ostaci alifatične, polarne hidrofilne ili hidrofobne aminokiseline; a4 je ostatak polarne hidrofilne aminokiseline; a6 je ostatak alifatične ili hidrofobne aminokiseline; a9 nedostaje ili je ostatak alifatične ili polarne hidrofilne aminokiseline; i a10 je ostatak alifatične, aromatične ili hidrofobne aminokiseline; b) CDR2 region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema formuli: b1b2b3b4b5b6b7 gde je: b1 ostatak alifatične, polarne hidrofobne ili hidrofilne aminokiseline; b2 ostatak alifatične ili hidrofobne aminokiseline; b3 i b4 su, nezavisno, ostaci polarne hidrofilne, alifatične ili hidrofobne aminokiseline; b5 je ostatak polarne hidrofilne ili alifatične hidrofobne aminokiseline; b6 je ostatak polarne hidrofilne ili alifatične hidrofobne aminokiseline; i b7 je je ostatak polarne hidrofilne aminokiseline; i c) CDR3 region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema formuli: c1c2c3c4c5c6c7c8c9c10c11c12c13c14c15c16c17 gde: c1 i c2 su, nezavisno, ostaci polarne hidrofilne aminokiseline; c3 je ostatak polarne hidrofilne, alifatične ili hidrofobne aminokiseline; c4, c5 i c6 su, nezavisno, ostaci alifatične, polarne hidrofilne ili hidrofobne aminokiseline; c7 nedostaje ili je ostatak polarne hidrofilne ili alifatične hidrofobne aminokiseline; c8 je ostatak polarne hidrofilne ili hidrofobne aminokiseline; i c9 je ostatak polarne hidrofilne aminokiseline, a gde dato antitelo ili fragment disosuje od polipeptida humanog NGF sa KD od oko 1 x 10-9 ili manjom i neutrališe bioaktivnost humanog NGF u standardnom in vitro testu sa IC50 od oko 1 x 10-8 M ili manjom.
75. Antitelo ili fragment prema zahtevu 74 naznačen time što: a1, a3, a4, a7 i a8 su, nezavisno, ostaci polarne hidrofilne aminokiseline; a2, a6, a11 i a12 su, nezavisno, ostaci alifatične hidrofobne aminokiseline; a5 je ostatak polarne hidrofilne ili alifatične aminokiseline; a9 nedostaje, ili je ostatak alifatične ili polarne hidrofilne aminokiseline; a10 je ostatak alifatične ili aromatične aminokiseline; b1 je ostatak alifatične, polarne hidrofobne ili hidrofobne aminokiseline; b2 je ostatak alifatične hidrofobne aminokiseline; b3, b4 i b7 su, nezavisno, ostaci polarne hidrofilne aminokiseline; b5 i b6 su, nezavisno, ostaci polarne hidrofilne ili alifatične hidrofobne aminokiseline; c1 i c2 su, nezavisno, ostaci polarne hidrofilne aminokiseline; c3 je ostatak polarne hidrofilne, alifatične ili hidrofobne aminokiseline; c4, c5 i c6 su, nezavisno, ostaci alifatične, polarne hidrofilne ili hidrofobne aminokiseline; c7 nedostaje ili je ostatak alifatične hidrofobne aminokiseline; c8 je ostatak hidrofobne aminokiseline; a c9 je ostatak polarne hidrofilne aminokiseline.
76. Antitelo ili fragment prema zahtevu 75 naznačen time što: a1, a3, a4 i a7 su Arg, Ser, Gln i Ser, respektivno; a2 je Ala; a5 je Gly ili Ser; a8 je Ser ili Ile; a9 nedostaje ili je Ser ili Gly; a10 je Ala, Tyr, Trp ili Phe; b1 je Asp, Gly, Ala ili Val; b2 i b3 su Ala i Ser, respektivno; b4 je Ser ili Asn; b5 je Leu ili Arg; b6 je Glu, Ala ili Gln; b7 je Ser ili Thr; c1 i c2 su Gln; c3 je Phe, Tyr, Arg ili Ala; c4 je Asn, Gly ili Ser; c5 je Ser ili Asn; c6 je Tyr, Ser, Trp ili Phe; c7 nedostaje ili je Pro ili His; c8 je Leu, Trp, Tyr ili Arg; i c9 je Thr.
77. Antitelo ili fragment prema zahtevu 75 naznačen time što: a1, a2, a3, a4 i a7 su Arg, Ala, Ser, Gln i Ser, respektivno; a5 je Gly ili Ser; a8 je Ser ili Ile; a9 nedostaje ili je Ser ili Gly; a10 je Ala ili Tyr; b1 je Asp ili Gly; b2 i b3 su Ala i Ser, respektivno; b4 je Ser ili Asn; b5 je Leu ili Arg; b6 je Glu, Ala ili Gln; b7 je Ser ili Thr; c1 i c2 su Gln; c3 je Phe, Tyr, Arg ili Ala; c4 je Asn, Gly ili Ser; c5 je Ser ili Asn; c6 je Tyr, Ser, Trp ili Phe; c7 nedostaje ili je Pro ili His; c8 je Leu, Trp, Tyr ili Arg; i c9 je Thr.
78. Antitelo prema zahtevu 74 naznačeno time što: a) CDR1 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 24, CDR2 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 20 a CDR3 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 16; b) CDR1 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 95, CDR2 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 96 a CDR3 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 97; c) CDR1 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 101, CDR2 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 102 a CDR3 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 103; d) CDR1 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 107, CDR2 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 108 a CDR3 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 109; e) CDR1 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 113, CDR2 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 114 a CDR3 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 115; f) CDR1 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 119, CDR2 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 120 a CDR3 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 121; g) CDR1 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 122, CDR2 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 123 a CDR3 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 124; h) CDR1 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 125, CDR2 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 126 a CDR3 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 127; i) CDR1 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 128, CDR2 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 129 a CDR3 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 130; ili j) CDR1 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 132, CDR2 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 133 a CDR3 lakog lanca ima aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 134.
79. Polinukleotid naznačen time što kodira antitelo ili fragment iz bilo kog od zahteva 69 do 78.
80. Ekspresioni vektor naznačen time što sadrži polinukleotid iz zahteva 79.
81. Ćelija domaćin naznačena time što sadrži ekspresioni vektor iz zahteva 80.
82. Ćelija domaćin prema zahtevu 81 naznačena time što je ta ćelija eukariotska ćelija.
83. Ćelija domaćin prema zahtevu 82 naznačena time što je ta ćelija CHO ćelija.
84. Medikament za lečenje bolnog poremećaja ili stanja povezanog sa povećanom ekspresijom NGF ili povišenom osetljivošću na NGF naznačen time što taj medikament sadrži farmaceutski delotvornu količinu monoklonskog antitela ili njegovog imunološki funkcionalnog imunoglobulinskog fragmenta, ili farmaceutski prihvatljive soli tog monoklonskog antitela ili fragmenta, gde je dato monoklonsko antitelo najmanje jedno od navedenih monoklonskih antitela prema zahtevu 1, kao i farmaceutski prihvatljiv nosilac, diluent ili ekscipijent.
85. Medikament prema zahtevu 84, naznačen time što dato monoklonsko antitelo sadrži: a) teški lanac koji ima varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 10, ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, kao i laki lanac koji ima varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 12, ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment; b) teški lanac koji ima varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 14, ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, kao i laki lanac koji ima varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 16, ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment; c) teški lanac koji ima varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 18, ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, kao i laki lanac koji ima varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 16, ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment; ili d) teški lanac koji ima varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 20, ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, kao i laki lanac koji ima varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je data kao sekvenca čiji je ID broj: 16, ili njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
86. Medikament za lečenje bolnog poremećaja ili stanja povezanog sa povećanom ekspresijom NGF ili povišenom osetljivošću na NGF naznačen time što taj medikament sadrži farmaceutski delotvornu količinu monoklonskog antitela ili njegovog imunološki funkcionalnog imunoglobulinskog fragmenta, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% identičnost sekvence sa aminokiselinskom sekvencom datom kao sekvenca čiji je ID broj: 10 ili aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnost sekvence sa aminokiselinskom sekvencom datom kao sekvenca čiji je ID broj: 12, kao i farmaceutski prihvatljiv nosilac, diluent ili ekscipijent.
87. Medikament prema zahtevu 86, naznačen time što dato monoklonsko antitelo disosuje od polipeptida humanog NGF sa KD od oko 1 x 10-9 ili manjom i neutrališe bioaktivnost humanog NGF u standardnom in vitro testu sa IC50 od oko 1 x 10-8 M ili manjom.
88. Medikament prema zahtevu 86, naznačen time što dato antitelo disosuje od polipeptida humanog NGF sa KD od oko 1 x 10-10 ili manjom i neutrališe bioaktivnost humanog NGF u standardnom in vitro testu sa IC50 od oko 1 x 10-9 M ili manjom.
89. Medikament prema zahtevu 86, naznačen time što dato antitelo disosuje od polipeptida humanog NGF sa KD od oko 1 x 10-11 ili manjom i neutrališe bioaktivnost humanog NGF u standardnom in vitro testu sa IC50 od oko 0,2 x 10-9 M ili manjom.
90. Upotreba farmakološki delotvorne količine antitela iz zahteva 1 naznačena time što služi za proizvodnju medikamenta pogodnog za lečenje bolnog poremećaja li stanja povezanog sa povećanom ekspresijom NGF ili povišenom osetljivošću na NGF.
91. Upotreba prema zahtevu 90, naznačena time što dato monoklonsko antitelo disosuje od polipeptida humanog NGF sa KD od oko 1 x 10-9 ili manjom i neutrališe bioaktivnost humanog NGF u standardnom in vitro testu sa IC50 od oko 1 x 10-8 M ili manjom.
92. Upotreba prema zahtevu 90, naznačena time što dato antitelo disosuje od polipeptida humanog NGF sa KD od oko 1 x 10-10 ili manjom i neutrališe bioaktivnost humanog NGF u standardnom in vitro testu sa IC50 od oko 1 x 10-9 M ili manjom.
93. Upotreba prema zahtevu 90, naznačena time što dato antitelo disosuje od polipeptida humanog NGF sa KD od oko 1 x 10-11 ili manjom i neutrališe bioaktivnost humanog NGF u standardnom in vitro testu sa IC50 od oko 0,2 x 10-9 M ili manjom.
94. Upotreba prema zahtevu 93, naznačena time što je dati bolni poremećaj ili stanje izabran iz grupe koja se sastoji od akutnog bola, dentalnog bola, bola usled traume, hirurškog bola, bola nakon amputacije ili apscesa, kauzalgije, demijelizacionih bolesti, neuralgija trigeminusa, kancera, hroničnog alkoholizma, moždanog udara, sindroma talamičkog bola, šećerne bolesti, sindroma stečene imunodeficijencije (HIV bolesti), dejstva toksina i hemoterapije, obične glavobolje, migrene, serijske glavobolje, vaskularnih i nevaskularnih sindroma, tenzione glavobolje, opšteg zapaljenja, artritisa, reumatskih bolesti, lupusa, osteoartritisa, fibromijalgije, inflamatornih poremećaja creva, sindroma iritabilnih creva, inflamatornih poremećaja očiju, inflamatornih poremećaja mokraćne bešike ili poremećaja nestabilne mok. bešike, psorijaze, stanja na koži sa inflamatornim komponentama, opekotina od Sunca, karditisa, dermatitisa, miozitisa, neuritisa, kolagenih vaskularnih oboljenja, hroničnih inflamatornih stanja, bola kod inflamacije i pridružene hiperalgezije i alodinije, neuropatskog bola i pridružene hiperalgezije ili alodinije, bola kod dijabetične neuropatije, kauzalgije, bola posredovanog simpatetičkim vlaknima, deaferentacionih sindroma, astme, oštećenja ili disfunkcije epitelnog tkiva, herpes simpleks infekcije, poremećaja visceralnog motiliteta u respiratornom, genitourinarnom, gastrointestinalnom ili vaskularnom traktu, rana, opekotina, alergijskih kožnih reakcija, pruritusa, vitiliga, opštih gastrointestinalnih poremećaja, kolitisa, gastričnog ulkusa, duodenalnog ulkusa, vazomotornog ili alergijskog rinitisa, ili bronhijalnih poremećaja, dismenoreje, dispepsije, gastroezofagealnog refluksa, pankreatitisa ili visceralgije. AMGEN, INC. One Amgen Center Drive Thousand Paks, CA 91320-1799, S.A.D. Zastupnik: Apstrakt u skladu sa članom 34 Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja interaguju sa ili se vezuju za humani faktor rasta nerava (NGF - Nerve Growth Factor) i tako neutrališu funkciju NGF. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske preparate navedenih antitela i postupke neutralizacije funkcije NGF, a posebno obezbeđuje postupak za tretiranje poremećaja koji su povezani sa NGF (npr., hronični bol) primenom farmaceutski efikasne količine anti-NGF antitela. Takođe, obezbeđeni su postupci za detekciju određene količine NGF u uzorku korišćenjem anti-NGF antitela. AMGEN, INC. One Amgen Center Drive Thousand Oaks, CA 91320-1799, S.A.D. Zastupnik:
MEP-2008-315A 2004-07-15 2004-07-15 Humana anti-ngf neutrališuća antitijela kao selektivni inhibitori ngf signalne kaskade ME00226B (me)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP04778409A EP1648509B8 (en) 2003-07-15 2004-07-15 Human anti-ngf neutralizing antibodies as selective ngf pathway inhibitors
PCT/US2004/022876 WO2005019266A2 (en) 2003-07-15 2004-07-15 Human anti-ngf neutralizing antibodies as selective ngf pathway inhibitors
US12/576,522 US9260514B2 (en) 2003-07-15 2009-10-09 Methods of treating conditions caused by increased expression of nerve growth factor (NGF) or increased sensitivity to NGF using anti-NGF neutralizing antibodies as selective NGF pathway inhibitors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ME00226B true ME00226B (me) 2011-02-10

Family

ID=43466840

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MEP-2008-315A ME00226B (me) 2004-07-15 2004-07-15 Humana anti-ngf neutrališuća antitijela kao selektivni inhibitori ngf signalne kaskade

Country Status (28)

Country Link
US (1) US9260514B2 (me)
EP (2) EP2485760B1 (me)
JP (3) JP2013507385A (me)
KR (1) KR101528393B1 (me)
CN (1) CN102762228A (me)
AR (1) AR078569A1 (me)
AU (2) AU2010308418A1 (me)
BR (1) BR112012008282A2 (me)
CA (1) CA2775924A1 (me)
CL (1) CL2012000881A1 (me)
CO (1) CO6541558A2 (me)
CR (1) CR20120198A (me)
EA (1) EA201290189A1 (me)
IL (1) IL218885A0 (me)
MA (1) MA33724B1 (me)
ME (1) ME00226B (me)
MT (1) MTP4289B (me)
MX (1) MX343748B (me)
MY (1) MY172283A (me)
NZ (2) NZ625391A (me)
PE (1) PE20121028A1 (me)
PH (1) PH12012500668A1 (me)
SG (1) SG10201603945RA (me)
TN (1) TN2012000136A1 (me)
TW (1) TW201125581A (me)
UA (1) UA102775C2 (me)
WO (1) WO2011049758A1 (me)
ZA (1) ZA201203135B (me)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITRM20030601A1 (it) * 2003-12-24 2005-06-25 Lay Line Genomics Spa Metodo per l'umanizzazione di anticorpi e anticorpi umanizzati con esso ottenuti.
ITRM20050290A1 (it) * 2005-06-07 2006-12-08 Lay Line Genomics Spa Uso di molecole in grado di inibire il legame tra ngf e il suo recettore trka come analgesici ad effetto prolungato.
CN102459337B (zh) 2009-05-04 2015-05-20 雅培研究有限责任公司 具有增强的体内稳定性的抗神经生长因子(ngf)抗体
KR20190112175A (ko) 2010-12-01 2019-10-02 앨더바이오 홀딩스 엘엘씨 항―ｎｇｆ 조성물 및 그의 용도
US9078878B2 (en) 2010-12-01 2015-07-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF antibodies that selectively inhibit the association of NGF with TrkA, without affecting the association of NGF with p75
US9067988B2 (en) 2010-12-01 2015-06-30 Alderbio Holdings Llc Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies
US9884909B2 (en) 2010-12-01 2018-02-06 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
US9539324B2 (en) 2010-12-01 2017-01-10 Alderbio Holdings, Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
US11214610B2 (en) 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
US9617334B2 (en) 2012-06-06 2017-04-11 Zoetis Services Llc Caninized anti-NGF antibodies and methods thereof
US9603775B2 (en) 2013-04-24 2017-03-28 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
KR102362002B1 (ko) * 2013-11-29 2022-02-10 제넨테크, 인크. 항체 선택 장치 및 방법
JP2018516112A (ja) 2015-04-17 2018-06-21 コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェＫｏｎｉｎｋｌｉｊｋｅ Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｎ．Ｖ． 異方性をもつ生物学的組織の検出
AU2017366870B2 (en) 2016-11-29 2024-09-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. A pharmaceutical composition for averting opioid addiction
WO2019178364A2 (en) * 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
EP3833687A1 (en) 2018-08-10 2021-06-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. A pharmaceutical composition for safe and effective treatment of knee and/or hip pain
IT201800009384A1 (it) 2018-10-11 2020-04-11 Cosmo Srl Peptide for cosmetic application
CN113924315B (zh) * 2019-06-10 2022-06-28 山东博安生物技术股份有限公司 抗β-NGF纳米抗体及其应用
CN113527483B (zh) * 2020-04-17 2023-09-22 珠海泰诺麦博制药股份有限公司 抗人神经生长因子的抗体
CN113549150A (zh) * 2020-04-26 2021-10-26 三生国健药业（上海）股份有限公司 结合人ngf的抗体、其制备方法和用途
EP4157881A4 (en) * 2020-05-27 2024-10-09 Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd. ANTIBODIES THAT SPECIFICALLY RECOGNIZE NERVE GROWTH FACTOR AND THEIR USES
AU2020204105B2 (en) * 2020-06-19 2023-06-08 Dartsbio Pharmaceuticals Ltd. Anti-human ngf antibodies and methods using same
US11655292B2 (en) 2020-06-23 2023-05-23 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Anti-human NGF antibodies and methods using same
IT202000020287A1 (it) * 2020-08-20 2022-02-20 Colosseum Combinatorial Chemistry Centre For Tech Societa A Responsabilita Limitata In Forma Abbrevi Peptide per applicazioni terapeutiche in campo dermatologico
EP4433500A1 (en) 2021-11-19 2024-09-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for reducing centralized pain
WO2023139542A1 (en) * 2022-01-21 2023-07-27 Institut Pasteur De Montevideo Active immunization for reducing osteoarthritic, neuropathic, and cancer pain
US20240002491A1 (en) 2022-04-27 2024-01-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for selecting patients for treatment with an ngf antagonist
FR3148027A1 (fr) * 2023-04-24 2024-10-25 Peptinov Composition vaccinale anti-ngf
WO2025264860A2 (en) 2024-06-18 2025-12-26 Yale University Methods of treating post-covid airway disease

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US913242A (en) 1905-08-29 1909-02-23 Electrelle Company Automatic music-playing attachment for pianos.
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
US4230691A (en) 1978-05-23 1980-10-28 The Massachusetts General Hospital Nerve growth factor antibody and process
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
US4710473A (en) 1983-08-10 1987-12-01 Amgen, Inc. DNA plasmids
DE3474511D1 (en) 1983-11-01 1988-11-17 Terumo Corp Pharmaceutical composition containing urokinase
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4786593A (en) 1985-04-16 1988-11-22 Wistar Institute Of Anatomy And Biology Diagnostic method for detection of neural crest disease
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
WO1988001649A1 (en) 1986-09-02 1988-03-10 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
JP2969647B2 (ja) 1988-09-14 1999-11-02 東ソー株式会社 モノクローナル抗体、それからなる阻害剤及びそれを用いた測定方法
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
SE465573B (sv) 1989-03-14 1991-09-30 Lope Medicine Ab Nervtillvaextfaktorpeptider, motsvarande antikroppar och foerfarande foer bestaemning av nativ nervtillvaextfaktor
JP2877509B2 (ja) 1989-05-19 1999-03-31 アムジエン・インコーポレーテツド メタロプロテイナーゼ阻害剤
JPH03163095A (ja) 1989-08-28 1991-07-15 Takeda Chem Ind Ltd ヒト神経成長因子の部分ペプチド、抗体およびその用途
ES2109225T3 (es) 1989-08-28 1998-01-16 Takeda Chemical Industries Ltd Anticuerpos, su produccion y uso.
US5656435A (en) 1989-08-28 1997-08-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibodies to peptides having NGF-like activity, said antibodies having no substantial cross-reactivity with NGF, and use thereof
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
JP3232415B2 (ja) 1990-08-29 2001-11-26 武田薬品工業株式会社 モノクローナル抗体，その製造法および用途
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
JPH06317587A (ja) 1990-08-31 1994-11-15 Takeda Chem Ind Ltd 抗体およびその用途
US5147294A (en) 1990-10-01 1992-09-15 Trustees Of Boston University Therapeutic method for reducing chronic pain in a living subject
CA2111348A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 John S. Logan Production of human hemoglobin in transgenic pigs
JPH06508880A (ja) 1991-07-08 1994-10-06 ユニバーシティ　オブ　マサチューセッツ　アット　アムハースト サーモトロピック液晶セグメント化ブロックコポリマー
JPH0576384A (ja) 1991-09-20 1993-03-30 Hitachi Ltd 抗ヒト神経成長因子モノクローナル抗体
EP0746609A4 (en) 1991-12-17 1997-12-17 Genpharm Int NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES
JP3519096B2 (ja) 1992-07-02 2004-04-12 武田薬品工業株式会社 モノクローナル抗体、ハイブリドーマおよびそれらの用途
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
US5844092A (en) 1994-03-18 1998-12-01 Genentech, Inc. Human TRK receptors and neurotrophic factor inhibitors
US5877016A (en) 1994-03-18 1999-03-02 Genentech, Inc. Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
GB9616105D0 (en) 1996-07-31 1996-09-11 Univ Kingston TrkA binding site of NGF
EP2305027B1 (en) 1996-12-03 2014-07-02 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vkappa regions and antibodies produced therefrom
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
CA2796140A1 (en) 1999-03-25 2000-09-28 Jochen Salfeld Human antibodies that bind human il-12 and methods for producing
IL147765A0 (en) 1999-07-29 2002-08-14 Medarex Inc HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO HER2/neu
US6627196B1 (en) 1999-08-27 2003-09-30 Genentech, Inc. Dosages for treatment with anti-ErbB2 antibodies
US6548062B2 (en) 2000-02-29 2003-04-15 Cephalon, Inc. Method of treating cancer with anti-neurotrophin agents
FR2807660A1 (fr) 2000-04-13 2001-10-19 Warner Lambert Co Utilisation d'antagonistes du ngf pour la prevention ou le traitement de douleurs viscerales chroniques
CA2975521A1 (en) 2001-05-30 2002-12-05 Genentech, Inc. Anti-ngf antibodies for the treatment of various disorders
IL166244A0 (en) 2001-07-12 2006-01-15 Jefferson Foote Super humanized antibodies
KR20050036852A (ko) 2001-10-15 2005-04-20 기린 비루 가부시키가이샤 항-ｈｌａ-ｄｒ 항체
EP1467756A4 (en) 2001-12-28 2007-03-21 Abgenix Inc METHODS OF USING ANTI-MUC18 ANTIBODIES
US6919426B2 (en) * 2002-09-19 2005-07-19 Amgen Inc. Peptides and related molecules that modulate nerve growth factor activity
US7252822B2 (en) 2002-10-08 2007-08-07 Rinat Neuroscience Corp. Methods for treating post-surgical pain by administering an anti-nerve growth factor antagonist
US7569364B2 (en) * 2002-12-24 2009-08-04 Pfizer Inc. Anti-NGF antibodies and methods using same
CN102746399B (zh) 2002-12-24 2016-03-02 里纳特神经系统学公司 抗ngf抗体及其使用方法
CN1849138B (zh) 2003-07-15 2011-11-30 安姆根有限公司 作为选择性ngf途径抑制剂的人抗ngf中和抗体
KR100894191B1 (ko) * 2003-07-15 2009-04-22 암젠 인코포레이티드 선택적인 ｎｇｆ 경로 저해제로서의 인체 항-ｎｇｆ 중화 항체 및 이 항체를 포함하는 약학적 조성물
EP1846451B1 (en) 2005-01-24 2013-05-15 Medimmune Limited Human antibodies against human ngf
US9401875B2 (en) 2012-06-01 2016-07-26 Nippon Telegraph And Telephone Corporation Packet transfer processing method and packet transfer processing device
US9300829B2 (en) 2014-04-04 2016-03-29 Canon Kabushiki Kaisha Image reading apparatus and correction method thereof

Also Published As

Publication number Publication date
TN2012000136A1 (en) 2013-09-19
EP3028717A1 (en) 2016-06-08
NZ599431A (en) 2014-07-25
CO6541558A2 (es) 2012-10-16
MY172283A (en) 2019-11-20
CN102762228A (zh) 2012-10-31
AU2010308418A1 (en) 2012-05-10
KR101528393B1 (ko) 2015-06-11
EP2485760B1 (en) 2016-07-13
MA33724B1 (fr) 2012-11-01
MTP4289B (en) 2011-05-12
CR20120198A (es) 2012-07-30
TW201125581A (en) 2011-08-01
ZA201203135B (en) 2013-01-30
EP2485760A1 (en) 2012-08-15
PH12012500668A1 (en) 2017-05-10
MX2012004035A (es) 2012-05-08
AR078569A1 (es) 2011-11-16
NZ625391A (en) 2016-02-26
AU2014203316A1 (en) 2014-07-10
JP2017014286A (ja) 2017-01-19
CL2012000881A1 (es) 2013-02-08
PE20121028A1 (es) 2012-08-06
JP2014169326A (ja) 2014-09-18
EA201290189A1 (ru) 2012-10-30
US9260514B2 (en) 2016-02-16
WO2011049758A1 (en) 2011-04-28
AU2014203316B2 (en) 2016-07-07
SG10201603945RA (en) 2016-07-28
IL218885A0 (en) 2012-06-28
JP2013507385A (ja) 2013-03-04
UA102775C2 (uk) 2013-08-12
BR112012008282A2 (pt) 2016-11-22
KR20120117007A (ko) 2012-10-23
CA2775924A1 (en) 2011-04-28
US20100034818A1 (en) 2010-02-11
MX343748B (es) 2016-11-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ME02785B (me) Humana anti-ngf neutrališuća antitela kao selektivni inhibitori ngf signalnog puta
US9260514B2 (en) Methods of treating conditions caused by increased expression of nerve growth factor (NGF) or increased sensitivity to NGF using anti-NGF neutralizing antibodies as selective NGF pathway inhibitors
ME00205B (me) HUMANA ANTI-IFN-γ NEUTRALIŠUĆA ANTITELA KAO SELEKTIVNI INHIBITORI IFN-γ PUTA
AU2016247195A1 (en) Human Anti-NGF Neutralizing Antibodies as Selective NGF Pathway Inhibitors
HK1166998B (en) Human anti-ngf neutralizing antibodies as selective ngf pathway inhibitors
HK1166998A (en) Human anti-ngf neutralizing antibodies as selective ngf pathway inhibitors
HK1169133A (en) Human anti-ngf neutralizing antibodies as selective ngf pathway inhibitors
HK1160609A (en) Human anti-ngf neutralizing antibodies as selective ngf pathway inhibitors
AU2013260740A1 (en) Human Anti-NGF Neutralizing Antibodies as Selective NGF Pathway Inhibitors
HK1169133B (en) Human anti-ngf neutralizing antibodies as selective ngf pathway inhibitors
HK1088534B (en) Human anti-ngf neutralizing antibodies as selective ngf pathway inhibitors